Summary
Denne protokollen beskriver teknikker som brukes til å bestemme ion kanal strukturer av cryo-elektronmikroskop, inkludert en baculovirus å effektivt uttrykke genene i pattedyrceller med minimal innsats og toksisitet, protein utvinning, rensing, og kvalitet kontroll, prøve rutenettet forberedelse og screening, samt innsamling og behandling.
Abstract
Forbigående reseptor potensielle kanaler (TRPCs) med godkjent TRP og er ikke-selektivt kasjon kanaler som spiller en viktig rolle i kalsium homeostase, spesielt store-opererte kalsium oppføring, som er avgjørende for å opprettholde riktig funksjon av synaptiske vesicle utgivelsen og intracellulær signalveier. Følgelig har TRPC kanaler vært innblandet i en rekke menneskelige sykdommer, inkludert hjerte sykdommer som hjerte-hypertrofi, nevrodegenerative lidelser som Parkinsons sykdom og nevrologiske lidelser som spinocerebellar ataksi. Derfor representerer TRPC kanaler et mulig pharmacologic mål i menneskelige sykdommer. Molekylære mekanismer av gating i disse kanalene er imidlertid uklart. Problemer å skaffe store mengder stabil, homogen og renset protein er en begrensende faktor i strukturen besluttsomhet studier, spesielt for pattedyr membran proteiner som TRPC ion kanalene. Her presenterer vi en protokoll for store uttrykk for pattedyr ion kanal membran proteiner med en modifisert baculovirus gene overføring system og rensing av disse proteinene ved affinity og størrelse-utestenging kromatografi. Videre presenterer vi en protokoll å samle single-partikkel cryo-elektron mikroskopi bilder fra renset protein og bruke disse bildene til å bestemme protein strukturen. Proteinstrukturer er en kraftfull metode for å forstå mekanismene av gating og funksjon i ionekanaler.
Introduction
Kalsium er involvert i mest cellulære prosesser inkludert signalering cascades, transkripsjon kontroll, nevrotransmitter-løslate og hormon molekyl syntese1,2,3. Homøostatisk vedlikehold av cytosolic gratis kalsium er avgjørende for helse og funksjon av celler. En av de store mekanismene intracellulær kalsium homeostasis er store-opererte kalsium oppføring (SOCE), en prosess der uttømming av kalsium lagret i endoplasmatiske retikulum (ER) utløsere åpningen av ionekanaler på plasma membranen å lette den påfyll av ER kalsium, som deretter kan brukes ved signalisering ytterligere4,5,6. Forbigående reseptor potensielle kanaler (TRPCs), som er kalsium-permeable kanaler tilhører TRP gruppe, har blitt identifisert som en sentral aktør i SOCE7,8,9 .
Blant de syv medlemmene i TRPC familien, TRPC3, TRPC6 og TRPC7 utgjør en undergruppe på homologue, og de er unike evne til å aktiveres av lipid sekundære messenger diacylglycerol (DAG), et fornedrelse produkt av signalnettverk lipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 uttrykkes svært glatt muskel og i hjerne og lillehjernen regioner i hjernen, der det spiller viktige roller i kalsium signalering som påvirker neurotransmission og neurogenesis12,13. Dysfunksjon av TRPC3 har vært knyttet til sentrale nervesystemet lidelser, kardiovaskulære lidelser og visse kreftformer som ovarian adenocarcinoma14,15,16. Derfor holder TRPC3 løftet som farmasøytiske mål for behandling av disse sykdommene. Utviklingen av målrettede narkotika opptrer på TRPC3 har vært begrenset av mangel på forståelse av sin molekylære aktivisering mekanismer, inkludert lipid bindende områder17,18. Vi har rapportert første atomic oppløsning strukturen av menneskelig TRPC3 kanalen (hTRPC3) og to lipid bindende nettsteder i lukket tilstand, å gi viktig innsikt i disse mekanismene19.
Den avgjørende faktoren for å bestemme strukturen av en membran proteinet i høy oppløsning er å skaffe protein av høy kvalitet. Tilsvarende screening av uttrykk og rensing må skaffe høykvalitets protein kan være en tidkrevende og kostbar oppgave. Her presenterer vi en protokoll som beskriver i detalj hvordan vi identifiserer de optimale forholdene for uttrykk og rensing av hTRPC3, som oppførte seg dårlig i vår første screening. Vi presenterer flere viktige punkter om hvordan du feilsøker og optimalisere protein atferden, som lå et solid grunnlag for våre cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM) studier. Vi bruker en modifisert baculoviral genererer vektor (pEG), utviklet av Gouaux og kolleger, som er optimalisert for screening analyser og effektiv generasjon av baculovirus i pattedyrceller20. Denne uttrykket metoden er egnet for rask og kostnadseffektiv overuttrykte proteiner i pattedyr cellemembranen. Vi kombinerer bruk av denne vektor med en fluorescens-gjenkjenning størrelse-utestenging kromatografi-basert (FSEC) prescreening metoden21. Denne metoden bruker en grønn fluorescerende protein (GFP) koden del Konstruer av interesse og forbedrer visualisering av målet protein i små, hele celler solubilized prøver. Dette gir screening av protein stabilitet i nærvær av ulike vaskemidler og tilsetningsstoffer, thermostabilizing mutasjoner, og tillater bruk av et lite antall celler fra småskala forbigående transfection. På denne måten kan en rekke forhold raskt bli vist før du flytter til en storstilt protein renselse. Følgende uttrykk, screening og rensing presenterer vi en protokoll for å skaffe og bildebehandling fra cryo-EM å generere de novo strukturelle beslutning av protein. Vi tror at metodene som er beskrevet her vil tjene som en generalizable protokoll for strukturelle studier av TRP kanal reseptorer og andre membran proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. endring av DH10α kompetent celler til å produsere Bacmid DNA
- Syntetisere genet av interesse og subclone det til en modifisert versjon av pEG vektoren som inneholder en twin strep-tag, His8-tag og GFP med et trombin cleavage nettsted på N terminus (pFastBacI)20.
- Transformere kompetent celler ved å legge til 5 ng av plasmider inneholder et ønsket gen i pFastBacI til 50 μL av DH10α celler i en 1,5 mL tube og ruge i 10 min på is. Varme sjokk celler for 45 s på 42 ° C. Tilsett 200 μL av super optimal buljong med katabolske repressor (SOC) medium røret og ruge for 4-8 h på 37 ° C i en orbital shaker 225 RPM.
- Plate 5 μL celler i en bacmid LB agar plate (50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracycline, 100 μg/mL Bluo-gal og 40 μg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], agar).
- Inkuber platen i 48 timer på 37 ° C.
Merk: Bluo-gal indikator flekker koloniene som fortsatt uttrykker lacZ (vektor innsetting mislykket), gir for utvalg av hvit (ble transformert) kolonier. - Velg en isolert hvit koloni, unngå hvitt kolonier som er i kontakt med blå koloniene, og vokse celler over natten i 6 mL av bacmid LB medium (50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracycline) på 37 ° C i en orbital shaker 225 RPM.
2. bakteriell forberedelse for isolering av Bacmid DNA
- For å isolere bacmid DNA, Nedspinning Escherichia coli celler for 10 min 2880 x g.
- Forkast nedbryting og resuspend pellets i 200 µL av cellen rørets løsning fra miniprep kit (se Tabell for materiale) av pipettering. Pass på at pellet er fullt og homogenously suspendert. Deretter overføre celle suspensjon i 1,5 mL rør.
- Legge til 200 µL av cellen lysis løsningen fra miniprep kit og blanding av invertere røret noen ganger. Inkuber for opptil 5 min ved romtemperatur (RT) til lyse cellene. Legge til 200 µL nøytralisering løsning fra miniprep kit og blanding av invertere tube noen ganger å stoppe lysis reaksjonen.
- Nedspinning i 10 min 21,130 x g i en bord sentrifuge. Samle 600 μL nedbryting i en 2 mL tube. Legge til 600 μL fenol: kloroform: isoamyl alkohol-løsning (se Tabell for materiale) og bland godt til ekstra DNA fra resten av cellen lysis produktene.
FORSIKTIG: Fenol: kloroform: isoamyl alkohol-løsning er giftig ved innånding, hudkontakt, og svelging. Det kan føre til kjemiske forbrenninger og kan være kreftfremkallende. Bruke hansker og en knappet labfrakk. Arbeid i avtrekksvifte. Kast denne spesialavfall riktig. - Spinne røret i 10 min 21130 x g i en bord sentrifuge. To separate flytende faser vil være synlig. Nøye overføre 300 μL den øvre vandige fasen til en ny tube. Tilsett 600 μL av 100% etanol å vaske DNA. Forsiktig Inverter røret å blande.
Merk: Gjør ikke virvelen, som dette kan skråstille bacmid DNA. - Kul rør ved å plassere dem i en 20 ° C fryseren i 10 min. Nedspinning i 10 min 21,130 x g i en bord sentrifuge. Forkast nedbryting og bevare DNA-pellets.
- Legg 1 mL av 70% etanol å vaske pellet. Forsiktig Inverter røret å blande. Spinn på 10 min 21,130 x g i en bordplaten sentrifuge. Forkast nedbryting og la pellets til luft tørr for ca 5 minutter eller til ingen væsker er synlig i røret og DNA pellet blir gjennomsiktig.
- Resuspend tørr pellet i 50 µL av sterile, DNase-fri, vaskebuffer vann. Måle DNA konsentrasjonen.
Merk: Frys bacmid DNA. Lagre på 4 ° C til flere dager.
3. hva Sf9 insekt celler med Bacmid å produsere P1 Baculovirus
- Frø 0,9 x 106 Sf9 celler/godt i 2 mL av passende medium (se Tabell for materiale) i hver brønn av en 6-og vev kultur plate. Inkuber celler ved 27 ° C for 20 min å fremme tilknytning til platen.
Advarsel: Cellekulturer er en potensiell biohazard. Innarbeide en godkjent laminær strømning hette med aseptiske teknikker og sjekk institusjonelle og offentlige retningslinjer for anbefalte verneklær og riktig avhending av avfall før du utfører eksperimenter. - Etter vedlegg, kan du legge 8 µL av transfection reagensen (se Tabell of Materials) til 100 µL av medier for hver brønn av 6 vel plate blir transfekterte i et sterilt rør. Legg til 6 μg av bacmid DNA 100 µL av medium i et separat sterilt rør. Inkuber 5 min RT. kombinere to løsninger og Inkuber for 45 min på RT.
- Erstatt medium i 6 brønnene med 2 mL av fersk medium. Legg blandingen i forrige hver godt dropwise (200 µL per brønn). Forsiktig rock platen slik blanding av hva løsningen til medium.
Merk: Ikke swirl eller riste platen fordi dette vil føre celler koble. - Inkuber celler for 5 d (120 h) i en 27 ° C fuktet inkubator. Sjekk GFP fluorescens før høsting for å kontrollere at viruset er produsert i en stor andel av celler. Hvis prosentandelen er lav, forlenge inkubasjon tiden etter behov (se figur 1 c).
- Samle supernatant som inneholder P1 viruset (ca 2 mL i hver brønn). Filtrere mediet som inneholder P1 virus i 2-mL rør med en 3 mL sprøyte og små 0,2 µm filter. Legge til sterilt fosterets bovin serum (FBS) en siste konsentrasjon av 1%.
Merk: Dette lager P1 virus bør lagres på 4 ° C og beskyttes mot lys.
4. infeksjon av Sf9 insekt celler med P1 Baculovirus å produsere P2 Baculovirus
- Forberede 200 mL (eller ønsket volum) av Sf9 celler i en konsentrasjon av 0,8 - 0,9 x 106 celler/mL i passende medium (se Tabell for materiale) i en flat bunn Erlenmeyer kultur bolle tilstrekkelig størrelse.
Merk: For suspensjon kultur, volumet brukes bør ikke overstige 40% av den totale kapasiteten til kolbe. - Legge til 1:2500 forholdet (v/v) P1 virus lager fra 3,5 Sf9 celle suspensjon kultur. Inkuber for tiden av optimal virus uttrykk (vanligvis 48-120 h avhengig av protein Konstruer) ved 27 ° C i en orbital shaker 115 RPM.
Merk: Relative virus uttrykket kan bestemmes ved å vise GFP fluorescens av viruset i et utvalg av kulturen. - Sentrifuge celle suspensjon for 40 min 11,520 x g og samle supernatant som inneholder P2 viruset. Filtrere nedbryting bruke engangs 0,2 µm filtre. Legge til FBS en siste konsentrasjon på 0,5%.
Merk: Dette lager P2 virus bør lagres på 4 ° C og beskyttes mot lys. - Få en titer for P2 viruset Sf9easy celler eller en virus teller.
5. infeksjon av HEK293 pattedyrceller med P2 Baculovirus for store Protein uttrykk
- Forberede en ønskelig mengde HEK293 pattedyr suspensjon cellekultur (4-6 L anbefales for utarbeidelse av frosne rutenett) i en konsentrasjon av 3.5-3,8 x 106 celler/mL i uttrykket medium (se Tabell for materiale) supplert med 1% (v / v) sterilt FBS i forbløffet bunn Erlenmeyer kultur flasker av tilstrekkelig størrelse.
Merk: For suspensjon kultur, volumet brukes bør ikke overstige 40% av det totale volumet av flasken. - Legge til 8% (v/v) av P2 virus lager løsning fra trinn 4.3 HEK293 celle suspensjon kultur. Ruge på 37 ° C i en orbital shaker 135 RPM.
- Legge 10 mM natrium butyrate på 12-18 h etter infeksjon. Inkuber for tiden av optimal protein uttrykk (vanligvis 36-72 h) på 30 ° C.
- Høste celler av sentrifugering for 20 min 2,880 x g. Vask celler av resuspending i ca 100 mL tris-bufret saltvann (SS) per liter celler høstet. Sentrifuge igjen for 20 min 2,880 x g og samle celle pellets.
Merk: Protokollen kan pauses her. Cellen pellets kan snapin-frosset i flytende nitrogen og lagret ved-80 ° C til rensing.
FORSIKTIG: Flytende nitrogen kan forårsake kryogene forbrenninger eller skade. Det kan forårsake frostskader. Det kan fortrenge oksygen og forårsake rask kvelning. Bruke kaldt isolerende hansker og ansiktsskjerm. - Samle små 1 mL avlinger på ulike tidspunkt og solubilize for 2t 4 ° c med rock eller rør i nærvær av ulike vaskemidler og/eller tilsetningsstoffer. Disse små hele celler solubilized utvalg kan gjøres enklere ved ultracentrifugation 235,000 × g i 10 min på 4 ° C og kjører som en 30 μL prøve på en størrelse-utestenging kromatografi (SEC) kolonne (se Tabell of Materials) til å fastslå det beste tidspunktet for uttrykket og de beste solubilization forholdene.
Merk: I tilfelle av hTRPC3 inkludert dette screening ulike buffere med pH-verdier fra 4.0-9.5 og salt konsentrasjoner av 50-500 mM; forskjellige ioniske komposisjoner (f.eks MgCl2 eller NaCl); forskjellige vaskemidler kritiske micelle konsentrasjon (CMC) verdiene til 0,1 - 20 mM; redusere tilsetningsstoffer som dithiothreitol, tris(2-carboxyethyl) phosphine og β-mercaptoethanol; og kalsium-chelaterande additiv ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA).
6. rensing av hTRPC3 Protein fra frosset celle Pellet
- Tine pellet buffer inneholder 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF), 0,8 μM aprotinin, 2 μg/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, og 1% digitonin, med 100 mL buffer per liter celler høstet. Når tint, sikre homogenitet av løsningen ved pipettering eller rør. La solubilize for 2t 4 ° c i et beaker i isen med et rør bar rotere.
- Fjerne celle rusk ved ultracentrifugation 235,000 × g 1t på 4 ° C. Kontrollere protein antallet ved å kjøre en 30 μL prøve på en SEC kolonne (se Tabell for materiale) av Væskekromatografi (HPLC) og visualisere målet protein av GFP-utsignal.
- Inkuber solubilized protein (supernatant) med kobolt affinitet harpiks for 1-2 h på 4 ° C. Kontroller protein binding til harpiks ved å kjøre en 30 μL prøve på en SEC-kolonne.
Merk: Hvis protein bindende har oppstått, GFP merket protein målet vil bli beholdt for kolonnen, ikke finnes i gjennomflytsenhet. Derfor finnes ingen GFP signal der tilsvarer målet protein størrelsen når gjennomflytsenhet kjøres på HPLC. - Vask harpiks med 10 kolonnen mengder buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 15 mM imidazole og 0,1% digitonin). Sjekk for protein tap ved å kjøre en 30 μL prøve på en SEC-kolonne.
Merk: Hvis protein tap fra kolonnen har oppstått, GFP merket protein målet vil finnes i vaskebuffer som har gått over kolonnen. Derfor vil GFP signalet være tilstede der tilsvarer målet protein størrelsen når vaskebuffer kjøres på HPLC. Hvis protein tap har oppstått, må imidazole konsentrasjonen av vaskebuffer senkes for å hindre forstyrre hans tag binding til kolonnen affinitet. - Elute resin-bundet hTRPC3 med buffer (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole og 0,1% digitonin). Legge trombin på en 1:20 molar forhold (for å holde seg GFP koden) og legge 10 mM EDTA (en hTRPC3 stabiliserende agent) til eluted prøven og ruge for 3t på 4 ° C. Kontroller at protein har vært elut ved å kjøre 90 μL en prøve utvannet 1: 100 på en SEC kolonne og bekrefter tilstedeværelsen av et GFP signal der tilsvarer målet protein størrelsen.
Merk: på dette punktet, tryptofan signalet fra total protein i tilsettes kan også sees. Bare mål affinitet-renset protein vil forbli i tilsettes og GFP og tryptofan signalene vil være nær identisk i profilen. Hvis målet protein ikke sett store antallet i tilsettes men ikke ble tapt i gjennomflytsenhet eller vask, protein har trolig vært bundet til kolonnen og kan være elut med en høyere konsentrasjon av imidazole i bufferen. - Konsentrere seg eluate til 500 μL eller mindre i et 15 mL 100K sentrifugal filter tube (se Tabell for materiale) av snurrende 2,880 x g på 4 ° C i 5 min intervaller. Resuspend protein av pipettering løsningen opp og ned mellom spinnene å unngå overconcentrating.
Merk: Sentrifuge tid kan bli forkortet når volumet nærmer seg ønsket endelige volumet. - Last konsentrat til en SEC kolonne i bufferen (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA og 0,1% digitonin). Kjør.
- Kombiner peak brøker som inneholder den intakt TRPC3-tetramer, som visualisert UV absorbansen signal, og satse til en siste konsentrasjon av minst 5 mg/mL.
7. screening av Protein av Negative-flekken elektronmikroskop
- Slå på maskinen glød-utslipp. Sette programmet for lossing et karbon-belagt rutenett med argon og oksygen for 30 s. Kjør programmet å gjøre karbon-belegget på kobber 400-mesh rister hydrofile før tillegg av protein løsningen.
- Sette opp fem 40 μL dråper sterilt vann og to 40 μL dråper 1% uranyl formiat løsning (lab film, voks papir eller en lignende overflate, se Tabellen for materiale). Ta rutenettet fra trinn 7.1 og legger 2,5 μL protein prøve 5 mg/mL (50-200 μM) til den mørke siden og la det sitte i 1 minutt.
- Etter 1 min, tørr rutenettet ved hjelp av filter papir. Berør ikke filter papir direkte til rutenettet overflaten; i stedet bringe papiret til kanten av flytende slippverktøyet og tillater kapillær handlingen å trekke væsken fra Rutenettet filter papir.
- Dukkert rutenettet i første dråpe vann. Gjenta med gjenværende dråper og første dråpe uranyl formiat tørke med filter papir. Tillate andre dråpe uranyl formiat sitte i 1 min og deretter tørke med filter papir. Tillate at rutenettet skal fullt lufttørke (ca 1 min) før lagring.
Merk: Denne fargeprotokoll kan ikke være ideell for alle protein-rengjøringsmiddel kombinasjoner. Ulike konsentrasjoner av uranyl formiat flekken og lengder tid for flekken eksponering bør testes hvis fremgangsmåten ovenfor ikke gir en flekk med god kontrast. - Bilde nett på et elektronmikroskop (se Tabell for materiale) å sjekke protein partikkel kvaliteten. Sikre at micrographs viser mange partikler som er homogene på general opptreden og distribusjon, vise god kontrast og tilpasse spådd størrelsen på målet protein.
- Generere foreløpig, med lav oppløsning, todimensjonal (2D) klassifikasjoner bruker 50-100 micrographs (se databehandling-trinn 10) for å sjekke at partiklene representerer ulike visninger av en enkelt konsekvent struktur.
Merk: Micrographs og foreløpige 2D klasser av tilstrekkelig kvalitet, som beskrevet ovenfor, er en god indikator at protokollen er tilstrekkelig optimalisert for protein rensing. Forberedelse og screening av cryo-EM rutenett garanteres på dette punktet.
8. EM eksempel forberedelse
- Glød-utslipp et gull holey karbon rutenett (se Tabell for materiale) som beskrevet i trinn 7.1.
- Bruke 2,5 μL konsentrert hTRPC3 protein prøven (5 mg/mL) på rutenettet. Blot rutenettet for 1,5 s med en klatt tvinge 1 og en vente 5 s 100% luftfuktighet og 4 ° C, deretter stupe rutenettet i flytende etan avkjølt av flytende nitrogen bruker en vitrifikasjon maskin.
Merk: Den fuktighet, temperatur, blot-force, blot tid og ventetiden oppført her ble brukt for forfatternes hTRPC3 studie19. De må endres for å gi optimal glasslegemet is andre proteiner og vaskemidler. - Skjermen frosset nett for optimal isforhold bruker cryo-EM mikroskop (se Tabell for materiale) og manuelt vise regioner av tykk is (rutenett-rutene som vises mindre og mørkere), tynn is (ruter som vises større og klarere) og medium is .
Merk: Tykkere is inneholder ofte mer partikler, mens tynnere is ofte gir bedre kontrast og oppløsning. Bruk manuell screening av bilder å finne som is forhold fører til et stort antall monodispersed partikler med god kontrast og oppløsning. Når gode forhold er kontrollert, gå til bildesamlingen på 300 kV cryo-EM mikroskop.
9. EM datainnsamling
- Bruker et automatisert oppkjøpet, registrere bildestakker i super telling oppløsningsmodus binned piksel størrelse av 1.074 Å på et elektronmikroskop operert på 300 kV med en nominell forstørrelse på 130.000 X direkte elektron detektor.
- Dose-smuldre vekk hvert bilde 40 rammer med en total eksponeringstid 8 s, med 0,2 s per ramme og en dose av 6.76 e− Å2 s−1 (nominell defokus verdier varierte fra 1.0 til 2,5 μm i forfatternes eksperimentet).
10. EM databehandling
- Implementere bevegelse korrigering av oppsummerte film stabler22 og beregne defokus verdier23 programmvre databehandling (se Tabell for materiale)24.
- Velg partikler fra micrographs. Bruk disse plukket partikler for å konstruere en første referanse-gratis 2D klassifisering bruker programvare24. Velg ideelle 2D klasse gjennomsnitt bruke som maler for automatisert partikkel plukking for hele datasettet.
- Manuelt sjekke kvaliteten på auto-plukket partikler og fjerner dårlig partikler. Bruk flere runder med 2D klassifisering for å rydde opp plukket partikler.
- Generere en første modell25. Emnet 2D plukket partikler til tredimensjonale (3D) klassifisering (ca 5 klasser) av C1 symmetri og en innledende rekonstruksjon low pass-filteret 60 Å en modell. Bestemme hvilke klasser har høy oppløsning og kombinere partikler i slik klasse.
- Finpusse partikler lokale avgrensningen med C4 symmetri (ved hTRPC3) brukes, og en høy oppløsning grense partikkel justering satt til 4,5 Å26.
11. model Building
- Bygge en modell (se Tabell for materiale for programvaren som brukes). For hTRPC3, bruk transmembrane domenet (TMD) av forbigående reseptor potensielle melastatin 4 (TRPM4) strukturen protein databank (PDB) 5wp6 som en guide27. Bruke store rester og sekundær prediksjon for å veilede de novo bygningen.
- Underlagt den første modellen til ekte verdensrommet raffinement med sekundær begrensninger28. Manuelt undersøke raffinert modellen og remodify etter behov (se Tabell for materiale for programvaren som brukes).
- Bruke Fourier skall sammenheng (FSC) kurver for å beregne forskjellen mellom den siste modellen og EM kartet for validering av raffinerte strukturen. Evaluere geometrier av atomic modellene (se Tabell for materiale for programvaren brukes)29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk oversikt over protokollen for uttrykk og rensing av hTRPC3 vises i figur 1A. Et bilde av hTRPC3 bacmid platen med ideelle hvit kolonier, lik den som er valgt for bacmid DNA rensing, er vist i figur 1B. Vi fant at 48 h er ideell for klart Bluo-gal flekker samtidig tilstedeværelse av isolert kolonier. Topp produksjon av P2 virus for hTRPC3, som visualisert ved GFP fluorescens, ble sett etter 4 d infeksjon i Sf9 insekt celler (figur 1 c).
P2 baulovirus ble høstet fra media, supplert med 1% FBS, og brukes til å infisere en suspensjon av HEK293 pattedyrceller. Natrium butyrate ble lagt til den infiserte celler 12-18 h etter virus å øke protein uttrykk20. Cellene ble deretter ruget for en ekstra 36 h på 30 ° C. Cellene ble høstet og utsatt for løselighet og stabilitet screening av FSEC (figur 2A)21. Cellene ble solubilized med sju forskjellige vaskemidler CMC verdiene til 0,01 - 20 mM på et vaskemiddel konsentrasjon ca 10 ganger CMC verdien. Etter hele celler solubilization, celle lysis rusk ble fjernet av ultracentrifugation og nedbryting som inneholder solubilized protein var lastet på en SEC kolonne og kjører HPLC i n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate (DDM/CHS) vaskemiddel inneholder buffer sammenligne absolutt løselighet og listeplassering volum av hTRPC3 under ulike forhold i forhold til en TRPM4 kontroll (figur 2B). Vi valgte å bruke DDM/CHS som første kjører bufferen for prøvene solubilized i forskjellige vaskemidler fordi DDM/CHS er de mest brukte vaskemiddel når løse strukturer av membran proteiner. Alle annet vaskemiddel-solubilized TRPC3 prøver viste peak posisjoner på ca 11,9 mL, noe som er trolig altfor stor, fordi tetramerisk form av hTRPC3 har en mindre molekylvekt enn positive kontrollere menneskelig TRPM4 (figur 2A og Finne 2B).
Likevel, fordi det var ingen struktur av noen TRPC kanal reseptor å sammenligne våre resultater til og fordi den store Molekylvekten kan skyldes arkitektur TRPC3 eller andre faktorer, vi gjennomført en småskala rensing av hTRPC3 med 25 mL celler med DDM/CHS hele eksperimentet DDM/CHS ga best Løseligheten av hTRPC3. SEC profilen hTRPC3 viste en monodisperse topp, men var fortsatt i en topp-posisjon representerer en høyere molekylvekt enn TRPM4 (data ikke vist). Vi sjekket proteinet i topp brøkdel av SEC profil av negative-flekken EM, fordi det er en rask metode for å verifisere protein kvaliteten og krever en svært liten mengde protein. Mikroskop-bilde, ble partikler observert med to transmembrane domener i samme partikkel. Det viste seg at to hTRPC3 partikler dimerized på en head-to-head måte gjennom samspillet mellom to cytosolic domener (figur 3D). Vi inkludert deretter redusere reagens dithiothreitol (DTT) i rensing bufferen for andre småskala rensing, håper å forstyrre dimerization av hTRPC3. Faktisk kom en ny topp med lavere molekylvekt av SEC fraksjoneres. Men partikler dukket opp for liten til å være en intakt tetramer og viste ingen funksjoner av membran proteiner som en transmembrane domene. Det viste seg at DDM/CHS ikke var et egnet rengjøringsmiddel for rensing hTRPC3, til tross for gir best løselighet for hTRPC3.
Neste vi prøvde en mildere vaskemiddel, digitonin, å solubilize hTRPC3, og sammenlignet den med protein solubilized i DDM/CHS. Her brukte vi to forskjellige kjører buffere som inneholder DDM/CHS og digitonin, henholdsvis. Dette var viktig gitt at vaskemiddel i kjører bufferen ofte bidrar til protein stabilitet og at membran protein kan bli ustabil når endring i vaskemidler fra solubilization til FSEC. Protein kjøre buffer inneholder digitonin viste en lovende peak forskyvning mot en lavere molekylvekt når solubilized i DDM/CHS eller digitonin. Protein solubilized av og kjøre i digitonin gitt den høyeste toppen i en stilling i forhold til kontrollen positiv, menneskelig TRPM4 (figur 3A). Da flyttet vi frem ved å utføre en småskala rensing med 25 mL av celler. Selv om flere og bred toppene ble observert sekund (figur 3B), protein viste funksjoner i en enkelt tetramerisk hTRPC3 kanal i 2D klassifisering av negative-flekken EM (Figur 3 c og figur 3D). Vi konkludere med at digitonin er en ideell vaskemiddel for rensing hTRPC3.
Vi skalert opp uttrykk for hTRPC3 og utført en middels skala rensing med 400 mL av celler i digitonin. Dermed håpet vi å få nok protein for noen frosne rutenett uten herjer medium og vaskemiddel før vi funnet ut siste betingelsene for rensing hTRPC3 i stor skala. Det skjer ofte at membran proteiner vise ustabilitet når Høykonsentrert for utarbeidelse av frosne rutenett. Renset og konsentrert protein ikke bare forskjøvet mot en høyere molekylvekt FSEC, men også viste støyende bakgrunn cryo-EM rutenett fotografert med et elektronmikroskop utstyrt med en EMCCD kameraet. Selv om vi kunne observere enkelt, intakt tetramerisk reseptorer, hTRPC3 renset i digitonin var ikke ideell for høy oppløsning cryo-EM studier.
For ytterligere å forbedre protein stabilitet, vist vi en rekke beskrevet i protokollen trinn 5. Vi valgte å skjermen tilsetningsstoffer basert på fysiologiske karakter av hTRPC3; f.eks., EDTA ble valgt fordi hTRPC3 er permeabel til kalsium og fjerner kalsium kan stabilisere protein. Alle prøvene testet av FSEC kjører i digitonin inneholder bufferen, 10 mM EDTA viste en bemerkelsesverdig effekt på stabilisere hTRPC3 i en intakt tetramerisk listeplassering (figur 4A). Det også betydelig økt antall partikler i cryo-EM mikroskop-bilde og redusert støy i bakgrunnen, som vist i figur 5.
Etter å ha identifisert de ideelle forholdene for uttrykk og rensing, utført vi et omfattende uttrykk (2 L) for hTRPC3. Cellene som inneholder hTRPC3 ble høstet og deretter solubilized. Ultracentrifuge-avklart lysate ble utsatt for metall-affinitet kolonnen rensing av batch-binding med en kobolt harpiks etterfulgt av rensing i en tyngdekraften kolonne. Oppbevaring av solubilized protein i kolonnen og elueringsrør affinitet-renset protein fra kolonnen ble bekreftet av FPLC (figur 4B). Vi fant at for hTRPC3, en imidazole konsentrasjon av 15 mM vaske bufferen var tilstrekkelig til å fjerne skadelige proteiner med uspesifikke harpiks bindende, og 250 mM imidazole i elueringsbufferen var tilstrekkelig til å elute fleste av solubilized hTRPC3 protein bundet til harpiks. Alle prøvene ble sjekket av FSEC, og eluted protein viste en skarp, monodisperse peak på den riktige listeplassering. Som iboende fleksibilitet mellom GFP koden og hTRPC3 protein kan gjøre justeringen av protein partikler under bildebehandling mer utfordrende, og fordi en trombin cleavage området ligger mellom GFP og hTRPC3, vi testet litt renset protein på ulike cleavage timene benytter trombin protease. Gitt at eluted protein inkubert med trombin på en 1:20 molar forholdet viste rimelig stabilitet og komplett cleavage etter 2 timer på 4 ° C, vi kløyvde av GFP fra alle renset protein bruker de samme betingelsene og kontrolleres av HPLC å bekrefte at GFP er c ompletely fjernet (figur 4C). Protein var videre renset av S, og i spalting av GFP kan igjen visualiseres topp posisjon skiftet mot en mindre molekylvekt (Figur 4 d). Et lite unconcentrated utvalg fra hoved peak brøkdel ble brukt til å lage rutenett for negative-flekken EM. Alle fraksjoner som inneholder den tetramerisk hTRPC3 ble deretter kombinert og reconcentrated til en siste konsentrasjon av 5 mg/mL, som ble brukt til å forberede rutenett cryo-EM bildebehandling. Som vi har observert at en del av protein fortsatt gradvis skiftet mot en større molekylær vekt, vi samlet bare fraksjoner på den riktige Molekylvekten og frøs rutenettene umiddelbart etter protein rensing. Vi gjennomført vanligvis en rekke eksperimenter fra rensing av protein til utarbeidelse av frosne rister en enkelt dag.
En 2,5 μL prøve renset hTRPC3 protein (konsentrasjon 5 mg/mL) ble brukt på en glød-utladet holey karbon rutenett. En vitrifikasjon maskin ble brukt til å forberede rutenettet med en 1,5 s blotting tid under 100% luftfuktighet etterfulgt av en dukkert i flytende etan avkjølt av flytende nitrogen. Dette trinnet fryser prøven i glasslegemet isen for bildebehandling. Bildene ble tatt på 130.000 X nominell forstørrelsen av cryo elektron mikroskop operert på 300 kV. Bildestakker ble innspilt i super-oppløsning telle modus med en binned pikselstørrelsen av 1.074 Å og en nominell defokus verdi oppstiller fra 1.0 å 2.5 μm ved hjelp av en direkte elektron detektor og automatisert oppkjøpet programvare. Hvert bilde var dose-fraksjonert 40 rammer med en total eksponeringstid 8 s (0,2 s per bilde) og en dose 6.76 e− Å−2 s−1. En representant mikroskop-bilde fra datasettet er vist i figur 5.
Bevegelse korreksjon og estimering av defokus verdier av de summerte film stablene ble utført. Ca 200 resulterende micrographs ble brukt som kilde for manuell partikkel plukking og første referanse-gratis 2D klassifisering31. Ni representant 2D klasse gjennomsnitt fra denne første klassifiseringen ble valgt og brukt som maler for automatisert partikkel plukking for hele datasettet. En manuell sjekk av autopicked partikler ble utført for å fjerne åpenbart dårlige partikler, så tre runder med 2D klassifisering ble brukt til å presisere markeringen av autopicked partikler (figur 5). Disse 2D-klassen valgte partiklene ble klassifisert til fem 3D klasser ved hjelp av en lav-pass-filter 60 Å som et første modell. Av disse fem klasser vises bare én oppløsning funksjoner (figur 5). Partikler fra denne klassen var mer utsatt for lokale raffinement med en høy oppløsning grense på 4,5 Å og C4 symmetri (figur 5)32. Raffinert modellen var manuelt undersøkt og remodified. Raffinert strukturen ble validert ved beregning av FSC kurver til å bestemme differansen mellom den siste modellen og EM kart og evaluering av geometrier av atomic modeller33.
Første modell konstruksjonen ble utført med TMD domenet av TRPM4 (PDB 5wp6) som en guide34. De novo bygge modell av hTRPC3 var hovedsakelig guidet av store rester og sekundær forutsigelse, med mange α helikser i strukturen sterkt tilrettelegge Registrer tildeling. I de innledende de novo-bygget modell, rekkefølge, lengde og sekundære strukturfunksjonene og omfangsrik rester er i nærheten avtale med prediksjon. Under raffinement, ble oppløsningen holdt til en lavere grense enn oppløsningen beregnet for siste gjenoppbyggingen. Tredimensjonale FSC ble brukt til å måle den normaliserte kryss-korrelasjonskoeffisienten mellom to selvstendig generert 3D kart (hver bruker halvparten av datasettet) over tilsvarende skjell i Fourier plass (som funksjonen av romlige frekvens). Vi ansatt en myk maske av 4.3 Å gjenoppbygging og en ekstra 4.3 Å cosinus myk kant med en low pass-filteret 10 Å, da brukes gullstandarden FSC 0.143 cutoff terskel. Denne ble brukt for endelig løsning rapportering.
Figur 1: uttrykk og rensing av hTRPC3 ved hjelp av BacMam systemet. (A) skjematisk prosedyre for hTRPC3 uttrykk og rensing. (B) Bacmid koloni utvalg på blå-hvit indikator plate. Velg en isolert hvit koloni (svart pil), ikke hvit kolonien med en imbedded blå koloni eller en hvit koloni i kontakt med en blå koloni (røde piler). (C) GFP fluorescens av P2 baculovirus i Sf9 celler under 20 X forstørrelse. Fluorescens skal lyse og finnes på cellemembranen og/eller indre av fleste cellene for et potent virus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: stabilitet screening av hTRPC3 av FSEC. (A) vaskemiddel screening av hTRPC3. HTRPC3 var hele celle solubilized i en rekke vaskemidler med en kritisk micelle konsentrasjon av 0.01 - 20 mM og ble kjørt i DDM/CHS-inneholder bufferen. Selv om DDM/CHS viser høyeste Løseligheten av hTRPC3, toppen vises feil posisjon, for stor skal tetramerisk hTRPC3 (blå spor). (B) TRPM4 kontroll, med et tetramerisk molekylvekt av ca 540 kDa, solubilized og kjøres i DDM/CHS, hadde en elueringsrør volum på ca 12.9 mL, mens TRPC3, med et tetramerisk molekylvekt av ca 400 kDa, solubilized og kjøre DDM/CHS, hadde et elueringsrør volum ca 11,9 ml. Med en mindre molekylvekt forventes hTRPC3 å ha et elueringsrør volum litt større enn TRPM4, ikke litt mindre, noe som tyder på at DDM/CHS ikke kan være en ideell vaskemiddel for hTRPC3 solubilization og rensing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: vaskemiddel buffer screening av hTRPC3 av FSEC. (A) løselighet og stabilitet test av hTRPC3 med digitonin. Digitonin ble testet for solubilization og kjører buffer. Merk listeplassering hTRPC3 protein solubilized i digitonin flyttet mot en større elueringsrør volum i forhold til protein solubilized i DDM/CHS (gul spor vs blå og røde spor). Bare kombinasjonen med digitonin i både solubilization og kjører buffere viser riktig størrelse på hTRPC3 av FSEC (gul spor, stjerne). (B) ligner FSEC resultatene av hele celler solubilized hTRPC3, topp plasseringen av hTRPC3 protein affinitet renset ved digitonin (rød spor, 14 mL) flyttet mot en større elueringsrør volum i forhold til protein affinitet renset ved DDM/CHS (blå spore, 12 mL) målt ved SEC-fraksjoneres. (C) Negative-flekken EM ble brukt til å verifisere kvaliteten på renset før cryo-EM datainnsamlingen. En ideell flekken skal presentere partikler (røde sirkler) negativt farget (vises hvite) og omgitt av et vaskemiddel ringen (vises svarte). En representant, ideelle mikroskop-bilde der disse partiklene er rikelig, monodispersed og dag i flere retninger vises. (D) kvalitetsdata fra negative-flekken EM bør gi 2D klasser med en tydelig og konsekvent generelle arkitektur og bør omfatte flere orientering av protein, med gjennomsnitt inneholdt og sentrert i masken (svart sirkel). 2D klasser fra negative-flekken EM micrographs av hTRPC3 solubilized i DDM/CHS finnes partikler som synes å være en head-to-head dimerization av hTRPC3 monomerer. Derimot er en grov (men klar og konsekvent) samlet acorn-lignende tetramerisk struktur tydelig i 2D klasser fra negative-flekken EM micrographs av hTRPC3 solubilized i digitonin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: rensing av hTRPC3. (A) stabilitet test av hTRPC3 i nærvær av EDTA. hTRPC3 var solubilized i digitonin i tilstedeværelse (rød trace) eller fravær (blå trace) 10 mm EDTA. Tidligere viste en enkelt og smalere peak på tetramer protein plasseringen (rød spor, stjerne), som indikerer at EDTA stabilisert hTRPC3 i sin tetramerisk conformation. (B) GFP fluorescens signaliserer FSEC hTRPC3 solubilized i digitonin og kjøre digitonin buffer. Tetramer toppen er observert i solubilized materiale før metal-affinitet kolonnen rensing (blå spor, stjerne). Fravær av denne toppen i gjennomflytsenhet fraksjonen angir en komplett binding av hTRPC3 protein i kolonnen affinitet (rød trace). Etter elueringsrør av imidazole, var fraksjoner i elueringsrørets toppen kontrollert av FSEC (grønn trace). Alle fraksjoner viser intakt tetramer peak ble samlet inn for ytterligere rensing. (C) Test av GFP spalting av hTRPC3 bruker trombin. Fordøyelsen tid ble testet med en liten mengde protein på 4 ° C, og fullstendigheten av fordøyelsen ble kontrollert av FSEC. I hvert spor, toppen til venstre tilsvarer hTRPC3 tetramer toppen (stjerne) og toppen til høyre er gratis GFP. Som lengden på fordøyelsen økt, redusert forholdet tetramerisk protein gratis GFP, som indikerer at GFP var blir kløyvde fra protein. 2t fordøyelsen viser en komplett spalting av GFP. (D) SEC profil av hTRPC3 før eller etter trombin fordøyelsen i digitonin som inneholder kjører buffer med 10 mM EDTA lagt. Som forventet, er listeplassering forskjøvet mot mindre elueringsrør volumet etter trombin fordøyelsen (rød trace). Hoved peak (stjerne) representerer den tetramerisk hTRPC3. Fraksjoner mellom røde linjer ble samlet i cryo-EM eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: skjematisk cryo-EM innsamling og behandling for hTRPC3. Samlingen av 3,660 film stabler av renset hTRPC3 ble gjort med et elektronmikroskop med en direkte elektron detektor. Bevegelse korreksjon og manuelt valg ble brukt som resulterer i 3,580 micrographs. Partiklene var autopicked og utsatt for 2D klassifisering. 2D klasser var fremme raffinert av 3D klassifisering. Bare én av fem 3D klasser vises høyoppløselig funksjoner. Denne klassen ble valgt for 3D raffinement og Frealign lokale raffinement, noe som resulterer i en struktur for hTRPC3 på 3.3 Å oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Strukturelle fastsettelse av proteiner av cryo-EM har revolusjonert strukturell biologi i de siste årene, takket være utviklingen av nye kameraer og algoritmer som betydelig raskere struktur fastsettelse av proteiner som ikke lett krystallklar, spesielt membran proteiner. Til tross for alle den siste utviklingen i cryo-EM teknikken forblir utarbeidelse av renset proteiner tilstrekkelig i kvalitet og kvantitet å lette høykvalitets tenkelig ofte tidkrevende, kostbare og utfordrende. Evne til å raskt uttrykke og skjermen flere genet konstruerer under en rekke rensing forhold, forbedrer som beskrevet i protokollen ovenfor, effektiviteten av denne prosessen ved å tillate rask og kostnadseffektiv produksjon av høy kvalitet renset protein for bruk i cryo-EM studier.
Mens metoden beskrevet her gir en måte å rense store mengder pattedyr membran proteiner til lavere kostnad enn ved direkte transfection og raskere enn generasjon stabilt transfekterte celle linjen, den har mange skritt, må alle være optimalisert til gi en høykvalitets protein avkastning. Innenfor biokjemiske teknikkene som brukes til å produsere og rense hTRPC3, finnes det en rekke viktige trinn og sjekkpunkter. Første kritiske kontrollpunktet er produksjon av bacmid DNA. Som beskrevet i resultatene, er ideelle kolonien utvalg første skritt i generasjon av kvalitet virus for protein uttrykk. I tillegg hvis konsentrasjonen av bacmid DNA renset fra den valgte kolonien er mindre enn 1 μg/μL, vil resulterende viruset ikke være tilstrekkelig for robust protein uttrykk. Andre kritiske kontrollpunktet er produksjon av P1 og P2 baculovirus. Virus titer kan estimeres ved GFP fluorescens, som vist i figur 1 c eller kan måles som beskrevet av Coleman et al. 35. i tillegg til viral titer, en gang løpet av infeksjon tid bør foretas for hver nye konstruere å avgjøre det optimale tidspunktet for infeksjon for maksimal protein uttrykk. Kritisk checkpoint tre er løselighet og stabilitet screening vist i figur 2. Vaskemidler med en høy CMC, som DDM, kan gi høy løselighet, men de er ikke ideelt for cryo-EM imaging fordi de kan føre til en rekke forurensende micelles. En mildere detergent, som digitonin, kan gi tilstrekkelig løselighet samtidig bevare protein stabiliteten. Screening av tilsetningsstoffer, som EDTA ved hTRPC3, er viktig for å oppdage en rensing tilstand som resulterer i intakt og homogen protein, sannsynligvis ved å fjerne kalsium fra hTRPC3, som er permeabel til kalsium. Kritisk checkpoint fire er verifisering av bestemt og effektiv protein fange under affinitet kolonnen rensing og observasjon av en ideell protein topp under SEC-fraksjoneres (Figur 4). Unngåelse av inkludering av forurensende protein partikler samtidig beholde alle mål protein er avgjørende for å oppnå en høy nok avkastning av protein for cryo-EM bildebehandling. Endring av batch-binding tid og forholdet mellom harpiks solubilized protein kan forbedre protein oppbevaring av kolonnen harpiks. Den generelle kvaliteten på SEC-fraksjoneres toppen er vår erfaring den beste indikatoren, før bildebehandling, av kvaliteten på renset protein partikler. Lav eller en bred topp under SEC-fraksjoneres angir mulige problemer for få protein partikler per bilde eller tilstedeværelse av forurensende protein aggregering/nedbrytningsprodukter, henholdsvis. I tillegg endringer i affinitet koden innenfor konstruere selv har bevist nødvendig i noen tilfeller for å sikre tilstrekkelig affinitet-tag-binding. Den endelige checkpoint før samling av cryo-EM datasett er verifisering av protein partikkel kvalitet av negative-flekken EM. Mens ikke strengt nødvendig, finner vi at det gir en utmerket mulighet til å spot og riktig protein problemer før du investerer i tid - og kostnadskrevende prosessen med å samle inn data med cryo-EM.
En alternativ metode å produsere protein for cryo-EM strukturelle studier er direkte rensing av protein fra innfødte vev kilden. Mens denne metoden møter ofte problemer med protein avkastning, er det et utmerket alternativ for proteiner som er svært rikt i cellene eller som finnes som en del av et stort multi protein kompleks som kan være vanskelig å produsere ved hjelp av en rekombinant overuttrykte systemet36. Men for enkelt proteiner uttrykt i moderat eller lav mengder under fysiologiske forhold, uttrykk og rensing systemet presenteres her er en effektiv, relativt lav pris og høy yield metoden for å produsere renset pattedyr membran protein for cryo-EM strukturelle studier. En metode som kan sterkt utfyller som presenteres her er rekonstituering renset protein i lipid nanodiscs før cryo-EM data samling37. Under denne metoden er proteiner imbedded i en liten disk av lipid bilayer, sannsynligvis gir en native-lignende microenvironment i forhold til vaskemiddel micelles, selv om det er ingen bevis så langt som strukturer oppløst i vaskemiddel og nanodisc forskjellige38,39,40. En annen tilnærming er å pakke protein direkte med amphipathic polymerer som styren maleic anhydride (SMA), som har blitt brukt for fastsettelse av membran protein strukturer41,42.
Disse metodene som er beskrevet i dette manuskriptet har vist seg for å være lett tilpasses i vår lab til en rekke andre pattedyr membran proteiner utover ionekanaler. Derfor tror vi denne protokollen vil være et verdifullt verktøy i strukturelle og funksjonelle analysene underlie høy spesifisitet målrettet stoff design. Dette vil være spesielt nyttige i nevrodegenerative sykdommer, hjerte-og karsykdommer og kreft, i hvilken ion kanaler er vanskelig, men høyt potensial narkotika mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker G. Zhao og X. Meng for støtte med datainnsamling på David Van Andel avansert Cryo-elektron mikroskopi Suite. Vi takker variabel HPC-teamet for beregningsorientert støtte. Vi gir vår takknemlighet til N. Clemente, D. kontingent, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth og Z. Ruan for kommentarer som forbedret dette manuskriptet. Vi takker D. Nadziejka redaksjonelle støtte for dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av interne variabel finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent - to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C.
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S.
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G.
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
