Summary
Det här protokollet beskriver en Mikroskop metod som vi har standardiserat och använt i flera år för att leverera vissa mängder nukleinsyror direkt till hemolymph myggor och hus flugor. Detta protokoll resulterar i minimal injektion dödlighet och tillåter dos korrelerade mätningar av fruktsamhet.
Abstract
Syntetiska dsRNAs, används för att framkalla RNA-interferens, kanske dosen beroende fenotypisk effekter. Dessa effekter är svåra att definiera om dsRNAs levereras med en icke-kvantitativa metod. Korrekt leverans av kända mängder av nucleic syror eller andra kemikalier är kritiska att mäta effekten av den förening som testas och att möjliggöra tillförlitlig jämförelse mellan föreningar.
Här tillhandahåller vi en reproducerbar, kvantitativa Mikroskop protokoll som garanterar korrekt leverans av särskilda doser av dsRNA, minska dödligheten oftast framkallas genom injektion skada. Dessa ändringar inkluderar tillägg av rodamin B, en graderad injektionsnål, och en förbättrad återställningsmetod lånat från Isoe och Collins. Denna metod tillåter beräkning av dos svaren och underlättar jämförelser mellan föreningar. Versioner av denna metod har använts framgångsrikt på tre släkten av myggor samt hus flugor för att bedöma minskningen i fruktsamhet följd nedtystning av ribosomalt RNA avskrifter.
Detta protokoll ger strategier för att minska flera utmaningar för små insekt Mikroskop. Grupp, mekanisk leverans av dsRNAs åtföljs av visuell kontroll, identifiering av effektiva platser för leverans och införandet av en återhämtningsperiod på efter injektion säkerställa korrekt dosering och låg skada dödlighet. Det här protokollet beskriver också en ovipositionen bioassay för enhetlig bestämning av effekter på fruktsamhet.
Introduction
Att leverera små biomolekyler, såsom nukleinsyror, till vuxna dipterans har visat sig vara utmanande i både Anopheles och husflugor. Oralt intag av dsRNAs har rapporterats att producera sterilitet (när inriktning gener endast uttrycks i testiklarna hos vuxna) och dödlighet (när riktade SNF7 och en steroid receptor coactivator) i larval Aedes aegypti1,2 . Dödligheten har också observerats när inriktning HSP70 i larval Musca domestica3. Sådana fenotypisk effekter, har dock inte resulterade efter utfodring dsRNA till vuxen Ae. aegypti i socker måltider4,5.
Mikroskop har använts för att kringgå midgut vid införandet av patogener eller nukleinsyror, därmed inducera en systemisk reaktion5,6,7,8,9,10 . Finns flera Mikroskop tekniker, som inbegriper utrustning alltifrån internt producerade apparaturar som kräver visuell mätning av injektionsvolymen till mikroprocessorstyrda spridare som möjliggör automatiserad volym leverans så lågt som 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interferens (RNAi) utlösare inriktning ribosomal mRNA, störa cystor utveckling i leddjur så olika som boskap fästingen Rhipicephalus microplus, myggen Aedes aegypti och Culex pipiens, och huset flyga Musca domestica5,9,12,13. I dessa studier var övervakning störningar av ovipositionen avgörande för att fastställa effekten av ympmedel som fenotypen kan manifesteras som uppsägning eller minskning av avkomman. Detta är en form av multigenerational dödliga fenotyp som är en kritisk och önskad effekt i många av icke-traditionella Agrilus metoder som Wolbachia -infekterade män introduktion (sexuell inkompatibilitet) och RNAi inducerad sterilitet5 ,9,14. Spåra både dödlighet och fruktsamhet är nödvändiga för att karakterisera och utvecklingen av mycket specifika biorationals (naturligt förekommande patogener eller naturliga derivat)15.
Detta protokoll presenterar detaljerade Mikroskop tekniker för både vuxna myggor och hus flugor; en process som är ofta inte väl beskrivna i litteraturen. Dessutom beskrivs ovipositionen bioassay metoder att på ett adekvat sätt utvärdera dsRNA effekter på vuxna dipterans. Dessa protokoll har utvecklats speciellt för Aedes aegypti och Musca domestica men kan ändras för andra arter.
Protocol
1. insekt förberedelse
- Söva myggor genom kylning dem vid 4 ° C för flera timmar eller av 2 min exponering för CO2 och sedan hålla vid 4 ° C före injektioner. Kalla söva flugor vid 4 ° C 2\u20123 h före injektioner. Säkerställa myggor och flugor är parade om ovipositionen är en variabel som svar.
Obs: Mosquito anesthetization metoden beror på art och stam, t.ex., Culex återhämta sig mycket snabbare från kalla anesthetization än Aedes aegypti och CO2 knockdown är därför att föredra. - På isen, noggrant scenen mygg eller flugor med mjuk pincett för att lägga dem ventralt exponeras på mikroskopet diabilder ~0.5 cm mellanrum. Standard diabilder kan hålla två rader med 6 myggor varje eller 6 – 7 hus flyger. Lämna ett 1-1,5 cm mellanrum i vänster eller höger slutet av bilden fritt från mygg eller flugor till stöd bild hantering.
- Hålla presentationer av stegvis insekter vid 4 ° C i stora petriskålar tills redo för injektion.
Obs: Borra ett hål genom petriskål locket kommer att förhindra insekter från att störas av luft förskjutning när tak. Att placera bilder på ett par glas kapillärer säkrade längst skålen kommer att underlätta borttagning från petriskål.
2. insekt injektion
- Förbereda dsRNA som beskrivs av Estep o.a. 5 och Sanscrainte o.a. 9. om fritt från föroreningar, dsRNA kan kvantifieras med en spektrofotometer för att mäta absorbansen vid 260 nm och beräkning av RNA-koncentrationen i μg/mL som en260 × utspädning faktor × 40.
- Ställ in dissekera Mikroskop och microinjector över en chill tabell eller grunt ishink att utföra injektioner på kall-sövd myggor och flugor (se steg 1.1 – 1.3 och figur 1).
- Dra glas kapillärer till en fin spets med nål avdragare (inställningar: värmare = 15 enheter, magnetventil = 4 A).
Obs: Se Tabell av material för tillverkarens information. - Placera kapillär nålen i en microinjector enligt tillverkarens instruktioner och paus nålspetsen genom att nypa med en pincett att producera en vass spets.
Obs: Föreslagna nål öppning storlekar är ~ 150 µm för mygga och ~ 250 µm för husfluga. - Ange microinjector för önskad leveransvolym. Menisken rörelse från ~ 50 nL alikvoter är lätt observerbara och rekommenderas för mosquito microinjections. Om tillgängligt, aktivera snabb injektion inställningar. Skölj nålen genom att fylla och utvisa nuclease-fritt vatten 3 gånger.
- Bereda lösningar för injektion vid en koncentration som sådan att 100\u2012150 nL kommer att ge önskad dos för myggor och 500 nL kommer att ge önskad dos för hus flugor.
Obs: Föreslog initiala doser: 1 µg för varje mygga och 5 µg för varje fluga5,9. - Valfritt för myggor, lägga till rodamin B (till stöd i visualisering) till lösningar med en slutlig koncentration på 3,0 µg/mL.
Obs: Färgämnet syns tydligt av dess rosa färg efter injektion genom nästan klart nagelbanden på ventrala ytan i buk och bröstkorg skärningspunkten. - Pipettera 3 – 4 µL av lösning för att injicera på en ren yta (till exempel en bit paraffin film) och dra i glas nålen utan att suga någon luft. Tryck in knappen Injicera upprepade gånger tills vätska börjar fördela från nålen och försiktigt torka droppar med en delikat uppgift torkare.
Obs: Medan vissa modeller av microinjectors kräver återfyllning sprutan, injektorn refereras i Tabellen av material inte. - En ultrafin punkt Rita märkpenna hash märken ~ 1 mm apart start från flytande menisken för att nålen skaftet. Detta kommer stöd i visualisera menisken rörelsen och se till att lösningen har angett mygga under injektionen.
- Ange bilden av mygg eller flugor (som förberett i steg 1,2 – 1,3) under nålen på chill bordet eller is (figur 1). Säkerställa att synfält i mikroskopet är tillräckligt bred för att se lösningen menisken i nålen.
- För myggor, justera nålen med den mellersta tredjedelen av mesokatepisternum (figur 2A), och medan stärkande mygga mot nålen med pincett placerade på motsatta sidan, försiktigt punktera nagelbanden med nål spets med den microinjector mikrometer.
- För hus flugor, justera nålen med mesopleuron (figur 2B) och samtidigt stagning i farten mot nålen, försiktigt punktera nagelbanden med kanylspetsen.
- Försiktigt glida nålen i mygga eller fluga kroppen tills spetsen har passerat mittlinjen.
Obs: Du för in nålen för grunt ofta resulterar i den injicerade flytande beading av insekten (se steg 2.15). - Medan du tittar på för förflyttning av den flytande menisken i nålen, tryck in knappen injicera tills önskad mängd vätska har injicerats. För myggor, om inställt på 50,6 nL alikvoter, tryck 2 X för ~ 100 nL eller 3 X för ~ 150 nL. För hus flugor, tryck in knappen injicera tills ~ 500 nL har injicerats (dvs. med 69 nL alikvoter tryck 7 X för 483 nL).
- Om menisken inte flytta, långsamt glida mygga eller flyga iväg nålen medan du tittar för menisk rörelse. Om en del av de injicerade lösning pärlorna ur nagelbanden vid nålen avlägsnas eller om menisken misslyckas att flytta, slänger insekten som lyckades inte denna injektion.
- Överföra framgångsrikt injicerade myggor i grupper om 10-15 eller hus flugor i grupper av 5 rensa 3.5 oz håller koppar. Täck med tyll eller nettning och återställa vid rumstemperatur.
- Efter myggor och flugor har återhämtat sig (1 – 2 h), Invertera varje innehav cup över en bomullstuss indränkt med 10% sackaroslösning.
Obs: Inversionen av koppen ovanpå sackaros bomull aids i överlevnad genom att ge enklare tillgång till socker måltid10. - Skölj nål som i steg 2.5 mellan injektion lösningar. När du är klar att injicera, används kassera nålar i en lämplig avfallsbehållare.
3. aedes aegypti dödlighet och ovipositionen bioassay
- För tre dagar efter injektion, fortsätta att ge myggor med 10% sackaros och registrera antalet synbart döda myggor.
- Fyll en ≤12-tums konstgjorda membranet (såsom kollagen korv höljet) med färskt blod (dvs. nötkreatur för Aedes aegypti) och Värm till 60 ° C i vattenbad.
- Kort torka membran genom att rulla på en pappershandduk och lägg över tyll mössor av 3.5 oz klart håller koppar. För att förbättra utfodring, spike blod med 1 mM ATP efter uppvärmning som en phagostimulant eller genom handtaget värmde blodet korven med ren händerna att lämna mänskliga flyktiga ämnen på höljet ytan.
- Efter blod utfodring, ersätter bomullstuss indränkt med 10% sackaros ovanpå anläggningen kopparna och tillåter myggor att vila för ~ 24 h innan du överför till ovipositionen koppar.
- Konstruera ovipositionen koppar genom att fylla rensa 3.5 oz bioassay koppar med ~ 30 mL avjoniserat H2O och placera en papperslapp fröet grobarhet (~ 4 cm breda och 5 cm långa med åsar som löper vertikalt) på botten av koppen och mot sida (figur 3A) . Täck med tyll eller nettning och skär en liten skåra (~ 1 cm) i tyll eller nettning cap.
- På 24 h efter blod utfodring, skär en liten skåra (~ 1 cm) i tyll cap innehav Cup och överföra endast enskilda kvinnor som framgångsrikt matas — med ett synligt blod bolus i buken — av mild mun aspiration i ovipositionen koppar (1 kvinna/ovipositionen kopp). Täta små skära i ovipositionen locket med en 10% sackaros mättade bomullstuss.
- -Muggar vid ~ 27 ° C i 5\u20127 dagar så att myggor till fullt oviposit medan spårning daglig dödlighet. Räkna ägg under en dissekera omfattning.
4. Musca domestica dödlighet och ovipositionen bioassay
- För tre dagar efter injektion, fortsätta att ge flugorna med 10% sackaros och registrera antalet synbart döda flugor.
- Tre dagar efter injektionen, söva flugor genom att kort placera ett polyeten rör dispensering CO2 över innehav kopparna tills alla flugor är orörlig längst ned i kopparna.
- Överföra flugor till en ren bur som består av en 4 L plast burk med en stockinette hylsa som täcker öppningen (10 cm, figur 3B). Ger flugor med vatten och en blandning av granulerad sackaros, mjölkpulver, och torkad äggula i en 8:8:1-förhållande (i volym) i fyra dagar, inspelning och ta bort döda flyger dagligen.
- Förbereda torra ingredienserna för färska flyga larval uppfödning medium genom att blanda 75% vetekli med 25% pelleterat foder av vikt. Tillsätt vatten för att nå 62% fukt (tills en droppe vatten kan knappt pressas ut).
- Förbereda en 2,5 cm diameter boll från en 1:1 blandning av ovanstående färska larval media och ”används” flyga larval medium (medium där flugor har tidigare pupated). Linda in bollen i en kvadrat med svart bomullstyg, pressa lätt tills medium vätska sipprar genom och sedan använda gummiband som håller duken på plats runt bollen.
- Sätta bollen i en 60 mL kopp och placera den i fly buren i 5 h (figur 3B).
- Skölj ägg av ovipositionen bollen och se till att äggen tas bort från under veck på duken. Skaka ägg för att störa kluster och överföra dem till en graderad 20 mL centrifugrör med en överföring Pipettera.
- Vänta tills äggen lösa och notera volymen av fast ägg i graderade röret. Tillsätt tillräckligt med vatten för att få volymen upp till 20 X volymen av fast ägg. Spela in den totala volymen av vatten plus ägg.
- Samtidigt blanda vatten och ägg suspensionen med magnetiska rör bar eller kraftig omrörning, Använd en 1 mL Pipettera spets (med slutet av spetsen avskurna) att dosera 0,5 mL i vatten och ägg suspension på en bit av pre-fuktad svart tyg i en serie linjer. Räkna äggen under en dissekera Mikroskop.
- Upprepa steg 4,9 två gånger. Om en av räkningarna är en svår avvikare (dvs, skiljer sig från de andra två räkningarna av > 35%), göra en fjärde räknas och bortse från avvikare.
- Beräkna det genomsnittliga antalet ägg per prov och multiplicera värdet med 2 för att få antalet ägg/mL av suspensionen. Multiplicera värdet ägg/mL erhålls genom volymen av ägg fjädringen från steg 4,8. Detta är uppskattningen för det totala antalet ägg som.
Representative Results
Mikroskop av dsRNA i myggor
Den här Mikroskop metoden har använts i vårt laboratorium för att utvärdera genuttryck, dödlighet och ovipositionen svar för över 80 dsRNA utlösare över flera mosquito släkten (Aedes, Anopheles, Culex). Injicera honor från kolonin stam av Ae. aegypti (ORL1952) med 1 µg av dsRNA härrör från de ribosomal avskrifter RPS6 och RPL26 (se Estep o.a. 5 för dsRNA produktionsmetoder och sekvensdata) visade signifikant minskning i relativa uttryck (RE) över flera ovipositionen cykler jämfört med myggor injiceras med en kontroll dsGFP. Aedes aegypti RE mätt efter 2nd gonotrophic cykeln visade signifikant minskning av RPS6 uttryck (P < 0,05) i myggor injiceras med dsRPS6 som bestämts av Students t-test mellan dsGFP kontroll i samma grupp (figur 4),5 .
Fruktsamhet bedömdes från enskilda kvinnor använder ovipositionen bioassayen beskrivs här. Efter 3 dagar efter injektion var myggor blod matas, överförs till enskilda ovipositionen behållare och tillåtet att lägga till fullbordan. Genomsnittliga koppling storlekar för den första gonotrophic-cykeln betydligt för båda dsRPS6 behandlade Ae. aegypti (n = 102 kvinnor, 1,3 ± 0,8 (medelvärde ± SE) ägg) och dsRPL26 behandlas (n = 86 kvinnor, 4,0 ± 1,1 ägg) jämfört med dsGFP injektioner (n = 79 kvinnor, 49,3 ± 3,5 ägg, figur 5A). Koppling bedömning efter en andra gonotrophic cykel visade också signifikant minskad ovipositionen för båda dsRNA behandlade grupperna, men med reducerad effekt storlek. Gruppstorlekar av Ae. aegypti var variabel och således betyder separation utfördes av Dunn's test5. Twenty-four-hour dödlighet var normalt 3% eller mindre.
Ett klart dos-effekt observerades vid injektion av dsRPS6 från 1 µg till 50 ng i kvinnliga Ae. aegyptioch koppling storlek varierade avsevärt jämfört med 1 µg/hona dsGFP insprutning kontroller i alla utom 25 ng/hona dsRPS6 dosen (figur 5B).
Mikroskop av dsRNA i hus flyger
Kolonin Musca domestica (ORL normala) injicerades med 5 µg dsRNA konstruktioner avsedda mot huset flyga RPS6 och RPL26 avskrifter9. Som observerades i Ae. aegypti, observerades signifikant reduktion av både specifika avskrift uttryck (RPS6 och RPL26) och minskning av koppling storlek (figur 4 och figur 5A). Signifikant reduktion i RE bestämdes av Students t-test mellan dsGFP kontroll i samma grupp (P < 0,05) och Holm-Sidak testet användes för att fastställa betydelsen mellan koppling storlekar för olika M. domestica behandlingsgrupperna. Ovariell dissektioner visade minskad oogenes i dsRPS6 och dsRPL26 behandlingar, medan dsGFP fed flugor hade normala vitellogenin nedfall som betygsatt på Tyndale-Biscoe skala9.
Figur 1: Mikroskop setup för att leverera microvolumes till vuxna myggor och hus flugor. Injektioner utförs på kall-sövd insekter iscensatt på objektglas över en chill tabell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikroskop platser för Ae. aegypti och M. domestica. (A) Adult Ae. aegypti injiceras i den mellersta tredjedelen av mesokatepisternum. (B) vuxen M. domestica injiceras i mesopleuron. Pilarna anger platser av injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ovipositionen bioassay setup. (A) Ae. aegypti ovipositionen assay koppar med fröet grobarhet papper som en ovipositionen substrat, utjämnade med tyll och 10% sackaros-indränkt bomull. (B) vuxna kvinnliga M. domestica i en ovipositionen assay behållare med mat (A), vatten (B) och larver media (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Relativa uttryck för RPS6 i Ae. aegypti och M. domestica injiceras med artspecifika dsRNAs. Aedes aegypti och M. domestica injicerades med 1 och 5 µg respektive av antingen kontroll dsRNA (dsGFP) eller dsRNA utformade mot RPS6 eller RPL26 avskrifter från varje insekt. Signifikant (P < 0,05) av RPS6 uttryck observerades hos myggor och flugor som injiceras med dsRPS6 och av flugor som injiceras med dsRPL26 (indikeras av asterisker). Felstaplar representera medelvärde ± SE och pelarfot siffran anger antal individer som granskas. Denna siffra har ändrats från Estep o.a. 5 och Sanscrainte o.a. 9. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: Genomsnittlig koppling storlek Ae. aegypti och M. domestica injiceras med artspecifika dsRNAs. (A) ägg nedfall minskade signifikant (P < 0,05) i både Ae. aegypti och M. domestica efter injektion av 1 och 5 µg respektive av antingen kontroll dsRNA (dsGFP) eller dsRNA utformad mot RPS6 eller RPL26 avskrifter från varje insekt. Asteriskerna visar signifikanta skillnader från dsGFP kontroll i samma grupp. Felstaplar representera medelvärde ± SE och pelarfot siffran anger antal individer som granskas. Denna siffra har ändrats från Estep o.a. 5 och Sanscrainte o.a. 9. (B) dos kurva av Ae. aegypti injiceras med dsRPS6 från 50 ng/kvinna till 1000 ng/kvinna visar betydande minskningar i fruktsamhet jämfört med dsGFP injiceras kohorter (50, 100 och 1000 ng/kvinna). Felstaplar representera medelvärde ± 95% CI från 36-81 enskilda organismer per dos. Punkter med bokstäver representerar signifikant skillnad mellan grupperna (P < 0,05) identifieras av ANOVA. Denna siffra har ändrats från Estep o.a. 5. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
Mikroskop är en värdefull laboratorium-teknik för att säkerställa leverans av dsRNA eller andra biorationals (dvs. bekämpningsmedel, virus, microsporidia). Medan många laboratorier utföra Mikroskop, är det exakta beloppet som injiceras ofta oklart på grund av tekniska begränsningar av leveranssystem där levererade volymen inte är direkt uppmätta11. Levererad volym och koncentration är kritiska parametrar som tillåter beräkning av toxikologiska standardåtgärder som EC50 eller IC50 eller för att definiera minimala effektiva doser5,16. Detta är särskilt viktigt i funktionella studier med hjälp av RNAi i vuxna insekter, där leverans av utfodring leder inte alltid till systemisk exponering för önskad partiklarna och faktisk dos passerar midgut är oklart5.
Förfarandet för Mikroskop kan vara initialt utmanande, uppnås snabba förbättringar i hastighet och leverans noggrannhet med övning och tålamod. Mastering injektion själva förfarandet är en investering i tid, men, när fulländat, förfarandet ger repeterbara resultat och dödlighet efter skada av < 3%. Förhållandet mellan framgångsrika injektioner kommer att öka kunskaper ökar så att injektion av 300 mygg eller flugor per dag.
Många av utmaningarna i Mikroskop är på grund av nålen används. Att fastställa ordentlig kapillär nål brytpunkt och spets vinkel är ett utmanande aspekt av förfarandet och kräver några försök och misstag att fastställa den mest effektiva öppning storleken för en viss art. En fin nål som är mest användbara för mygga Mikroskop (~ 150 µm) är för liten för att snabbt leverera den större volymen som injiceras i flyger medan däremot större nålen öppning att verk på flugor (~ 250 µm) orsakar omfattande skador skador för mindre myggor och oacceptabla injektion dödlighet. En nål som brutit med en trubbig spets är ofta svårt att få igenom nagelbanden utan vävnadsskada och ökad dödlighet. Insekt skalor eller vävnad bitar kan täppa nålar under loppet av ett experiment, så är det ofta användbart att ha flera nålar drog om byte krävs. Vi har funnit att det är lättare att ersätta en svårt nål i stället för att spendera tid att försöka rensa en fastnat eller sotigt nål.
Att observera injektionslösningen in insekten är kritisk så att misslyckade injektioner kan tas bort (se stegen 2.14-2.15). Rodamin B komplement till injektion lösningar ger en tydlig visuell för att säkerställa att kalla-iscensatt insekter får korrekt dosering och är särskilt användbart samtidigt öva (se steg 2,7).
De metoder för injektion och ovipositionen bioassay som presenteras här har framgångsrikt inducerade genen knockdown och mätbara fenotypisk effekter i vuxen Ae. aegypti och M. domestica när du dsRNAs utformats mot artspecifika ribosomal avskrifter (figur 4 och figur 5A). Dessutom, denna metod förmåga att korrekt leverera microvolumes till individer möjliggör dos-responskurvor ska genereras för små mängder material (så lågt som 50 ng; Figur 5B). Detta är särskilt användbart för metoder såsom screening siRNAs eller dsRNAs, som producerar stora kvantiteter av dessa molekyler kan kostnaden oöverkomliga.
Denna metod kan ändras för att injicera biologiska agens (virus, bakterier, microsporidia) eller kemiska bekämpningsmedel, efter att säkerställa att varje leverans buffertar är ofarlig genom injektion. Leveransvolym begränsas av storleken på insekten, producerar koncentrerad är testa lösningar viktigt.
För att på ett adekvat sätt utvärdera dsRNA effekten, är det nödvändigt att spåra ovipositionen som dödliga fenotyper kan endast manifesteras hos avkomman. Som presenteras här, håller kvinnliga Ae. aegypti separat efter blooding möjliggör bestämning av enskilda koppling storlek och ytterligare tester på samma personer kan göras nedströms ovipositionen (dvs gen uttryck studier, ytterligare gonotrophic cykler, vävnad specifika knockdown) att korrelera reproduktionskapaciteten med andra åtgärder såsom genuttryck. Som M. domestica oviposit allmänt en grupp svar, är anstiftan isolerade dräktig flugor att lägga mycket arbetskraft intensiv och inte praktiskt för ett stort antal individer17. Därför presenteras en metod för att bestämma medelvärdet koppling storlek.
Mikroskop metoden presenteras här ger konsekvent systemisk leverans till myggor och hus flugor. Tillsammans med dödlighet och ovipositionen spårning bioassays, kan dessa mångsidiga verktyg användas för att bedöma transkriptionell och fenotypiska effekterna av små RNA-molekyler, biologiska agens och traditionella bekämpningsmedel där muntliga leverans inte är lönsamt.
Disclosures
Alla författarna är anställda eller entreprenörer av United States Department of Agriculture eller försvarsdepartementet. Detta manuskript producerades under tjänsteplikt och är enligt lag i det offentliga rummet. Åsikterna representerar yttrandet från författarna och representerar inte en officiell ståndpunkt eller påskrift av den amerikanska regeringen. Omnämnandet av en kommersiell produkt är inte en rekommendation för användning.
Acknowledgments
Författarna tackar Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li och Roxie White (USDA-ARS) för hjälp med datainsamling och analys. Vi tackar också Drs. Pia Olafson (USDA-ARS) och Ke Wu (University of Florida) för kritisk granskning av manuskript och Niklaus Hostettler (University of Florida) för filmning Mikroskop filmen. Finansieringen tillhandahölls av USDA, WII - 141C projektet av marinen och Marine Corps Public Health Center och programmet distribuerat War Fighters-skydd. Finansiärerna hade ingen roll i design eller utveckling av manuskript eller riktning av studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
