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Biochemistry

मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आयन चैनल संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल तकनीक का वर्णन करता है, एक baculovirus प्रणाली कुशलतापूर्वक न्यूनतम प्रयास और विषाक्तता, प्रोटीन निष्कर्षण, शुद्धि के साथ स्तनधारी कोशिकाओं में जीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया सहित, और गुणवत्ता की जांच, नमूना ग्रिड तैयारी और स्क्रीनिंग, साथ ही साथ डेटा संग्रह और प्रसंस्करण ।

Abstract

विहित टीआरपी उपपरिवार के क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनलों (TRPCs) जो कैल्शियम homeostasis में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से स्टोर संचालित कैल्शियम प्रवेश, जो उचित समारोह को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है गैर कटियन चैनल हैं synaptic पुटिका रिलीज और intracellular संकेतन मार्ग । तदनुसार, TRPC चैनलों को हृदय संबंधी विकारों जैसे कार्डियक अतिवृद्धि, neurodegenerative विकारों जैसे पार्किंसंस रोग, और neurologic विकारों जैसे spinocerebellar गतिभंग सहित मानव रोगों की एक किस्म में फंसाया गया है. इसलिए, TRPC चैनल मानव रोगों में एक संभावित औषधीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । बहरहाल, इन चैनलों में गेटिंग का आणविक तंत्र अभी भी अस्पष्ट है. स्थिर, सजातीय, और शुद्ध प्रोटीन की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने में कठिनाई संरचना निर्धारण अध्ययन में एक सीमित कारक है, विशेष रूप से स्तनधारी झिल्ली प्रोटीन के लिए ऐसे TRPC आयन चैनल के रूप में किया गया है । यहां, हम स्तनधारी आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन के बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक संशोधित baculovirus जीन स्थानांतरण प्रणाली का उपयोग और समानता और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा इन प्रोटीन की शुद्धि । हम आगे शुद्ध प्रोटीन से एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को इकट्ठा करने के लिए और प्रोटीन संरचना का निर्धारण करने के लिए इन छवियों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । संरचना निर्धारण आयन चैनलों में गेटिंग और समारोह के तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ।

Introduction

कैल्शियम सिग्नलिंग कैस्केडिंग, प्रतिलेखन नियंत्रण, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज़, और हार्मोन अणु संश्लेषण1,2,3सहित सबसे सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है. cytosolic मुक्त कैल्शियम के समस्थिति रखरखाव के स्वास्थ्य और कोशिकाओं के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । intracellular कैल्शियम homeostasis के प्रमुख तंत्र में से एक स्टोर संचालित कैल्शियम प्रविष्टि (SOCE), एक प्रक्रिया है जिसमें कैल्शियम की कमी endoplasmic जालिका (एर) में संग्रहीत प्लाज्मा झिल्ली पर आयन चैनलों के उद्घाटन से चलाता है की सुविधा फिर4,5,6संकेतन में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एर कैल्शियम की भरपाई । क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल (TRPCs), जो कैल्शियम-पारगंय टीआरपी superfamily से संबंधित चैनल हैं, SOCE7,8,9 में एक प्रमुख भागीदार के रूप में पहचान की गई है ।

TRPC परिवार में सात सदस्यों के अलावा, TRPC3, TRPC6, और TRPC7 एक homologue उपसमूह के रूप में, और वे लिपिड माध्यमिक दूत diacylglycerol (तमंचा), संकेतन लिपिड के एक गिरावट उत्पाद द्वारा सक्रिय किया जा करने की क्षमता में अद्वितीय हैं phosphatidylinositol ४, ५-bisphosphate (PIP2)१०,११. TRPC3 अत्यधिक चिकनी मांसपेशियों में और मस्तिष्क और अनुमस्तिष्क क्षेत्रों में व्यक्त की है, जहां यह कैल्शियम संकेत है कि प्रभाव neurotransmission और neurogenesis12,13में आवश्यक भूमिका निभाता है । TRPC3 की शिथिलता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों, हृदय विकारों, और कुछ ऐसे डिम्बग्रंथि ग्रंथिकर्कटता14,15,16के रूप में कैंसर के लिए जोड़ा गया है । इसलिए, TRPC3 इन रोगों के उपचार के लिए एक दवा लक्ष्य के रूप में वादा रखती है । विशेष रूप से लक्षित TRPC3 पर अभिनय दवाओं के विकास के अपने आणविक सक्रियकरण तंत्र की समझ की कमी के द्वारा सीमित किया गया है, लिपिड बाइंडिंग साइटों सहित17,18. हम मानव TRPC3 चैनल के पहले परमाणु-संकल्प संरचना की सूचना दी है (hTRPC3) और उसके दो एक बंद राज्य में लिपिड बाध्यकारी साइटों, इन तंत्र19में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

उच्च संकल्प पर एक झिल्ली प्रोटीन की संरचना का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण कारक उच्च गुणवत्ता के प्रोटीन प्राप्त करने के लिए है । अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों के इसी स्क्रीनिंग एक समय लेने वाली और महंगा प्रयास किया जा सकता है । यहां हम एक विस्तार से वर्णन प्रोटोकॉल कैसे हम अभिव्यक्ति और hTRPC3, जो हमारे प्रारंभिक स्क्रीनिंग में खराब बर्ताव की शुद्धि के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान प्रस्तुत करते हैं । हम कैसे समस्या निवारण और प्रोटीन व्यवहार है, जो हमारे क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) के अध्ययन के लिए एक ठोस आधार रखना अनुकूलन पर कई प्रमुख बिंदुओं वर्तमान । हम एक संशोधित baculoviral उत्पादन सदिश का उपयोग करें (खूंटी), Gouaux और सहकर्मियों द्वारा विकसित, जो स्क्रीनिंग परख और स्तनधारी कोशिकाओं में baculovirus के कुशल पीढ़ी के लिए अनुकूलित है20। इस अभिव्यक्ति विधि स्तनधारी कोशिका झिल्ली में प्रोटीन की तेजी से और लागत प्रभावी व्यक्त करने के लिए उपयुक्त है । हम इस वेक्टर के उपयोग को प्रतिदीप्ति-डिटेक्शन आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी-आधारित (FSEC) विधि21के साथ संयोजित करते हैं । इस विधि का उपयोग करता है एक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) टैग हित के निर्माण से जुड़े और छोटे, पूरे सेल solubilized नमूनों में लक्ष्य प्रोटीन के दृश्य में सुधार । यह अलग डिटर्जेंट और additives की उपस्थिति में प्रोटीन स्थिरता की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है, thermostabilizing उत्परिवर्तनों के साथ, और छोटे पैमाने पर क्षणिक अभिकर्मक से कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के उपयोग की अनुमति देता है । इस तरह बड़े पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए जाने से पहले स्थितियों की एक भीड़ तेजी से दिखलाई जा सकती है । अभिव्यक्ति के बाद, स्क्रीनिंग, और शुद्धि, हम क्रायो से छवियों को प्राप्त करने और प्रसंस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान प्रोटीन की एक डी नोवो संरचनात्मक निर्धारण उत्पंन करने के लिए । हमें विश्वास है कि यहां वर्णित दृष्टिकोण टीआरपी चैनल रिसेप्टर्स और अंय झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल के रूप में काम करेंगे ।

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Protocol

1. Bacmid डीएनए का उत्पादन करने के लिए DH10α सक्षम कोशिकाओं का रूपांतरण

  1. ब्याज की जीन संश्लेषित और यह खूंटी एक जुड़वां strep युक्त वेक्टर के एक संशोधित संस्करण में उपक्लोन-टैग, एक His8 टैग, और एन टर्मिनस (pFastBacI) पर एक thrombin दरार साइट के साथ GFP20।
  2. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में DH10α कोशिकाओं के ५० μL करने के लिए pFastBacI में एक वांछित जीन युक्त प्लाज्मिड के 5 एनजी जोड़कर सक्षम कोशिकाओं को बदलने और बर्फ पर 10 मिनट के लिए मशीन । हीट शॉक ४५ एस के लिए कोशिकाओं ४२ डिग्री सेल्सियस पर । catabolic दमन के साथ सुपर इष्टतम शोरबा के २०० μL जोड़ें (समाज) के माध्यम से ट्यूब और 4-8 के लिए मशीन में ३७ ° c पर एक कक्षीय शेखर में २२५ rpm ।
  3. प्लेट एक bacmid पौंड आगर प्लेट पर कोशिकाओं के 5 μL (५० μg/एमएल कनमीसिन, 7 μg/एमएल gentamicin, 10 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन, १०० μg/एमएल Bluo-gal, और ४० μg/एमएल isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], आगर).
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४८ ज के लिए थाली मशीन ।
    नोट: Bluo-gal सूचक दाग कालोनियों जो अभी भी lacZ (वेक्टर सम्मिलन असफल) व्यक्त कर रहे हैं, सफेद (सफलतापूर्वक रूपांतरित) कालोनियों के चयन के लिए अनुमति देता है ।
  5. ध्यान से एक पृथक सफेद कॉलोनी का चयन करें, किसी भी सफेद कालोनियों है कि नीले रंग की कालोनियों के संपर्क में हैं, और bacmid पौंड मध्यम (५० μg/एमएल कनमीसिन, 7 μg/एमएल gentamicin, 10 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन) की 6 मिलीलीटर में रातोंरात कोशिकाओं को बढ़ने से बचने के ३७ डिग्री सेल्सियस में एक कक्षीय शेखर में २२५ rpm ।

2. Bacmid डीएनए के अलगाव के लिए बैक्टीरियल तैयारी

  1. bacmid डीएनए को अलग करने के लिए, २८८० x gपर 10 मिनट के लिए नीचे ई कोलाई कोशिकाओं स्पिन
  2. supernatant त्यागें और miniprep किट से सेल resuspend समाधान के २०० µ l में गोली resuspend ( सामग्री की तालिकादेखें) pipetting द्वारा । सुनिश्चित करें कि गोली पूरी तरह से और homogenously निलंबित कर दिया है । फिर, १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में सेल निलंबन स्थानांतरण ।
  3. miniprep किट से सेल lysis सॉल्यूशन का २०० µ l डालें और कई बार ट्यूब को उलटा करके मिलाइये । कक्षों को लाइसे करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट तक के लिए मशीन । miniprep किट और मिश्रण से बेअसर समाधान के २०० µ एल जोड़ें ट्यूब पलटने से कुछ समय lysis प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ।
  4. एक मेज टॉप केंद्रापसारक में २१,१३० x जी में 10 मिनट के लिए नीचे स्पिन । एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में supernatant के ६०० μL लीजिए । जोड़ें ६०० μL phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) और सेल lysis उत्पादों के शेष से डीएनए निकालने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण ।
    चेतावनी: Phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl शराब समाधान सांस लेना द्वारा विषाक्त है, त्वचा के साथ संपर्क में है, और अगर निगल लिया । यह केमिकल जलने का कारण बन सकता है और यलो हो सकता है । दस्ताने पहनते है और एक बटन लैब कोट । एक धुएं डाकू में काम करते हैं । इस खतरनाक कचरे के निपटान उचित है ।
  5. एक मेज टॉप केंद्रापसारक में २११३० x जी में 10 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन । दो अलग तरल चरणों दिखाई जाएगी । ध्यान से एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी जलीय चरण के ३०० μL स्थानांतरण । डीएनए को धोने के लिए १००% इथेनॉल के ६०० μL जोड़ें । धीरे मिश्रण करने के लिए ट्यूब उलटा ।
    नोट: भंवर नहीं है, के रूप में इस bacmid डीएनए कतरनी कर सकते हैं ।
  6. 10 मिनट के लिए एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखकर उन्हें शांत ट्यूबों. 10 मिनट के लिए नीचे स्पिन २१,१३० एक्स जी में एक मेज टॉप केंद्रापसारक में । supernatant त्यागें और डीएनए गोली की रक्षा ।
  7. गोली धोने के लिए ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे मिश्रण करने के लिए ट्यूब उलटा । एक तालिका शीर्ष केंद्रापसारक में २१,१३० x जी में 10 मिनट के लिए स्पिन । supernatant त्यागें और गोली लगभग 5 मिनट के लिए शुष्क हवा के लिए या जब तक कोई तरल ट्यूब में दिखाई दे रहा है और डीएनए गोली पारदर्शी हो जाता है अनुमति देते हैं ।
  8. ५० में सूखी गोली resuspend, बाँझ के µ एल, DNase-मुक्त, जल । डीएनए एकाग्रता को मापने ।
    नोट: bacmid डीएनए फ्रीज नहीं है । 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए स्टोर ।

3. Bacmid के साथ Sf9 कीट कोशिकाओं के अभिकर्मक P1 Baculovirus का उत्पादन

  1. बीज ०.९ x 106 Sf9 कोशिकाओं के उचित माध्यम से 2 मिलीलीटर ( सामग्री की तालिकादेखें) में एक 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की एक अच्छी तरह से । थाली के लिए लगाव को बढ़ावा देने के लिए 20 मिनट के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन ।
    चेतावनी: सेल संस्कृतियों एक संभावित खतरा है । अपूतित तकनीकों का उपयोग कर एक अनुमोदित लामिना प्रवाह हूड में काम और अनुशंसित सुरक्षात्मक कपड़ों और अपशिष्ट के उचित निपटान के लिए संस्थागत और सरकारी दिशा निर्देशों की जांच करने से पहले प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए ।
  2. लगाव के बाद, अभिकर्मक के 8 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से एक बाँझ ट्यूब में transfected जा रहा है के लिए मीडिया के १०० µ एल । एक अलग बाँझ ट्यूब में मध्यम के १०० µ एल के लिए bacmid डीएनए के 6 μg जोड़ें । आरटी पर 5 मिनट की मशीन दो समाधान और आरटी पर ४५ मिनट के लिए मशीन का मिश्रण ।
  3. 6 कुओं में मध्यम ताजा मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें । एक अच्छी तरह से dropwise के लिए पिछले कदम से मिश्रण जोड़ें (प्रति well २०० µ एल) । धीरे से मध्यम में अभिकर्मक समाधान के मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए थाली रॉक ।
    नोट: भंवर या थाली हिला नहीं है क्योंकि यह कोशिकाओं को अलग करने का कारण होगा ।
  4. एक 27 ° c humidified मशीन में 5 डी (१२० ज) के लिए कोशिकाओं की मशीन । जांच करें कि वायरस कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत में उत्पादित किया जा रहा है सत्यापित करने के लिए कटाई से पहले GFP प्रतिदीप्ति; यदि प्रतिशत कम है, के रूप में आवश्यक गर्मी समय विस्तार ( चित्रा 1Cदेखें) ।
  5. P1 वायरस युक्त supernatant लीजिए (एक अच्छी तरह से के बारे में 2 मिलीलीटर) । एक 3 मिलीलीटर सिरिंज और छोटे ०.२ µm फिल्टर का उपयोग कर 2 मिलीलीटर ट्यूबों में P1 वायरस युक्त माध्यम फिल्टर । 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) जोड़ें ।
    नोट: P1 वायरस का यह स्टॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए ।

4. P1 Baculovirus के साथ Sf9 कीट कोशिकाओं के संक्रमण P2 Baculovirus का उत्पादन करने के लिए

  1. तैयार २०० मिलीलीटर (या वांछित मात्रा) Sf9 कोशिकाओं की एकाग्रता पर ०.८-०.९ x 106 कोशिकाओं/मिलीलीटर उचित माध्यम में ( सामग्री की तालिकादेखें) में एक फ्लैट नीचे Erlenmeyer पर्याप्त आकार की संस्कृति कुप्पी ।
    नोट: निलंबन संस्कृति के लिए, उपयोग की गई मात्रा कुप्पी की कुल क्षमता का ४०% से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  2. Sf9 कोशिका निलंबन संस्कृति के लिए ३.५ से P1 वायरस स्टॉक के 1:2500 अनुपात (वी/वी) जोड़ें । इष्टतम वायरस अभिव्यक्ति के समय के लिए मशीन (आमतौर पर ४८-१२० एच प्रोटीन के निर्माण पर निर्भर करता है) में 27 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर में ११५ rpm ।
    नोट: सापेक्षिक वायरस व्यंजक को संस्कृति के एक नमूने में वायरस के GFP प्रतिदीप्ति को देखकर निर्धारित किया जा सकता है.
  3. ११,५२० x जी में ४० मिनट के लिए सेल निलंबन केंद्रापसारक और P2 वायरस युक्त supernatant इकट्ठा । डिस्पोजेबल ०.२ µm फिल्टर का उपयोग कर supernatant फिल्टर । ०.५% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए FBS जोड़ें ।
    नोट: P2 वायरस के इस शेयर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए ।
  4. Sf9easy कोशिकाओं या एक वायरस काउंटर का उपयोग कर P2 वायरस के लिए एक titer प्राप्त करें ।

5. बड़े पैमाने पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए P2 Baculovirus के साथ HEK293 स्तनधारी कोशिकाओं का संक्रमण

  1. HEK293 स्तनधारी सेल निलंबन संस्कृति की एक वांछनीय मात्रा तैयार (4-6 एल जमे हुए ग्रिड की तैयारी के लिए सिफारिश की है) ३.५ की एकाग्रता में-३.८ x 106 कोशिकाओं/एमएल में अभिव्यक्ति मध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) 1% के साथ पूरक (v/ v) चकित-नीचे Erlenmeyer पर्याप्त आकार की संस्कृति की कुप्पी में बाँझ FBS.
    नोट: निलंबन संस्कृति के लिए, उपयोग की गई मात्रा कुप्पी की कुल मात्रा का ४०% से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  2. HEK293 कोशिका निलंबन संस्कृति के लिए कदम ४.३ से P2 वायरस स्टॉक समाधान के 8% (v/v) जोड़ें । १३५ rpm पर एक कक्षीय शेखर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  3. 12-18 एच के बाद संक्रमण में 10 मिमी सोडियम butyrate जोड़ें । 30 डिग्री सेल्सियस पर इष्टतम प्रोटीन अभिव्यक्ति (आमतौर पर ३६-७२ ज) के समय के लिए मशीन ।
  4. २,८८० एक्स जीमें 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा फसल कोशिकाओं लगभग १०० मिलीलीटर tris में resuspend द्वारा कोशिकाओं को धो-बफर खारा (टीबीएस) कोशिकाओं के प्रति लीटर काटा । २,८८० x जी में 20 मिनट के लिए फिर से केंद्रापसारक और सेल गोली इकट्ठा ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । कोशिका छर्रों तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए और शुद्धि तक-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    चेतावनी: तरल नाइट्रोजन क्रायोजेनिक जलता है या चोट के कारण हो सकता है । इसका कारण शीतदंश हो सकता है । यह ऑक्सीजन विस्थापन और तेजी से घुटन के कारण हो सकता है । ठंड से बचाने के दस्ताने और चेहरा ढाल पहनते हैं ।
  5. विभिंन डिटर्जेंट और/या additives की उपस्थिति में कमाल है या सरगर्मी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए अलग-अलग समय अंक और solubilize पर छोटे 1 मिलीलीटर फसल लीजिए । इन छोटे पूरे सेल solubilized नमूने २३५,००० × जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ultracentrifugation द्वारा स्पष्ट किया जा सकता है और एक आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) कॉलम ( सामग्री की तालिकादेखें) पर एक 30 μL नमूना के रूप में चलाने के लिए सबसे अच्छा समय निर्धारित करने के लिए अभिव्यक्ति और उत्तम solubilization शर्तें ।
    नोट: hTRPC3 के मामले में, इस स्क्रीनिंग ४.०-९.५ और ५०-५०० मिमी के नमक सांद्रता से पीएच मूल्यों के साथ अलग बफर शामिल; विभिंन ईओण रचनाएं (जैसे MgCl2 या NaCl के रूप में); क्रिटिकल micelle एकाग्रता के साथ अलग डिटर्जेंट (सीएमसी) ०.१-20 मिमी के मूल्यों; dithiothreitol, tris (2-carboxyethyl) phosphine, और β-mercaptoethanol जैसे additives को कम करने; और कैल्शियम-chelating additive ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) ।

6. जमे हुए सेल गोली से hTRPC3 प्रोटीन का शुद्धिकरण

  1. गल बफर में गोली 20 मिमी Tris (पीएच ८.०), ५०० मिमी NaCl, 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF), ०.८ माइक्रोन aprotinin, 2 μg/एमएल leupeptin, 2 मिमी pepstatin एक, और 1% digitonin, की कोशिकाओं के प्रति लीटर बफर के १०० मिलीलीटर का उपयोग कर काटा । एक बार गल, pipetting या सरगर्मी से समाधान की एकरूपता सुनिश्चित करते हैं । एक बार घूर्णन हलचल के साथ बर्फ में डूबे एक चोंच में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए solubilize करने के लिए अनुमति दें ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए २३५,००० × g पर ultracentrifugation द्वारा सेल मलबे निकालें । एक एसईसी स्तंभ पर एक 30 μL नमूना ( सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) और GFP संकेत उत्पादन द्वारा लक्ष्य प्रोटीन कल्पना द्वारा प्रोटीन की मात्रा की पुष्टि करें ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 ज के लिए कोबाल्ट संबध राल के साथ solubilized प्रोटीन (supernatant) की मशीन । एक सेकंड कॉलम पर एक 30 μL नमूना चल रहा द्वारा राल के लिए प्रोटीन बाध्यकारी सत्यापित करें ।
    नोट: यदि प्रोटीन बाइंडिंग हुई है, तो GFP टैग किए गए प्रोटीन लक्ष्य को स्तंभ पर रखा जाएगा, न कि प्रवाह-थ्रू में । इसलिए, कोई GFP संकेत लक्ष्य प्रोटीन आकार करने के लिए इसी स्थिति में मौजूद होगा जब प्रवाह के माध्यम से HPLC पर चलाया जाता है ।
  4. बफर के 10 कॉलम संस्करणों के साथ राल धो (20 मिमी Tris, पीएच ८.०, ५०० मिमी NaCl, 15 मिमी imidazole, और ०.१% digitonin). एक सेकंड कॉलम पर एक 30 μL नमूना चलाकर प्रोटीन घटाने के लिए जांच करें ।
    नोट: यदि स्तंभ से प्रोटीन हानि हुई है, GFP टैग किए गए प्रोटीन लक्ष्य है कि कॉलम में पारित कर दिया है धो बफर में पाया जाएगा । इसलिए, GFP संकेत जब वाश बफ़र HPLC पर चलाया जाता है लक्ष्य प्रोटीन आकार करने के लिए संगत स्थिति पर मौजूद हो जाएगा । प्रोटीन की हानि हुई है, तो imidazole की एकाग्रता को धो बफ़र के संबंध स्तंभ के लिए अपने टैग बाइंडिंग को बाधित करने को रोकने के लिए कम करने के लिए पड़ सकता है ।
  5. Elute बफर के साथ राल बंधे hTRPC3 (20 मिमी Tris, पीएच ८.०, ५०० मिमी NaCl, २५० मिमी imidazole, और ०.१% digitonin) । एक 1:20 दाढ़ अनुपात में thrombin जोड़ें (GFP टैग सट करने के लिए) और hTRPC3 नमूना करने के लिए 10 मिमी EDTA (एक eluted स्थिर एजेंट) जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए मशीन । जांच करें कि प्रोटीन एक सेकंड कॉलम पर 1:100 पतला एक नमूना के ९० μL चल रहा है और लक्ष्य प्रोटीन आकार करने के लिए इसी स्थिति में एक GFP संकेत की उपस्थिति की पुष्टि के द्वारा eluted किया गया है ।
    नोट: इस समय रेफरेंस में कुल प्रोटीन से tryptophan सिग्नल भी देखे जा सकते हैं । केवल लक्ष्य संबध-शुद्ध प्रोटीन रेफरेंस में रहेगा और GFP और tryptophan सिग्नल प्रोफाइल में समरूपी के निकट होंगे । अगर लक्ष्य प्रोटीन रेफरेंस में बड़ी मात्रा में नहीं देखा है लेकिन प्रवाह के माध्यम से या धोने में खो नहीं था, प्रोटीन की संभावना कॉलम के लिए बाध्य रह गया है और बफर में imidazole की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग कर eluted जा सकता है ।
  6. एक 15 मिलीलीटर 100K केंद्रापसारक फिल्टर ट्यूब में ५०० μL या कम करने के लिए eluate ध्यान केंद्रित ( सामग्री की तालिकादेखें) 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट वेतन वृद्धि में २,८८० x g पर कताई द्वारा । resuspend प्रोटीन समाधान pipetting और स्पिन के बीच नीचे से अधिक ध्यान देने से बचने के लिए ।
    नोट: समय केंद्रापसारक मात्रा वांछित अंतिम मात्रा दृष्टिकोण के रूप में छोटा किया जा सकता है ।
  7. बफर में एक सेकंड कॉलम पर ध्यान केंद्रित लोड (20 मिमी Tris, पीएच ८.०, ५०० mm NaCl, 1 mm EDTA, और ०.१% digitonin) । चलाने.
  8. चोटी बरकरार TRPC3 tetramer युक्त अंशों का मिश्रण है, के रूप में यूवी अवशोषक संकेत द्वारा visualized, और फिर से ध्यान केंद्रित करने के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए 5 मिलीग्राम/

7. अनिष्ट-दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन की स्क्रीनिंग

  1. चमक-निर्वहन मशीन चालू करें । 30 एस के लिए आर्गन और ऑक्सीजन का उपयोग कर एक कार्बन लेपित ग्रिड का निर्वहन करने के लिए कार्यक्रम का गठन करने के लिए कार्बन-कॉपर ४००-मेष ग्रिड हाइड्रोफिलिक पर कोटिंग करने के लिए पहले प्रोटीन समाधान के अलावा करने के लिए प्रोग्राम चलाएं ।
  2. सेट अप बाँझ पानी की ५ ४० μL बूंदें और 1% uranyl प्रारूपण समाधान के २ ४० μL बूंदें (प्रयोगशाला फिल्म, मोम कागज, या एक ऐसी ही सतह पर, सामग्री की तालिकादेखें) । ७.१ कदम से ग्रिड ले लो और अंधेरे पक्ष पर प्रोटीन नमूना 5 मिलीग्राम/एमएल (५०-२०० माइक्रोन) के २.५ μL जोड़ें और इसे 1 मिनट के लिए बैठते हैं ।
  3. 1 मिनट के बाद, ग्रिड फिल्टर कागज का उपयोग कर सूखी । ग्रिड सतह के लिए सीधे फिल्टर पेपर स्पर्श न करें; इसके बजाय, तरल छोटी बूंद के किनारे करने के लिए कागज लाने के लिए और केशिका कार्रवाई फिल्टर कागज में ग्रिड से तरल खींचने के लिए अनुमति देते हैं ।
  4. पानी की पहली बूंद में ग्रिड डुबकी । फिल्टर कागज के साथ सूखी और पानी की शेष बूंदों और uranyl प्रारूपण की पहली बूंद के साथ दोहराएं । uranyl formation की दूसरी बूंद 1 मिनट के लिए बैठते है और फिर फिल्टर कागज के साथ सूखी अनुमति देते हैं । ग्रिड पूरी तरह से शुष्क हवा (के बारे में 1 मिनट) भंडारण से पहले की अनुमति दें ।
    नोट: यह दाग प्रोटोकॉल सभी प्रोटीन के लिए आदर्श नहीं हो सकता है-डिटर्जेंट संयोजन । uranyl प्रारूप के विभिंन सांद्रता दाग और दाग जोखिम के लिए समय की विभिंन लंबाई का परीक्षण किया जाना चाहिए अगर ऊपर कदम अच्छा कंट्रास्ट के साथ एक दाग प्रदान नहीं करते हैं ।
  5. छवि एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर ग्रिड ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रोटीन कण की गुणवत्ता की जांच करने के लिए । सुनिश्चित करें कि माइक्रोग्राफ कई कणों कि सामान्य उपस्थिति और वितरण में समरूप हैं दिखाने के लिए, अच्छा विपरीत प्रदर्शन, और लक्ष्य प्रोटीन की अनुमानित आकार से मेल खाते हैं.
  6. उत्पंन प्रारंभिक, कम संकल्प, दो आयामी (2d) ५०-१०० माइक्रोग्राफ का उपयोग वर्गीकरण (देखें डेटा प्रोसेसिंग-कदम 10) की जांच करने के लिए कि कणों एक सुसंगत संरचना के विभिंन विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
    नोट: माइक्रोग्राफ और प्रारंभिक पर्याप्त गुणवत्ता के 2d वर्गों, जैसा कि ऊपर वर्णित है, एक मजबूत संकेत है कि प्रोटोकॉल पर्याप्त प्रोटीन शुद्धि के लिए अनुकूलित किया गया है । तैयारी और क्रायो-EM ग्रिड की स्क्रीनिंग इस बिंदु पर वारंट है ।

8. EM नमूना तैयारी

  1. चमक-निर्वहन एक सोने का छेद कार्बन ग्रिड ( सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में ७.१ कदम में वर्णित है ।
  2. लागू hTRPC3 प्रोटीन नमूना (5 मिलीग्राम/एमएल) के ग्रिड पर २.५ μL । दाग १.५ एस के लिए ग्रिड 1 के एक दाग बल और 5 के एक प्रतीक्षा समय का उपयोग कर १००% आर्द्रता और 4 डिग्री सेल्सियस, तो तरल में ग्रिड डुबकी तरल नाइट्रोजन द्वारा ठंडा एक vitrification मशीन का उपयोग कर ।
    नोट: आर्द्रता, तापमान, दाग-बल, दाग समय, और प्रतीक्षा समय यहां सूचीबद्ध लेखकों ' hTRPC3 अध्ययन19के लिए उपयोग किया गया । वे अंय प्रोटीन और डिटर्जेंट के लिए इष्टतम अवलेह बर्फ का उत्पादन बदलने की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. एक क्रायो-EM माइक्रोस्कोप का उपयोग कर इष्टतम बर्फ की स्थिति के लिए स्क्रीन जमे हुए ग्रिड ( सामग्री की तालिकादेखें) और मैन्युअल रूप से मोटी बर्फ के क्षेत्रों को देखने (ग्रिड चौकों कि छोटे और गहरे रंग दिखाई देते हैं), पतली बर्फ (बड़ा और उज्जवल दिखाई देते हैं कि ग्रिड चौकों), और मध्यम बर्फ .
    नोट: मोटा बर्फ अक्सर अधिक कणों रखती है, जबकि पतली बर्फ अक्सर बेहतर कंट्रास्ट और संकल्प पैदावार । monodispersed कणों की एक बड़ी संख्या में अच्छा कंट्रास्ट और समाधान के साथ जो बर्फ की स्थिति का परिणाम निर्धारित करने के लिए छवियों के मैनुअल स्क्रीनिंग का उपयोग करें । एक बार अच्छी शर्तों सत्यापित कर रहे हैं, एक ३०० केवी क्रायो-EM माइक्रोस्कोप पर छवि संग्रह के लिए कदम ।

9. EM डेटा संग्रह

  1. एक स्वचालित अधिग्रहण कार्यक्रम का प्रयोग, रिकॉर्ड छवि सुपर संकल्प गिनती मोड में एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 130, 000X प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के नाममात्र का इज़ाफ़ा के साथ ३०० केवी पर संचालित पर १.०७४ Å की एक बिन्नी पिक्सेल आकार के साथ ।
  2. खुराक-fractionate हर इमेज को ४० फ्रेम्स के साथ 8 एस का कुल एक्सपोजर टाइम, ०.२ एस फ्रेम के साथ और ६.७६ की खुराक दर ई− Å− 2 s− 1 (नाममात्र के infocus मूल्यों को १.० से २.५ माइक्रोन से लेखकों के प्रयोग में अलग) ।

10. EM डेटा प्रोसेसिंग

  1. संक्षेप फिल्म स्टैक22 और अनुमान infocus मूल्यों23 डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें)24के प्रस्ताव सुधार लागू करें ।
  2. माइक्रोग्राफ से कणों उठाओ । इन उठाया कणों का उपयोग करने के लिए एक प्रारंभिक संदर्भ-मुफ्त 2 डी वर्गीकरण सॉफ्टवेयर24का उपयोग कर निर्माण । संपूर्ण डेटा सेट के लिए स्वचालित कण चुनने के लिए टेंपलेट्स के रूप में उपयोग करने के लिए आदर्श 2d वर्ग औसत का चयन करें ।
  3. मैन्युअल रूप से ऑटो उठाया कणों की गुणवत्ता की जाँच करें और खराब कणों को हटा दें । उठाया कणों को साफ करने के लिए 2d वर्गीकरण के कई दौर का प्रयोग करें ।
  4. एक प्रारंभिक मॉडल25उत्पंन करते हैं । विषय 2d तीन आयामी (3 डी) वर्गीकरण (के बारे में 5 वर्गों) C1 समरूपता और एक प्रारंभिक पुनर्निर्माण कम एक संदर्भ मॉडल के रूप में ६० Å के फिल्टर से गुजारें का उपयोग करने के लिए कणों उठाया । निर्धारित करें कि कौन सा वर्ग उच्च-रिज़ॉल्यूशन सुविधाएं है और ऐसे वर्ग के भीतर कणों का मिश्रण है ।
  5. इसके अलावा (hTRPC3 के मामले में) C4 समरूपता के साथ स्थानीय शोधन का उपयोग कर कणों को परिष्कृत लागू और कण संरेखण के लिए एक उच्च संकल्प सीमा ४.५ Å26के लिए सेट ।

11. मॉडल बिल्डिंग

  1. एक मॉडल का निर्माण (सॉफ्टवेयर इस्तेमाल के लिए सामग्री की तालिका देखें) । hTRPC3 के लिए, transmembrane डोमेन (TMD) का उपयोग क्षणिक रिसेप्टर संभावित melastatin 4 (TRPM4) संरचना प्रोटीन डाटा बैंक (PDB) 5wp6 एक गाइड के रूप में27. डी नोवो इमारत गाइड करने के लिए भारी अवशेषों और माध्यमिक संरचना की भविष्यवाणी का प्रयोग करें ।
  2. माध्यमिक संरचना के साथ वास्तविक अंतरिक्ष शोधन के लिए प्रारंभिक मॉडल विषय28संयमी । मैन्युअल रूप से परिष्कृत मॉडल की जाँच करें और आवश्यकतानुसार संशोधित करें (उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर के लिए सामग्री की तालिका देखें).
  3. रूपान्तर शेल सहसंबंध लागू करें (FSC) curves परिष्कृत संरचना के सत्यापन के लिए अंतिम मॉडल और EM मानचित्र के बीच अंतर की गणना करने के लिए । परमाणु मॉडलों के geometries का मूल्यांकन (सॉफ्टवेयर इस्तेमाल के लिए सामग्री की तालिका देखें)29,30।

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Representative Results

अभिव्यक्ति और hTRPC3 की शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 1aमें दिखाया गया है । आदर्श सफेद कालोनियों के साथ hTRPC3 bacmid प्लेट की एक छवि, bacmid डीएनए शोधन के लिए चयनित एक के समान, चित्रा 1bमें दिखाया गया है । हमने पाया है कि ४८ एच स्पष्ट Bluo के लिए आदर्श है, जबकि अलग कॉलोनियों की उपस्थिति बनाए रखने लड़की धुंधला । hTRPC3 के लिए P2 वायरस के पीक उत्पादन, के रूप में GFP प्रतिदीप्ति द्वारा visualized, Sf9 कीट कोशिकाओं (चित्रा 1C) में संक्रमण के 4 डी के बाद देखा गया था ।

P2 baulovirus मीडिया से काटा गया था, 1% FBS के साथ पूरक है, और HEK293 स्तनधारी कोशिकाओं के निलंबन को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया । सोडियम butyrate प्रोटीन अभिव्यक्ति20को बढ़ावा देने के लिए वायरस के बाद संक्रमित कोशिकाओं 12-18 ज में जोड़ा गया था । कोशिकाओं को तो 30 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त ३६ एच के लिए मशीन थे । कोशिकाओं को काटा और FSEC (चित्रा 2a)21द्वारा घुलनशीलता और स्थिरता स्क्रीनिंग के अधीन थे । कोशिकाओं को ०.०१ के सीएमसी मूल्यों के साथ सात अलग डिटर्जेंट का उपयोग कर solubilized थे-20 मिमी एक डिटर्जेंट एकाग्रता में लगभग 10 बार सीएमसी मूल्य. पूरे-सेल solubilization के बाद, सेल lysis मलबे ultracentrifugation द्वारा हटा दिया गया था और solubilized प्रोटीन युक्त supernatant एक सेकंड कॉलम पर लोड किया गया था और n-HPLC में dodecyl पर चलाने-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (डीडीएम/CHS) डिटर्जेंट युक्त बफर एक TRPM4 नियंत्रण (चित्रा बी) के सापेक्ष विभिन्न स्थितियों के तहत hTRPC3 की निरपेक्ष घुलनशीलता और चोटी की मात्रा की स्थिति की तुलना करने के लिए । हम विभिंन डिटर्जेंट में solubilized नमूनों के लिए प्रारंभिक चल रहे बफर के रूप में डीडीएम/CHS का उपयोग करने के लिए चुना है क्योंकि डीडीएम/CHS झिल्ली प्रोटीन की संरचनाओं को हल करते समय सबसे अधिक इस्तेमाल किया डिटर्जेंट है । विभिंन डिटर्जेंट-solubilized TRPC3 नमूनों के सभी के बारे में ११.९ मिलीलीटर, जो संभावना बहुत बड़ी है पर चोटी पदों दिखाया है, क्योंकि hTRPC3 के tetrameric रूप सकारात्मक नियंत्रण मानव TRPM4 से एक छोटे आणविक भार है (चित्रा 2a और चित्र b) ।

फिर भी, क्योंकि वहां किसी TRPC चैनल रिसेप्टर की कोई संरचना करने के लिए हमारे परिणामों की तुलना करने के लिए और क्योंकि बड़े आणविक वजन TRPC3 या अन्य कारकों की वास्तुकला की वजह से हो सकता है, हम hTRPC3 के एक छोटे पैमाने पर शुद्धीकरण के 25 मिलीलीटर का उपयोग किया डीडीएम/CHS के रूप में प्रयोग के दौरान CHS भर का उपयोग कर कोशिकाओं hTRPC3 का सबसे अच्छा घुलनशीलता दिया । hTRPC3 के एसईसी प्रोफ़ाइल एक monodisperse चोटी दिखाया लेकिन एक चोटी TRPM4 से एक उच्च आणविक वजन का प्रतिनिधित्व करने की स्थिति में अभी भी था (नहीं दिखाया डेटा) । हम नकारात्मक द्वारा सेकंड प्रोफाइल के पीक अंश में प्रोटीन की जांच की, उंहें दाग है, क्योंकि यह प्रोटीन की गुणवत्ता की पुष्टि की एक तेजी से विधि है और प्रोटीन की एक बहुत छोटी राशि की आवश्यकता है । micrograph में, कणों एक ही कण में मौजूद दो transmembrane डोमेन के साथ मनाया गया । यह प्रकट है कि दो hTRPC3 कणों dimerized एक सिर में दो cytosolic डोमेन (चित्रा 3 डी) के बीच बातचीत के माध्यम से सिर तरीके से । हम तो दूसरे छोटे पैमाने पर शुद्धिकरण के लिए शुद्धि बफर में कम करने वाले रिएजेंट dithiothreitol (डीटीटी) शामिल थे, hTRPC3 के dimerization को बाधित करने की उम्मीद. वास्तव में, कम आणविक वजन के साथ एक दूसरे शिखर एसईसी आंशिक रूप से दिखाई दिया । हालांकि, कणों एक बरकरार tetramer होने के लिए बहुत छोटा दिखाई दिया और एक transmembrane डोमेन के रूप में झिल्ली प्रोटीन की कोई विशेषताएं नहीं दिखाया. यह पता चला कि डीडीएम/CHS शुद्ध hTRPC3 के लिए एक उपयुक्त डिटर्जेंट नहीं था, hTRPC3 के लिए सबसे अच्छा घुलनशीलता देने के बावजूद ।

अगले, हम एक मामूली डिटर्जेंट की कोशिश की, digitonin, solubilize hTRPC3 के लिए, और यह के साथ तुलना में प्रोटीन solubilized में डीडीएम/CHS । यहां हम दो अलग चल रहे बफर का इस्तेमाल किया डीडीएम/CHS और digitonin, क्रमशः । यह दिया महत्वपूर्ण है कि चल बफर में डिटर्जेंट अक्सर प्रोटीन स्थिरता के लिए योगदान देता है और यह कि झिल्ली प्रोटीन अस्थिरता हो सकती है जब solubilization से FSEC को डिटर्जेंट बदल सकता है । प्रोटीन digitonin युक्त बफर में चलाने के एक कम आणविक वजन की ओर एक होनहार शिखर बदलाव दिखाया जब या तो डीडीएम/CHS या digitonin में solubilized । प्रोटीन solubilized द्वारा और digitonin में चलाने के सकारात्मक नियंत्रण की स्थिति के सापेक्ष एक उचित स्थिति में सर्वोच्च शिखर उपज, मानव TRPM4 (3 ए आंकड़ा) । तो फिर हम एक छोटे पैमाने पर कोशिकाओं के 25 मिलीलीटर का उपयोग कर शुद्धि प्रदर्शन से आगे चले गए । हालांकि कई और व्यापक चोटियों सेकंड (चित्र 3 बी) द्वारा मनाया गया, प्रोटीन 2 डी वर्गीकरण में एक एकल tetrameric hTRPC3 चैनल के नकारात्मक द्वारा सुविधाओं को दिखाया-दाग EM (चित्रा 2 डी और चित्रा 3d) । हम निष्कर्ष है कि digitonin शुद्ध hTRPC3 के लिए एक आदर्श डिटर्जेंट है ।

हम hTRPC3 की अभिव्यक्ति बढ़ाया और digitonin में कोशिकाओं के ४०० मिलीलीटर का उपयोग कर एक मध्यम पैमाने पर शुद्धि प्रदर्शन किया । ऐसा करके, हम एक बड़े पैमाने पर hTRPC3 शुद्ध करने के लिए बाहर लगा अंतिम शर्तों से पहले हम मध्यम और डिटर्जेंट बर्बाद कर के बिना कुछ जमे हुए ग्रिड के लिए पर्याप्त प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आशा व्यक्त की । यह अक्सर होता है कि झिल्ली प्रोटीन अस्थिरता दिखाने जब अत्यधिक जमे हुए ग्रिड की तैयारी के लिए ध्यान केंद्रित । शुद्ध और केंद्रित प्रोटीन FSEC द्वारा एक उच्च आणविक वजन की ओर न केवल स्थानांतरित कर दिया, लेकिन यह भी क्रायो में शोर पृष्ठभूमि-EM ग्रिड एक इलेक्ट्रॉन एक EMCCD कैमरा के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दिखाया । हालांकि हम एकल, बरकरार tetrameric रिसेप्टर्स का पालन करने में सक्षम थे, hTRPC3 digitonin में शुद्ध उच्च संकल्प क्रायो-EM अध्ययन के लिए आदर्श नहीं था.

आगे प्रोटीन स्थिरता में सुधार करने के लिए, हम प्रोटोकॉल चरण 5 में वर्णित शर्तों की एक बड़ी संख्या दिखलाई । हम hTRPC3 के शारीरिक चरित्र के आधार पर additives स्क्रीन करने के लिए चुना; जैसे, EDTA चुना गया था क्योंकि hTRPC3 कैल्शियम के लिए पारगंय है और कैल्शियम को हटाने प्रोटीन को स्थिर कर सकते हैं । सभी नमूने digitonin-बफर युक्त में चल FSEC द्वारा परीक्षण किया, 10 मिमी EDTA एक बरकरार tetrameric चोटी की स्थिति (चित्रा 4a) में स्थिर hTRPC3 पर एक उल्लेखनीय प्रभाव दिखाई दिया । यह भी काफी क्रायो-EM micrograph में कणों की संख्या में वृद्धि हुई है और पृष्ठभूमि में शोर में कमी आई, जैसा कि चित्रा 5में दिखाया गया है ।

अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए आदर्श स्थितियों की पहचान कर, हम hTRPC3 के एक बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति (2 एल) का प्रदर्शन किया । hTRPC3 युक्त कोशिकाओं को काटा गया और फिर solubilized. Ultracentrifuge-स्पष्ट lysate एक गुरुत्वाकर्षण कॉलम में शुद्धि के बाद एक कोबाल्ट राल के साथ बंधन बैच द्वारा धातु-संबध कॉलम शुद्धि के अधीन था । कॉलम के भीतर solubilized प्रोटीन की अवधारण और अपनत्व के रेफरेंस-शुद्ध प्रोटीन कॉलम से FPLC (फिगर 4B) का सत्यापन किया गया. हमने पाया है कि hTRPC3 के लिए, धोने बफर में 15 मिमी की एक imidazole एकाग्रता के लिए विशिष्ट राल बाध्यकारी के साथ दूषित प्रोटीन को दूर करने के लिए पर्याप्त था, और २५० mm imidazole रेफरेंस बफर में solubilized के बहुमत elute करने के लिए पर्याप्त था hTRPC3 प्रोटीन राल के लिए बाध्य । सभी नमूनों FSEC द्वारा जांच की गई, और eluted प्रोटीन सही चोटी की स्थिति में एक तेज, monodisperse चोटी दिखाया । GFP टैग और hTRPC3 प्रोटीन के बीच आंतरिक लचीलापन के रूप में छवि प्रसंस्करण के दौरान प्रोटीन कणों के संरेखण और अधिक चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं, और क्योंकि एक thrombin दरार साइट GFP और hTRPC3 के बीच स्थित है, हम शुद्ध की एक छोटी राशि का परीक्षण अलग दरार बार में प्रोटीन thrombin का उपयोग करना । यह देखते हुए कि eluted प्रोटीन एक 1:20 दाढ़ अनुपात में thrombin के साथ मशीन उचित स्थिरता और पूरा दरार 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के बाद दिखाया गया है, हम सब शुद्ध प्रोटीन से GFP एक ही शर्तों का उपयोग कर और HPLC द्वारा जांच की पुष्टि करने के लिए कि GFP सी गया है ompletely निकाला गया (आरेख 4c) । प्रोटीन आगे एस द्वारा शुद्ध किया गया था, और GFP के दरार फिर एक छोटे आणविक वजन (चित्रा 4d) की ओर चोटी की स्थिति बदलाव से कल्पना की जा सकती है । मुख्य पीक अंश से एक छोटे से ध्यान केंद्रित नमूना नकारात्मक के लिए ग्रिड बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था उंहें दाग । tetrameric hTRPC3 युक्त सभी अंशों तो संयुक्त और 5 मिलीग्राम/एमएल, जो क्रायो-EM इमेजिंग के लिए ग्रिड तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था की एक अंतिम एकाग्रता को ध्यान केंद्रित किया गया । जैसा कि हम ने देखा है कि प्रोटीन का हिस्सा अभी भी धीरे से एक बड़ा आणविक वजन की ओर स्थानांतरित, हम सही आणविक वजन में ही भागों एकत्र और ग्रिड तुरंत सील प्रोटीन शुद्धि के बाद । हम आम तौर पर एक ही दिन के भीतर जमे हुए ग्रिड की तैयारी के लिए प्रोटीन के शोधन से प्रयोगों के अनुक्रम पूरा किया ।

शुद्ध hTRPC3 प्रोटीन का एक २.५ μL नमूना (एकाग्रता 5 मिलीग्राम/एमएल) एक चमक-निर्वहन छेद कार्बन ग्रिड पर लागू किया गया था । एक vitrification मशीन के लिए ग्रिड तैयार करते थे, १००% आर्द्र तरल नाइट्रोजन द्वारा ठंडा तरल एतान में एक डुबकी के बाद के तहत एक १.५ s सोख्ता समय का उपयोग कर । इस कदम इमेजिंग के लिए अवलेह बर्फ में नमूना जमा देता है । छवियों पर कब्जा कर लिया गया था 130, 000X नाममात्र एक क्रायो इलेक्ट्रॉन ३०० केवी पर संचालित माइक्रोस्कोप द्वारा बढ़ाई । छवि के ढेर सुपर संकल्प गिनती मोड में १.०७४ Å के एक बिन्नी पिक्सेल आकार और एक नाममात्र के लिए १.० से २.५ माइक्रोन से लेकर एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर और स्वचालित अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मूल्य की गणना के साथ दर्ज किया गया । प्रत्येक छवि 8 एस (०.२ एस प्रति फ्रेम) और ६.७६ ई− Å−2 s−1की एक खुराक दर के कुल जोखिम समय के साथ ४० फ्रेम करने के लिए खुराक-fractionated था । इस डेटा सेट से एक प्रतिनिधि micrograph चित्रा 5में दिखाया गया है ।

गति सुधार और अभिव्यक्त फिल्म के ढेर के infocus मूल्यों का आकलन किया गया था । लगभग २०० परिणामस्वरूप माइक्रोग्राफ मैनुअल कण उठा और प्रारंभिक संदर्भ के लिए स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया मुक्त 2d वर्गीकरण31। इस प्रारंभिक वर्गीकरण से नौ प्रतिनिधि 2d वर्ग औसत चयनित और संपूर्ण डेटा सेट के लिए स्वचालित कण उठा के लिए टेंपलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया । एक मैनुअल की जांच के लिए ले लिया कणों स्पष्ट रूप से खराब कणों को दूर करने के लिए प्रदर्शन किया गया था, तो तीन राउंड के 2 डी वर्गीकरण के चयन को परिष्कृत करने के लिए लागू किया गया था फिर से लेने के कणों (चित्रा 5) । ये 2d श्रेणी के चयनित कणों पांच 3d कक्षाओं में वर्गीकृत एक प्रारंभिक संदर्भ मॉडल के रूप में ६० Å के एक कम पास फिल्टर का उपयोग कर रहे थे । इन पांच वर्गों में से केवल एक उच्च संकल्प सुविधाओं प्रदर्शित (चित्रा 5) । इस वर्ग से कणों को और अधिक ४.५ Å और C4 समरूपता लागू (चित्रा 5)३२के एक उच्च संकल्प सीमा के साथ स्थानीय शोधन के अधीन थे । परिष्कृत मॉडल मैंयुअल रूप से जांच की और संशोधित किया गया था । परिष्कृत संरचना FSC curves की गणना द्वारा मान्य किया गया अंतिम मॉडल और EM मानचित्र और परमाणु मॉडल३३के geometries के मूल्यांकन के बीच अंतर का निर्धारण करने के लिए.

प्रारंभिक मॉडल निर्माण एक गाइड३४के रूप में TRPM4 संरचना (PDB 5wp6) के TMD डोमेन का उपयोग किया गया था । De नोवो hTRPC3 के मॉडल का निर्माण मुख्य रूप से भारी अवशेषों और माध्यमिक संरचना भविष्यवाणी द्वारा निर्देशित किया गया था, बहुत संरचना में α helices के साथ बहुत रजिस्टर काम की सुविधा । प्रारंभिक डी नोवो-निर्मित मॉडल में, आदेश, लंबाई, और माध्यमिक संरचनात्मक सुविधाओं और भारी अवशेषों की स्थिति भविष्यवाणी के साथ करीब समझौते में हैं । जनकल्याण के दौरान, संकल्प अंतिम पुनर्निर्माण के लिए अनुमानित संकल्प से कम सीमा तक आयोजित किया गया. तीन आयामी FSC दो स्वतंत्र रूप से उत्पंन 3 डी नक्शे के बीच सामान्यीकृत पार सहसंबंध गुणांक को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था (प्रत्येक डेटा सेट का उपयोग कर आधा) रूपान्तर अंतरिक्ष में इसी गोले पर (के रूप में स्थानिक आवृत्ति के एक समारोह) । हम पुनर्निर्माण से ४.३ å के एक नरम मुखौटा कार्यरत है और एक अतिरिक्त ४.३ å कोज्या नरम बढ़त 10 å के एक कम पास फिल्टर के साथ साथ, तो सोने के मानक FSC ०.१४३ cutoff दहलीज इस्तेमाल किया । यह अंतिम समाधान रिपोर्टिंग के लिए उपयोग किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: BacMam प्रणाली का उपयोग कर hTRPC3 की अभिव्यक्ति और शुद्धि । (क) hTRPC3 अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए योजनाबद्ध प्रक्रिया. (ख) नीली-सफेद सूचक प्लेट पर Bacmid कॉलोनी चयन । एक अलग सफेद कॉलोनी (काला तीर), नहीं एक imbedded ब्लू कॉलोनी या एक नीली कॉलोनी (लाल तीर) के साथ संपर्क में एक सफेद कॉलोनी के साथ एक सफेद कॉलोनी चुनें । (ग) 20X आवर्धन के अंतर्गत Sf9 कोशिकाओं में P2 baculovirus का GFP प्रतिदीप्ति. प्रतिदीप्ति उज्ज्वल और कोशिका झिल्ली और/या एक शक्तिशाली वायरस के लिए कोशिकाओं के बहुमत के इंटीरियर पर मौजूद होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: FSEC द्वारा hTRPC3 की स्थिरता स्क्रीनिंग । (क) hTRPC3 की डिटर्जेंट स्क्रीनिंग. hTRPC3 ०.०१-20 मिमी की एक महत्वपूर्ण micelle एकाग्रता के साथ डिटर्जेंट की एक किस्म में पूरे सेल solubilized था और डीडीएम/CHS-युक्त बफर में चलाया गया था । हालांकि डीडीएम/CHS hTRPC3 के उच्चतम घुलनशीलता से पता चलता है, चोटी गलत स्थिति में दिखाई देता है, बहुत बड़ी tetrameric hTRPC3 (ब्लू ट्रेस) हो । (ख) TRPM4 नियंत्रण, लगभग ५४० केडीए के एक tetrameric आणविक भार के साथ, solubilized और CHS में चलाने के लिए, लगभग १२.९ मिलीलीटर की एक रेफरेंस मात्रा थी, जबकि TRPC3, एक tetrameric आणविक भार के साथ लगभग ४०० केडीए, solubilized और रन में डीडीएम/CHS, लगभग ११.९ मिलीलीटर की एक रेफरेंस मात्रा थी । एक छोटे आणविक वजन के साथ, hTRPC3 एक रेफरेंस मात्रा TRPM4 से थोड़ा बड़ा है, थोड़ा छोटा नहीं है, सुझाव है कि डीडीएम/CHS hTRPC3 solubilization और शुद्धि के लिए एक आदर्श डिटर्जेंट नहीं हो सकता है की उंमीद होगी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: डिटर्जेंट FSEC द्वारा hTRPC3 के बफर स्क्रीनिंग । (क) घुलनशीलता और स्थिरता परीक्षण के hTRPC3 का उपयोग digitonin. Digitonin दोनों solubilization के लिए और बफ़र चल रहा में परीक्षण किया गया था । digitonin में प्रोटीन solubilized की तुलना में एक बड़ा रेफरेंस वॉल्यूम की ओर खिसकाया hTRPC3 प्रोटीन solubilized की चोटी की स्थिति का ध्यान रखें डीडीएम/CHS (पीला स्ट्रेस बनाम नीला और लाल निशान) । केवल संयोजन दोनों solubilization और चल रहे बफ़र्स में digitonin का उपयोग करके FSEC (पीला ट्रेस, तारांकन) द्वारा hTRPC3 का सही आकार दिखाता है । (ख) सम्पूर्ण कोशिका solubilized hTRPC3 के FSEC परिणामों के समान, hTRPC3 प्रोटीन संबधों की चोटी की स्थिति digitonin में शुद्धि (रेड स्ट्रेस, 14 एमएल) प्रोटीन संबधों की तुलना में एक बड़ा रेफरेंस वॉल्यूम की ओर खिसकाया गया-डीडीएम/CHS (नीला ट्रेस, 12 मिलीलीटर) के रूप में सेकंड द्वारा मापा-भिन्नीकरण. (ग) नकारात्मक-दाग उंहें शुद्ध प्रोटीन की गुणवत्ता को सत्यापित करने से पहले क्रायो em डेटा संग्रह करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक आदर्श दाग कणों (लाल हलकों) नकारात्मक दाग (सफेद दिखने) और एक डिटर्जेंट की अंगूठी (काले दिखने) से घिरा पेश करना चाहिए । एक प्रतिनिधि, आदर्श micrograph जिसमें इन कणों प्रचुर मात्रा में हैं, monodispersed, और कई झुकाव में उपस्थित दिखाया गया है । (घ) नकारात्मक से गुणवत्ता डेटा-दाग उंहें एक स्पष्ट और लगातार सामांय वास्तुकला के साथ 2d कक्षाएं प्रदान करना चाहिए और प्रोटीन के कई झुकाव शामिल होना चाहिए, निहित औसत के साथ और मुखौटा के भीतर केंद्रित (काला सर्कल) । hTRPC3 solubilized के डीडीएम/CHS में नकारात्मक-दाग EM माइक्रोग्राफ से 2d कक्षाएं उपस्थित कणों कि dimerization hTRPC3 के एक सिर से सिर मोनोमर दिखाई देते हैं । इसके विपरीत, किसी न किसी (लेकिन स्पष्ट और सुसंगत) समग्र शाहबलूतिक tetrameric संरचना की तरह नकारात्मक से 2d वर्गों में स्पष्ट है, digitonin में hTRPC3 solubilized के दाग EM माइक्रोग्राफ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: hTRPC3 का शुद्धिकरण । (क) EDTA की उपस्थिति में hTRPC3 का स्थिरता परीक्षण. hTRPC3 में digitonin में solubilized की मौजूदगी (रेड स्ट्रेस) या 10 एमएम EDTA की अनुपस्थिति (ब्लू स्ट्रेस) थी । पूर्व tetramer प्रोटीन की स्थिति में एक एकल और संकरा चोटी दिखाया (लाल ट्रेस, तारांकन), यह दर्शाता है कि EDTA अपनी tetrameric अनुरूपता में hTRPC3 स्थिर । (ख) solubilized में hTRPC3 digitonin के लिए GFP प्रतिदीप्ति संकेत FSEC और digitonin बफर में चला. tetramer पीक धातु-संबध स्तंभ शुद्धि (नीला ट्रेस, तारांकन) से पहले solubilized सामग्री में मनाया जाता है । प्रवाह-माध्यम अंश में इस चोटी के अभाव से अपनत्व स्तंभ (red trace) में hTRPC3 प्रोटीन का पूर्ण बंधन इंगित करता है. imidazole द्वारा रेफरेंस के बाद रेफरेंस पीक में अंशों को FSEC (ग्रीन स्ट्रेस) द्वारा चेक किया गया । आगे की शुद्धि के लिए अक्षुण्ण tetramer चोटी दिखाकर सभी अंश एकत्र किए गए. (ग) thrombin का उपयोग hTRPC3 के GFP क्लीवेज की परीक्षा. पाचन समय 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन की एक छोटी राशि का उपयोग कर परीक्षण किया गया था, और पाचन की पूर्णता FSEC द्वारा जांच की थी । प्रत्येक स्ट्रेस में, बाईं ओर चोटी पर hTRPC3 tetramer चोटी (तारांकन) और दाईं ओर चोटी पर मुक्त GFP चोटी है. के रूप में पाचन की लंबाई में वृद्धि हुई, tetrameric प्रोटीन के अनुपात को मुक्त GFP कमी आई है, यह दर्शाता है कि GFP प्रोटीन से सट जा रहा था । 2 एच पाचन GFP की एक पूरी दरार से पता चलता है । (घ) hTRPC3 के सेकंड प्रोफाइल से पहले या बाद में thrombin पाचन digitonin युक्त चल बफर के साथ 10 मिमी EDTA जोड़ा । जैसी कि उम्मीद थी, चोटी की स्थिति thrombin पाचन के बाद छोटे रेफरेंस वॉल्यूम की ओर खिसक जाती है (रेड स्ट्रेस). मुख्य शिखर (तारांकन) tetrameric hTRPC3 का प्रतिनिधित्व करता है । लाल रेखाओं के बीच अंशों को क्रायो-EM प्रयोगों के लिए एकत्र किया गया था. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: क्रायो EM डेटा संग्रह और hTRPC3 के लिए प्रसंस्करण के योजनाबद्ध । शुद्ध hTRPC3 के ३,६६० फिल्म के ढेर का संग्रह एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के साथ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया गया था । गति सुधार और मैनुअल चयन ३,५८० माइक्रोग्राफ में जिसके परिणामस्वरूप लागू किया गया । कणों और ले लिया 2 डी वर्गीकरण के अधीन थे । 2d कक्षाएं आगे 3 डी वर्गीकरण द्वारा परिष्कृत किया गया । केवल पांच 3d कक्षाओं से बाहर एक उच्च संकल्प सुविधाओं को प्रदर्शित किया । इस वर्ग के लिए 3 डी शोधन और Frealign स्थानीय शोधन, ३.३ Å संकल्प पर hTRPC3 के लिए एक संरचना में जिसके परिणामस्वरूप के लिए चुना गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

क्रायो द्वारा प्रोटीन के संरचनात्मक निर्धारण-EM पिछले कुछ वर्षों में संरचनात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में क्रांति आई है, नए कैमरों और एल्गोरिदम के विकास के लिए धंयवाद है कि काफी ऊपर प्रोटीन है कि नहीं की संरचना संकल्प गति आसानी से crystalize, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन । क्रायो-EM तकनीक में हाल के अग्रिमों के सभी के बावजूद, शुद्ध प्रोटीन की तैयारी गुणवत्ता और मात्रा में पर्याप्त उच्च गुणवत्ता इमेजिंग की सुविधा के लिए अक्सर समय लेने वाली, महंगा, और चुनौतीपूर्ण बनी हुई है । तेजी से व्यक्त करने की क्षमता और स्क्रीन एकाधिक जीन शोधन शर्तों की एक किस्म के तहत constructs, के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है, तेजी से और लागत प्रभावी उच्च गुणवत्ता के उत्पादन की अनुमति देकर इस प्रक्रिया की क्षमता में सुधार क्रायो-EM अध्ययन में उपयोग के लिए शुद्ध प्रोटीन ।

जबकि विधि यहां वर्णित एक तरह से प्रत्यक्ष अभिकर्मक से कम लागत पर स्तनधारी झिल्ली प्रोटीन की बड़ी मात्रा में शुद्ध और अधिक जल्दी से एक छुरा transfected सेल लाइन की पीढ़ी के द्वारा प्रदान करता है, यह कई कदम उठाए हैं, जिनमें से प्रत्येक के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए एक उच्च गुणवत्ता प्रोटीन उपज प्रदान करते हैं । जैव रासायनिक उत्पादन और hTRPC3 को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीक के भीतर, महत्वपूर्ण कदम और चौकियों के एक नंबर रहे हैं । पहली महत्वपूर्ण चौकी bacmid डीएनए का उत्पादन होता है । जैसा कि परिणामों में वर्णित है, आदर्श कॉलोनी चयन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक गुणवत्ता वायरस की पीढ़ी में पहला कदम है । इसके अतिरिक्त, यदि bacmid डीएनए की एकाग्रता चयनित कॉलोनी से शुद्ध कम 1 μg/μL है, जिसके परिणामस्वरूप वायरस मजबूत प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त नहीं होगा । दूसरी महत्वपूर्ण चेकपॉइंट P1 और P2 baculovirus का उत्पादन है । वायरस titer GFP प्रतिदीप्ति द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 1C में दिखाया गया है या कोलमैन एट अल द्वारा वर्णित के रूप में मापा जा सकता है । ३५. वायरल titer के अलावा, संक्रमण के समय का एक समय पाठ्यक्रम एक नए निर्माण के लिए किया जाना चाहिए के लिए अधिकतम प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए संक्रमण का इष्टतम समय निर्धारित करते हैं । क्रिटिकल चेकपॉइंट तीन घुलनशीलता और स्थिरता स्क्रीनिंग चित्रा 2में दिखाया गया है । एक उच्च सीएमसी के साथ डिटर्जेंट, ऐसे डीडीएम के रूप में, उच्च घुलनशीलता प्रदान कर सकते हैं, लेकिन वे क्रायो के लिए आदर्श नहीं है-EM इमेजिंग क्योंकि वे दूषित micelles के एक बहुतायत में परिणाम कर सकते हैं । एक मामूली डिटर्जेंट, जैसे digitonin, पर्याप्त घुलनशीलता प्रदान करते हुए प्रोटीन स्थिरता के संरक्षण कर सकते हैं । additives की स्क्रीनिंग, hTRPC3 के मामले में EDTA के रूप में, एक शुद्धि शर्त है कि बरकरार है और समरूप प्रोटीन, शायद hTRPC3 से कैल्शियम को हटाने के द्वारा परिणाम है, जो कैल्शियम को पारगंय है की खोज के लिए महत्वपूर्ण है । महत्वपूर्ण चौकी चार समानता कॉलम शुद्धि के दौरान विशिष्ट और कुशल प्रोटीन पर कब्जा करने के सत्यापन और सेकंड के दौरान एक आदर्श प्रोटीन चोटी के अवलोकन है-भिन्नीकरण (चित्रा 4). संक्रमण प्रोटीन कणों के शामिल किए जाने के परिहार जबकि लक्ष्य प्रोटीन के सभी को बनाए रखने क्रायो-EM इमेजिंग के लिए प्रोटीन की एक उच्च पर्याप्त उपज प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । बैच के परिवर्तन-बाध्यकारी समय और solubilized प्रोटीन के लिए राल का अनुपात राल कॉलम द्वारा प्रोटीन प्रतिधारण को बेहतर बनाने में मदद कर सकते हैं । सेकंड के समग्र गुणवत्ता-अंश शिखर हमारे अनुभव में सबसे अच्छा संकेतक है, इमेजिंग करने से पहले, शुद्ध प्रोटीन कणों की गुणवत्ता का । एक कम या सेकंड के दौरान एक व्यापक पीक-भिन्नीकरण छवि या दूषित प्रोटीन एकत्रीकरण/ह्रास उत्पादों की उपस्थिति के प्रति भी कुछ प्रोटीन कणों की संभावित समस्याओं को इंगित करता है, क्रमशः । साथ ही, स्वयं निर्माण के भीतर समानता टैग करने के लिए परिवर्तन पर्याप्त समानता-टैग बाइंडिंग सुनिश्चित करने के लिए कुछ मामलों में आवश्यक सिद्ध किया है । अंतिम चेकपॉइंट क्रायो-em डेटा सेट का संग्रह करने से पहले नकारात्मक दाग EM द्वारा प्रोटीन कण की गुणवत्ता का सत्यापन है । हालांकि सख्ती से आवश्यक नहीं है, हम पाते है कि यह एक उत्कृष्ट अवसर और समय में निवेश करने से पहले प्रोटीन की गुणवत्ता के मुद्दों को सही मौका प्रदान करता है और लागत क्रायो द्वारा डेटा एकत्र करने की गहन प्रक्रिया उंहें ।

क्रायो-EM संरचनात्मक अध्ययन के लिए प्रोटीन के उत्पादन का एक वैकल्पिक तरीका देशी ऊतक स्रोत से प्रोटीन की सीधी शुद्धि है । हालांकि इस विधि अक्सर प्रोटीन उपज के साथ मुद्दों मुठभेड़ों, यह प्रोटीन है कि कोशिकाओं में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है या कि एक बड़ी बहु के भाग के रूप में मौजूद है के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है-प्रोटीन जटिल है, जो एक रिकॉमबिनेंट का उपयोग कर उत्पादन मुश्किल हो सकता है प्रणाली३६। हालांकि, एक प्रोटीन के लिए शारीरिक शर्तों के तहत मध्यम या कम मात्रा में व्यक्त की, अभिव्यक्ति और शोधन प्रणाली यहां प्रस्तुत एक कुशल, अपेक्षाकृत कम लागत और शुद्ध स्तनधारी झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन के लिए उच्च उपज विधि है के लिए क्रायो-EM संरचनात्मक अध्ययन । एक तरीका है कि दृढ़ता से पूरक है कि यहां प्रस्तुत कर सकता है लिपिड nanodiscs में शुद्ध प्रोटीन के पुनर्गठन से पहले क्रायो EM डेटा संग्रह३७है । इस विधि के अंतर्गत, प्रोटीन लिपिड bilayer की एक छोटी सी डिस्क में imbedded हैं, शायद डिटर्जेंट micelles की तुलना में एक देशी-microenvironment की तरह उपलब्ध कराने, हालांकि वहां कोई सबूत नहीं है कि अब तक कि संरचनाओं डिटर्जेंट और nanodisc में भंग कर रहे है भि३८,३९,४०. एक और दृष्टिकोण को प्रोटीन निकालने के लिए सीधे styrene पुरुष एनहाइड्राइड (SMA), जो सफलतापूर्वक झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं४१,४२के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया है जैसे amphipathic पॉलिमर का उपयोग कर रहा है ।

इन इस पांडुलिपि में वर्णित दृष्टिकोण को आसानी से हमारे प्रयोगशाला में आयन चैनल से परे अंय स्तनधारी झिल्ली प्रोटीन की एक किस्म के लिए अनुकूलनीय साबित हो गया है । इसलिए, हमें विश्वास है कि इस प्रोटोकॉल संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा कि आबाद उच्च विशिष्टता लक्षित दवा डिजाइन । इस neurodegenerative रोग में विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगा, हृदय रोग, और कैंसर, जिसमें आयन चैनल मुश्किल लेकिन उच्च क्षमता दवा लक्ष्य कर रहे हैं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डेविड वान Andel उंनत क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुइट में डेटा संग्रह के साथ समर्थन के लिए जी Zhao और एक्स मेंग धंयवाद । हम गणना के समर्थन के लिए वारी उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग टीम की सराहना करते हैं । हम N. क्लेमेंट, डी. बकाया राशि, जे Floramo, वाई हुआंग, वाई किम, सी. ंयूएलर, बी. रोथ, और जेड Ruan टिप्पणी है कि बहुत इस पांडुलिपि में सुधार के लिए हमारे आभार देते हैं । हम इस पांडुलिपि के लिए संपादकीय समर्थन के लिए Nadziejka धंयवाद । इस काम को इंटरनल वारी फंडिंग ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

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References

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जैव रसायन अंक १४३ आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन शुद्धि संरचना निर्धारण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्रायो-EM baculovirus
मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि
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Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

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