Summary
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה microinjection לנו יש סטנדרטית, ומשמש מזה מספר שנים כדי לספק כמויות מסוימות של חומצות גרעין ישירות hemolymph של יתושים וזבובים הבית. פרוטוקול זה תוצאות בתמותה הזרקת מינימלית ומאפשר במינון בקורלציה מדידות של פוריות.
Abstract
DsRNAs סינתטי, בשימוש כדי לגרום הפרעה RNA, יכול להיות השפעות פנוטיפי תלויה במינון. תופעות אלה הן שקשה להגדיר אם dsRNAs מועברים באמצעות שיטה שאינם כמותיים. משלוח מדויקת של כמויות ידוע של חומצות גרעין או חומרים כימיים אחרים הוא קריטי כדי למדוד את היעילות של המתחם נבדק וכדי לאפשר השוואה אמינה בין תרכובות.
כאן אנו מספקים פרוטוקול microinjection לשחזור, כמותיים המבטיחה מדויקת מסירה של מנות ספציפיות של dsRNA, הפחתת התמותה הנגרמת בדרך כלל על ידי הזרקת פגיעה. שינויים אלה כוללים התוספת של Rhodamine B, מחט ההזרקה בוגר, שיטת שחזור משופר שהושאל בפעולות וקולינס. שיטה זו מאפשרת חישוב מינון תגובות ואסטמה ומקילה על השוואות בין תרכובות. גירסאות של שיטה זו שימש בהצלחה על שלושה סוגים של יתושים, כמו גם זבובים הבית, כדי להעריך את ההפחתה בפוריות הנובעת ג'ין להחרשת של הפרוטוקולים ribosomal RNA.
פרוטוקול זה מספק אסטרטגיות לצמצום מספר אתגרים של microinjection חרקים קטנים. ביחד, מכני מסירת dsRNAs בליווי אימות חזותי, זיהוי של מיקומים יעיל עבור משלוח, והכללה של תקופת התאוששות שלאחר הזרקת להבטיח מינון מדויק ותמותה נמוכה פציעה. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר של bioassay ההטלה לקביעת אחיד של השפעות על פוריות.
Introduction
אספקת מולקולות קטנות, כגון חומצות גרעין, dipterans הבוגרת הוכיחה להיות מאתגר, הן Culicidae והן Muscidae. אוראלי קליטת dsRNAs דווחה לייצר עקרות (כאשר המיקוד גנים אך ורק לידי האשכים של מבוגרים), תמותה (כאשר המיקוד SNF7 ו- coactivator של קולטן סטרואידים) זחל Aedes aegypti1,2 . התמותה גם נצפתה כשמתכוונים HSP70 בזחל זבוב דומסטיקה3. עם זאת, תופעות כאלה פנוטיפי, לא גרמו לאחר להאכלת dsRNA למבוגרים Ae. aegypti סוכר ארוחות4,5.
Microinjection שימש כדי לעקוף את פיתול כאשר היכרות עם פתוגנים או חומצות גרעין, ובכך גרימת תגובה מערכתית5,6,7,8,9,10 . מספר טכניקות microinjection קיימים לערב ציוד החל שההדרכה המיוצר ללא צורך במיקור חוץ, הדורשים מדידה חזותי של הזרקת לאמצעי האחסון מרססים הנשלטות על-ידי מיקרו-מעבד לאפשר למשלוח אוטומטי נפח נמוך כמו 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. גורמים הפרעה (RNAi) RNA מיקוד ribosomal mRNAs, לשבש את התפתחות השחלות אצל פרוקי רגליים מגוונים כמו טיק בקר Rhipicephalus microplus, היתושים Aedes aegypti , כולכית מצויה, הבית עף זבוב דומסטיקה5,9,12,13. במחקרים אלה, ניטור השיבוש של הטלה היה חיוני לקביעת היעילות של inoculant כפי פנוטיפ יכול להתבטא כמו סיום או הפחתת צאצאי. . זה סוג של פנוטיפ קטלני multigenerational כי הוא השפעה קריטית, הרצוי רבות של שיטות לא מסורתיות/מוצרים חדשים כמו Wolbachia -נגוע זכרים מבוא (חוסר התאמה מינית), RNAi המושרה עקרות5 9, ,14. מעקב פוריות וגם התמותה יש צורך באפיון ופיתוח של biorationals ספציפי מאוד (פתוגנים המתרחשים באופן טבעי ו/או נגזרות טבעי)15.
פרוטוקול זה מציג טכניקות microinjection מפורט הן למבוגרים יתושים וזבובים הבית; תהליך זה הוא לעתים קרובות לא היטיב לתאר בספרות. בנוסף, מתוארים ההטלה מתודולוגיות bioassay להעריך כראוי dsRNA השפעות על dipterans למבוגרים. פרוטוקולים אלה פותחו במיוחד עבור Aedes aegypti ו דומסטיקה זבוב , אבל יכול להיות שונה עבור מינים אחרים.
Protocol
1. הכנה חרקים
- עזים ומתנגד יתושים על ידי מצמרר אותם על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות, או על ידי חשיפה 2 דקות CO2 ולאחר מכן החזקת ב 4 ° C לפני זריקות. קר עזים ומתנגד זבובים-2\u20123 4 ° C h לפני זריקות. להבטיח יתושים וזבובים והידנית אם ההטלה הוא משתנה התגובה.
הערה: שיטת ההרדמה יתושים תלוי המין ואת המתח, למשל, כולכית להתאושש מהר מן ההרדמה קר יותר Aedes aegypti , ולכן עדיפה CO2 נוקאאוט. - על קרח, בזהירות שלב יתושים או זבובים באמצעות מלקחיים רך כדי לפרוס אותם ventrally חשופות על שקופיות מיקרוסקופ ~0.5 ס"מ אחד מהשני. שקופיות רגיל יכול להכיל שתי שורות של 6 יתושים או זבובים בית 6-7. השאירו רווח 1 – 1.5 ס"מ בקצה השמאלי או הימני של השקופית ברורה של יתושים או זבובים כדי לסייע שקופית טיפול.
- לשמור על שקופיות של חרקים בשלבים 4 ° C בפטרי גדולה עד מוכן להזרקה.
הערה: קידוח חור המכסה פטרי תסייע למנוע חרקים להיות מוטרדת עקירה אוויר כאשר מיצוי. הצבת שקופיות על זוג נימים זכוכית מאובטח לתחתית צלחת תקל להסרת מ פטרי.
2. חרקים הזרקה
- להכין dsRNA כפי שתואר על ידי אסטפ. et al. 5 ו. Sanscrainte et al. 9. אם חינם של מזהמים, dsRNA ניתן לכמת באמצעות ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את ספיגת 260 ננומטר, חישוב ריכוז ה-RNA μg/mL כמו260 × דילול גורם × 40.
- להגדיר לנתח מיקרוסקופ, microinjector מעל הטבלה צונן או דלי קרח רדוד לבצע זריקות ומורדמת קר יתושים, זבובים (ראה צעד 1.1-1.3 ו איור 1).
- . עצור נימים זכוכית טיפ בסדר עם מחט פולר (הגדרות: דוד = 15 יחידות, ברז חשמלי = 4 א).
הערה: ראה טבלה של חומרים לפרטים של היצרן. - למקם את המחט נימי microinjector לפי הוראות היצרן, הפסקה מחט מאת צובט עם זוג מלקחיים כדי לייצר בחוד.
הערה: מחט המוצע הפתיחה גדלים הם מיקרומטר ~ 150 עבור יתושים ~ 250 מיקרומטר של זבוב הבית. - הגדר microinjector עבור נפח המשלוח הרצויה. מניסקוס תנועה מ ~ 50 nL aliquots היא בקלות הנצפה ומומלצת יתוש microinjections. אם הוא זמין, אפשר הגדרות זריקה מהירה. יש לשטוף את המחט על ידי מילוי וגירשו את המים ללא נוקלאז 3 פעמים.
- להכין פתרונות עבור הזרקה-ריכוז כזה כי 100\u2012150 nL יספק המינון הרצוי עבור יתושים ורצון nL 500 לספק הרצוי במינון לזבובים הבית.
הערה: הציע מינונים הראשונית: µg 1 עבור כל יתוש ו µg 5 עבור כל זבוב5,9. - באופן אופציונלי עבור יתושים, להוסיף Rhodamine B (כדי לסייע ויזואליזציה) פתרונות-ריכוז סופי של 3.0 µg/mL.
הערה: לצבוע יהיה גלוי בבירור על ידי צבעו ורוד לאחר הזרקה דרך הקוטיקולה כמעט ברור על פני השטח הגחון בצומת בית החזה/בטן. - Pipette µL 3-4 פתרון להזריק על משטח נקי (כגון פיסת סרט צילום פרפין) ויש למשוך המחט זכוכית ללא מכניסה אוויר. נלחצים לחצן הכנס שוב ושוב עד שהנוזל מתחיל לוותר על מן המחט לנגב בעדינות טיפות עם מגב המשימה העדינה.
הערה: בעוד כמה דגמים של microinjectors דורשים למלא את משבצות המזרק, מזרק שאוזכרו טבלה של חומרים לא נכון. - באמצעות סמן הצבע בסדר אולטרה, צייר hash סימני ~ 1 מ"מ בנפרד החל מניסקוס נוזלי הדוקרן המחט. זה לסייע להמחיש את התנועה מניסקוס ולהבטיח כי הפתרון נכנסה היתוש במהלך ההזרקה.
- הגדר את השקופית של יתושים או זבובים (כפי שהוכנו בשלבים 1.2-1.3) תחת המחט תירגע הטבלה או קרח (איור 1). להבטיח את שדה ראייה במיקרוסקופ הוא מספיק רחב לראות את הפתרון מניסקוס במחט.
- היתושים, ליישר את המחט עם האמצעי-שליש mesokatepisternum (איור 2 א), בעוד וחיבקה היתוש נגד המחט עם מלקחיים מניחים בצד הנגדי, בעדינות לנקב את הקוטיקולה באמצעות קצה המחט microinjector מיקרומטר.
- לזבובים הבית, ליישר את המחט עם mesopleuron (איור 2B) ו, תוך מרענן הזבוב נגד המחט, בעדינות לנקב את הקוטיקולה עם קצה המחט.
- בעדינות להחליק את המחט לתוך היתוש או לעוף הגוף עד הקצה עבר דרך האמצע.
הערה: החדרת המחט רדוד מדי לעתים קרובות התוצאה פלאיירים נוזלי מוזרק החרק (ראה שלב 2.15). - תוך כדי צפייה על התנועה של מניסקוס נוזלי במחט, נלחצים לחצן הכנס עד שהוחדרו את הכמות הרצויה של נוזל. היתושים, אם להגדיר 50.6 nL aliquots, הקש 2 X עבור ~ 100 nL או 3 X ~ 150 nL. לזבובים הבית, נלחצים לחצן הכנס עד ~ 500 nL שהוחדרו (קרי, עם 69 nL aliquots מסחטת 7 X 483 nL).
- אם אלך להביא את האלונקה לא זזה, לאט שקופית היתוש או לטוס המחט תוך כדי צפייה לתנועה מניסקוס. אם חלק של חרוזים פתרון מוזרק החוצה הקוטיקולה על הסרת מחט או אם אלך להביא את האלונקה נכשל להעביר, למחוק את החרק כמו הזרקה זו היה לא מוצלח.
- להעביר בהצלחה מוזרק יתושים בקבוצות של 10-15 או הבית זבובים בקבוצות של 5 כדי לנקות את עוז 3.5 מחזיק כוסות. לכסות עם טול או אחר תנועותיהם ולשחזר בטמפרטורת החדר.
- לאחר יתושים וזבובים התאוששו (1 – 2 h), היפוך כל גביע אחזקות על כדור צמר גפן טבול עם 10% סוכרוז הפתרון.
הערה: ההיפוך של הגביע על גבי כל העזרים כותנה סוכרוז הישרדות על-ידי מתן גישה קלה יותר על ארוחה של סוכר10. - לשטוף את המחט כמו שלב 2.5 בין הזרקת פתרונות. בסיום הזרקת, המשומשות מחטים במיכל שרפ המתאים.
3. aedes aegypti bioassay התמותה, ההטלה
- במשך שלושה ימים לאחר ההזרקה, ממשיכים לספק יתושים עם 10% סוכרוז ולהקליט את המספר של יתושים מתים בעליל.
- למלא ≤12 אינץ קרום מלאכותי (כגון קולגן נקניק) עם דם טרי (קרי, שור עבור Aedes aegypti) ומחממים עד 60 ° צלזיוס באמבט מים חמים.
- בקצרה יבש הקרום על ידי גלגול על מגבת נייר ושכבה על פני הפקקים טול של עוץ 3.5 ברור מחזיק כוסות. כדי לשפר האכלה, ספייק דם עם 1 מ מ ATP לאחר חימום כמו phagostimulant או על-ידי אחיזה של נקניק דם ומחוממת נקי החשופות לעזוב שיכללו חומרים נדיפים אנושי על פני מעטפת.
- לאחר דם האכלה, להחליף את כדור צמר גפן ספוג עם 10% סוכרוז על גבי מחזיק כוסות ולאפשר יתושים לנוח ~ 24 h לפני העברת כוסות ההטלה.
- לבנות כוסות ההטלה באמצעות מילוי נקה 3.5 כוסות bioassay עוז עם ~ 30 מ"ל יונים H2O והנחת פיסת נייר נביטת זרעים (~ 4 ס"מ ו- 5 ס מ ארוך עם הרכסים העוברים במאונך) בחלק התחתון של הגביע, כנגד הצד (איור 3 א) . מכסה עם טול או אחר תנועותיהם, לחתוך חתך קטן (~ 1 ס מ) בהכיפה טול או אחר תנועותיהם.
- ב 24 שעות דם שלאחר האכלה, לחתוך חתך קטן (~ 1 ס מ) בהכיפה טול של גביע אחזקות ולהעביר רק נקבות בודדות אשר בהצלחה האכילה – עם מנת דם גלוי בבטן — על ידי השאיפה הפה עדין לכוסות ההטלה (1 כוס נקבה/הטלה). חותם את החתך קטן על הכיפה הטלה עם כדור צמר גפן רוויות 10% סוכרוז.
- מחזיק כוסות ב ~ 27 ° C 5\u20127 ימים לאפשר יתושים oviposit באופן מלא תוך מעקב יומי התמותה. ספור ביצים תחת טווח ויבתר.
4. זבוב דומסטיקה bioassay התמותה, ההטלה
- במשך שלושה ימים לאחר ההזרקה, להמשיך לספק את הזבובים עם 10% סוכרוז ולהקליט את המספר של זבובים מתים בעליל.
- שלושה ימים לאחר ההזרקה, עזים ומתנגד זבובים על ידי בקצרה הנחת צינור פוליאתילן dispensing CO2 מעל מחזיק כוסות עד מכל הזבובים ללא תנועה בחלק התחתון של הכוסות.
- העברת הזבובים כלוב נקי מורכבת צנצנת פלסטיק 4 L עם שרוול stockinette מכסה הפתח (10 ס"מ, איור 3B). לספק מים זבובים עם תערובת של סוכרוז מגורען, אבקת חלב, ייבשה חלמון ביצה ב 8:8:1 יחס (לפי נפח) במשך ארבעה ימים, הקלטה של הסרת מת טיסות יומיות.
- היכונו החומרים היבשים טריים לטוס זחל גידול בינוני על ידי ערבוב 75% סובין חיטה עם משק 25% מגורען לפי משקל. מוסיפים מים כדי להגיע 62% לחות (עד טיפת מים יכול להתמצות בקושי החוצה).
- להכין כדור בקוטר 2.5 ס מ מתערובת 1:1 של התקשורת זחל טריים לעיל, "שימוש" לטוס בינוני זחל (בינוני שבו יש זבובים בעבר pupated). עוטפים את הכדור בכיכר של בד כותנה שחור, לסחוט בעדינות עד בינוני נוזלי מבצבץ דרך ולאחר מכן השתמש גומיות כדי להחזיק את הבד במקום סביב הכדור.
- לשים את הכדור בתוך כוס 60 מ ל ולמקם אותו בכלוב לטוס במשך 5 שעות (איור 3B).
- לשטוף ביצים מהכדור ההטלה ולהבטיח כי הביצים יוסרו מתחת קפלי הבד. לנער ביצים כדי לשבש את אשכולות ומעבירים אותם אל שפופרת צנטרפוגה mL 20 בוגר עם pipet העברה.
- המתן עד הביצים ליישב ורשום את עוצמת הקול של הביצים התיישבו הצינור. להוסיף מים כדי להביא אמצעי האחסון עד 20 X הנפח של ביצים התיישבו. להקליט את הנפח הכולל של מים בתוספת ביצים.
- תוך כדי ערבוב את המתלים מים וביצה עם בר מערבבים מגנטי או ערבוב נמרץ, להשתמש טיפ pipet 1 מ"ל (עם סוף קצה מנותקים) כדי לשלול 0.5 מ של מים וביצה התליה על חתיכת בד שחור מראש בטעימת בסדרה של קווים. לספור את הביצים במיקרוסקופ ויבתר.
- חזור על שלב 4.9 עוד פעמיים. אם אחד מהסעיפים חריג חשוד טעות חמורה (קרי, נבדל שני סעיפים אחרים על-ידי > 35%), לבצע ספירה רביעית והתעלם את חריג חשוד טעות.
- לחשב את מספר הביצים לדגימה רשע ולהתרבות ערך זה על ידי 2 כדי לקבל את מספר הביצים/mL של ההשעיה. הכפל את הערך ביצים/mL מתקבל על ידי הנפח של המתלה הביצה משלב 4.8. זוהי ההערכה עבור המספר הכולל של ביצים זיון.
Representative Results
Microinjection של dsRNA יתושים
שיטה זו microinjection שימש במעבדה שלנו להעריך ביטוי גנים, תמותה ותגובת ההטלה מפעילה dsRNA מעל 80 מעבר יתושים מספר סוגים (אאדס, אנופלס, כולכית). מזריק נקבות בגלל הלחץ המושבה של Ae. aegypti (ORL1952) µg 1 של dsRNA נגזר התרשימים ribosomal RPS6 ו- RPL26 (ראה אסטפ. et al. 5 שיטות הייצור dsRNA ולנתונים רצף) הראו משמעותי הפחתת בביטוי היחסי (RE) על פני ההטלה מספר מחזורי בהשוואה יתושים הזריק dsGFP שליטה. Aedes aegypti RE נמדד בעקבות מחזור 2nd gonotrophic הראו הפחתה של ביטוי RPS6 (P < 0.05) יתושים הזריק dsRPS6 כפי שנקבע על ידי מבחן t של סטודנט בין שליטה dsGFP של אותה קבוצה (איור 4)5 .
פוריות הוערכה של נקבות בודדות באמצעות של bioassay ההטלה המתואר כאן. לאחר 3 ימים לאחר ההזרקה, היתושים היו דם האכיל הועבר לתוך מיכלים ההטלה בודדים, מותר להניח עד לסיומו. מצמד הממוצע גדלים עבור מחזור gonotrophic הראשונה הצטמצמו באופן משמעותי עבור dsRPS6 שני מטופלים Ae. aegypti (n = 102 נקבות, ביצים (זאת אומרת ± SE) ± 0.8 1.3), dsRPL26 התייחס (n = 86 נקבות, ביצים ± 1.1 4.0) לעומת זריקות dsGFP (n = 79 נקבות, 49.3 ± 3.5 ביצים, איור 5A). הערכת קלאץ לאחר מחזור gonotrophic השני הראה גם ההטלה מופחתת באופן משמעותי לשתי הקבוצות dsRNA מטופלים, אבל עם גודל השפעה מופחתת. גודל הקבוצות של Ae. aegypti היו משתנה, ולכן ההפרדה אמצעי בוצע על ידי בדיקה של דאן5. עשרים ארבע שעות התמותה היה בדרך כלל 3% או פחות.
אפקט במינון ברור נצפתה כאשר הזרקת dsRPS6 מ- 1 µg ל- 50 ng הנשי Ae. aegypti, ואת גודל תטולה מגוונים באופן משמעותי בהשוואה ל- 1 dsGFP µg/נקבה מוזרק שולטת בכל מלבד המנה dsRPS6 ng 25/נקבה (איור 5B).
Microinjection של dsRNA בית עפה
המושבה דומסטיקה זבוב (בזן הרגיל) הוזרקו 5 µg של המבנים dsRNA מתוכנן נגד זבוב הבית תעתיקים של RPS6 ו- RPL26-9. כפי נצפתה ב Ae. aegypti, הפחתה משמעותית הן ביטוי התעתיק הספציפי (RPS6 ו- RPL26), חסכון בתטולה נצפתה (איור 4 , איור 5A). הפחתה משמעותית ב- RE נקבע ע י מבחן t של סטודנט בין שליטה dsGFP של אותה קבוצה (P < 0.05) הבדיקה הולם-Sidak שימש לקביעת המשמעות בין מצמד מידות עבור שונה מ דומסטיקה קבוצות הטיפול. והניתוחים השחלות הראה oogenesis מופחת בטיפולי dsRPS6 ו- dsRPL26, בעוד dsGFP ניזונים הזבובים היה התצהיר vitellogenin נורמלי כמו מדורג-מידה Tyndale-ביסקו9.
איור 1: Microinjection ההתקנה עבור אספקת microvolumes למבוגרים יתושים וזבובים הבית. ההזרקה מתבצעת על חרקים ומורדמת קר מבוים על שקופיות מיקרוסקופ לטבלה צונן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אתרים Microinjection Ae. aegypti , מסיה דומסטיקה. (א) למבוגרים Ae. aegypti מוזרקים בשליש האמצעי אחד-של mesokatepisternum. (B) למבוגרים מ דומסטיקה מוזרקים ב mesopleuron. חיצים מציינים באתרים של הזרקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הגדרת bioassay ההטלה. (א) assay ההטלה Ae. aegypti כוסות בנייר נביטת זרעים כמו המצע ההטלה, כתרים עם טול ו 10% סוכרוז ספוג כותנה. (B) למבוגרים נקבה מ דומסטיקה במיכל וזמינותו הטלה עם מזון (א), מים (ב) ומדיה זחל (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ביטוי היחסי של RPS6 ב Ae. aegypti ו מ דומסטיקה הזריק dsRNAs תלויי מין. Aedes aegypti , מסיה דומסטיקה הוזרקו µg 1 ו-5 בהתאמה של dsRNA גם שליטה (dsGFP) או dsRNA תוכנן כנגד RPS6 או RPL26 תעתיקים של כל חרק. צמצום משמעותי (P < 0.05) של RPS6 ביטוי נצפתה ב יתושים וזבובים מוזרק עם dsRPS6 על ידי זבובים הזריק dsRPL26 (מסומן על ידי כוכביות). קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± SE ומציין מספר העמודה בסיס מספר יחידים בחן. איור זה שונה מאסטפ. et al. 5 ו. Sanscrainte et al. 9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: גודל תטולה הממוצע של Ae. aegypti , מסיה דומסטיקה הזריק dsRNAs תלויי מין. (א) ביצה התצהיר צומצם באופן משמעותי (P < 0.05) Ae. aegypti והן דומסטיקה מ' לאחר הזרקה של µg 1 ו-5 בהתאמה של שליטה או dsRNA (dsGFP) או dsRNA מתוכנן נגד תעתיקים RPS6 או RPL26 של כל חרק. כוכביות מצביעים על הבדלים משמעותיים מן השליטה dsGFP באותה הקבוצה. קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± SE ומציין מספר העמודה בסיס מספר יחידים בחן. איור זה שונה מאסטפ. et al. 5 ו. Sanscrainte et al. 9. (B) עקומת מינון של Ae. aegypti הזריק dsRPS6 מ 50 ng/נקבה כדי 1000 ng/נקבה מראה הפחתה משמעותית פוריות לעומת dsGFP מוזרק גדודים (50, 100, 1000 ng/נקבה). קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± 95% CI של 36-81 אורגניזמים נפרדים לכל מנה. נקודות עם האותיות מייצגות הבדל משמעותי בין הקבוצות (P < 0.05) המזוהה על-ידי ANOVA. איור זה שונה מאסטפ. et al. 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
Microinjection היא טכניקה מעבדה יקר כדי להבטיח מסירה של dsRNA או biorationals אחרים (קרי, חומרי הדברה, וירוסים, microsporidia). בעוד מעבדות רבות לבצע microinjection, הסכום המדויק מוזרק ברור לעיתים קרובות בשל מגבלות טכניות של מערכת משלוח שבהם נפח המשלוח אינו נמדד ישירות11. ריכוז ונפח ונמסרו הם פרמטרים קריטיים המאפשרים חישוב של אמצעים רעילות סטנדרטיים כגון EC50 או IC50 או להגדיר יעיל מינימלית במינונים5,16. הדבר חשוב במיוחד פונקציונלי מחקרים באמצעות RNAi בחרקים למבוגרים, משלוח על ידי האכלת לא תמיד לגרום מערכתית החלקיקים הרצוי ואיפה המינון בפועל חוצה את פיתול הוא לא ברור5.
בעוד ההליך microinjection יכול להיות מאתגר בתחילה, שיפורים מהירה ברמת הדיוק ומהירות המשלוח מושגות עם אימון וסבלנות. מאסטרינג ההליך הזרקת עצמו היא השקעה של זמן, אבל, ברגע הושלמה, ההליך מייצרת תוצאות הדיר ותמותה פציעה של < 3%. היחס של זריקות מוצלחות יגדל כמו מיומנות גדל המאפשר הזרקה של 300 יתושים או זבובים לכל יום.
רבים מן האתגרים של microinjection הם עקב המחט בשימוש. קביעת נקודת הפריצה נימי המחט וזווית טיפ הוא היבט מאתגר של ההליך ואינו דורש ניסוי וטעייה כדי לקבוע את גודל הפתיחה היעיל ביותר עבור זן נתון. המחט בסדר השימושיים ביותר עבור יתושים microinjection (~ 150 מיקרומטר) הוא קטן מדי במהירות לספק נפח גדול מוזרק זבובים תוך ולהפך, המחט גדולה יותר פתיחת כי עבודות על זבובים (~ 250 מיקרומטר) גורם נזק פגיעה נרחב כדי היתושים קטן יותר הזרקה לא מקובל התמותה. מחט שבורה עם טיפ בוטה לעתים קרובות קשה לעבור את הקוטיקולה ללא נזק לרקמות ותמותה מוגברת. סולמות חרקים או חתיכות רקמה יכולים להיסתם מחטים במהלך ניסוי, כך לעיתים קרובות מועיל שיהיה מספר מחטים הוציא אם החלפת נדרשת. מצאנו כי קל להחליף מחט קשה מאשר לבזבז זמן כדי לנסות לנקות את מחט שנתקע או הסתבך.
התבוננות הפתרון הזרקת הזנת את החרק הוא קריטי כך זריקות לא מוצלח ניתן להסיר (ראה שלבים 2.14-2.15). בנוסף rhodamine B הזרקת פתרונות מספק תמונה ברורה כדי להבטיח חרקים מבוים קר לקבל את המינון הנכון יכולה להיות שימושית במיוחד בזמן תרגול (ראה שלב 2.7).
הזרקה, ההטלה bioassay השיטות המובאות כאן בהצלחה זירזה את ג'ין תמונות ציפורים וניתנת למדידה אפקטים פנוטיפי למבוגרים Ae. aegypti , מסיה דומסטיקה בעת שימוש dsRNAs תוכנן נגד תלויי מין ribosomal תעתיקים (איור 4 , איור 5A). בנוסף, מאפשר היכולת של שיטה זו למסור במדויק microvolumes ליחידים עקומות תגובת המינון שיווצר עבור כמויות קטנות של חומר (המתחילים 50 ng; איור 5B). הדבר שימושי במיוחד עבור שיטות כמו הקרנת siRNAs או dsRNAs, לייצר כמויות גדולות של מולקולות אלה יכול להיות שאבטחה.
בשיטה זו יכול להיות שונה כדי להזריק ביולוגיים (וירוסים, חיידקים, microsporidia) או בחומרי הדברה כימיים, לאחר להבטיח כי כל מאגרי משלוח הם לא מזיק בזריקה. כמו משלוח נפח מוגבל על ידי הגודל של החרק, בהפקת מרוכז בדיקות פתרונות יש חשיבות.
להעריך כראוי dsRNA יעילות, יש צורך לעקוב אחר ההטלה פנוטיפים קטלני יכול להתבטא רק רומא. כפי שהוצג כאן, מחזיק הנשי Ae. aegypti בנפרד לאחר blooding מאפשר קביעת גודל מצמד בודד והוא לבדיקות נוספות על האנשים באותו יכול להיעשות במורד הזרם של הטלה (קרי, מחקרים ביטוי של גנים, gonotrophic נוספים מחזורים, רקמות ספציפיות נוקאאוט) כדי לתאם הרבייה פלט עם אמצעים אחרים כגון גנים. כפי דומסטיקה מ oviposit בדרך כלל בתגובה קבוצה, הסתה מבודד gravid הזבובים להטיל היא עבודה מאוד אינטנסיבית, לא מעשית עבור מספרים גדולים של יחידים17. לכן, מוצגת שיטה לקביעת גודל תטולה מרושע.
השיטה microinjection המובאת כאן מספקת משלוח עקבי מערכתית כדי יתושים וזבובים הבית. יחד עם התמותה, ההטלה מעקב bioassays, כלים מגוונים אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעות גנים ברמת השעתוק והתרגום פנוטיפי של מולקולות RNA קטנות, ביולוגיים, וחומרי הדברה מסורתי היכן משלוח אוראלי אינה ברת קיימא.
Disclosures
כל המחברים הם עובדים או קבלנים של מחלקת החקלאות של ארצות הברית או ההגנה. כתב יד זה הופק במהלך הקורס של חובות, על פי חוק לרשות הציבור. הדיעות מייצגים את דעת המחברים, אינם מייצגים את העמדה הרשמית או הסבה על ידי ממשלת ארה ב. אזכור של מוצר מסחרי אינה המלצה לשימוש.
Acknowledgments
המחברים תודה Hanayo Arimoto (Navy), דנה ג'ונסון, לוסי Li, ולבן רוקסי (USDA-ARS) בשביל לעזור עם רכישת נתונים וניתוח. אנחנו גם תודה ד"ר פיא Olafson (USDA-ARS) וו קה (אוניברסיטת פלורידה) עבור סקירה ביקורתית של כתב היד, ניקלאוס Hostettler (אוניברסיטת פלורידה) בשביל לצלם את צילומי מיקרוסקופ. מימון סופק על ידי USDA, הפרויקט WII - 141C של חיל הים מרכז בריאות לציבור של חיל הנחתים, ואת לפרוס מלחמה לוחמי התוכנית להגנת. התורמים שחיים היה אין תפקיד עיצוב או הכיוון של המחקר או פיתוח של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup - 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. Colpitts, T. 1435, Humana Press. 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
