Summary
Denne protokollen beskriver en microinjection metode som vi har standardisert og brukt i flere år for å levere bestemte mengder nukleinsyrer direkte til hemolymph av mygg og huse fluene. Denne protokollen gir minimal injeksjon dødelighet og lar dose korrelert målinger av fruktbarhet.
Abstract
Syntetiske dsRNAs, brukes til å indusere RNA-interferens, må dose avhengige fenotypiske effekter. Disse effektene er vanskelig å definere hvis dsRNAs leveres med en ikke-kvantitativ metode. Nøyaktig levering av kjente mengder nukleinsyrer eller andre kjemikalier er viktig å måle effekten av sammensatte testes og tillate pålitelig sammenligning mellom forbindelser.
Her gir vi en reproduserbare, kvantitativ microinjection protokoll som sikrer presis levering av bestemte doser av dsRNA, redusere dødeligheten vanligvis forårsaket av injeksjon skade. Disse endringene inkluderer tillegg av Rhodamine B, en uteksaminert injeksjon nål, og en forbedret gjenopprettingsmetode lånt fra Isoe og Collins. Denne metoden gjør at beregningen av dosen svar og forenkler sammenligninger mellom forbindelser. Versjoner av denne metoden har blitt brukt på 3 planteslekter mygg samt huse fluene for å vurdere reduksjon i fruktbarhet skyldes genet stanse ribosomal RNA transkripsjoner.
Denne protokollen gir strategier for å redusere flere utfordringer av lite insekt microinjection. Sammen, mekanisk levering av dsRNAs ledsaget av visuell bekreftelse, identifikasjon av effektiv steder for levering, og inkludering av en post injeksjon restitusjonsperiode sikre riktig dosering og lav skade dødelighet. Denne protokollen beskriver også en oviposition bioassay for uniform fastsettelse av virkningene på fruktbarhet.
Introduction
Levere små biomolecules, som nucleic syrer, til voksen dipterans har vist seg for å være utfordrende både store forekomster og fluelarver. Muntlig opptaket av dsRNAs har blitt rapportert å produsere sterilitet (når målretting gener utelukkende uttrykt i testiklene voksne) og dødelighet (når rettet mot SNF7 og en steroid reseptor-coactivator) i larver Aedes aegypti1,2 . Dødelighet er også observert når målretting HSP70 i larver Musca domestica3. Slike fenotypiske effekter, men resultert ikke etter fôring dsRNA til voksne Ae. aegypti i sukker måltider4,5.
Microinjection er brukt til å omgå midttarmen og blir når introdusere patogener eller nucleic syrer, og dermed indusere en systemisk respons5,6,7,8,9,10 . Flere microinjection teknikker finnes, med utstyr fra in-house produsert apparatene som krever visuelle måling av injeksjon volumet Mikroprosessorstyrt sprøytebrukere som tillater automatisk volum levering så lavt som 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA forstyrrelser (RNAi) utløsere målretting ribosomal mRNAs, forstyrre ovarian utvikling i leddyr så forskjellige som storfe tick Rhipicephalus Micro Plus, myggen Aedes aegypti og Culex pipiens, og huset fly Musca domestica5,9,12,13. I disse studiene var overvåking avbrudd i oviposition avgjørende for å bestemme effekten av inoculant som fenotypen kan manifestere seg som avslutning eller reduksjon av avkom. Dette er en form for multigenerational lethal fenotypen som er en kritisk og ønsket effekt i mange av ikke-tradisjonelle biocontrol metoder som Wolbachia -infisert menn introduksjon (seksuelle inkompatibiliteten) og RNAi indusert sterilitet5 ,9,14. Både dødelighet og fruktbarhet er nødvendig for karakterisere og utvikling av svært spesifikke biorationals (naturlig forekommende patogener og/eller naturlig derivater)15.
Denne protokollen gir detaljert microinjection teknikker for både voksne mygg og huset fluer; en prosess som er ofte ikke godt beskrevet i litteraturen. I tillegg er oviposition bioassay metoder tilstrekkelig vurdere dsRNA effekter på voksen dipterans beskrevet. Disse protokollene ble utviklet spesielt for Aedes aegypti og Musca domestica , men kan endres for andre arter.
Protocol
1. insekt forberedelse
- Bedøve mygg ved chilling dem på 4 ° C i flere timer eller 2 min eksponering for CO2 og deretter holde på 4 ° C før injeksjoner. Kalde bedøve fluer på 4 ° C 2\u20123 h før injeksjoner. Sikre mygg og fluene er parret hvis oviposition er et svar-variabel.
Merk: Mygg anesthetization metoden avhenger av arter og belastning, f.eks Culex komme seg mye raskere fra kald anesthetization enn Aedes aegypti og derfor CO2 knockdown anbefales. - På is, nøye scenen mygg eller fluer med myk tang for å legge dem ventrally utsatt på mikroskopet lysbilder ~0.5 cm fra hverandre. Standard lysbilder kan holde to rader med 6 mygg eller 6-7 huset fluer. La et 1-1,5 cm mellomrom på venstre eller høyre slutten av lysbildet klar av mygg eller fluer å hjelpe Skyv håndtering.
- Hold lysbilder av iscenesatt på 4 ° C i store Petri retter til du er klar for injeksjon.
Merk: Bore hull gjennom Petriskål lokket forhindrer insekter blir forstyrret av luft forskyvning når capping. Plassere lysbilder på et par glass kapillærene sikret til parabolen bunnen vil lette fjerning fra Petriskål.
2. insekt injeksjon
- Forberede dsRNA som beskrevet av Estep et al. 5 og Sanscrainte et al. 9. Hvis gratis forurensninger, dsRNA kan kvantifiseres med et spektrofotometer for å måle absorbansen 260 nm og beregning av RNA konsentrasjon i μg/mL som en260 × fortynning faktor × 40.
- Angi dissekere mikroskop og microinjector over en chill tabell eller grunt is bøtte utføre injeksjoner på kalde-anesthetized mygg og fluer (se trinn 1,1-1,3 og figur 1).
- Dra glass kapillærene til en fin spiss med nål avtrekker (innstillinger: ovn = 15 enheter solenoid = 4 A).
Merk: Se Tabell for materiale for produsentens detaljer. - Plass kapillær nålen i en microinjector henhold til produsentens instruksjoner og pause pinne-spissen av knipe med en tang til å produsere en skarp poeng.
Merk: Foreslåtte nål åpning størrelser er ~ 150 µm for moskito og ~ 250 µm for flue. - Angi microinjector for ønsket levering volum. Menisk bevegelse fra ~ 50 nL dele er lett observerbare og anbefales for mygg microinjections. Hvis Aktiver innstillinger for rask injeksjon. Skyll nålen ved å fylle og utvise nuclease-fritt vann 3 ganger.
- Utarbeide løsninger for injeksjon i en konsentrasjon slik at 100\u2012150 nL vil gi ønsket dose for myggen og 500 nL vil gi ønsket dose for huse fluene.
Merk: Foreslo første doser: 1 µg for hver moskito og 5 µg for hver flue5,9. - Valgfritt for mygg, legge Rhodamine B (for å hjelpe til med visualisering) løsninger på en siste konsentrasjon av 3.0 µg/mL.
Merk: Fargestoff vil bli synlig ved sin rosa farge etter injeksjon gjennom nesten klar cuticle på ventral overflaten i magen/thorax skjæringspunktet. - Pipetter 3-4 µL løsningen å injisere på et rent underlag (for eksempel et stykke parafin film) og trekke i glass nålen uten suger i noen luft. Trykke ned på Sett inn-knappen gjentatte ganger til væsken begynner å dispensere fra nålen og forsiktig stryke dråper med en delikat oppgave vindusvisker.
Merk: Mens noen modeller av microinjectors krever tilbakefylling sprøyten, injektoren i Tabellen for materiale ikke. - Med en ultra-fin spiss markør, tegne hasj merker ~ 1 mm fra hverandre starter fra den flytende meniscus til p skaft. Dette vil hjelpe visualisere menisk bevegelse og sikre at løsningen har angitt mosquito under injeksjon.
- Angi lysbildet mygg eller fluer (som forberedt i trinn 1.2-1.3) under nålen chill tabellen eller is (figur 1). Sikre at synsfelt i mikroskopet er bred nok til å se den løsning meniscus i nålen.
- Mygg, justere nålen med den midtre tredjedel av mesokatepisternum (figur 2A) og mens oppkvikkende mosquito mot nålen med tang plassert på motsatt side, forsiktig punktering cuticle nål tips bruke den microinjector mikrometer.
- For huset fluer, justere nålen med mesopleuron (figur 2B) og, mens avstiving fly mot nålen, forsiktig punktering cuticle med pinne-spissen.
- Forsiktig skyv nålen inn mosquito eller fly kroppen til spissen har gått gjennom midtlinjen.
Merk: Sette inn nålen for grunt ofte resulterer i det injiserte flytende profilering av insekt (se trinn 2,15). - Mens du ser for bevegelse av den flytende meniscus i nålen, trykker du knappen Sett inn til den ønskede mengden av væske har blitt injisert. For mygg, hvis satt til 50.6 nL dele, trykk 2 X for ~ 100 nL eller 3 X ~ 150 nL. For huset fluer, trykker du knappen Sett inn til ~ 500 nL har blitt injisert (dvs. med 69 nL dele trykk 7 X for 483 nL).
- Hvis meniscus ikke beveger, sakte skyve mosquito eller fly av nålen mens du ser for menisk bevegelse. Hvis en del av den injiserte løsning perler av cuticle nål fjerning eller hvis meniscus mislykkes å flytte, forkaster insekt som var denne injeksjon ikke vellykket.
- Overføre ble injisert mygg i grupper på 10-15 eller huset fluer i grupper på 5 for å fjerne 3,5 oz holder kopper. Dekk med tyll og netting og gjenopprette ved romtemperatur.
- Etter mygg og fluene har gjenopprettet (1-2 h), invertere hver holder kopp over en bomull ball fuktet med 10% sucrose løsning.
Merk: Inversjon av koppen over sukrose bomull aids i overlevelse ved å gi enklere tilgang til en sukker måltid10. - Skyll nål som i trinn 2.5 mellom injeksjon løsninger. Når ferdig injeksjon kvitt deg med brukte nåler i en egnet beholder.
3. aedes aegypti dødelighet og oviposition bioassay
- For tre dager etter injeksjon, fortsette å gi mygg 10% sukrose og registrere antall synlig døde mygg.
- Fyll en ≤12-tommers kunstig membran (for eksempel kollagen pølse foringsrør) med friskt blod (dvs. bovin for Aedes aegypti) og varme til 60 ° C i varmt vannbad.
- Kort tørr membranen ved å rulle på et papirhåndkle og lå over tyll caps på 3,5 oz klart holde kopper. For å forsterke fôring, spike blod med 1 mM ATP etter oppvarming som en phagostimulant eller som varmet blodpølse med rense Bart hender å la menneskelige flyktige på casing overflaten.
- Etter blod fôring, erstatte bomull ball fuktet med 10% Sukrose på holde koppene og tillate mygg hvile for ~ 24 h før du overfører til oviposition kopper.
- Konstruere oviposition Cup fylle fjerne 3,5 oz bioassay kopper med ~ 30 mL vaskebuffer H2O og plassere frø spiring papir (~ 4 cm bred og 5 cm lang med rygger loddrett) nederst i cup og mot siden (figur 3A) . Dekk med tyll og netting og skjær en liten sprekk (~ 1 cm) i tyll og netting cap.
- På 24 timer etter blod fôring, skjær en liten sprekk (~ 1 cm) i tyll cap av holder cup og overføre bare enkelte kvinner som ble matet, med en synlig blod bolus i magen-av mild munnen aspirasjon i oviposition kopper (1 kvinne/oviposition cup). Forsegle de små kutt i oviposition lokket med en 10% sukrose mettet bomullsdott.
- Hold kopper på ~ 27 ° C i 5\u20127 dager for at myggen til fullt oviposit mens sporing daglig dødelighet. Antall egg under en dissecting omfang.
4. Musca domestica dødelighet og oviposition bioassay
- For tre dager etter injeksjon, fortsette å gi fluene 10% sukrose og registrere antall synlig døde fluer.
- Tre dager etter injeksjon, bedøve fluer ved kort å plassere en polyetylen rør dispensing CO2 over holder koppene til alle fluene er urørlig nederst i koppene.
- Overføre flyr til en ren bur består av 4 L plast glasset med en glattstrikk ermet som dekker åpningen (10 cm, figur 3B). Fluer med vann og en blanding av granulert sukrose, pulverisert melk, og tørket eggeplomme i 8:8:1-forhold (etter volum) i fire dager, innspilling og fjerne død flyr daglig.
- Forberede tørre ingredienser frisk fly larver oppdrett medium ved å blande 75% hvetekli med 25% pelleted husdyr feed vekt. Legge til vann for å nå 62% fuktighet (inntil en dråpe vann kan knapt bli presset ut).
- Forberede en 2,5 cm diameter ball fra en 1:1 blanding av over frisk larver media og "brukt" fly larver medium (medium som fluer har tidligere pupated). Brytes ballen i et svart bomull klut, presse lett til middels væske siver gjennom og bruke gummi band til å holde kluten på plass rundt ballen.
- Sette ballen i 60 mL kopp og plasser den på fly buret for 5 h (figur 3B).
- Skyll egg av oviposition ballen og sikre at eggene er fjernet fra folder i duken. Riste egg for å forstyrre klynger og overføre dem til en uteksaminert 20 mL sentrifuge rør med en overføring pipetter.
- Vent til eggene bosette og Merk volumet av utlignede eggene i uteksaminert røret. Legg nok vann til å bringe volumet opptil 20 X volumet av utlignede eggs. Registrere det totale volumet av vann pluss egg.
- Mens vann og egg suspensjon med enten magnetic røre bar eller energisk omrøring, bruke en 1 mL Pipetter tips (med slutten av spissen kuttet) til å dispensere 0,5 mL vann og egg suspensjon på et stykke pre-fuktet black klut i en serie linjer. Telle egg under dissecting mikroskop.
- Gjenta steg 4,9 to ganger. Hvis en teller er en alvorlig avvikende (dvs. er forskjellig fra de andre to tellinger av > 35%), gjør en fjerde teller og ignorere avvikende.
- Beregne gjennomsnittlig antall egg per prøve og multipliserer verdien med 2 få antall egg/mL av suspensjon. Multiplisere den egg/mL verdien av volumet av egg suspensjon fra trinn 4.8. Dette er anslaget for antall egg lagt.
Representative Results
Microinjection av dsRNA i mygg
Denne microinjection metoden er brukt i vårt laboratorium evaluere genuttrykk, dødelighet og oviposition svar for over 80 dsRNA utløsere over flere mygg slekter (Aedes, Anopheles, Culex). Injisere kvinner fra kolonien stammen av Ae. aegypti (ORL1952) med 1 µg av dsRNA fra ribosomal transkripsjoner RPS6 og RPL26 (se Estep et al. 5 dsRNA produksjonsmetoder og sekvens data) viste signifikant reduksjon i relativ uttrykk (RE) over flere oviposition sykluser sammenlignet med mygg injisert med en kontroll dsGFP. Aedes aegypti RE målt etter 2nd gonotrophic syklusen viste betydelig reduksjon av RPS6 uttrykk (P < 0,05) i mygg injisert med dsRPS6 som bestemmes av en Student t-test mellom dsGFP kontrollen i samme gruppe (Figur 4)5 .
Fruktbarhet ble vurdert fra enkelte kvinner med oviposition-bioassay beskrevet her. Etter 3 dager etter injeksjon var mygg blod matet overført til individuelle oviposition beholdere og lov til å legge til ferdigstillelse. Gjennomsnittlig clutch størrelser for første gonotrophic syklus ble betydelig redusert for begge dsRPS6 behandlet Ae. aegypti (n = 102 kvinner, 1,3 ± 0,8 (gjennomsnittlig ± SE) egg) og dsRPL26 behandlet (n = 86 kvinner, 4.0 ± 1.1 egg) sammenlignet med dsGFP injeksjoner (n = 79 kvinner, 49.3 ± 3.5 egg, figur 5A). Clutch vurdering etter en andre gonotrophic syklus viste også betydelig redusert oviposition for begge dsRNA behandlet grupper, men med redusert effekt størrelse. Gruppe størrelser Ae. aegypti var variabel, og dermed betyr separasjon ble utført av Dunn's test5. Tyve-fire-timers dødelighet var normalt 3% eller mindre.
En klar doseeffekt ble observert når sprøytebruk dsRPS6 fra 1 µg til 50 ng i kvinnelige Ae. aegyptiog clutch størrelse variert betydelig sammenlignet med 1 µg/kvinne dsGFP injisert kontroller i nesten 25 ng/kvinne dsRPS6 dose (figur 5B).
Microinjection av dsRNA i huset fluer
Kolonien Musca domestica (ORL normal) ble injisert med 5 µg av dsRNA konstruksjoner laget mot huset fly RPS6 og RPL26 utskrifter9. Som ble observert i Ae. aegypti, ble betydelig reduksjon av både bestemt transkripsjon uttrykk (RPS6 og RPL26) og reduksjon i clutch størrelse observert (Figur 4 og figur 5A). Betydelig reduksjon i RE ble bestemt av Student t-test mellom dsGFP kontrollen i samme gruppe (P < 0,05) og Holm-Sidak testen ble brukt til å bestemme betydningen mellom clutch størrelser for forskjellige M. domestica behandlingsgrupper. Ovarian disseksjoner viste redusert oogenesis i dsRPS6 og dsRPL26 behandlinger, mens dsGFP matet fluer hadde normal vitellogenin avsettelse favoritthoteller på formen-Biscoe skala9.
Figur 1: Microinjection installasjonsprogrammet for å levere microvolumes til voksne mygg og huse fluene. Injeksjoner utføres på kalde-anesthetized insekter iscenesatt på objektglass over en chill tabell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microinjection steder for Ae. aegypti og M. domestica. (A) voksen Ae. aegypti blir injisert i den midtre tredjedel av mesokatepisternum. (B) voksen M. domestica er injisert i mesopleuron. Pilene angir områder av injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oviposition bioassay oppsett. (A) Ae. aegypti oviposition analysen kopper med frø spiring papir som en oviposition underlaget, avkortet med tyll og 10% sukrose-gjennomvåt bomull. (B) vann voksne kvinnelige M. domestica i en oviposition analysen beholder med mat (A), (B) og larver media (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Relative uttrykk for RPS6 i Ae. aegypti og M. domestica injisert med artsspesifikke dsRNAs. Aedes aegypti og M. domestica ble injisert med 1 til 5 µg av enten kontroll dsRNA (dsGFP) eller dsRNA designet mot RPS6 eller RPL26 utskrifter fra hver insekt. Betydelig reduksjon (P < 0,05) av RPS6 uttrykk ble observert i mygg og fluer injisert med dsRPS6 og fluer injisert med dsRPL26 (angitt med stjerner). Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± SE og nummer på kolonne base angir antall personer undersøkt. Dette tallet har blitt endret fra Estep et al. 5 og Sanscrainte et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Gjennomsnittlig clutch størrelsen på Ae. aegypti og M. domestica injisert med artsspesifikke dsRNAs. (A) Egg deponering ble betydelig redusert (P < 0,05) både Ae. aegypti og M. domestica etter injeksjon av 1 til 5 µg av begge kontrollene dsRNA (dsGFP) eller dsRNA designet mot RPS6 eller RPL26 utskrifter fra hver insekt. Stjernene angir betydelige forskjeller mellom dsGFP kontrollen i samme gruppe. Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± SE og nummer på kolonne base angir antall personer undersøkt. Dette tallet har blitt endret fra Estep et al. 5 og Sanscrainte et al. 9. (B) Dose kurven av Ae. aegypti injisert med dsRPS6 fra 50 ng/kvinne til 1000 ng/kvinne viser betydelige reduksjoner i fruktbarhet i forhold til dsGFP injisert kohorter (50, 100 og 1000 ng/kvinne). Feilfelt representerer gjennomsnittlig ± 95% CI fra 36-81 individuelle organismer per dose. Poeng med bokstaver representerer signifikant forskjell mellom grupper (P < 0,05) identifisert av VARIANSANALYSE. Dette tallet har blitt endret fra Estep et al. 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Microinjection er en verdifull laboratorium teknikk å sikre levering av dsRNA eller andre biorationals (dvs. plantevernmidler, virus, microsporidia). Mens mange laboratorier utfører microinjection, er nøyaktig hvor injisert ofte uklar på grunn av tekniske begrensninger av levering systemet der leverte volumet ikke direkte målt11. Leverte volum og konsentrasjonen er kritiske parametere at beregningen av standard toksikologiske tiltak som EC50 eller IC50 eller for å definere minimal effektive doser5,16. Dette er spesielt viktig i funksjonelle studier med RNAi i voksen insekter, der levering av fôring ikke alltid resultere i systemisk eksponering for ønsket partikler og faktiske dosen krysset midttarmen og blir er uklart5.
Mens microinjection prosedyren kan være utgangspunktet utfordrende, er rask forbedringer i hastigheten og levering nøyaktighet oppnådd med øvelse og tålmodighet. Mastering injeksjon selve inngrepet er en gang investering, men når oppnådd, prosedyren produserer repeterbare resultater og skade dødelighet av < 3%. Forholdet mellom vellykket injeksjoner vil øke ferdigheter øker tillater injeksjon av 300 mygg eller flyr per dag.
Mange av utfordringene i microinjection er på grunn av nålen brukes. Å bestemme riktig kapillær nål systemavbruddspunkt og tips vinkel er en utfordrende delen av prosedyren og krever litt prøving og feiling for å finne den mest effektive åpning-størrelsen for artene. Fin nålen mest nyttige for mygg microinjection (~ 150 µm) er for små til å levere raskt større volumet injiseres flyr mens derimot større nålen åpning at fungerer på fluer (~ 250 µm) forårsaker omfattende skade til mindre myggen og uakseptabel injeksjon dødelighet. En nål brutt med en butt tupp er ofte vanskelig å komme gjennom cuticle uten skade på vev og økt dødelighet. Insekt skalaer eller vev stykker kan tette nåler i løpet av et eksperiment, så det er ofte nyttig å ha flere nåler trakk hvis erstatning. Vi har funnet at det er enklere å erstatte en vanskelig nål i stedet for å bruke tid på å prøve å fjerne en fast eller fouled nål.
Observere injeksjon løsningen inn insekt er viktig slik at mislykkede injeksjoner kan fjernes (se trinnene 2.14-2,15). Rhodamine B tillegg til injeksjon løsninger gir en klar visuell kald-trinnvis insekter får riktig dosering og er spesielt nyttig mens praktisere (se trinn 2.7).
Injeksjon og oviposition bioassay metodene presenteres her har ble indusert genet knockdown og målbare fenotypiske effekter i voksen Ae. aegypti og M. domestica når bruker dsRNAs designet mot artsspesifikke ribosomal transkripsjoner (Figur 4 og figur 5A). I tillegg evne til denne metoden nøyaktig levere microvolumes til enkeltpersoner tillater dose svar kurver genereres for små mengder av materiale (så lavt som 50 ng; Figur 5B). Dette er spesielt nyttig for metoder som screening siRNAs eller dsRNAs, som produserer store mengder av disse molekylene kan være kostnadseffektive uoverkommelige.
Denne metoden kan endres for å injisere biologiske midler (virus, bakterier, microsporidia) eller kjemiske plantevernmidler, kontroller at noen levering buffere er ufarlige ved injeksjon. Som levering er begrenset av størrelsen på insekt, produsere konsentrert er teste løsninger av betydning.
For å tilstrekkelig vurdere dsRNA effekt, er det nødvendig å spore oviposition som dødelige fenotyper kan kun manifesterer i avkom. Som presenteres her, holder kvinnelige Ae. aegypti separat etter blooding gir individuelle clutch størrelse besluttsomhet og ytterligere testing på de samme individene kan gjøres nedstrøms av oviposition (dvs. gene expression studier, ytterligere gonotrophic sykluser, vev bestemt knockdown) å korrelere reproduktive utgang med andre tiltak som genuttrykk. Som M. domestica generelt oviposit en gruppe svar, er eggende isolert gravid flyr til lå svært arbeidsintensiv og ikke praktisk for mange enkeltpersoner17. Derfor vises en metode for å bestemme gjennomsnittlig clutch størrelse.
Metoden microinjection presenteres her gir konsekvent systemisk levering til mygg og huse fluene. Sammen med dødelighet og oviposition sporing bioassay, kan disse allsidige verktøyene brukes til å vurdere transcriptional og fenotypiske virkningene av små RNA molekyler, biologiske midler og tradisjonelle plantevernmidler der muntlig levering er ikke levedyktig.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte eller oppdragstakere United States Department of Agriculture eller forsvarsdepartementet. Dette manuskriptet ble produsert i løpet av offisielle plikter og er ved lov i offentlige. Synspunktene uttrykt representerer oppfatning av forfatterne, og representerer ikke en offisiell posisjon eller anbefaling av den amerikanske regjeringen. Omtale av et kommersielt produkt er ikke en anbefaling for bruk.
Acknowledgments
Forfatterne takker Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li og Roxie White (USDA-ARS) for hjelp med datainnsamling og analyse. Vi har også takke Dr. Pia Olafson (USDA-ARS) og Ke Wu (University of Florida) for kritisk gjennomgang av manuskriptet og Niklaus Hostettler (University of Florida) filmingen mikroskop opptakene. Midler ble gitt av USDA, WII - 141C prosjektet marinen og Marine Corps Public Health Center og distribuert krigen jagerfly beskyttelse programmet. Fond ikke hadde noen rolle i design eller retning av studien eller utvikling av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
