Summary
Denne protokol beskriver mikroinjektion metoder, som vi har standardiseret og brugt i flere år til at levere bestemte mængder af nukleinsyrer direkte til hemolymph af myg og stuefluer. Denne protokol resultater i minimal injektion dødelighed og tillader dosis korreleret målinger af frugtbarhed.
Abstract
Syntetiske dsRNAs, anvendes til at fremkalde RNA-interferens, kan have dosis afhængige fænotypisk virkninger. Disse virkninger er vanskelige at definere hvis dsRNAs leveres ved hjælp af en ikke-kvantitativ metode. Præcis levering af kendte mængder af nukleinsyrer eller andre kemikalier er kritisk at måle effekten af den sammensatte testes og give pålidelig sammenligning mellem forbindelser.
Her giver vi en reproducerbar, kvantitative mikroinjektion protokol, der sikrer præcis levering af særlige doser af dsRNA, reducere dødeligheden typisk fremkaldt ved injektion skade. Disse ændringer omfatter tilføjelse af rhodaminfilteret B, en gradueret injektion nål, og en forbedret genoprettelsesmetode lånt fra Isoe og Collins. Denne metode giver mulighed for beregning af dosis svar og letter sammenligninger mellem forbindelser. Versioner af denne metode er brugt med succes på tre slægter af myg samt stuefluer for at vurdere reduktionen i frugtbarhed som følge af genhæmning af ribosomale RNA udskrifter.
Denne protokol giver strategier til at reducere flere udfordringer af små insekt mikroinjektion. Sammen, mekanisk levering af dsRNAs ledsaget af visuel kontrol, identifikation af effektiv steder for levering og medtagelsen af en post injektion tilbagebetalingsperioden sikrer nøjagtig dosering og lave skade dødelighed. Denne protokol beskriver også en oviposition bioassay for ensartet bestemmelse af effekter på fertilitet.
Introduction
Leverer små biomolekyler, såsom nukleinsyrer, til voksen dipterans har vist sig for at være udfordrende i både Culicidae og Muscidae. Oral optagelse af dsRNAs er blevet rapporteret til at producere sterilitet (når målretning gener udelukkende udtrykt i testiklerne af voksne) og dødelighed (når rettet mod SNF7 og en steroid receptor coactivator) i larve Aedes aegypti1,2 . Dødelighed er også blevet observeret, når målretning HSP70 i larve Musca domestica3. Sådanne fænotypisk virkninger, har imidlertid ikke ført efter fodring dsRNA til voksen Ae. aegypti i sukker måltider4,5.
Mikroinjektion er blevet brugt til at omgå midgut, når vi indfører patogener eller nukleinsyrer, dermed inducere en systemisk reaktion5,6,7,8,9,10 . Flere mikroinjektion teknikker findes, der involverer udstyr lige fra internt producerede apparater, der kræver visuel måling af Injektionsvolumen til mikroprocessor-kontrolleret injektorer, der giver mulighed for automatiseret volumen levering så lavt som 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interferens (RNAi) udløser målretning ribosomale mRNAs, forstyrre æggestokkene udvikling i leddyr så forskellige som kvæg kryds Rhipicephalus microplus, myg Aedes aegypti og Culex pipiens, og huset flyve Musca domestica5,9,12,13. I disse undersøgelser var overvågning afbrydelse af oviposition af afgørende betydning for bestemmelse af effektiviteten af inoculant som Fænotypen kan manifestere sig som bringes til ophør eller nedsættelse af afkommet. Dette er en form for mindretalsspørgsmålet dødbringende fænotype, der er en kritisk og ønskede effekt i mange af de ikke-traditionelle biocontrol metoder som Wolbachia -inficeret hanner Introduktion (seksuelle uforenelighed) og RNAi induceret sterilitet5 ,9,14. Sporing af både dødelighed og frugtbarhed er nødvendig for kendetegner og udvikling af meget specifikke biorationals (naturligt forekommende patogener og/eller naturlige derivater)15.
Denne protokol præsenterer detaljerede mikroinjektion teknikker til både voksne myg og stuefluer; en proces, der ofte ikke er godt beskrevet i litteraturen. Derudover er oviposition bioassay metoder til tilstrækkeligt evaluere dsRNA indvirkning på voksne dipterans beskrevet. Disse protokoller blev udviklet specielt til Aedes aegypti og Musca domestica men kan ændres til andre arter.
Protocol
1. insekt forberedelse
- Bedøver myg ved nedkøling dem ved 4 ° C for flere timer eller ved 2 min eksponering til CO2 og derefter holde ved 4 ° C forud for injektioner. Kolde bedøver fluer på 4 ° C 2\u20123 h før injektioner. Sikre myg og fluer er parret hvis oviposition er en respons variabel.
Bemærk: Myg anesthetization metode afhænger af art og stamme, fx Culex inddrive meget hurtigere fra kolde anesthetization end Aedes aegypti og CO2 knockdown er derfor at foretrække. - På is, omhyggeligt fase myg eller fluer ved hjælp af bløde pincet til at lægge dem ventrally udsat på mikroskop slides ~0.5 cm fra hinanden. Standard dias kan holde to rækker af 6 myg eller 6 – 7 hus fluer. Være 1 – 1,5 cm mellemrum på den venstre eller højre ende af diasset klart af myg eller fluer til støtte skub håndtering.
- Holde dias af iscenesatte insekter ved 4 ° C i store petriskåle indtil klar til injektion.
Bemærk: Bore et hul gennem petriskål låg vil hjælpe med at forhindre insekter fra at blive forstyrret af luft forskydning, når udjævningen. Placere dias på et par glas kapillærer sikret til parabol bunden vil lette fjernelse fra petriskål.
2. insekt injektion
- Forberede dsRNA som beskrevet af Estep et al. 5 og Sanscrainte et al. 9. Hvis fri for forurenende stoffer, dsRNA kan kvantificeres ved hjælp af et spektrofotometer til måling af absorbans ved 260 nm og beregning af RNA-koncentrationen i μg/mL som en260 × fortynding faktor × 40.
- Opsætning af dissekere mikroskop og microinjector over en chill tabel eller lavvandede isspand kan udføre injektioner på kolde-bedøvede myg og fluer (Se trin 1.1-1.3 og figur 1).
- Trække glas kapillærer til en fin spids med nål puller (indstillinger: varmelegeme = 15 enheder, magnetventil = 4 A).
Bemærk: Se Tabel af materialer for fabrikantens oplysninger. - Placer kapillær nålen ind i et microinjector som pr fabrikantens anvisninger og pause nål tip ved at knibe med et par pincet til at producere en skarp punkt.
Bemærk: Foreslåede kanyle åbningen størrelser er ~ 150 µm for myg og ~ 250 µm til flue. - Angive microinjector for ønskede levering volumen. Menisk bevægelse fra ~ 50 nL delprøver er nemt observerbare og anbefalede for myg microinjections. Hvis den er tilgængelig, aktivere indstillinger for hurtig injektion. Skyl nålen ved at udfylde og udvise nukleasen-gratis vand 3 gange.
- Forberede løsninger for injektion i en koncentration, sådan at 100\u2012150 nL vil give ønskede dosis for myg og 500 nL vil give ønskede dosis til hus fluer.
Bemærk: Foreslog indledende doser: 1 µg for hvert myg og 5 µg for hver flue5,9. - Valgfrit for myg, tilføje rodamin B (til støtte i visualisering) til løsninger i en endelig koncentration på 3,0 µg/mL.
Bemærk: Farvestoffet vil være klart synlig ved sin pink farve efter injektion gennem næsten klart neglebånd på den ventrale overflade af maven/thorax skæringspunktet. - Tilsæt 3-4 µL af løsning at indskyde på en ren overflade (såsom et stykke af paraffin film) og trække i glas nål uden sutter i nogen luft. Trykkes inject-knappen gentagne gange, indtil væsken begynder at dispensere fra nål og forsigtigt tørre dråber af med en delikat opgave vinduesvisker.
Bemærk: Mens nogle modeller af microinjectors kræver opfyldning sprøjten, injektor refereret i Tabel af materialer ikke. - Brug en ultra-fin spids markør, tegne nummertegn ~ 1 mm apart startende fra den flydende menisk til nålen skanken. Dette vil støtte i at visualisere bevægelsen menisk og sikre, at løsningen har indtastet myg under injektion.
- Sæt dias af myg eller fluer (som udarbejdet i trin 1,2 – 1,3) under nålen på chill tabel eller is (figur 1). Sikre at synsfelt i mikroskop er bred nok til at se løsning menisken i nålen.
- For myg, justere nålen med den midterste tredjedel af mesokatepisternum (figur 2A), og mens afstivet myg imod nålen med pincet placeret på den modsatte side, forsigtigt punktere neglebånd med nål tip via den microinjector mikrometer.
- Til hus fluer, justere nålen med mesopleuron (figur 2B), og mens afstivet flyve mod nålen, forsigtigt punktere neglebånd med nål-spids.
- Blidt skub nålen ind myg eller flyve krop, indtil spidsen har passeret midterlinjen.
Bemærk: Indsætte nålen for lavvandede ofte resulterer i den injicerede flydende beading ud af insektet (Se trin 2.15). - Mens du ser til bevægelse af de flydende menisk i nålen, trykke knappen inject indtil den ønskede mængde væske har været injiceres. For myg, hvis sat til 50,6 nL delprøver, tryk 2 X for ~ 100 nL eller 3 X for ~ 150 nL. Til hus fluer, trykke knappen inject indtil ~ 500 nL har været injiceres (dvs. med 69 nL delprøver Tryk på 7 X for 483 nL).
- Hvis menisken ikke flyttes, langsomt glide myg eller flyve ud nålen mens du ser til menisk bevægelse. Hvis en del af den injicerede løsning perler ud af neglebånd på nål fjernelse eller hvis menisken undlader at flytte, kassere insekt som var denne injektion ikke vellykket.
- Overføre held injiceres myg i grupper på 10-15 eller stuefluer i grupper af 5 til at rydde 3,5 ounce holding kopper. Dække med tyl eller netting og inddrive ved stuetemperatur.
- Efter myg og fluer har genvundet (1-2 h), invertere hver bedrift cup over et stykke vat vædet med 10% rørsukkeropløsning.
Bemærk: Inversion af cup på toppen af saccharose bomuld aids i overlevelse ved at give lettere adgang til en sukker måltid10. - Skyl nål som i trin 2.5 mellem injektion løsninger. Når du er færdig, indsprøjtning, kassere anvendes nåle i en passende skarpe container.
3. aedes aegypti dødelighed og oviposition bioassay
- For tre dage efter injektion, fortsætte med at give myg med 10% saccharose og registrere antallet af synligt døde myg.
- Fyld en ≤12-tommer kunstig membran (såsom kollagen pølse beklædning) med frisk blod (dvs. kvæg for Aedes aegypti) og opvarmes til 60 ° C i vandbad.
- Kort tørre membranen af rullende på et stykke køkkenrulle og lå på tværs af tyl caps af de 3,5 ounce klart holde kopper. For at forbedre fodring, spike blod med 1 mM ATP efter opvarmning som en phagostimulant eller ved at håndtere den varmede blod pølse med rene hænder til at forlade menneskelige flygtige stoffer på kabinettet overflade.
- Efter blod fodring, erstatte vat vædet med 10% saccharose på toppen af bedriften kopper og tillade myg til at hvile for ~ 24 h før overførsel til oviposition kopper.
- Konstruere oviposition kopper ved at udfylde klart 3,5 ounce bioassay kopper med ~ 30 mL deioniseret H2O og placere et stykke frø spiring papir (~ 4 cm bred og 5 cm lang med kamme kører lodret) i bunden af koppen og mod siden (figur 3A) . Dække med tyl eller netting og skære en lille slids (~ 1 cm) i fælles landbrugspolitik, tyl eller netting.
- På 24 h efter blod fodring, skære en lille slids (~ 1 cm) i tyl hætten af bedriften cup og overføre kun enkelte kvinder, der blev fodret — med et synligt blod bolus i abdomen — ved blid munden aspiration i oviposition kopper (1 kvinde/oviposition cup). Forsegle den lille snit i oviposition cap med en 10% saccharose mættede vat.
- Hold kopper på ~ 27 ° C for 5\u20127 dage at tillade myg til fuldt oviposit mens tracking daglige dødelighed. Antal æg under et dissekere muligheder.
4. Musca domestica dødelighed og oviposition bioassay
- For tre dage efter injektion, fortsætte med at give fluer med 10% saccharose og registrere antallet af synligt døde fluer.
- Tre dage efter injektion, bedøver fluer af kort placere en polyethylen rør udlevering CO2 over bedriften kopper, indtil alle fluer er ubevægelig på bunden af kopper.
- Overføre fluer til et rent bur består af en 4 L plast krukke med en glatstrikkede ærme dækker åbningen (10 cm, figur 3B). Give fluer med vand og en blanding af granuleret saccharose, pulveriseret mælk, og tørrede æggeblomme i en 8:8:1 ratio (efter volumen) i fire dage, registrering og fjernelse af døde flyver dagligt.
- Forberede tørre ingredienser frisk flyve larver opdræt medium ved at blande 75% hvedeklid med 25% pelleted foder efter vægt. Tilsæt vand for at nå 62% fugt (indtil en dråbe vand kan næppe blive skubbet ud).
- Forberede en 2,5 cm diameter bolden fra en 1:1 blanding af ovenstående frisk larve medierne og "brugt" flyve larver medium (medium, hvor fluerne har tidligere pupated). Wrap bolden i et kvadrat med sort bomuldsklud, presse let indtil medium væske siver gennem, så brug gummi bands for at holde kluden på plads omkring kuglen.
- Sætte bolden i en 60 mL kop og placere den i den flyve bur for 5 h (figur 3B).
- Skyl æg ud oviposition bolden og sikre, at æggene er fjernet fra under folder i kluden. Ryst æg for at forstyrre klynger og overføre dem til en gradueret 20 mL centrifugeglas med en overførsel pipette.
- Vent, indtil æggene nøjes med og opmærksom på omfanget af de udlignede æg i den graduerede tube. Tilføje tilstrækkeligt vand for at bringe volumen op til 20 X mængden af udlignede æg. Optage det samlede rumfang af vand plus æg.
- Samtidig med at blande vand og æggebakke suspension med enten en magnetisk røre bar eller kraftig omrystning, bruge en 1 mL pipette tip (med udgangen af spidsen afskåret) at give afkald på 0,5 mL vand og æggebakke suspension på et stykke af præ fugtede sort klud i en række linjer. Tælle æg under en dissekere mikroskop.
- Gentag trin 4.9 to gange mere. Hvis en tæller er en svær outlier (dvs., adskiller sig fra de andre to optællinger af > 35%), gør en fjerde tæller og se bort fra afvigende.
- Beregne det gennemsnitlige antal æg pr. sample og ganger denne værdi med 2 for at få antallet af æg/mL af suspensionen. Multiplicere værdien æg/mL fremstillet volumen af æg suspension fra trin 4.8. Dette er estimatet for antallet af æg lagt.
Representative Results
Mikroinjektion af dsRNA i myg
Mikroinjektion metoden har været brugt i vores laboratorium til at evaluere genekspression, dødelighed og oviposition svar til over 80 dsRNA udløsere på tværs af flere myg slægter (Aedes, Anopheles, Culex). Indsprøjte hunner fra koloni stamme af Ae. aegypti (ORL1952) med 1 µg for dsRNA udvundet fra de ribosomale udskrifter RPS6 og RPL26 (Se Estep et al. 5 for dsRNA produktionsmetoder og sekvens data) viste signifikant reduktion i relativ udtryk (RE) på tværs af flere oviposition cykler i forhold til myg injiceres med en kontrol dsGFP. Aedes aegypti RE målt efter 2nd gonotrophic cyklus viste signifikant reduktion af RPS6 udtryk (P < 0,05) i myg injiceres med dsRPS6 som bestemt ved en Students t-test mellem dsGFP kontrol af den samme gruppe (figur 4)5 .
Frugtbarhed blev vurderet ud fra individuelle kvinder bruger oviposition bioassay beskrevet her. Efter 3 dage efter injektionen var myg blod fodret, overført til individuelle oviposition beholdere og tilladt at lægge til færdiggørelse. Gennemsnitlige kobling størrelser for den første gonotrophic cyklus blev væsentligt reduceret for begge dsRPS6 behandlet Ae. aegypti (n = 102 hunner, 1,3 ± 0,8 (gennemsnit ± SE) æg) og dsRPL26 behandles (n = 86 hunner, 4,0 ± 1.1 æg) sammenlignet med dsGFP injektioner (n = 79 hunner, 49.3 ± 3,5 æg, figur 5A). Kobling vurdering efter en anden gonotrophic cyklus viste også væsentligt reduceret oviposition for begge dsRNA behandlede grupper, men med nedsat effekt størrelse. Gruppestørrelser af Ae. aegypti var variabel og dermed betyder adskillelse blev udført af Dunn's test5. Tyve-fire-timers MORTALITET var normalt 3% eller mindre.
En klar dosis-effekt blev observeret når indsprøjte dsRPS6 fra 1 µg til 50 ng i kvindelige Ae. aegyptiog kobling størrelse varierede betydeligt i forhold til 1 µg/kvinde dsGFP indsprøjtet kontrol i alle, men den 25 ng/kvinde dsRPS6 dosis (figur 5B).
Mikroinjektion af dsRNA i hus fluer
Koloni Musca domestica (ORL normale) blev sprøjtet med 5 µg for dsRNA konstruktioner designet mod hus flyve RPS6 og RPL26 afskrifter9. Som blev observeret i Ae. aegypti, blev betydelig reduktion af både specifikke udskrift udtryk (RPS6 og RPL26) og reduktion af kobling størrelse observeret (figur 4 og figur 5A). Betydelig reduktion i RE var bestemt af Student's t-test mellem dsGFP kontrol af samme gruppe (P < 0,05) og Holm-Sidak test blev anvendt til at bestemme betydningen mellem kobling størrelser til forskellige M. domestica behandlingsgrupper. Æggestokkene dissektioner viste reduceret oogenesen i dsRPS6 og dsRPL26 behandlinger, mens dsGFP fodret fluer havde normal vitellogeninproduktion depositionen som bedømt på Tyndale-Biscoe skala9.
Figur 1: mikroinjektion setup til at levere microvolumes til voksne myg og stuefluer. Injektioner er udført på kolde-bedøvede insekter iscenesat på objektglas over en chill tabel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mikroinjektion websteder for Ae. aegypti og M. domestica. (A) voksen Ae. aegypti er indsprøjtet i den midterste tredjedel af mesokatepisternum. (B) voksen M. domestica injiceres i mesopleuron. Pilene angiver lokaliteter af injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Oviposition bioassay setup. (A) Ae. aegypti oviposition assay kopper med frø spiring papir som en oviposition substrat, loft med tyl og 10% saccharose-gennemblødt bomuld. (B) voksne kvindelige M. domestica i en oviposition assay container med mad (A), vand (B), og larver medier (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Relative udtryk for RPS6 i Ae. aegypti og M. domestica injiceres med artsspecifik dsRNAs. Aedes aegypti og M. domestica blev sprøjtet med 1-5 µg henholdsvis af enten kontrol dsRNA (dsGFP) eller dsRNA designet mod RPS6 eller RPL26 afskrifter fra hver insekt. Betydelig reduktion (P < 0,05) af RPS6 udtryk blev observeret i myg og fluer injiceres med dsRPS6 og af fluer injiceres med dsRPL26 (vises med stjerner). Fejllinjer udgør gennemsnit ± SE og nummer på kolonne base angiver antal personer undersøgt. Dette tal er blevet ændret fra Estep et al. 5 og Sanscrainte et al. 9. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Gennemsnitlig kobling størrelse af Ae. aegypti og M. domestica injiceres med artsspecifik dsRNAs. (A) æg deposition blev reduceret betydeligt (P < 0,05) i både Ae. aegypti og M. domestica efter injektion af 1 og 5 µg henholdsvis af enten kontrol dsRNA (dsGFP) eller dsRNA designet mod RPS6 eller RPL26 afskrifter fra hver insekt. Stjerner angiver betydelige forskelle fra dsGFP kontrollen af samme gruppe. Fejllinjer udgør gennemsnit ± SE og nummer på kolonne base angiver antal personer undersøgt. Dette tal er blevet ændret fra Estep et al. 5 og Sanscrainte et al. 9. (B) dosis kurve af Ae. aegypti injiceres med dsRPS6 fra 50 ng/kvinde til 1000 ng/kvindelige viser betydelige reduktioner i frugtbarhed i forhold til dsGFP indsprøjtet kohorter (50, 100 og 1000 ng/kvinde). Fejllinjer udgør gennemsnit ± 95% CI fra 36-81 individuelle organismer pr. dosis. Punkter med bogstaver repræsenterer signifikant forskel mellem grupperne (P < 0,05) identificeret af ANOVA. Dette tal er blevet ændret fra Estep et al. 5. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Mikroinjektion er en værdifuld laboratorium teknik til at sikre levering af dsRNA eller andre biorationals (dvs., pesticider, virus, microsporidia). Mens mange laboratorier udfører mikroinjektion, er det nøjagtige beløb injiceres ofte uklar på grund af tekniske begrænsninger af den levering systemet hvor leverede volumen ikke direkte målte11. Leveret mængde og koncentration er kritiske parametre, der giver mulighed for beregning af toksikologiske foranstaltninger såsom EC50 eller IC50 eller for at definere minimal effektive doser5,16. Dette er især vigtigt i funktionelle studier ved hjælp af RNAi i voksen insekter, hvor levering af fodring ikke altid fører til systemisk eksponering for de ønskede partikler og den faktiske dosis krydser midgut er uklart5.
Mens mikroinjektion procedure kan være udfordrende, i første omgang, nås hurtige forbedringer i hastighed og levering nøjagtighed med praksis og tålmodighed. Mastering injektion selve proceduren er en gang investering, men når først udført, proceduren, der producerer repeterbare resultater og skade dødelighed af < 3%. Forholdet mellem vellykket injektioner vil stige som færdigheder øger tillade injektion af 300 myg eller fluer per dag.
Mange af udfordringerne ved mikroinjektion skyldes nålen bliver brugt. Bestemmelse af korrekt kapillær nål brudpunkt og spids vinkel er en udfordrende aspekt af proceduren og kræver nogle trial and error til at bestemme den mest effektive åbning størrelse for en given art. Den fin nål mest nyttige for myg mikroinjektion (~ 150 µm) er for små til at hurtigt levere den større mængde injiceres fluer, mens omvendt, større nålen åbning at værker på fluer (~ 250 µm) forårsager omfattende skade skader til mindre myg og uacceptabel injektion dødelighed. En nål med en stump spids er ofte vanskeligt at komme igennem neglebånd uden vævsskader og øget dødelighed. Insekt skalaer eller væv stykker kan tilstoppe nåle i løbet af et eksperiment, så det er ofte nyttigt at have flere nåle trak hvis udskiftning er nødvendig. Vi har fundet, at det er lettere at erstatte en vanskelig nål i stedet for at bruge tid på at forsøge at fjerne et fastklemt eller straffesparksfelt nål.
Observere injektion løsningen ind i insekt er kritisk og derfor forgæves injektioner kan fjernes (Se trin 2.14-2.15). Rodamin B supplement til injektion løsninger giver en klar visuel for at sikre, at kolde-iscenesatte insekter modtager korrekt dosering og er især nyttig, mens øve (Se trin 2.7).
Indsprøjtning og oviposition bioassay metoder præsenteres her har med held induceret gen knockdown og målbare fænotypisk virkninger i voksen Ae. aegypti og M. domestica når du bruger dsRNAs designet mod artsspecifikke ribosomale udskrifter (figur 4 og figur 5A). Desuden, denne metodes evne til præcist levere microvolumes til enkeltpersoner giver mulighed for dosis/respons-kurver skal genereres for små mængder af materiale (så lavt som 50 ng; Figur 5B). Dette er især nyttigt for metoder såsom screening siRNAs eller dsRNAs, som producerer store mængder af disse molekyler kan være cost-uoverkommelige.
Denne metode kan ændres til at injicere biologiske agenser (vira, bakterier, microsporidia) eller kemiske pesticider, efter at sikre, at enhver levering buffere er uskadelige ved injektion. Levering volumen er begrænset af størrelsen af insekt, producerer koncentreret er test solutions af betydning.
Til at tilstrækkeligt vurdere dsRNA effektivitet, er det nødvendigt at spore oviposition som dødbringende fænotyper kan kun manifestere i afkom. Som præsenteres her, holde kvindelige Ae. aegypti separat efter blooding giver mulighed for individuelle kobling størrelsesbestemmelse og yderligere test på de samme individer kan gøres neden for oviposition (dvs. gen expression undersøgelser, yderligere gonotrophic cyklusser, væv specifikke knockdown) at korrelere formeringsevnen med andre foranstaltninger såsom genekspression. Som M. domestica oviposit generelt i gruppen svar, er ansporer isolerede fælderne fluer at lægge meget arbejdskraft intensiv og ikke praktisk for et stort antal individer17. Derfor præsenteres en metode til at bestemme betyde kobling størrelse.
Metoden mikroinjektion præsenteres her giver konsekvent systemisk levering til myg og stuefluer. Kombineret med dødelighed og oviposition sporing bioassays, kan disse alsidige værktøjer bruges til at vurdere effekterne transcriptional og fænotypiske små RNA molekyler, biologiske agenser og traditionelle pesticider hvor oral levering er ikke levedygtige.
Disclosures
Alle forfattere er medarbejdere eller kontrahenter af United States Department of Agriculture eller Department of Defense. Dette håndskrift blev produceret i løbet af officielle pligter og er ved lov i det offentlige domæne. Synspunkterne repræsenterer udtalelse fra forfattere og repræsenterer ikke en officiel holdning eller påtegning af den amerikanske regering. Omtale af et kommercielt produkt er ikke en anbefaling til brug.
Acknowledgments
Forfatterne takke Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li og Roxie White (USDA-ARS) for hjælpe med dataopsamling og analyse. Vi takker også Drs. Pia Olafson (USDA-ARS) og Ke Wu (University of Florida) for kritisk gennemgang af håndskriftet og Niklaus Hostettler (University of Florida) til at filme mikroskop optagelser. Finansieringen blev leveret af USDA, WII - 141C projektet af søværnet og Marine Corps Public Health Center og indsat krig krigere Protection Program. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i design eller retning af forsøget eller udviklingen af håndskriftet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
