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Immunology and Infection

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

doi: 10.3791/58654 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.

Abstract

인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.

Introduction

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마지막 십 년간에서 인간의 질병1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증3양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플4,5종종 비교 필요 하다.

또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처리, 파라핀, 포함 및 샘플6,7의 포함에 기여.

샘플의 조작 관련 된 이러한 모든 구절 수동 샘플의 포함을 포함 하 여 수동 오류 및 낮은 범위, 단면 및 얼룩 수동 톰 대상이 됩니다. 현재, 조직학 평가 murine 조직 준비의 모든 과정은 다양 한 연구소에서 실험실 프로토콜 및 수동 프로토콜 의존 합니다. 이 연구의 목표 오류와 murine histopathological 시험에 다양성을 줄이기 위해 표준화 자동화 프로토콜을 구현 하는 것입니다.

우리의 지식, 여기 완전 자동된 조직 처리 및 murine 조직;의 조직학 평가 대 한 포함에 대 한 첫 번째 프로토콜 설명 이러한 인간의 표본 분석에 대 한 병 리 단위에서 정기적으로 사용 됩니다. 방법의 타당성의 실용적인 예를 들어, 창 자 염증의 murine 모델 분석 된, 즉, , 만성 대 장 염 모델으로 인 한 식 수8 에서에서 dextran 나트륨 황산 염 (DSS)의 반복된 관리 9. DSS 처리 동물 예를 들면, 체중 감소, 느슨한 대변 또는 설사, 및 섬유 증 뿐만 아니라 콜론의 단축 창 자 염증의 표시를 전시 하기 때문에 인간의 선 동적인 장 질병 (IBD)10 유사한 밀접 하 게이 실험 설정 8,,911. 인간의 IBD 환자에 대 한 관찰, DSS 처리는 복잡 한 질병 과정을 생성 합니다. 이러한 맥락에서 정교한 조직학 평가 조직 아키텍처의 심오한 변화를 이해 해야 합니다. 따라서, 샘플 준비 품질을 높이기 위한 기술된 프로토콜의 구현 조직학의 해석에 의존 하는 연구자를 유익할 수 있습니다 고 immunohistochemical murine 실험 설정에 대 한 분석. 조직 구조의 변경에 관련 된 인간 질병의 murine 실험 모델, 세포 조직 침투 또는 다른 조직 및 장기 (내장, 뇌, 간, 피부)에 염증의 존재의 증가 품질 사용할 수 있는 histopathological 검사를 위한 샘플 준비입니다.

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Protocol

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동물 건강 (Auth. 127/15, 27/13)의 이탈리아 정부에 의해 승인 과정과 종양학 IACUC (기관 동물 관리 및 사용 위원회)의 유럽 연구소의 동물 보호 지침을 따라

1. 만성 대 장 염 유도 반복 DSS 관리

  1. 별도 연령과 성별 쥐 2 그룹 (치료 DSS 제어 H2O 대, 실험적인 그룹 당 적어도 5 쥐 littermates)에 일치합니다.
  2. 2.5% 관리 DSS (40 kDa) 치료 그룹에 7 일 및 물 컨트롤 그룹에 대 한 식용 수에서.
    참고: 이 모델은 과거 만성 장 염증9을 유도합니다.
  3. 7 일 후, DSS 치료를 중지 하 고 14 일에 대 한 두 그룹에 게 물. 3 번이이 프로세스를 반복 합니다.
    참고: DSS의 반복적인 관리 밀접 하 게 닮은 인간 IBD, 즉, 섬유 증9장 점 막의 변경을 유도 합니다.
  4. CO2 흡입에 의해, 즉 제도적 IACUC에 의해 승인 절차에 따라 쥐를 희생.
  5. 메스와 마우스 복 부와 복을 엽니다.
    참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한.
  6. 집게, 핀셋으로 작은 창 자에서 콜론을 구분 합니다. 족집게와 집게 콜론 삭제하시오
    참고: 콜론 길이 측정 (그림 1A) colitis DSS 처리 쥐에서 발생 하는 경우 확인 하는 방법입니다.
  7. 린스 차가운 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x의 10 mL를 페 트리 접시에 콜론 누르고 부드럽게 찌 재료를 제거 하.

2. murine 조직 고정

  1. 10%의 10 mL에 각 murine 콜론 견본을 담가 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF) RT (실내 온도)에.
    참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한.
  2. 실시간에서 18-24 h에 대 한 조직 수정

3. 콜론 구분 및 조직 준비

  1. 작은 핀셋으로 고정된 조직 NBF 컨테이너에서 제거 하 고 배양 접시에 넣어. 작은 핀셋으로 단면 작업 접시에 콜론을 넣어.
  2. 살 균 메스와 파편 (0.3 c m 길이 0.2 c m)에서 콜론을 잘라. 이 조각 길이 카세트의 두께 초과 하기에 최적입니다.
  3. 작은 핀셋 (그림 2A)으로 한 콜론 세그먼트를 선택 합니다. 작은 핀셋 (그림 2B)와 카세트를 포함 하는 방향의 파라핀의 끝을 돌출 하는 플라스틱 중 하나에 하나의 콜론 세그먼트를 삽입 합니다.
  4. 카세트 당 추가 3 콜론 세그먼트 (3.2-3.3) 작업을 반복 합니다. 직물의 중복을 최소화 하기 위해 인접 튀어나온 팁에 세그먼트를 삽입 하지 마십시오
  5. 신중 하 게 4 개의 가장자리 (그림 2C)을 추진 하 여 카세트를 단단히 닫습니다. 조직 손상을 방지 하기 위해 조직을 압박 하지 마십시오.
  6. 플라스틱 지원 프레임에 표를 삽입 합니다. 샘플을 식별 하기 위해 지원 프레임 레이블을 지정 합니다. 각 생물 학적 샘플에 대 한 반복 합니다.

4. 조직 처리

  1. (그림 3A, 3B) 전원 버튼을 누르면 자동된 프로세서를 켭니다.
  2. 파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀은 완전히 녹아, 전용된 아이콘 (그림 3C)의 존재를 관찰 하 여 확인 될 때까지 기다립니다.
  3. 자동화 된 프로세서 (그림 3D)에서 제공 하는 금속 바구니에 각 방향된 카세트 (조직 표본 포함) 수동으로 삽입 합니다. 바구니 인 최적화를 서로 가까이 줄 카세트를 세로로 배치 합니다.
  4. 금속 바구니 (그림 3E)를 닫습니다.
  5. 말 대 꾸 (그림 3 층)의 뚜껑을 엽니다. 쌈 바구니 기계를 삽입 하는 곳입니다. (그림 3) 프로세서의 전용된 주택에 바구니를 삽입 합니다. 말 대 꾸 (그림 3 H)의 뚜껑을 닫습니다.
  6. 악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 (그림 3I) 작업 프로토콜 정의. 솔루션, 타이밍 및 표 1에 제공 된 스키마에 따라 구현할 온도 시퀀스를 선택 합니다.
  7. 전용된 컴퓨터 아이콘 (그림 3J)를 클릭 하 여 바구니를 포함 하는 통 렬 한 반박에서 실행 될 프로토콜을 지정 합니다. 시작 버튼 (그림 3 L)를 클릭 하 여 프로토콜을 시작 합니다.
  8. 악기는 프로토콜의 끝을 확인 하는 전용된 아이콘의 존재 여부를 관찰 하 여 고 기계에서 나오는 경보 음색을 듣고 여 때까지 기다립니다.
  9. 말 대 꾸 뚜껑을 엽니다. (그림 3 M) 프로세서에서 바구니를 제거 합니다.

5. 조직 포함

  1. (그림 4A) 전원 버튼을 누르면 자동된 embedder를 켭니다.
  2. 파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀 악기의 내부 온도계에 표시 된 파라핀 욕조의 온도 관찰 하 여 녹아 완전히 확인 될 때까지 기다립니다.
  3. Embedder 선반에 모든 처리 카세트 프로세서 바구니에서 수동으로 전송. 각 랙 최대 32 카세트를 포함할 수 있습니다. (그림 4B, 4c).
  4. (그림 4C, 4d, 4E) 주요 embedder 뚜껑을 엽니다.
  5. 악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 신호는 로봇 시스템 랙 되는 삽입 (그림 4 층).
  6. 입구 주택 뚜껑 (그림 4G)를 엽니다. 랙 입구 주택에 삽입 합니다. 각 embedder는 동시에 최대 4 선반을 포함할 수 있습니다 (그림 4 H, 4I). (그림 4J) 입구 주택 뚜껑을 닫습니다.
  7. 표 2 (그림 4 K)에 따라 포함 절차를 시작 하려면 악기 컴퓨터에서 터치 스크린을 사용 합니다.
    참고: 32 카세트의 각 랙 포함 45 분 걸립니다.
  8. 악기 전용된 아이콘 (그림 4 L)의 존재를 관찰 하 여 프로토콜의 끝을 확인 될 때까지 기다립니다.
  9. 콘센트 랙 (그림 4 M)를 제거 합니다. 주요 embedder 뚜껑을 닫습니다.
  10. 선반에서 포함 된 블록 (방향 격자 포함)를 제거 합니다. 스토리지 골 판지 상자에 포함 된 블록을 전송 합니다.

6. 마이크로미터 단면

  1. 톰의 냉각 접시를 켭니다. -8 사이의 온도 설정-10 ° c
  2. 증류수 2 L를 포함 하는 톰의 서 모스 탯 물 목욕을 켭니다. 42-45 ° c.에 사이 물 목욕의 온도 설정
  3. 장소는 파라핀 블록 냉각 플레이트에 포함. 블록을 수 있도록 적어도 5 분 기다립니다.
  4. 냉각 접시에서 한 블록을가지고 고 톰 블록 홀더에 배치.
  5. 10 µ m 두께 6 번을 절단 하 여 두께 10 µ m. 트림 블록을 절단 하는 톰을 설정 합니다.
  6. 10 µ m에서 3 µ m. 컷 한 3 µ m에 대 한 섹션 Hematoxylin과 오신 (H & E)에 얼룩이 지는 톰의 두께 설정을 변경 합니다.
  7. 작은 브러시로 3 µ m 섹션을 수집 합니다. 3 µ m 섹션 조직 주름을 줄이기 위해 물 표면에 그것을 신중 하 게 누워 물 욕조에 넣어. 단일 유리 슬라이드에 온도 조절 장치로 통제 물 탕에서 조직 단면도 수집 합니다.
    1. 필요한 경우 추가 섹션을 잘라.
  8. 샘플 id를 작성 하 여 유리 슬라이드를 레이블을 지정 합니다.
  9. 적어도 10 분 동안 37 ° C 오븐에 슬라이드를 넣어.
  10. 유리 슬라이드 랙 즉각적인 분석 또는 스토리지 박스에 넣어.

7. hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩

  1. 전원 버튼을 누르면 자동된 염색기에 전환 합니다. 악기 모니터에 로딩 바의 변화를 관찰 하 여 로봇 팔의 초기화를 허용 합니다.
  2. 염색기 랙, 세로 최대 30 슬라이드 삽입으로 유리 슬라이드를 삽입 합니다.
  3. 적절 한 무선 주파수 식별 (RFID) 플라스틱 태그와 랙 라벨. RFID 태그 제조 인 컴퓨터에 로드 된 올바른 얼룩 프로토콜을 식별 하는 시스템입니다.
  4. 랙을 염색기에 넣습니다. 자동으로 로드 하 고 RFID 태그의 인식에 따라 얼룩 프로토콜을 시작 하려면 컴퓨터를 허용 합니다.
    참고: H & E 염색에 대 한 프로토콜에서 설명 하는 표 3.

8. Immunohistochemical 얼룩

  1. Immunohistochemical Mallory trichrome 앞에서 설명한7얼룩을 수행 합니다.

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Representative Results

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식 수에 DSS의 반복 된 관리에 의해 유도 된 실험 만성 대 장 염은 밀접 하 게 닮은 인간 IBD8,9장 염증의 murine 모델. 그림 1 은 콜론 단축 (그림 1A), DSS 유도 된 염증의 존재와 저 승 식 프로-염증 성 유전자 CXCL10 등의 점수를 널리 사용 매개 변수를 포함 한 DSS 치료의 효과를 설명 합니다. , tnfmcp-1 (그림 1B). 염증 세포의 침투 cytofluorimetry (그림 1C)에 의해 분석 장 lamina propria에 면역 반응의 모집을 보여주는 DSS 처리에 의해 크게 향상 되었습니다.

그림 2 묘사 어떻게 저 승 조직 구분 되 고 지향된 카세트에 삽입. 이 카세트는 exteriorly 압출 팁을 수 있도록 조직의 삽입 수직으로 하 고 적절 한 방향 즉,, 루멘 안쪽에 벽과 그리드를 포함 하도록 설계 되었습니다 (그림 2A, 2B, 2 C ). 카세트 닫으면 조직 방향 일어나는 전통적인 조직학 카세트 (그림 2B)와 반대로 격자에 의해 유지 됩니다.

조직 처리 자동화 된 프로세서 (그림 3A-3 M , 표 1), 포함 하는 동안 수행 됩니다 절차는 자동화 된 embedder (그림 4A-4 M , 표 2) 하 여 수행 됩니다. 후자의 악기에서 로봇 카세트를 수집 하 고 파라핀의 정확한 금액을 dispenses. 마지막으로 톰을 사용 하 여 섹션 각 파라핀 블록에서 절단 됩니다. 슬라이드는 다음 추가 분석을 위해 준비 됩니다.

그림 5 는 자동 H & E 염색 (그림 5A-5E표 3)의 주요 구절 설명 및 H & E 염색 (그림 5 층) 후 슬라이드를 표시 하는 방법. 그림 67 어떻게 자동된 처리 및 포함 프로토콜의 구현 강하게 murine 저 승 표본의 histopathological 분석의 품질을 증가 표시 합니다. 샘플 자동 프로토콜 치료 쥐 (그림 6A)에서 파생 된 준비의 H & E stainings DSS 취급 생쥐 (그림 6B)의 그들에 비교 되었다. Histopathological 점수 평가 침투, 상피 변경 및 변경에 설명 된 대로 점 막 구조의 세포 등 염증 성 창 자 점 막에서 발생 하는 다른 매개 변수를 수정 하 여 평가 했다 표 4. 그림 6 c H 대표 & 저 승 조직 수동으로 처리 하 고 전통적인 카세트에 포함의 전자 얼룩을 묘사 한다. 그림 7에서 murine 조직 준비 및 자동된 악기를 통해 수행 포함의 품질 또한 IHC에 의해 확인 되었다 CD20 그리고 Mallory trichrome 얼룩8,9 저 승에서 얼룩 치료 (그림 7A, 7c) 및 DSS 처리 (그림 7B, 7d)의 쥐.

그림 8 이 방법의 실제적인 관련성을 설명합니다. 같은 콜론 샘플 처리 하 고 수동 또는 자동 방법을 통해 포함 했다. 각 샘플 (어느 컨트롤 또는 DSS 처리) 2 등분으로 자르고는 수동 또는 자동 방법을 병렬로 처리 했다. H & E 염색 되었고 수행 후 완전 한 현미경 평가 관한 해결 모든 병 적인 매개 변수 변경 점 막 구조, 세분성, 면역 세포에 침투, 막 두께, 선의 진공 일반적으로 장 염증 동안 관찰, 매뉴얼에 대 한 모두는 각 샘플에 대 한 평가 했다 및 자동화 프로토콜 (그림 8A 와 표 4). 자동화 프로토콜 샘플의 준비는 일관 되 게 수동 방법 보다 조직학 매개 변수의 더 높은 비율의 평가 허용. 또한, 다른 조직학 매개 변수에 대 한 별도 분석을 수행한 (그림 8B). 아키텍처 및 기저 침투 평가 했다 긍정적으로 영향을, 치료 쥐에 특히 자동화 된 방법으로 샘플 준비.

처리 및 현재 인간 histopathological 분석에 대 한 사용을 포함 하는 샘플에 대 한 자동화 된 방법 murine 표본 분석을 위해 성공적으로 적용할 수 있습니다. 높은 품질 표본 murine 저 승 조직의 기저 면역 침투 및 아키텍처 평가에 수동 방법을 통해 우수성을 보여 주는 자동화 된 방법으로 생성 됩니다.

Figure 1
그림 1: 만성 장 염증 평가. (A) 콜론 길이 측정. DSS 처리에서 프로-염증 성 유전자 (cxcl10, tnf, mcp-1)의 (B) 저 승 식 (블랙 바, n = 12) 쥐를 치료 (화이트 바, n = 6). 저 승 lamina propria의 (C) Immunophenotyping DSS 치료 세포 (폐쇄 기호, n = 12) 쥐를 치료 (기호, n 열 = 6). CD11b + Ly6G + CD11b + f 4 호 중구 / 80 + 세포 (왼쪽된 패널), CD4 + 및 CD8 + T 세포 (오른쪽 패널) 침투 컨트롤에서 (기호, n 열 = 10) 및 DSS 처리 마우스 (폐쇄 기호, n = 10). 통계적 의미 순위 t 테스트 서명 Wilcoxon 대응 쌍을 사용 하 여 계산 됩니다. p ≤ 0.05 * * p ≤ 0.01. 의미 값 ± SEM 보고 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 샘플 준비 설명. (A)는 외부 카세트 (흰색)에 의해 구성 조직 준비 및 방향의 카세트의 그림에 필요한 악기 및 내부 그리드 압출 방향 팁. (B, C) (B) 전에 카세트의 내부 격자에서 murine 콜론의 삽입 및 격자의 (C) 폐쇄 후. 패널에서 B 표시 됩니다 (왼쪽) 방향의 카세트 또는 전통적인 카세트 (오른쪽)에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 자동화 된 처리의 설명. (A, B) 프로세서를 자동화합니다. (C) 아이콘 올바른 파라핀 왁 스 용 해 온도 설명 합니다. (D, E) (D) 금속 바구니 및 폐쇄 (E)에 카세트 삽입 (F, G, H) 말 대 꾸에 금속 바구니 삽입 (I, J, K) 처리 프로토콜의 선택입니다. (L) 프로토콜의 실행. (M) 바구니 형태는 토르의 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 자동 포함의 설명 . 자동화 된 embedder의 (A) 그림. (B, C) 랙에서 카세트 삽입 (D, E) 개막식 (D)과 뚜껑의 폐쇄 (E) 랙의 존재의 기계에 (F) 신호. (G, H) 랙 입구 주택에 삽입 (I, J)는 뚜껑의 폐쇄. 포함 프로토콜의 (K) 시작. (L) 콘센트 주택 뚜껑의 오프닝. 랙 형태의 콘센트 주택 (M) 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 자동된 H & E 염색기의 설명. 슬라이드 홀더 (A) 그림. (B, C) 기계에서 슬라이드 홀더 삽입 컴퓨터의 (D) 폐쇄. 얼룩 프로토콜의 (E) 시작. (F) 톰 절단 및 H & E 염색 후 슬라이드의 Exemplificative 그림. 오른쪽 패널, H & E 샘플 방향을 묘사 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 저 승의 H & E stainings 형성 치료 및 DSS 처리 쥐. 준비 H & E 치료 (A) 및 DSS 처리 (B) 샘플의 얼룩 (처리, 임베디드, 스테인드)와 (A, B)를 자동 또는 수동 (C) 방법. 눈금 막대 = 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: Mallory trichrome (A, B)와 IHC stainings CD20 + 셀 (C, D)의 침투의 치료 (A-C) 및 DSS 처리 (B, D) 마우스. Mallory 얼룩: 블루, 콜라겐, 다크 핑크, 핵, 진한 빨강색, 세포질. 눈금 막대 = 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 수동 및 자동 프로토콜 조직 분석 비교. (A) 총 histopathological 매개 변수 평가할 수동 (흰색 막대) 또는 자동화 된 방법 (자주색 막대)으로 준비 하는 모든 섹션에서. (B) 비율 (흰색 막대) 수동 또는 치료 (일반) 또는 DSS 취급 생쥐 (점선된 바)에 자동화 된 방법 (자주색 막대)으로 준비 하는 샘플에 표시 된 매개 변수입니다. 통계적 의미 순위 t 테스트 서명 Wilcoxon 대응 쌍을 사용 하 여 계산 됩니다. p < 0.05; p < 0.005입니다. 의미 값 ± SEM 보고 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

시 약 시간 (분) 온도 (° C) 압력
NBF 1 RT 주변
에탄올 95% 1 RT 주변
에탄올 95% 1 RT 주변
에탄올 95% 1 RT 주변
절대 에타 놀 1 45 주변
절대 에타 놀 11 45 주변
절대 에타 놀 30 RT 주변
크 실 렌 1 RT 주변
크 실 렌 1 45 주변
크 실 렌 28 45 주변
파라핀 왁 스 5 65 진공

표 1: 자동 조직 처리 프로토콜.

각 카세트에 대 한 로봇에 의해 액션 perfomed
랙에서 한 카세트를 제거
카세트를 식별
전 열 형
장소에 미리가 열된 형 카세트
파라핀은 카세트에 대 한 금액을 분배
금형 냉각
강화 하기 위해 파라핀을 허용
형에서 응고 파라핀 블록 제거
현재 품질 센서 블록
파라핀 블록을 출력 문에 놓으십시오

표 2: 자동화 프로토콜을 포함 합니다.

카테고리 기준 정의 점수 값
선 동적인 세포 침투 심각도 (백혈구에 침투 lamina propria 영역의 밀도 평가 hpf) 아니 침투 0
최소한의 급성 (< 10%) 0.25
온화한 만성 (10-25%, 흩어져 호 중구) 0.5
보통 만성 (26-50%) 0.75
답변으로 표시 (> 51%, 조밀한 침투) 1
범위 (백혈구 침투의 확장) 점 막 0.5
점 막과 submucosal 0.75
상피 변화 증식 (경도 지하실, 토 굴 신장으로 볼 수 있는 상피 세포 수 증가) 아니 증식 0
최소 (< 25%) 0.25
가벼운 (26-35%) 0.5
보통 (36-50%, mitoses 크립 상피의 위 세 번째에서) 0.75
답변으로 표시 (> 51%, 기본 토 굴에서 먼 토 굴 상피에 있는 mitoses) 1
잔 셀 손실 (토 굴 당 초기 잔 셀 번호를 기준으로 잔 셀 숫자의 감소) 손실 없음 0
최소 (< 25%) 0.25
가벼운 (26-35%) 0.5
보통 (36-50%) 0.75
답변으로 표시 (> 51%) 1
점 막 구조 (muscolaris 거칠어 넘어 도달 하는 상피 결함) 아니 궤 양 0
궤 양 0.25
알갱이 만듦 조직 (셀, 침투 둘러싸인 새로운 모세 혈관과 결합 조직 수리 hypertrophied 영역) 알갱이 만듦 조직 없음 0
알갱이 만듦 조직 0.25
점 막 두께 토 굴 깊이 아니 두껍게 0
두껍게 0.5
선 진공 아니 희박 0
진공 0.5
발육 이상 아니 발육 이상 0
발육 이상 0.5
최대 점수 6

표 3: 자동화 프로토콜을 얼룩이 지기.

각 슬라이드에 대 한 제조 인에 의해 액션 perfomed 시 약 시간 (s) 온도 (° C)
Essicate 180 60
Essicate 180 60
Deparaffinize 크 실 렌 120 RT
Deparaffinize 크 실 렌 120 RT
수 화 에탄올 96% 120 RT
수 화 에탄올 96% 120 RT
워시 소 주 wtaer 240 RT
얼룩 되며 Carazzi의 되며 540 RT
린스 수도 물 360 RT
얼룩 오신 오신 Y 1 %aqueos 솔루션 60 RT
린스 수도 물 120 RT
탈수 에탄올 96% 20 RT
탈수 에탄올 96% 20 RT
탈수 절대 에타 놀 15 RT
탈수 절대 에타 놀 15 RT
지우기 크 실 렌 30 RT
지우기 크 실 렌 30 RT

표 4: 창 자 염증의 평가 대 한 제도 점수.

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Discussion

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우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.

이 방법의 잠재적인 적용 가능성을 보여 장 염증, 만성 직장 염 DSS 유도 모델의 만성 murine 실험 설정을 선택 했습니다. 이 설정은 정교한 조직학 평가 만성 장 염증 시 발생 하는 조직 아키텍처의 심오한 변경 조사를 요구 하는 IBD 환자에서 관찰 하는 복잡 한 질병 과정을 유사 합니다. 이러한 프로세스의 조직학 평가 증가 샘플 준비 품질에서 크게 유익할 수 있습니다. 참고로,이 프로토콜 적용할 수 있습니다 다른 murine 조직 (즉, spleens, 림프절, 간, 뇌), 유일한 차이 지향된 카세트는 루멘 없이 조직에 대 한 필요 하지 않습니다.

가장 중요 한 관찰 수동 오류 감소 했다 (즉,, 샘플의 방향) 격자와 카세트를 사용 하 여 및 카세트 포함 (단계 매뉴얼 중 일반적으로 수행에 대 한 재개의 제거 프로토콜), 강하게 분석의 전반적인 재현성 향상. 실험에 의하여 동쪽을 향한 카세트 조직을 삽입 때 여기에 설명 된 프로토콜, 샘플 준비의 시작 부분에만 조작 됩니다. 일단 폐쇄, 카세트는 다시 열, 따라서 올바른 방향의 유지 보수를 보장 하 고 수동 오류3,11을 감소 하지 않습니다. 이러한 두 가지 중요 한 단계 표준화 이후 분석의 전체 품질을 향상 및 손실 또는 하지 평가할 샘플, 문제 모두 카세트의 재개 또는3 샘플의 잘못 된 방향에 링크의 수를 감소 ,11.

우리는 또한 섬유 증 (그림 7), 자동화 프로토콜의 구현으로 과소 평가 실험 창 자 염증의 murine 모델에 매우 자주 그와 같은 복잡 한 생물 학적 이벤트 평가에 성공 했다. 프로토콜의 설정 하는 동안 우리는 엄격 하 게 우리가 조직 변경 피하기 위해 24 시간을 초과 해서는 안 실현 고정 시간 등 기술적인 세부 사항 표준화. 이렇게 함으로써, 우리 후속 immunohistochemical 분석의 품질을 유지할 수 있습니다.

자동화 된 방법 개선 치료 쥐에 (서) 특히 조직 구조의 변경에 관련 된 이러한 매개 변수 평가. 실제로, 건강 한 대응으로 병 적인 조직의 올바른 비교 실험 모델3의 최종 평가 대 한 비판적으로 중요 하다.

조직 처리에 관하여 다른 프로토콜 연구실에서 사용할 수 있는 자동화 된 프로세서에서 실행 되도록 테스트 했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜 소리와 매우 일관 된 결과 주었다. 우리는 또한 시간 길이 프로토콜에 대 한 구현. 짧은 프로토콜 처리 murine (장,이 경우) 충분 했다 murine 샘플 크기에 인간의 작은 biopsic 견본에 비교 했기 때문에, 조직. 마지막으로, 전체 자동화 된 절차 총 실험 시간 감소. 톰 절단 및 조각 준비 처리의 시작 부분에서 우리는 총 소요시간 5 h는 계산. 그와 반대로, 연산자의 기술 능력에 따라 같은 프로토콜의 완성 수동으로 요청할 수 있습니다 시간의 금액을 두 번 이상 처리 및 포함 하는 동안 특히. 기술에의 한 제한 자동된 프로세서와 실험실에서 수행 하는 embedder 요구 한다 이다.

결론적으로, 우리는 이러한 자동화 프로토콜의 구현 murine 실험 모델 인간의 질병을 다루는 변환 연구자의 작품을 ameliorate 크게 수 믿습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

IRCCS 폴 병원, 기술 지원에 대 한 밀라노와 IEO 동물 시설 지원에 대 한의 병 리의 부를 축산에는 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10x SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1x Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

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References

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  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
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Erratum

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함
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Cite this Article

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).More

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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