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Engineering

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

Published: November 17, 2018 doi: 10.3791/58640
Automatic Translation
1,2,3,4, 2,4
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 2Institute for Cell Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University, 3Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 4Department of Pathology, School of Medicine, Johns Hopkins University

Summary

As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.

Abstract

Nós desenvolvemos uma ferramenta para enriquecer e expandir as células T antígeno-específicas. Isto pode ser útil em casos como de A) detectar a existência de pilhas de T antígeno-específicas, B) sondar a dinâmica das respostas antígeno-específicas, C) compreender como antígeno-específicos respostas afetam o estado de doença, tais como a auto-imunidade, D) desmistificar heterogêneos respostas de células T antígeno-específicas, ou E) utilizam células antígeno-específicas para a terapia. A ferramenta baseia-se em uma partícula magnética que nós conjugado antígeno-específicas e sinais co-estimulatória de célula T, e que nós chamamos como apresentadoras artificial de células (aAPCs). Consequentemente, uma vez que a tecnologia é simples de produzir, ele pode facilmente ser adotado por outros laboratórios; assim, nosso objetivo aqui é descrever detalhadamente a fabricação e o uso subsequente da aAPCs. Nós explicamos como anexar antígeno-específicas e co-estimulatória sinais para a aAPCs, como utilizá-los para enriquecer para as células T antígeno-específicas e como expandir as células T antígeno-específicas. Além disso, destacaremos considerações com base em informações experimentais e biológicas de nossa experiência com caracterizando as células T antígeno-específicas de projeto de engenharia.

Introduction

Com a ascensão de muitos imunoterapias, há uma necessidade de ser capaz de caracterizar e controlar respostas imunes. Em particular, a resposta imune adaptativa é de interesse devido a especificidade e a durabilidade das pilhas. Recentemente, terapias de células T de receptor de antígeno quimérico foram aprovadas para a terapia do câncer; no entanto, os receptores de antígeno são baseados fora comum célula superfície antígeno CD19, em vez dos antígenos específicos para o câncer1. Além da especificidade, imunoterapias também podem sofrer com a falta de controle e limitada a compreensão da resposta imune dinâmica dentro de câncer ou auto-imunidade.

Um dos desafios de estudar respostas antígeno-específicas é sua extremamente baixa frequência, por exemplo., as células T antígeno-específicos são 1 de cada 104 106 T células2,3. Assim, para investigar qual T células estão presentes ou respondendo, as células precisam tanto ser enriquecido e ampliado, ou o sinal deles precisa ser amplificado. É caro e difícil de manter as células de alimentador usando técnicas atuais que incidem sobre a expansão de células antígeno-específicas. Células de técnicas atuais que enfocam amplificando o sinal de T antígeno-específicos, como a enzima-lig immunospot (ELISPOT) do ensaio, limitar a re-utilização dessas células T4. Finalmente, devido à baixa sensibilidade, muitas vezes estas duas técnicas precisam ser combinada para enumeração de antígeno-específicas.

Para solucionar esses problemas, nós desenvolvemos o antígeno de artificiais baseados em nanopartículas magnéticas apresentando célula (aAPC)5,6,7,8. A aAPC pode ser acrescida com um complexo antígeno-específicas-peptídeo sinal carregado histocompatibilidade (pMHC) - e moléculas coestimulatórias -ex., um anticorpo anti-CD28-para ambos enriquecer as células T antígeno-específicas e então posteriormente estimule sua expansão (Figura 1). As partículas, portanto, podem ser um produto de prateleira econômico que pode ser tanto personalizado para atender a estímulos de antígeno-específicas ainda padronizado através de experimentos e pacientes. Realizar o enriquecimento e a expansão processar resultados em centenas de milhares-dobra expansão de células T CD8 + de antígeno-específicas e pode resultar em frequências de até 60% após apenas uma semana, permitindo a caracterização ou uso terapêutico do grande número de células. Aqui, descrevemos como fazer nanopartículas aAPCs, algumas considerações de projeto crítico em escolher as propriedades de nanopartículas e demonstrar alguns resultados típicos de utilizar essas partículas no isolamento e na expansão raras células de CD8 + T antígeno-específicas.

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Protocol

Todos os ratos foram mantidos as orientações aprovadas pelo Conselho de revisão institucional da Universidade Johns Hopkins.

1. carregar a proteína de fusão de imunoglobulina dimérica Major complexo de histocompatibilidade (MHC-Ig) com antígeno desejado peptídeo de sequência.

Nota: Se usar o H - 2Kb: Ig e, em seguida, siga o protocolo detalhado no passo 1.1; se usar o H-2Db:Ig e, em seguida, siga o protocolo detalhado no passo 1.2.

  1. Ativo de carregamento de sequência do peptide em H - 2Kb: Ig.
    1. Prepare os buffers de necessários. Prepare o buffer de desnaturação, fazendo uma solução de NaCl de 150 mM e 15mM Na2CO3 em água deionizada e em seguida, ajustar o pH a 11,5. Prepare o buffer de renaturalização fazendo uma solução de 250 mM Tris-HCl em água desionizada e ajustar o pH para 6,8.
      Nota: Normalmente, exigirá cerca de 5 mL de buffers a desnaturação e a renaturalização de 1 mg de H - 2Kb: Ig.
    2. H - 2Kb de desnaturar: Ig para permitir a ligação do peptídeo reforçada. Trazer o H - 2Kb: Ig a operação de concentração entre 0,5-2 mg/mL com tampão fosfato salino (PBS). Em seguida, diluir o H - 2Kb: Ig para uma concentração final de 100-200 µ g/mL, com volume de 5-10 equivalentes de desnaturação do buffer e permitam a incubação à temperatura ambiente por 15 min.
    3. Adicionar 50 excesso molar de peptídeo sequência (geralmente peptídeo conservado em estoque é mantido em 1 mM a-80 ° C) para o H - 2 Kb: solução de Ig.
      Observação: Geralmente antígenos peptídeos precisará ser dissolvido dentro de pelo menos 10% dimetilsulfóxido (DMSO) e em seguida adicionado lentamente à PBS para permanecer solúvel. Dependendo da sequência de aminoácidos, a quantidade de DMSO pode precisar ser aumentada.
    4. Renaturalização de H - 2Kb: Ig com peptídeo. Imediatamente após a adição do peptide, trazer a solução para um pH de 7.4 adicionando buffer de renaturalização. Permitir que a solução neutralizada incubar durante 48 h a 4 ° C.
    5. Concentre-se e lavar o peptídeo carregado H - 2Kb: Ig. utilizando um concentrador centrífugo com um 50 kDa de peso molecular de corte (MWCO), siga as instruções do fabricante para lavar o peptídeo carregado H - 2Kb: solução Ig 3 vezes com PBS, concentre-se a pelo menos 1 mg/mL e quantificar a concentração de um espectrofotômetro.
  2. Ativo de carregamento de sequência do peptide em H-2Db:Ig.
    1. Prepare os buffers de necessários. Prepare o buffer de desnaturação fazendo uma solução de ácido cítrico de 131 mM, 150 mM NaCl e 124 milímetros Na2HPO4 em água desionizada e ajustando o pH para 6,5. Prepare o buffer de renaturalização fazendo uma solução de 120 mM Tris HCl em água desionizada e ajustar o pH a 8,8.
      Nota: Normalmente, exigirá cerca de 5 mL de tampão a desnaturação e 1 mL de tampão de renaturalização de 1 mg de H-2Db:Ig.
    2. Desnaturar o H-2Db:Ig para permitir a ligação do peptídeo reforçada. Trazer o H-concentração de 2Db:Ig a uma concentração final de 0,5-2 mg/mL com PBS. Em seguida, diluir o H-2Db:Ig a uma concentração final de 100-200 µ g/mL com equivalentes de volume 5-10 de buffer de desnaturação.
    3. Adicionar 50 excesso molar de peptídeo sequência (geralmente peptídeo conservado em estoque é mantido em 1 mM a-80 ° C) para o H-2Db:Ig solução e permitir que a incubar durante 1 h a 37 ° C.
    4. Adicionar β2 microglobulina e renaturalização H-2Db:Ig com peptídeo. Adicione 2 vezes excesso molar de β2 microglobulina. Em seguida, trazer a solução para um pH de 7.4 adicionando buffer de renaturalização. Permitir que a solução neutralizada incubar por 24 h a 4 ° C.
    5. Concentre-se e lavar peptídeo carregado H-2Db:Ig., utilizando um concentrador centrífugo com um 50 kDa MWCO, siga as instruções do fabricante para lavar o peptídeo carregado H - 2 Kb: Ig solução 3 vezes com PBS, concentre-se a pelo menos 1 mg/mL e quantificar o concentração em um espectrofotômetro.

2. conjugado complexos peptídeo-MHC e moléculas coestimulatórias à superfície de nanopartículas magnéticas para formar nanopartículas Artificial células apresentadoras. Use um dos três métodos diferentes, dependendo do tamanho de partícula e aplicação.

Nota: Um número de diferentes técnicas pode ser usado para conjugar as proteínas na superfície das partículas. Neste documento, que são descritas 3 abordagens distintas: partículas amina-revestidas (passo 2.1), N-Hidroxisuccinimida (NHS)-partículas revestidas (passo 2.2) e partículas biotin antirevestido (passo 2.3). Estes processos também têm sido descritos em detalhe na seção de métodos de dois trabalhos publicados6,7. Execute todas as etapas em uma coifa de biossegurança com soluções estéreis para manter a esterilidade do estoque aAPC partículas.

  1. Casaco antígeno-específicas e estimulatórios sinais para partículas magnéticas revestidas amina (Figura 2). Este processo é descrito por 100 nm, nanopartículas superparamagnético amina-revestido.
    Nota: Protocolos detalhados para anexar o anticorpo na superfície de uma partícula revestido de amina podem ser encontrados em https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, onde o Technote 201 descreve como a thiolate anticorpos e conjugado para maleimide funcionalizar partículas e 202 descrever o processo necessário para funcionalizar partículas amina-revestidas com grupos funcionais de maleimide. Aqui, destacam-se apenas de pequenas modificações para o MHC-Ig e sinais co-estimulatória ligados a essas partículas.
    1. Thiolate os anticorpos com reagente do Traut (Technote 201).
      1. Prepare um 10x buffer de PBS-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido (0,1 M PBS e 100 mM de EDTA). Adicionar o 10x tampão PBS-EDTA para os anticorpos em um 01:10 proporção para evitar a oxidação de tióis grátis adicionados aos anticorpos.
      2. Adicionar 20 excesso molar do reagente do Traut (2-iminothiolane) ao anticorpo e incubar durante 2 h à temperatura ambiente com a mistura. Medir reagente do Traut (pó seco) dentro de uma coifa de químicos para evitar respiração como converte grupos amina para grupos tiol.
      3. Lave muito bem com tampão PBS-EDTA 3 vezes usando um concentrador centrífugo com um 50 kDa MWCO 1x e siga as instruções do fabricante, concentrando-se até um volume final de 500 µ l. medir a concentração da solução anticorpo usando um Espectrofotómetro.
    2. Converter os grupos funcionais amina nas nanopartículas magnéticas para grupos de maleimide usando sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclo-hexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC, Technote 202).
      1. Adicionar o 10x tampão PBS-EDTA para os anticorpos em um 01:10 relação às partículas.
      2. Dissolva em água desionizada e vórtice Sulfo-SMCC para Ressuspender em uma concentração de 1 mg/mL. Medir o Sulfo-SMCC (pó seco) dentro de uma coifa de químicos para evitar respiração como converte grupos amina para grupos de maleimide.
      3. Adicione 0,016 nmol da solução Sulfo-SMCC para cada milímetro quadrado de superfície das partículas. Para 1 mg de 100 partículas nm, use 0,3 mg de Sulfo-SMCC. Deixe reagir por 1,5 h em temperatura ambiente.
      4. Lavar as partículas com tampão PBS-EDTA 3 vezes usando um campo magnético com uma coluna magnética 1x e Resuspenda em 500 µ l de tampão PBS-EDTA 1x.
        Nota: Se utilizar partículas menores do que 200 nm, tais como partículas de 100 nm descritos neste documento, provavelmente os ímãs permanentes não será poderosos o suficiente para puxar as partículas para lavagem ou efeitos de concentração. Assim, para lavar as partículas menores, use uma coluna magnética composta de esferas ferromagnéticas para amplificar o campo magnético.
    3. Partículas maleimide-acrescida de reagir com anticorpos thiolated (nota técnica 201).
      1. Adicionar as partículas a um frasco de cintilação de vidro, adicionar uma barra de agitação magnética-mini, coloque apenas uma polegada acima de uma placa de agitação magnética e induzir magnética mistura da solução de partícula.
      2. Para a solução de mistura, adicione gota a gota os anticorpos thiolated (0,5 mg de anticorpo para cada 1 mg de partículas). Permita a reagir durante a noite em temperatura ambiente.
      3. Lave com o tampão PBS 1x, 3 vezes usando um campo magnético e Resuspenda em 500 µ l de PBS 1x. Rotular e armazenar a 4 ° C por até 6 meses.
        Nota: Eficiência de conjugação de máxima ocorre quando partículas maleimide-acrescida imediatamente são misturadas com proteína de thiolated.
  2. Casaco antígeno-específicas e estimulatórios sinais para partículas magnéticas NHS-revestido (Figura 3). Este processo é descrito por 200 nm, nanopartículas superparamagnético NHS-revestido.
    1. Prepare a ressuspensão buffer, buffer de têmpera e buffer de armazenamento. O buffer de ressuspensão é 25mm 2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico (MES) com 0.01% Tween 20 ajustado ao pH 6.0. O buffer de têmpera é uma solução de 100 mM de Tris-HCl pH 7,4. O buffer de armazenamento é uma solução de 10 mM PBS e 0,01% Tween em pH 7,4.
    2. Resuspenda as partículas liofilizadas em 1 mL de tampão de ressuspensão. Vórtice vigorosamente durante pelo menos 15 min até agregados não são visíveis.
    3. Coloque as partículas magnéticas num suporte magnético para remover o sobrenadante, resuspenda com 0,5 mL de tampão de ressuspensão e transferir para um frasco de cintilação. Vórtice até agregados não são visíveis.
    4. Adicione 0,1 mg de proteína total por 1 mg de ressuspensa partículas. Vórtice de misturar e reagem à temperatura ambiente para 2,5 h enquanto mistura.
    5. Adicionar 0,1 mL de tampão que extingue e reagem à temperatura ambiente por 30 min, enquanto mistura.
    6. Coloque o frasco de cintilação num suporte magnético e lavar as partículas. Espere até que o sobrenadante é claro para remover. Remover as partículas do suporte magnético, adicionar 1 mL de tampão de ressuspensão e vórtice até agregados não são visíveis. Repetir este processo três vezes e ressuspender as partículas em 1 mL de tampão de ressuspensão. Armazene as partículas a 4 ° C por até 6 meses.
  3. Casaco sinais estimulatórios e antígeno-específicas para partículas magnéticas biotin antirevestido (Figura 4). Este processo é descrito por 50-100 nm, antibiotina superparamagnético nanopartículas.
    1. Biotinylate MHC-Ig ou moléculas coestimulatórias.
      1. Ajustar a concentração de proteína para 0,5-2 mg/mL de tampão PBS. Resuspenda sulfo-NHS-biotina em uma concentração de 10 mg/mL em água desionizada e adicionar 20-fold molar em excesso para estimulatórios anticorpo. Incube a temperatura ambiente por 45 min.
      2. Lave muito bem com PBS 3 vezes usando um concentrador centrífugo com um 50 kDa MWCO, siga as instruções do fabricante, concentrando-se até um volume final de 500 µ l. medir a concentração da solução de anticorpo usando um espectrofotômetro.
    2. Conjugado biotinilado MHC-Ig e/ou sinais co-estimulatória para antibiotina nanopartículas. Para 500 µ l de estoque antipartículas biotina, adicionar 0,5 nmol de anticorpo estimulatório e incubar a 4 ° C durante a noite.
    3. Lave aAPC conjugados nanopartículas. Porque estas partículas são menores do que 200 nm, molhe uma coluna magnética e colocar num suporte magnético.
    4. Adicione a suspensão de partículas/proteína para a coluna. Permitir que todas as proteínas/partículas completamente inserir a coluna.
    5. Lavar, adicionando 0,5 mL de PBS três vezes para a coluna.
    6. Eluir removendo a coluna do suporte magnético, adicionar 0,5 mL de PBS para a coluna, e usando o êmbolo, eliminar a partícula aAPCs dentro de um frasco de cintilação do vidro. Armazenar as partículas a 4 ° C por até 6 meses.
      Nota: As partículas são estáveis a 4 ° C (não devem ser congelados) por até 6 meses. Temperaturas mais altas diminuem a funcionalidade das partículas e uma agregação de partículas foram observadas (dados não mostrados). Não manter em temperatura ambiente por longos períodos de tempo como isto diminui significativamente a vida útil das partículas.

3. caracteriza o conteúdo de proteína na Artificial apresentadoras de nanopartículas de célula usando a pesquisa de anticorpos fluorescentes.

Nota: Este é um controle de qualidade útil da produzido artificial células apresentadoras de. Além disso, a quantidade de sinal estimulatório é usada para produzir doses equivalentes aAPC em lotes e vários tipos de aAPC (EG., tamanhos diferentes).

  1. Medir a concentração de partículas de aAPCs revestido.
    1. Use unconjugated partículas da solução-mãe e fazer uma titulação de dose de 1:2 em uma solução de PBS através de uma placa de cultura de tecido 96 poços fundo chato com 100 µ l por bem.
    2. Leia as partículas na leitura de placa espectrofotómetro a 405 nm para criar uma curva padrão de uma concentração de partículas conhecidas.
    3. Tirar uma amostra da aAPCs conjugados, diluído em PBS, para um volume total de 100 µ l e ler sobre o Espectrofotômetro.
  2. Remover uma amostra de aAPCs fabricados e mancha com anticorpos fluorescentes.
    1. Para calcular quanto amostra para remover, estime o número de anticorpos na superfície da partícula.
      Nota: Estas técnicas, suponha que uma densidade de cerca de 1000 µm/anticorpos2 de área de superfície de partícula. Para ser capaz de detectar a fluorescência, requer cerca de 1011 MHC-Ig ou moléculas CD28 totais por teste fluorescente.
    2. Trazer o volume total de aAPCs até 100 µ l de PBS, adicionar os anticorpos de coloração em uma diluição de 1: 100 e incubar durante 1 h a 4 ° C.
      Nota: Anticorpos exemplo utilizados com sucesso são FITC Conjugado anti rato rato Ig λ1, λ2 e λ3 cadeia leve, clone R26 46 para detectar MHC-Ig e rato de conjugado FITC anti armênio/Syrian hamster IgG, clonagem G192-1, para detectar o anti-rato CD28.
  3. Lavar as partículas e lê a fluorescência em um leitor de placa fluorescente.
    1. Magneticamente lave (como descrito na etapa 2), as frações manchado aAPC três vezes com 0,5 mL de PBS.
    2. Eluir a aAPCs lavados com 0,5 mL de PBS.
    3. Adicione 100 µ l da aAPCs eluted para uma placa de 96 poços fundo chato ler a concentração usando a absorvância como passo 3.1.
    4. Pegue o restante µ l 400, dividido em alíquotas de 2 a 200 µ l e adicionar dois poços em um prato preto, poliestireno de 96 poços, fundo chato. Titula-se na proporção de 1:2 para baixo a placa tomando 100 µ l da solução e mistura com o poço próximo que tem 100 µ l de PBS em cada bem, pelo menos quatro vezes.
      Nota: Médio múltiplo Replica da medição para reduzir o ruído na medição.
    5. No mesmo prato preto 96 poços, fazer uma curva padrão do anticorpo fluorescente usado para manchar, adicionando-o no 1: 200 em um poço com 200 µ l de PBS e titulada para baixo na proporção de 1:2 para pelo menos 12 poços.
    6. Depois de tanto aAPC e fluorescentes anticorpos estão na placa, ler a placa com um leitor de placa fluorescente.
  4. Calcule a quantidade de proteína por partícula. Determinar a concentração de anticorpos, comparando os valores para a curva padrão, onde a concentração de anticorpos é conhecida, assumir uma proporção de 1:1 de coloração anticorpos detectados anticorpos. Em seguida, dividindo esta concentração de anticorpos detectados com a concentração de partículas determinado pelo ensaio de absorvância dará o número de anticorpos por partícula.

4. enriquece o antígeno-específicos CD8 + células T com nanopartículas preparados artificiais células apresentadoras.

  1. Isole as células T CD8 +.
    1. Eutanásia dos animais pela exposição ao isoflurano seguido por deslocamento cervical.
    2. Remover o baço e linfonodos de camundongos C57BL/6j de sua e coloque em uma solução de PBS. Macerar os órgãos e eluir as células através de um filtro de célula de µm 70 estéril com lavagens frequentes de PBS.
    3. Para eliminar as células não - CD8 + T, use um kit de isolamento de célula de CD8 + T não-sensível ao toque e siga as instruções do fabricante.
      Nota: Cada condição de antígeno requer pelo menos 3 x 106 células de CD8 + T.
  2. Adicione a aAPCs de nanopartículas para ligar as células T CD8 +.
    1. Após o isolamento, concentre-se para um volume de 100 µ l de PBS com 0,5% albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA.
    2. Determinar o número de aAPCs adicionar pelo cálculo com base na relação de 1011 aAPC-limite, peptídeo carregado MHC-Ig para cada 10 células T CD8 + de6 .
    3. Incubar a aAPC partículas e células T CD8 + de 1 h a 4 ° C, com uma mistura contínua em um poliestireno estéril 5 mL tubo de fundo redondo.
  3. Prepare a mídia completada e fator de crescimento de células T (TCGF) para eluir, cultura de células T CD8 +.
    1. Para a mídia completada, suplemento completo RPMI 1640 mídia (com glutamina) com 1 x não aminoácidos essenciais, piruvato de sódio de 1 mM, 0.4 x solução de vitamina, 92 µM 2-Mercaptoetanol, 10 µM ciprofloxacina e 10% de soro fetal bovino (FBS).
    2. Para fazer o TCGF, seguir os protocolos já estabelecidos e referenciado aqui9.
      Nota: TCGF é um cocktail in-house de citocinas imunes humanas que é essenciais para fornecer células T com sinais de estimulação adicional necessários para crescer. TCGF poderia ser trocado por conhecidos de célula T estimulatórios citocinas como Il-2, IL-7, ou IL-15; no entanto, cada um pode polarizar a resposta das células T em conformidade. O protocolo descrito neste documento não foi otimizado com esses coquetéis; assim, outras técnicas devem ser consultadas para as concentrações e combinações se TCGF não é usado com exemplos listados10,11.
  4. Lave e enriquecer a aAPC e mistura de células T CD8 +.
    1. Lave a aAPCs partículas magnéticas conforme descrito na etapa 2. No entanto, lavar primeiro usando o tampão PBS com 0,5% de BSA e 2 mM EDTA, segundo usando suplementado mídia e terceiro usando completados mídia com 1% TCGF.
    2. Eluir aAPCs e enriquecido as células T CD8 + em 500 µ l de mídia complementada com 1% TCGF.
    3. Contar as células usando um hemocytometer e a placa em um prato fundo U 96 em 160 µ l por alvéolo de mídia complementado com 1% TCGF na concentração de 2,5 x 105 T CD8 + células/mL.
    4. Se isolando usando aAPCs com apenas peptídeo carregado MHC-Ig na superfície (sem sinais co-estimulatória), em seguida completa passo 4.5. Se isolando usando aAPCs com ambos MHC-Ig peptídeo-carregado com os sinais de superfície e co-estimulatória, prossiga para o passo 5.
  5. Adicione as partículas magnéticas revestidas com sinais co-estimulatória na superfície para a fração enriquecida e adicione um campo magnético para cluster co os sinais estimulatórios na superfície das células T.
    1. Para as frações enriquecidas, adicionar um equimolar (ou maior dependendo da aplicação-consulte a seção sobre aAPC Propriedades para controle) de anticorpos estimuladores para o número de peptídeo-carregado MHC-Ig sobre a partícula.
    2. Permitir co-estimulatória partículas magnéticas vincular a enriquecido células CD8 + T para 1 h a 4 ° C.
    3. Adicione campo magnético colocando a placa de cultura entre dois ímãs de neodímio N52 disco de 1,9 cm (0,75 polegadas) de comprimento.
      Nota: N52 ímans em forma de disco têm um campo extremamente forte. Cuidado deve ser tomado tanto para armazená-los com espaçadores entre ímãs, como é difícil remover um do outro e quando colocá-los sobre as placas de cultura. Para minimizar os ímãs de degola para os componentes metálicos da incubadora, colocá-los em recipientes de isopor 50 mL tubo cônico no fundo e o topo.

5. expandir e detectar antígeno-específicos CD8 + células T com nanopartículas preparados artificiais células apresentadoras.

  1. Adicionar a placa bem fundo U 96 com aAPCs e células T CD8 + em um umidificado 5% CO2, incubadora 37 ° C por 3 dias. No dia 3, alimente as células com 80 µ l por alvéolo de mídia complementado com 2% TCGF e lugar para a incubadora até dia 7.
  2. No dia 7, colhem as células estimuladas em um 5 mL redonda tubo inferior para a contagem.
  3. Uma vez que todos da solução é colhida, spin-down as células colhidas para Ressuspender em 0,5 mL de PBS com 0,05% de azida de sódio e 2% FBS. Contagem de células viáveis por coloração com azul de trypan e contando com um hemocytometer.
  4. Retire 50.000-500.000 células contadas em dois novos 5ml redondo fundo tubos para coloração de antígeno-específicas. Um tubo será usado para a mancha de peptídeo-MHC cognato, e o outro tubo será usado para a mancha não-cognato para determinar a coloração de fundo.
  5. Adicionar 1 µ g de biotinilado MHC-Ig (usando a técnica descrita na etapa 2) para o respectivo cognato e tubos não-cognato em 100 µ l de PBS com 0,05% de azida de sódio e 2% FBS com allophycocyanin (APC)-anti-rato de rato conjugado CD8a, clone 53-6,7 (factor de diluição de 1: 100) para 1 h a 4 ° C.
  6. Adicionar streptavidin secundário e viver morta mancha. Lave em excesso biotinilado MHC-Ig com PBS através de centrifugação. Então manchar todas as amostras com uma relação de 1:350 de ficoeritrina (PE)-rotulado relação streptavidin e 1: 1000 de uma mancha de célula morta verde fixável ao vivo/morto por 15 min a 4 ° C.
  7. Ler todas as amostras em um citômetro de fluxo para determinar a especificidade e o número de células antígeno-específicas.
    1. Desbotar secundária em excesso e ao vivo/morto mancha por centrifugação e ressuspender com 150 µ l de tampão PBS com 0,05% de azida de sódio e 2% FBS para ler sobre um citômetro de fluxo.
  8. Determine o número e % de células antígeno-específicas com o software de análise de dados.
    1. Para determinar a porcentagem de células antígeno-específicas, utilize as seguintes portas na respectiva ordem ao vivo + + linfócitos (dispersão direta por dispersão de lado), CD8 + e dímero +. Determine o dímero + portão, comparando o não-cognato à mancha cognata.
    2. Determine a porcentagem de células antígeno-específicas em uma amostra subtraindo-se o percentual de dímero + da mancha MHC-Ig cognata da mancha não-cognato MHC-Ig.
    3. Usando esta percentagem de células antígeno-específicas, multiplicá-lo pelo número de células contadas, rendendo o número de células antígeno-específicas resultantes do enriquecimento e expansão.
      Nota: A compensação terá que ser instalada sobre o citômetro de fluxo desde que há sobreposição espectral com o fluorophores usado neste painel.

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Representative Results

Para completar um enriquecimento sucesso e expansão das células T antígeno-específicos, o peptídeo-carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias devem ser anexadas com sucesso para a partícula aAPC. Baseado nos 3 métodos de fixação de partícula, nós fornecemos alguns dados representativos para um resultado do processo de conjugação bem sucedida (Figura 5a). Com efeito, se a densidade de ligante é muito baixa, então não haverá estimulação eficaz de células T CD8 + de antígeno-específicas onde isso ocorre em torno de espaçamento linear entre os ligantes acima de 100 nm em nossa experiência (Figura 5b)7.

Além de ambos leituras quantitativa de anticorpos fluorescentes e expansões de células T CD8 + transgénicos, aAPCs nanopartículas pode ser verificada para controle de qualidade por dopagem no cognatas células transgénicas de CD8 + T antígeno-específicas. Isso pode ser feito por isolar as células T CD8 + de um rato geneticamente modificado como um rato Pmel que tem células de CD8 + T antígeno-específicas gp100 específicos e doping em um fundo de B6 na proporção de 1: 1000. Contagem e coloração antes e depois de enriquecimento permitem a enumeração do enriquecimento de dobra (Figura 6a) e percentual de recuperação (Figura 6b)6. Nestes resultados representativos, demonstramos que sinal-1 somente aAPCs fornecer o mais eficiente enriquecimento (quase 10 vezes) e cerca de 80% célula de recuperação, que é melhorada em relação a aAPCs tradicional sinal 1 e 2 que tenham específico anti-CD28 sobre a partícula tão bem.

Uma vez aAPCs partículas foram suficientemente caracterizados e qualidade controlada, em seguida, eles podem ser usados no enriquecimento e expansão de raras células de CD8 + T antígeno-específicos de sua ratos. Para resultados precisos, é essencial dispor de reagentes de funcional de detecção, tais como o dímero biotinilado. O controle de qualidade do dímero biotinilado também pode ser feito em células T CD8 + transgénicas para verificar a coloração. Resultados representativos, mostram a coloração positiva com células T CD8 + de gp100 específicos com as células T CD8 + B6 como um controle de fundo (Figura 7). A Figura 7 demonstra também que, se houver demasiado elevado dos níveis do dímero biotinilado e, em seguida, diminuirá sua avidez como vai competir com si e exibem ligação mono-valente.

Após o enriquecimento e a expansão de células T CD8 + de rato durante sete dias, se poderia esperar entre 5 e 50 por cento células de CD8 + T antígeno-específicas, com quase 20.000 a 200.000 células de CD8 + T antígeno-específicas depois de começar com 5 x 106 células CD8 + T por condição (Figura 8) 6. especificamente, quando a coloração para células de CD8 + T antígeno-específicos, é fundamental conhecer a fundo a coloração do dímero biotinilado, onde neste caso foi 4,15%; qualquer percentagem inferior isto da mancha cognata é considerada um resultado negativo (figura 8a). Além disso, este mostrará onde desenhar os portões de citometria de fluxo para determinar a percentagem efectiva de células T CD8 + de antígeno-específicas. Isto é importante em casos onde as células T CD8 + de antígeno-específicos não têm populações distintas (como mostrado na figura 8a) mas podem aparecer como um esfregaço amplo.

O mesmo processo pode ser usado para isolar e estimular células humanas de CD8 + T antígeno-específicas. Controle de qualidade e resultados semelhantes devem ser vistos onde aumentos substanciais em percentagens e números de células T CD8 + de antígeno-específicas são observados após apenas uma semana de expansão após o enriquecimento (Figura 9)5.

Figure 1
Figura 1 : Esquemática do processo de enriquecimento de antígeno-específicas e expansão usando células apresentadoras artificial de nanopartículas. Primeiro, complete um isolamento de células T CD8 + não-sensível ao toque. Em seguida, adicione aAPCs nanopartículas para as células T CD8 +. Enriquecer com um campo magnético, cultura e estimular com aAPCs. Finalmente, detecta enriquecidas e ampliadas as células CD8 + T antígeno-específicas por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: esquemático para conjugação do peptide-carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias à superfície das partículas magnéticas revestidas amina. Brevemente, reticulador Sulfo-SMCC é usado para funcionalizar a superfície de partículas magnéticas com grupos funcionais de maleimide. MHC-Ig e moléculas coestimulatórias são simultaneamente acrescidas com reagentes do Traut para produzir grupos funcionais de tiol. As partículas ativadas e sinais de proteína são reagiu juntos e depois lavados para produzir o antígeno-específicas artificial apresentadoras célula magnética nanopartículas. Esta figura foi modificada em material suplementar de publicação do nosso laboratório em Nano letras7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: esquemático para conjugação do peptide-carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias à superfície das partículas magnéticas revestidas NHS. Brevemente, as partículas de NHS-revestido são reagiu juntamente com peptídeo carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias e depois lavadas para produzir o antígeno-específicas artificial apresentadoras célula magnética nanopartículas. Esta figura foi modificada em material suplementar de publicação do nosso laboratório em Nano letras7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Esquemático para conjugação do peptide-carregado MHC-Ig e moléculas coestimulatórias à superfície das partículas magnéticas biotin antirevestido. MHC-Ig e moléculas coestimulatórias são acrescidas com NHS-biotina para produzir grupos funcionais de biotina. Em seguida, as partículas do biotin antirevestido são reagiu juntamente com o MHC-Ig-peptídeo carregado funcionalizado e moléculas coestimulatórias. Posteriormente, essas partículas são lavadas para produzir o antígeno-específicas artificial apresentadoras célula magnética nanopartículas. Esta figura foi modificada em material suplementar de publicação do nosso laboratório em Nano letras7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Conjugação de eficiência é fundamental para o enriquecimento e a expansão de células T de antígeno-específicas. (um) base de dados representante para eficiência de conjugação com os métodos de conjugação de três para três diferentes partículas magnéticas descritas no documento: partículas revestidas de amina, partículas revestidas de NHS e partículas biotin antirevestido. Cada ponto de dados representa uma técnica de preparação de partículas diferentes e barras de erro representam no MEV mostrou (b) como a densidade de ligante afeta transgénica estimulação CD8 + células T, onde a densidade de ligante é representada como espaçamento linear entre ligantes em nanômetros em 600 nm e 50 nm aAPCs (n = 5 e barras de erro representam no MEV mostrou). Este valor foi modificado desde a publicação do nosso laboratório em Nano letras7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Controle de qualidade de enriquecimento aAPC. Células de T CD8 + específicas gp100 Pmel transgénicas foram dopadas na proporção de 1: 1000 em células T CD8 + B6-sua. (a) prega enriquecimento foi medido utilizando citometria de fluxo após o enriquecimento manchando o marcador de congenic Thy1.1 e CD8. Aqui foi uma comparação entre partículas único sinal 1 ou Db-Ig carregado com gp100, tradicional sinal 1 e 2 partículas ou Db-Ig carregado com gp100 anti-CD28 e partículas não-cognato sinal 1 e 2. (b) células também foram contadas antes e depois de medir a recuperação de células por cada um dos métodos. Dados representam três experimentos independentes e representam barras de erro no MEV mostrou dados combinados foi medido por One-Way ANOVA com pós-teste de Tukey (*p< 0.05, * *p< 0,01). Este valor foi modificado desde a publicação do nosso laboratório em Nano letras6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Controle de qualidade do dímero biotinilado. As células T CD8 + de Gp100 específicos foram isoladas a partir de um rato Pmel transgénico e manchado em 100 µ l de PBS com três concentrações de biotinilado Db-Ig carregado com gp100 e APC anti-CD8a, usando sua células-T CD8 + B6 como controlo negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8 : Enriquecimento e expansão de células T CD8 + de antígeno-específicas. As células T CD8 + de sua B6 foram enriquecidas com qualquer sinal 1 só (carregado com TRP2 Kb-Ig) ou sinal de 1 e 2 (Kb-Ig carregado com TRP2 e anti-CD28, conjugada com a superfície da partícula). Sinal 2 Então foi adicionado para a fração enriquecida de sinal 1 única aAPCs e todas as células foram cultivadas por 7 dias. (a) células CD8 + T estão manchadas e fechado sobre uma mancha fluorescente ao vivo/morto, em seguida, gated CD8 + e KbTRP2 + e em comparação com um não-cognato Kb-Ig para detectar células de CD8 + T antígeno-específicas. (b) porcentagem e (c) o número de células T CD8 + específicas TRP2, portanto, pode ser determinado, onde poderia ser detectado maior percentual e número de células T CD8 + de antígeno-específicas de abordagem única de enriquecimento o sinal 1 (n = 7, barras de erro representam o desvio-padrão, teste t pareado bicaudal *p < 0.05, * *p < 0,01). Este valor foi modificado desde a publicação do nosso laboratório em Nano letras6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9 : Enriquecimento e expansão de células CD8 + T antígeno-específicas de. (a) representante fluxo cytometry parcelas no dia 0 antes do enriquecimento e dia 7 mostram os efeitos dramáticos de enriquecimento e expansão de células CD8 + T antígeno-específicas de doadores saudáveis com nanopartículas tradicional aAPCs onde A2-Ig carregado com NY-ESO1 e A2-Ig carregado com MART1 antígenos são mostrados. (b) isto gera altas porcentagens (~ 10-20%) e números (0,5-1 x 106) de células T CD8 + de antígeno-específicas por dia, 7 (n = 3 de doadores independentes, barras de erro representam no MEV mostrou). Este valor foi modificado desde a publicação do nosso laboratório na ACS Nano5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nós criamos uma tecnologia de isolamento romance celular de T antígeno-específicos com base em nanopartículas artificial células apresentadoras (aAPCs). Nanopartículas aAPCs peptídeo-carregou MHC na superfície que permite a ligação de pilha de T antígeno-específicas e ativação ao lado de ativação co-estimulatória. aAPCs também são paramagnéticos e assim pode ser usados para enriquecer as células T antígeno-específicas raras usando um campo magnético. Nós temos otimizado e estudou Propriedades de chave de nanopartículas de tamanho, densidade de ligante e escolha de ligante e sua influência sobre a vinculação, enriquecimento, ativação e enriquecimento de célula (Arquivo complementar 1-caixa 1).

Assim, os resultados de procedimento de enriquecimento e expansão em expansão de células CD8 + T antígeno-específicos de vários thousand-fold, produzindo antígeno-específicas percentagens tão elevado quanto 60% e, pode ser usados em configurações de murino e humanas (Arquivo complementar 2-caixa 2 ). Tais números elevados e percentagens das células T antígeno-específicos permitem a caracterização das respostas imunes para doenças (ex., câncer, doença auto-imune, etc), permitem a descoberta de novos alvos imunes e mecanismos e oferecer a oportunidade de ser usado em imunoterapia adotivos. Um exemplo de uma aplicação específica é sequenciar o tumor do paciente, identificar mutações, localizar potenciais MHC-ligantes de sequências de mutante, produzir aAPCs com esses antígenos do candidato principal, e então utilizar o aAPCs para determinar se o paciente tem qualquer neoantigens de tumor-específicas.

Com efeito, as limitações metodológicas foram uma barreira fundamental para estudar e identificar respostas antígeno-específicas. As técnicas atuais a exigir procedimentos substancial tempo e trabalho-intensivo, (b) presente dificuldade em manter linhas celulares tais como a necessidade de coletar células dendríticas autólogas, (c) exigem semanas de expansão de células T antes da obtenção de resultados, (d) resultado em especificidades baixas (1-2%) e baixo número de antígeno-específicos CD8 + T células, (e) muitas vezes com sinal de fundo significativo e células (f) o CD8 + T que são produzidas muitas vezes não podem ser utilizados ou estudados em ensaios mais. Um método necessita de imunização com antígeno antes ELISPOT para caracterizar a presença de antígeno-específicas resposta14,15,16,17. Outro método utilizando plasmídeo de expressão gênica em tandem-mini para transfect células apresentadoras requer multiplexação tetrâmero manchas com citocinas + respostas como relato para aumentar a sensibilidade de18. Nem peptídeo pulsante endógena células apresentadoras na cultura em vitro , só resulta em um aumento de 0,5% de especificidade do antígeno15.

Nossa abordagem resolve estas limitações metodológicas e, portanto, pode atuar como uma ferramenta de diagnóstica e terapêutica. Passos críticos para garantir o enriquecimento de células T CD8 + antígeno-específicas e expansão são para 1) efetivamente carregar MHC-Ig com antígeno de peptídeo 2) conjugado sinais estimulatórios à superfície de nanopartículas, 3) vincular as partículas de células T, 4) enriquecer as células vinculadas a as nanopartículas com um campo magnético, 5) expandir pilhas de T eluted ligados a nanopartículas em cultura e 6) detectar MHC de células no dia 7 com biotinilado, peptídeo-carregado de CD8 + T antígeno-específicas.

Os principais problemas que emergem no protocolo de enriquecimento e expansão surgem de produção inadequada ou reagentes de detecção expirado ou nanopartículas aAPCs. Certifique-se de que o dímero biotinilado pode manchar as células de CD8 + T antígeno-específicos com testes em células transgénicas de CD8 + T antígeno-específicas. Se o peptídeo-MHC-Ig não tem um modelo de rato transgénico correspondente, pode ser útil carregar um peptídeo de controlo positivo e teste o controle positivo para verificar o carregamento. No entanto, alguns peptídeos não podem carregar para o MHC-Ig; Isto pode ser simulado com algoritmos de MHC-carregamento como Net-MHC, ou experimentalmente, com ADMs-célula com base em ensaios13. estabilidade de partícula aAPC pode diminuir após 6 meses, então se houver alguma variabilidade nos resultados de enriquecimento e expansão e, em seguida, outro fluorescente ensaio de leitor de placa pode ser realizado para verificar a estabilidade.

Em um futuro trabalho, pretendemos estender as capacidades, amplitude e profundidade do ensaio. Estamos trabalhando no aumento a taxa de transferência e a capacidade de multiplex com vários antígenos investigados em uma vez em um formato de placa de 96 poços. Atualmente, a principal limitação é que apenas alguns antígenos podem ser investigados simultaneamente. Estamos trabalhando esta investigando como o tamanho da partícula aAPC e ligante massa volúmica influencia o enriquecimento. Além disso, estamos a analisar como diferentes célula composições efeito T CD8 + células expansão dentro da cultura. Finalmente, pretendemos imitar essa tecnologia dentro de MHC-classe II para ser capaz de enriquecer e expandir células de CD4 + T antígeno-específicas.

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Disclosures

Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: sob um acordo de licenciamento entre NexImmune e The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck tem direito a uma parte dos royalties recebidos pela Universidade sobre as vendas dos produtos descritos neste artigo. Ele também foi dos fundadores da NexImmune e é dono de capital na empresa. Ele serve como um membro do Conselho de administração e Conselho Consultivo Científico do NexImmune. Os termos destas disposições foram revistos e aprovados pela The Johns Hopkins University, em conformidade com suas políticas de conflito de interesses.

Acknowledgments

J.W.H. obrigado NIH câncer nanotecnologia centro de treinamento no Instituto Johns Hopkins para nanobiotecnologia, a nacional Science Foundation Graduate bolsa de pesquisa (DGE-1232825) e a Fundação de arcos de apoio à comunhão. Este trabalho foi financiado pelo apoio do National Institutes of Health (R21 de P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de inovação TEDCO/Maryland e a Fundação de Coulter (JPS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein BD Biosciences 551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig BD Biosciences 551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein BD Biosciences 550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000 GE Life Sciences 28932257
Purified Human Beta 2 Microglobulin Bio-Rad PHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles Micromod 79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm Ocean Nanotech SN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPure Miltenyi 130-105-637
EZ-Link NHS-Biotin ThermoFisher 20217
Sulfo-SMCC Crosslinker  ProteoChem c1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochloride Sigma-Aldrich I6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene Corning 3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46   BD Biosciences 553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1 BD Biosciences 554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice Jackson Laboratory 005023
C57BL/6J (B6 wildtype) mice Jackson Laboratory 000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse Miltenyi 130-104-075
MS Columns Miltenyi 130-042-201
LS Columns Miltenyi 130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE Biolegend 405203
N52 disk magnets of 0.75 inches  K&J Magnetics DX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 Biolegend 100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation  ThermoFisher L-34969

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References

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Engenharia edição 141 nanopartículas enriquecimento magnético artificiais células apresentadoras de antígeno células T imunoterapia câncer enriquecimento célula rara expansão de células T terapia adotiva de célula T Neoantigen immunoengineering bioengenharia
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Hickey, J. W., Schneck, J. P. Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles. J. Vis. Exp. (141), e58640, doi:10.3791/58640 (2018).

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