Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक microinjection पद्धति है कि हम मानकीकृत किया है और कई वर्षों के लिए इस्तेमाल के लिए न्यूक्लिक एसिड की विशिष्ट मात्रा में मच्छरों और घर मक्खियों के hemolymph सीधे देने के लिए । इस प्रोटोकॉल न्यूनतम इंजेक्शन मृत्यु दर में परिणाम और खुराक fecundity की माप संबंधित अनुमति देता है.
Abstract
सिंथेटिक dsRNAs, आरएनए हस्तक्षेप प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया, खुराक निर्भर phenotypic प्रभाव हो सकता है. ये प्रभाव यदि dsRNAs एक गैर-मात्रात्मक विधि का उपयोग कर वितरित कर रहे हैं को परिभाषित करने के लिए कठिन हैं । न्यूक्लिक एसिड या अन्य रसायनों की ज्ञात मात्रा का सटीक वितरण यौगिक परीक्षण किया जा रहा की प्रभावकारिता को मापने के लिए और यौगिकों के बीच विश्वसनीय तुलना की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है.
यहां हम एक reproducible, मात्रात्मक microinjection प्रोटोकॉल है कि dsRNA की विशिष्ट खुराक के सटीक वितरण सुनिश्चित करता है, आम तौर पर इंजेक्शन चोट से प्रेरित मृत्यु दर को कम करने प्रदान करते हैं । इन संशोधनों Rhodamine बी, एक स्नातक इंजेक्शन सुई के अलावा शामिल हैं, और एक बेहतर वसूली विधि Isoe और कोलिंस से उधार लिया । इस विधि की अनुमति देता है खुराक प्रतिक्रियाओं की गणना और यौगिकों के बीच तुलना की सुविधा. इस विधि के संस्करण सफलतापूर्वक मच्छरों के तीन पीढ़ी पर इस्तेमाल किया गया है और साथ ही घर मक्खियों राइबोसोमल आरएनए टेप के जीन मुंह बंद करने से उत्पन्न fecundity में कमी का आकलन करने के लिए.
इस प्रोटोकॉल छोटे कीट microinjection की कई चुनौतियों को कम करने के लिए रणनीतियों प्रदान करता है । साथ में, dsRNAs के यांत्रिक वितरण दृश्य सत्यापन के साथ, वितरण के लिए प्रभावी स्थानों की पहचान, और एक पोस्ट इंजेक्शन वसूली अवधि के शामिल किए जाने के सटीक खुराक और कम चोट मृत्यु दर सुनिश्चित. इस प्रोटोकॉल भी fecundity पर प्रभाव के समान दृढ़ संकल्प के लिए एक oviposition परख का वर्णन ।
Introduction
छोटे न्यूक्लिक एसिड के रूप में, वयस्क dipterans करने के लिए Culicidae और Muscidae दोनों में चुनौतीपूर्ण साबित हो गया है, जैसे dsRNAs के मौखिक रूप से बांझपन का उत्पादन करने के लिए सूचित किया गया है (जब विशेष रूप से वयस्कों के परीक्षण में व्यक्त जीन लक्ष्यीकरण) और मृत्यु दर (जब लक्ष्यीकरण SNF7 और एक स्टेरॉयड रिसेप्टर coactivator) में लार्वा एडीज aegypti1,2 . लार्वा Musca domestica3में HSP70 को टारगेट करते समय मृत्युदर को भी देखा गया है । इस तरह के phenotypic प्रभाव, तथापि, चीनी भोजन में वयस्क Ae. aegypti को dsRNA खिलाने के बाद परिणाम नहीं है4,5।
Microinjection जब रोगज़नक़ों या न्यूक्लिक एसिड शुरू midgut दरकिनार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जिससे एक प्रणालीगत प्रतिक्रिया उत्प्रेरण5,6,7,8,9,10 . कई microinjection तकनीक मौजूद है, में घर से लेकर उपकरणों का उत्पादन किया है कि माइक्रोप्रोसेसर नियंत्रित इंजेक्टर कि स्वचालित मात्रा में प्रसव के लिए अनुमति के रूप में २.३ nL के लिए इंजेक्शन की मात्रा के दृश्य माप की आवश्यकता 5 , 9 , 10 , 11. आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) राइबोसोमल mRNAs लक्ष्यीकरण ट्रिगर्स, arthropods में डिंबग्रंथि के विकास में बाधा के रूप में विविध के रूप में मवेशी टिक Rhipicephalus microplus, मच्छरों एडीज aegypti और Culex pipiens, और घर उड़ Musca domestica5,9,12,13। इन अध्ययनों में, oviposition के विघटन की निगरानी inoculant की प्रभावकारिता का निर्धारण करने के लिए आवश्यक था के रूप में phenotype समाप्ति या संतान की कमी के रूप में प्रकट हो सकता है. इस multigenerational घातक phenotype का एक रूप है कि गैर के कई में एक महत्वपूर्ण और वांछित प्रभाव है Wolbachia-संक्रमित पुरुषों परिचय (यौन असंगति) और RNAi प्रेरित बांझपन की तरह पारंपरिक-5 ,9,14. दोनों मृत्यु दर और fecundity पर नज़र रखने निस्र्पक और अत्यधिक विशिष्ट के विकास के लिए आवश्यक है (स्वाभाविक रूप से रोगजनकों और/
इस प्रोटोकॉल दोनों वयस्क मच्छरों और घर मक्खियों के लिए विस्तृत microinjection तकनीक प्रस्तुत करता है; एक प्रक्रिया है कि अक्सर साहित्य में अच्छी तरह से वर्णित नहीं है । इसके अलावा, oviposition परख के तरीके पर्याप्त रूप से वयस्क dipterans पर dsRNA प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए वर्णित हैं । ये प्रोटोकॉल विशेष रूप से एडीज aegypti और Musca domestica के लिए विकसित किए गए थे लेकिन अन्य प्रजातियों के लिए संशोधित किया जा सकता है ।
Protocol
1. कीट तैयारी
- कई घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या सह2 के लिए 2 मिनट के जोखिम के द्वारा उंहें द्रुतशीतन द्वारा Anesthetize मच्छरों और फिर 4 ° c पर पकड़े इंजेक्शन से पहले । ठंड anesthetize 4 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों 2 \ u20123 एच इंजेक्शन से पहले । सुनिश्चित करें कि मच्छरों और मक्खियों के साथी अगर oviposition एक प्रतिक्रिया चर रहा है ।
नोट: मच्छर anesthetization विधि प्रजातियों और तनाव पर निर्भर करता है, जैसे, Culex बहुत जल्दी ठीक से ठंडा anesthetization से एडीज aegypti और इसलिए सह2 पछाड़ना बेहतर है । - बर्फ पर, ध्यान से चरण मच्छरों या मक्खियों नरम संदंश का उपयोग करके उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड पर उजागर करने के लिए ventrally ~ ०.५ सेमी के अलावा. मानक स्लाइड 6 मच्छरों प्रत्येक या 6-7 घर मक्खियों की दो पंक्तियों पकड़ कर सकते हैं । एक 1-1.5 सेमी की जगह छोड़ दिया है या मक्खी मच्छरों की स्पष्ट स्लाइड के सही अंत में और स्लाइड हैंडलिंग सहायता के लिए मक्खियों ।
- इंजेक्शन के लिए तैयार होने तक बड़े पेट्री व्यंजन में 4 डिग्री सेल्सियस पर मंचन कीड़ों की स्लाइड्स रखें ।
नोट: पेट्री डिश ढक्कन के माध्यम से एक छेद ड्रिलिंग जब कैपिंग हवा विस्थापन से परेशान किया जा रहा से कीड़ों को रोकने में मदद मिलेगी । डिश नीचे करने के लिए सुरक्षित कांच केशिकाओं के एक जोड़े पर स्लाइड रखने पेट्री डिश से हटाने में आसानी होगी ।
2. कीट इंजेक्शन
- Estep एट अल द्वारा वर्णित के रूप में dsRNA तैयार । 5 और Sanscrainte एट अल. 9. यदि संदूषणों से मुक्त, dsRNA २६० एनएम पर अवशोषण को मापने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग करके quantified जा सकता है और μg/एमएल में आरएनए एकाग्रता की गणना२६० × कमजोर कारक × ४० के रूप में ।
- सेट अप विदारक माइक्रोस्कोप और एक चिल टेबल या उथले बर्फ की बाल्टी पर microinjector को ठंडा-anesthetized मच्छरों और मक्खियों पर इंजेक्शन प्रदर्शन (कदम 1.1-1.3 और चित्रा 1) देखें ।
- खींचो ग्लास केशिकाओं सुई खींचने के साथ एक ठीक टिप करने के लिए (सेटिंग्स: हीटर = 15 इकाइयों, solenoid = 4 ए) ।
नोट: निर्माता के विवरणों के लिए सामग्री तालिका देखें. - निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक microinjector में केशिका सुई प्लेस और एक तेज बिंदु का उत्पादन करने के लिए संदंश की एक जोड़ी के साथ चुटकी द्वारा सुई टिप तोड़ ।
नोट: सुझाव सुई खोलने के आकार रहे हैं ~ १५० मच्छर के लिए µm और रहवास के लिए ~ २५० µm. - इच्छित वितरण वॉल्यूम के लिए microinjector सेट करें । Meniscus आंदोलन से ~ ५० nL aliquots आसानी से चौकस और मच्छर microinjections के लिए सिफारिश की है । यदि उपलब्ध हो, तेजी से इंजेक्शन सेटिंग्स सक्षम करें । भरने और nuclease-मुक्त पानी को खदेड़ने से सुई कुल्ला 3 बार ।
- एक एकाग्रता पर इंजेक्शन के लिए समाधान तैयार करें इस तरह कि 100 \ u2012150 nL मच्छरों के लिए वांछित खुराक प्रदान करेगा और ५०० nL घर मक्खियों के लिए वांछित खुराक प्रदान करेगा.
नोट: सुझाया प्रारंभिक खुराक: प्रत्येक मच्छरदानी के लिए 1 µ g और प्रत्येक रहवास 5,9के लिए 5 µ g. - मच्छरों के लिए वैकल्पिक रूप से, Rhodamine बी जोड़ें (दृश्य में सहायता करने के लिए) ३.० µ g/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में समाधान के लिए ।
नोट: डाई पेट में ventral सतह पर लगभग स्पष्ट छल्ली के माध्यम से इंजेक्शन के बाद अपने गुलाबी रंग से स्पष्ट रूप से दिखाई जाएगी/छाती चौराहे । - पिपेट 3-समाधान के 4 µ एल एक साफ सतह पर इंजेक्षन करने के लिए (जैसे आयल फिल्म के एक टुकड़े के रूप में) और किसी भी हवा में चूसने के बिना गिलास सुई में आकर्षित । दबाना बार जब तक तरल सुई से बांटना शुरू होता है और धीरे से बूंदों पोंछ एक नाजुक कार्य वाइपर के साथ बटन इंजेक्षन ।
नोट: microinjectors के कुछ मॉडलों backfilling सिरिंज की आवश्यकता होती है, जबकि सामग्री की तालिका में संदर्भित इंजेक्टर नहीं है । - एक अल्ट्रा ठीक बिंदु मार्कर का उपयोग करना, हैश अंक आकर्षित ~ 1 मिमी के अलावा तरल meniscus से सुई टांग करने के लिए शुरू । यह meniscus आंदोलन visualizing में सहायता और यह सुनिश्चित करें कि समाधान इंजेक्शन के दौरान मच्छर में प्रवेश किया है ।
- सर्द मेज या बर्फ (चित्रा 1) पर सुई के तहत मच्छरों या मक्खियों (के रूप में चरणों में तैयार 1.2-1.3) की स्लाइड सेट करें । सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप में देखने के क्षेत्र काफी व्यापक सुई में समाधान meniscus को देखने के लिए है ।
- मच्छरों के लिए, mesokatepisternum (चित्रा 2a) के मध्य एक तिहाई के साथ सुई संरेखित करें, और जबकि विपरीत पक्ष पर रखा संदंश के साथ सुई के खिलाफ मच्छर ब्रेस, धीरे सुई टिप के साथ छल्ली पंचर का उपयोग microinjector माइक्रोमीटर.
- घर मक्खियों के लिए, mesopleuron (चित्रा बी) के साथ सुई संरेखित करें और, जबकि सुई के खिलाफ मक्खी संभालो, धीरे सुई टिप के साथ छल्ली पंचर ।
- धीरे मच्छर या मक्खी शरीर में सुई स्लाइड जब तक टिप midline के माध्यम से पारित कर दिया है ।
नोट: सुई डालने भी उथले इंजेक्शन तरल में अक्सर परिणाम कीट से बाहर मनके (२.१५ कदम देखें) । - जबकि सुई में तरल meniscus के आंदोलन के लिए देख, दबाना इंजेक्शन बटन जब तक तरल की वांछित मात्रा में इंजेक्ट किया गया है । मच्छरों के लिए, अगर ५०.६ nL aliquots के लिए सेट, ~ १५० nL के लिए ~ १०० nL या 3x के लिए 2x दबाएं । घर मक्खियों के लिए, इंजेक्शन बटन दबाना जब तक ~ ५०० nL इंजेक्ट किया गया है (यानी, ४८३ 7X के लिए ६९ nL aliquots प्रेस nL के साथ).
- यदि meniscus कदम नहीं है, धीरे मच्छर स्लाइड या बंद सुई मक्खी जबकि meniscus आंदोलन के लिए देख रहे हैं । सुई हटाने पर छल्ली से बाहर इंजेक्शन समाधान मोतियों का एक हिस्सा है या अगर meniscus को स्थानांतरित करने के लिए विफल रहता है, इस इंजेक्शन सफल नहीं था के रूप में कीट त्यागें.
- स्थानांतरण सफलतापूर्वक 10-15 या घर के समूहों में मक्खी मच्छरों इंजेक्शन 5 के समूहों में साफ करने के लिए ३.५ ऑउंस पकड़े कप । tulle या जाल के साथ कवर और कमरे के तापमान पर ठीक हो ।
- मच्छरों और मक्खियों के बाद (1-2 ज) बरामद किया है, एक कपास 10% सुक्रोज समाधान के साथ लथपथ गेंद पर प्रत्येक होल्डिंग कप पलटना ।
नोट: एक चीनी भोजन10के लिए आसान पहुंच प्रदान करके अस्तित्व में सुक्रोज कपास एड्स के शीर्ष पर कप के उलटा । - इंजेक्शन समाधान के बीच २.५ कदम के रूप में कुल्ला सुई । जब इंजेक्शन किया, एक उचित sharps कंटेनर में इस्तेमाल किया सुई त्यागें ।
3. एडीज aegypti मृत्युदर और oviposition की परख
- इंजेक्शन के बाद तीन दिनों के लिए, 10% सुक्रोज के साथ मच्छरों प्रदान करने के लिए जारी है और दिख मृत मच्छरों की संख्या रिकॉर्ड ।
- एक ≤ 12 इंच कृत्रिम झिल्ली (जैसे कोलेजन सॉसेज आवरण के रूप में) ताजा रक्त के साथ भरें (यानी, एडीज aegyptiके लिए गोजातीय) और गर्म पानी में स्नान ६० ° c करने के लिए गर्मी ।
- संक्षेप में एक कागज तौलिया पर रोलिंग द्वारा झिल्ली सूखी और ३.५ ऑउंस स्पष्ट पकड़े कप के tulle टोपियां भर देना । एक phagostimulant के रूप में हीटिंग के बाद या साफ नंगे हाथों से गर्म रक्त सॉसेज संभाल द्वारा आवरण सतह पर मानव वाष्पशीलता छोड़ने के लिए 1 मिमी एटीपी के साथ खिला, कील रक्त को बढ़ाने के लिए ।
- रक्त पिलाने के बाद, कपास की गेंद को पकड़ कप के शीर्ष पर 10% सुक्रोज से लथपथ की जगह और मच्छरों को oviposition कप में स्थानांतरित करने से पहले ~ 24 एच के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- के साथ स्पष्ट ३.५ ऑउंस परख कप भरने से oviposition कप का निर्माण ~ 30 मिलीलीटर एच2ओ और बीज अंकुरण कागज का एक टुकड़ा रखने (~ 4 सेमी चौड़ा और 5 सेमी लंबी खड़ी चल लकीरें के साथ) कप के तल पर और पक्ष के खिलाफ (3 ए आंकड़ा) . tulle या जाल के साथ कवर और tulle या जाल टोपी में एक छोटे भट्ठा (~ 1 सेमी) में कटौती ।
- 24 घंटे के बाद रक्त पिलाने में, एक छोटे भट्ठा (~ 1 सेमी) जोत कप के tulle कैप में कटौती और केवल व्यक्तिगत महिलाओं है कि सफलतापूर्वक खिलाया-पेट में एक दृश्य रक्त बोल्स के साथ-oviposition कप में कोमल मुंह आकांक्षा द्वारा (1 महिला/oviposition कप) । एक 10% सुक्रोज संतृप्त कपास की गेंद के साथ oviposition टोपी में छोटे कटौती सील ।
- कप पकड़ो ~ 27 ° c के लिए 5 \ u20127 दिनों के लिए मच्छरों को पूरी तरह से oviposit दैनिक मृत्यु दर पर नज़र रखने की अनुमति है । एक विदारक गुंजाइश के तहत अंडे गिनती ।
4. Musca domestica मृत्युदर और oviposition की परख
- इंजेक्शन के बाद तीन दिनों के लिए, 10% सुक्रोज के साथ मक्खियों प्रदान करने के लिए जारी है और दिख मृत मक्खियों की संख्या रिकॉर्ड ।
- इंजेक्शन के बाद तीन दिन, anesthetize सभी मक्खियों कप के तल पर अविचल रहे हैं जब तक संक्षेप में होल्डिंग कप पर2 सह वितरण एक पॉलीथीन ट्यूब रखने से मक्खियों.
- स्थानांतरण एक साफ एक stockinette खोलने कवर आस्तीन के साथ एक 4 एल प्लास्टिक जार के शामिल पिंजरे को मक्खियों (10 सेमी, 3 बी चित्र) । पानी और दानेदार सुक्रोज, पाउडर दूध का एक मिश्रण के साथ मक्खियों प्रदान करते हैं, और एक 8:8:1 अनुपात में सूखे अंडे की जर्दी (मात्रा से) चार दिनों के लिए, रिकॉर्डिंग और हटाने मृत मक्खियों दैनिक ।
- 25% के साथ ७५% गेहूं चोकर मिश्रण द्वारा ताजा मक्खी लार्वा पालन माध्यम के लिए सूखी सामग्री तैयार वजन द्वारा गोली पशुधन फ़ीड । पानी जोड़ें ६२% नमी तक पहुंचने के लिए (जब तक पानी की एक बूंद मुश्किल से निचोड़ा जा सकता है) ।
- ऊपर ताजा लार्वा मीडिया का एक 1:1 मिश्रण से एक २.५ सेमी व्यास गेंद तैयार करने और "प्रयुक्त" फ्लाई लार्वा मध्यम (मध्यम जिसमें मक्खियों पहले pupated है) । काले सूती कपड़े के एक वर्ग में गेंद लपेटें, हल्के से मध्यम तरल के माध्यम से रिसाव जब तक निचोड़, तो रबर बैंड का उपयोग करने के लिए गेंद के आसपास जगह में कपड़ा पकड़ ।
- एक ६० मिलीलीटर कप में गेंद रखो और यह 5 घंटे के लिए मक्खी पिंजरे में जगह (3बी चित्र) ।
- oviposition गेंद से अंडे कुल्ला और सुनिश्चित करें कि अंडे कपड़े में परतों के नीचे से हटा रहे हैं । शेक अंडे समूहों को बाधित करने के लिए और एक स्थानांतरण प्लास्टिक के साथ एक स्नातक 20 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
- इंतजार जब तक अंडे बसने और एेसे ट्यूब में बसे हुए अंडे की मात्रा ध्यान दें । पर्याप्त पानी जोड़ने के लिए मात्रा को लाने के लिए बसे हुए अंडे की मात्रा 20X । पानी से अधिक अंडे की कुल मात्रा रिकॉर्ड ।
- जबकि या तो एक चुंबकीय हलचल बार या जोरदार सरगर्मी के साथ पानी और अंडा निलंबन मिश्रण, एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक टिप का प्रयोग करें (बंद टिप कट के अंत के साथ) के लिए पूर्व के एक टुकड़े पर पानी और अंडा निलंबन के ०.५ मिलीलीटर वितरण के लिए लाइनों की एक श्रृंखला में काले कपड़े गीला । एक विदारक खुर्दबीन के नीचे अंडे गिनने की ।
- दोहराएं चरण ४.९ दो बार । यदि एक मायने में एक गंभीर ग़ैर है (यानी, > 35% से अंय दो मायने रखता है से अलग है), एक चौथाई गिनती और ग़ैर उपेक्षा करते हैं ।
- नमूना प्रति अंडे की संख्या मतलब की गणना और निलंबन के अंडे की संख्या प्राप्त करने के लिए 2 से इस मूल्य गुणा/ अंडे की मात्रा से कदम ४.८ से प्राप्त अंडों/एमएल मूल्य गुणा । यह निर्धारित अंडों की कुल संख्या के लिए अनुमान है.
Representative Results
मच्छरों में dsRNA का Microinjection
इस microinjection विधि हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया है जीन अभिव्यक्ति, मृत्यु दर और ८० के लिए oviposition प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए कई मच्छर पीढ़ी भर में dsRNA ट्रिगर (एडीज, Anopheles, Culex) । राइबोसोमल और RPS6 से व्युत्पंन dsRNA के 1 µ जी के साथ एई aegypti (ORL1952) की कॉलोनी तनाव से महिलाओं के इंजेक्शन (RPL26 एट अल देखें । 5 dsRNA उत्पादन विधियों और अनुक्रम डेटा के लिए) एक नियंत्रण dsGFP के साथ इंजेक्शन मच्छरों की तुलना में जब कई oviposition चक्र भर में सापेक्ष अभिव्यक्ति (आरई) में उल्लेखनीय कमी दिखाई । एडीज aegypti 2एन डी gonotrophic चक्र के बाद पुनः मापा RPS6 अभिव्यक्ति की उल्लेखनीय कमी (पी < ०.०५) के रूप में एक छात्र की टी परीक्षण द्वारा निर्धारित के रूप में dsRPS6 के साथ इंजेक्शन में दिखाया गया एक ही समूह के dsGFP नियंत्रण (चित्रा 4)5 .
Fecundity व्यक्तिगत महिलाओं से मूल्यांकन किया गया था oviposition का उपयोग कर परख यहां वर्णित है । 3 दिनों के बाद इंजेक्शन, मच्छरों खून खिलाया, व्यक्तिगत oviposition कंटेनरों में स्थानांतरित कर रहे थे, और पूरा करने के लिए करना अनुमति दी । पहले gonotrophic चक्र के लिए औसत क्लच आकार काफी कम दोनों dsRPS6 इलाज Ae. aegypti के लिए थे (n = १०२ महिलाओं, १.३ ± ०.८ (मतलब ± SE) अंडे) और dsRPL26 इलाज (n = ८६ महिलाओं, ४.० ± १.१ अंडे) जब तुलना में dsGFP इंजेक्शन (n = ७९ महिलाओं, ४९.३ ± ३.५ अंडे, चित्र 5 ए) । एक दूसरे gonotrophic चक्र के बाद क्लच मूल्यांकन भी दोनों dsRNA इलाज समूहों के लिए काफी कम oviposition दिखाया है, लेकिन कम प्रभाव आकार के साथ । एई. aegypti के समूह आकार चर रहे थे और इस तरह अलग मतलब है डन टेस्ट5द्वारा किया गया था । चौबीस घंटे की मृत्यु सामान्य रूप से 3% या उससे कम थी ।
एक स्पष्ट खुराक प्रभाव जब 1 µ जी से ५० महिला Ae. aegyptiमें एनजी करने के लिए dsRPS6 इंजेक्शन मनाया गया था, और क्लच आकार काफी विविध जब 1 µ जी की तुलना में/महिला dsGFP इंजेक्शन सभी में नियंत्रण लेकिन 25 एनजी/महिला dsRPS6 खुराक (चित्रा 5B) ।
घर मक्खियों में dsRNA की Microinjection
कॉलोनी Musca domestica (ORL सामान्य) के साथ 5 µ जी के dsRNA के घर मक्खी RPS6 और RPL26 टेप9के खिलाफ बनाया गया था का इंजेक्शन थे । के रूप में एई. aegypti, दोनों विशिष्ट प्रतिलिपि अभिव्यक्ति (RPS6 और RPL26) और क्लच आकार में कमी की उल्लेखनीय कमी में मनाया गया था(चित्रा 4 और चित्रा 5 ए) । पुनः में उल्लेखनीय कमी एक ही समूह के dsGFP नियंत्रण के बीच छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था (P < ०.०५) और होल्म-Sidak परीक्षण अलग M. domestica उपचार समूहों के लिए क्लच आकार के बीच महत्व निर्धारित करने के लिए उपयोग किया गया था । डिंबग्रंथि विच्छेदों dsRPS6 और dsRPL26 उपचार में कम oogenesis दिखाया, जबकि dsGFP फेड मक्खियों vitellogenin-टिंडेल हाउस पब्लिशर्स स्केल9पर रेटेड के रूप में सामांय Biscoe जमाव था ।
चित्रा 1: वयस्क मच्छरों और घर मक्खियों के लिए microvolumes पहुंचाने के लिए Microinjection सेटअप । इंजेक्शन ठंड anesthetized कीड़ों पर प्रदर्शन कर रहे है एक चिल मेज पर माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मंचन किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: Ae. aegypti और एम. domesticaके लिए Microinjection साइटें । (क) वयस्क Ae. aegypti mesokatepisternum के बीच एक तिहाई में इंजेक्ट कर रहे हैं । (ख) वयस्क एम. domestica mesopleuron में इंजेक्ट किए जाते हैं. तीर इंजेक्शन की साइटों से संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: Oviposition परख सेटअप । (क) एई. aegypti oviposition एक oviposition सब्सट्रेट के रूप में बीज अंकुरण कागज के साथ परख कप, tulle और 10% सुक्रोज-लथपथ कपास के साथ छाया हुआ । (ख) भोजन के साथ एक oviposition परख कंटेनर में वयस्क महिला एम. domestica (क), जल (ख), और लार्वा मीडिया (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: RPS6 के एई में सापेक्ष अभिव्यक्ति . aegypti और एम domestica प्रजातियों के साथ इंजेक्शन विशेष dsRNAs । एडीज aegypti और एम. domestica 1 और 5 µ जी के साथ इंजेक्शन थे क्रमशः या तो नियंत्रण dsRNA (dsGFP) या dsRNA प्रत्येक कीट से RPS6 या RPL26 टेप के खिलाफ बनाया गया है । RPS6 अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण कमी (P < ०.०५) को मच्छरों में मनाया गया और मक्खियों द्वारा dsRPS6 के साथ इंजेक्ट किया जाता है और dsRPL26 के साथ इंजेक्ट किया जाता है (तारक द्वारा दर्शाया गया) । त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसई और संख्या कॉलम आधार पर जांच व्यक्तियों की संख्या इंगित करता है । यह आंकड़ा Estep एट अल से संशोधित किया गया है । 5 और Sanscrainte एट अल. 9. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 5: एई. aegypti और एम domestica के औसत क्लच आकार प्रजातियों के साथ-विशिष्ट dsRNAs इंजेक्शन । (A) अंडा जमाव काफी कम हो गया था (P < ०.०५) दोनों Ae. aegypti और M. domestica 1 और 5 µ g के इंजेक्शन के बाद क्रमशः या तो नियंत्रण dsRNA (dsGFP) या dsRNA प्रत्येक कीट से RPS6 या RPL26 टेप के विरुद्ध डिज़ाइन किया गया । तारांकन एक ही समूह के dsGFP नियंत्रण से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करता है । त्रुटि पट्टियों का प्रतिनिधित्व मतलब ± एसई और संख्या कॉलम आधार पर जांच व्यक्तियों की संख्या इंगित करता है । यह आंकड़ा Estep एट अल से संशोधित किया गया है । 5 और Sanscrainte एट अल. 9. (ख) की खुराक वक्र एई. aegypti से dsRPS6 के साथ इंजेक्शन ५० एनजी/महिला को १००० एनजी/महिला dsGFP इंजेक्शन साथियों की तुलना में fecundity में उल्लेखनीय कटौती से पता चलता है (५०, १००, और १००० एनजी/महिला) । त्रुटि सलाखों के प्रतिनिधित्व ± ९५% CI से 36-81 व्यक्तिगत जीवों खुराक प्रति । अक्षरों के साथ पॉइंट्स समूहों (P < ०.०५) द्वारा पहचाने गए ANOVA के बीच महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । यह आंकड़ा Estep एट अल से संशोधित किया गया है । 5. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
Microinjection dsRNA या अंय जैव-तर्कसंगत (यानी, कीटनाशक, वायरस, microsporidia) के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए एक मूल्यवान प्रयोगशाला तकनीक है । जबकि कई प्रयोगशालाओं microinjection प्रदर्शन, सटीक राशि इंजेक्शन अक्सर वितरण प्रणाली की तकनीकी सीमाओं के कारण स्पष्ट नहीं है, जहां वितरित की मात्रा सीधे11मापा नहीं है. वितरित की मात्रा और एकाग्रता महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि ऐसे EC50 या IC50 के रूप में मानक विषाक्तता उपायों की गणना की अनुमति या ंयूनतम प्रभावी खुराक5,16को परिभाषित कर रहे हैं । यह कार्यात्मक अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है वयस्क कीड़ों में RNAi का उपयोग कर, जहां वितरण के द्वारा डिलीवरी हमेशा वांछित कणों के लिए प्रणालीगत जोखिम में परिणाम नहीं है और वास्तविक midgut पार खुराक स्पष्ट5है ।
जबकि microinjection प्रक्रिया शुरू में चुनौतीपूर्ण हो सकता है, गति और वितरण सटीकता में तेजी से सुधार अभ्यास और धैर्य के साथ प्राप्त कर रहे हैं । माहिर इंजेक्शन प्रक्रिया ही एक समय निवेश है, लेकिन, एक बार पूरा, प्रक्रिया दोहराने परिणाम और चोट की मौत का उत्पादन < 3%. सफल इंजेक्शन का अनुपात वृद्धि के रूप में प्रवीणता ३०० मच्छरों के इंजेक्शन या प्रति दिन मक्खियों की अनुमति बढ़ जाएगी ।
microinjection की चुनौतियों के कई कारण सुई इस्तेमाल किया जा रहा है । उचित केशिका सुई तोड़ बिंदु और टिप कोण का निर्धारण प्रक्रिया का एक चुनौतीपूर्ण पहलू है और किसी दिए गए प्रजातियों के लिए सबसे प्रभावी खोलने के आकार का निर्धारण करने के लिए कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता है । ठीक सुई मच्छर microinjection के लिए सबसे उपयोगी (~ १५० µm) भी जल्दी से बड़ी मात्रा में मक्खियों में इंजेक्शन देने के लिए छोटा है, जबकि इसके विपरीत, बड़ी सुई खोलने कि मक्खियों पर काम करता है (~ २५० µm) छोटे मच्छरों के लिए व्यापक चोट क्षति का कारण बनता है और अस्वीकार्य इंजेक्शन मृत्यु दर । एक कुंद टिप के साथ टूट सुई अक्सर ऊतक क्षति और वृद्धि की मृत्यु के बिना छल्ली के माध्यम से प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । कीट तराजू या ऊतक टुकड़े एक प्रयोग के पाठ्यक्रम पर सुई रोकना कर सकते हैं, तो यह अक्सर प्रतिस्थापन की आवश्यकता है, तो खींच लिया कई सुइयों के लिए उपयोगी है. हमने पाया है कि यह एक मुश्किल सुई की जगह के बजाय एक जाम या बेईमान सुई स्पष्ट करने की कोशिश करने के लिए समय बिताने के लिए आसान है ।
इंजेक्शन समाधान कीट में प्रवेश अवलोकन महत्वपूर्ण है ताकि असफल इंजेक्शन (2.14-2.15 कदम देखें) हटाया जा सकता है । इंजेक्शन समाधान के लिए Rhodamine बी इसके अलावा एक स्पष्ट दृश्य प्रदान करता है कि ठंड का मंचन कीड़ों उचित खुराक प्राप्त है और विशेष रूप से उपयोगी है, जबकि अभ्यास (२.७ कदम देखें) ।
इंजेक्शन और oviposition परख तरीकों यहां प्रस्तुत सफलतापूर्वक जीन पछाड़ना और मध्यम श्रेणी का phenotypic प्रभाव वयस्क Ae. aegypti और M. domestica में प्रेरित किया है जब प्रजातियों के खिलाफ डिजाइन dsRNAs का उपयोग कर विशिष्ट राइबोसोमल टेप (चित्रा 4 और आंकड़ा 5 ए) । इसके अतिरिक्त, इस विधि की क्षमता को सही व्यक्तियों को microvolumes देने के लिए खुराक प्रतिक्रिया curves के लिए सामग्री की छोटी मात्रा के लिए उत्पंन होने की अनुमति देता है (के रूप में कम के रूप में ५० एनजी; चित्रा 5B). यह विशेष रूप से ऐसी स्क्रीनिंग siRNAs या dsRNAs के रूप में तरीकों के लिए उपयोगी है, के रूप में इन अणुओं की बड़ी मात्रा में उत्पादन लागत निषेध किया जा सकता है ।
यह विधि जैविक एजेंटों (वायरस, बैक्टीरिया, microsporidia) या रासायनिक कीटनाशकों इंजेक्षन करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के बाद कि किसी भी डिलीवरी बफ़र्स इंजेक्शन द्वारा अहानिकर है संशोधित किया जा सकता है । के रूप में वितरण की मात्रा कीट के आकार तक सीमित है, केंद्रित परीक्षण समाधान उत्पादन महत्व का है ।
पर्याप्त रूप से dsRNA प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, यह घातक phenotypes संतान में ही प्रकट हो सकता है के रूप में oviposition ट्रैक करने के लिए आवश्यक है. के रूप में यहां प्रस्तुत है, महिला एई aegypti अलग पकड़ के बाद व्यक्तिगत क्लच आकार निर्धारण और एक ही व्यक्ति पर आगे परीक्षण के लिए अनुमति देता है oviposition के बहाव किया जा सकता है (यानी, जीन अभिव्यक्ति अध्ययन, अतिरिक्त gonotrophic चक्र, ऊतक विशिष्ट पछाड़ना) जीन अभिव्यक्ति जैसे अन्य उपायों के साथ प्रजनन उत्पादन को सहसंबंधित करने के लिए. के रूप में एम. domestica आम तौर पर एक समूह की प्रतिक्रिया में oviposit, अलग gravid के लिए करना मक्खियों के लिए करना बहुत गहन श्रम और व्यक्तियों की बड़ी संख्या के लिए व्यावहारिक नहीं है17। इसलिए, मतलब क्लच आकार निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत है ।
microinjection विधि यहां प्रस्तुत मच्छरों और घर मक्खियों के लिए लगातार प्रणालीगत प्रसव प्रदान करता है । मृत्यु दर और oviposition ट्रैकिंग परख के साथ युग्मित, इन बहुमुखी उपकरण के लिए छोटे आरएनए अणु, जैविक एजेंटों के transcriptional और phenotypic प्रभाव का आकलन किया जा सकता है, और पारंपरिक कीटनाशकों जहां मौखिक वितरण व्यवहार्य नहीं है ।
Disclosures
सभी लेखक संयुक्त राज्य कृषि विभाग या रक्षा विभाग के कर्मचारी या ठेकेदार हैं । इस पांडुलिपि सरकारी कर्तव्यों के पाठ्यक्रम के दौरान उत्पादन किया गया था और सार्वजनिक क्षेत्र में कानून द्वारा है । विचार लेखकों की राय का प्रतिनिधित्व करते है और एक आधिकारिक स्थिति या अमेरिकी सरकार द्वारा समर्थन का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं । एक वाणिज्यिक उत्पाद का उल्लेख उपयोग के लिए एक सिफारिश नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों Hanayo Arimoto (यूएस नेवी), दाना जॉनसन, लुसी ली, और Roxie व्हाइट (USDA-ARS) डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण के साथ मदद के लिए धंयवाद । हम डीआरएस का भी शुक्रिया अदा करते हैं । पिया Olafson (USDA-ARS) और (फ्लोरिडा विश्वविद्यालय) के वू पांडुलिपि और Niklaus Hostettler (फ्लोरिडा विश्वविद्यालय) के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए माइक्रोस्कोप फुटेज फिल्माने के लिए । धन USDA, WII-नौसेना और मरीन कोर सार्वजनिक स्वास्थ्य केंद्र के 141C परियोजना, और तैनात युद्ध सेनानियों संरक्षण कार्यक्रम द्वारा प्रदान की गई थी । निधियों में पांडुलिपि के अध्ययन या विकास की डिजाइन या निर्देशन में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
