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Immunology and Infection

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

가장자리 지역 B 세포 (MZBs) 다시 흐름을 그들의 마이그레이션 경로 향하는 여 전단 흐름의 힘에 응답할. 이 프로토콜에는 기록 하 고 분석 응용 장치, 펌프, 현미경 이미징 시스템, 그리고 무료 소프트웨어를 사용 하 여 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.

Abstract

가장자리 지역 B 세포 (MZBs)는 낭 봉투 마우스 비장 한계 영역에 있는 B 세포의 인구. 모 낭에 도달, 혈액 흐름의 전단 힘을 MZBs 마이그레이션 해야 합니다. 선물이 여기 생체 외에서이 흐름 유도 MZB 마이그레이션 분석 하는 방법. 첫째, MZBs 마우스 비장 으로부터 격리 됩니다. 둘째, MZBs 흐름 챔버 슬라이드에서 integrin ligands에 정착, 전단 흐름에 노출 되며 마이그레이션 동안 현미경 이미지. 셋째, 이미지는 마이그레이션할 MZBs의 MTrack2 자동 셀 ImageJ를 위한 플러그인을 추적을 사용 하 여 처리 되 고 결과 셀 트랙 Ibidi chemotaxis 도구를 사용 하 여 정량은. 마이그레이션 데이터 셀 이동 하는 얼마나 빨리, 얼마나 자주 그들은 방향을 변경, 전단 흐름 벡터의 이동 방향에 영향을 미치는 여부 및 어떤 integrin ligands 관련 공개. MZBs를 사용 하 고, 비록 메서드를 쉽게 전단 흐름의 힘에 응답 하는 백혈구의 마이그레이션 분석 하는 데 적용할 수 있습니다.

Introduction

면역 세포는 인체에서 가장 운동 셀 이며 종종 혈액과 림프 흐름에서 전단 힘에 맞설 해야 합니다. 그러나, 백혈구1,2,3,,45의 전단 힘 유도 마이그레이션에 비교적 몇 가지 연구 있다. 선물이 여기 흐름 체 외에 면역 세포의 응답을 분석 하는 안정적이 고 양적 프로토콜. 수행 하는 분석 결과의 구성 요소, 제조 필요 하지 않습니다 그리고 모든 장비 및 소모품을 상업적으로 사용할 수 있습니다. 프로토콜, 세포 정화 및 마이그레이션 분석을 포함 하 여 하루에 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 한계 영역 B 세포 (MZBs)의 마이그레이션 설명, 비록 프로토콜 마이그레이션 다른 종류의 면역 세포의 흐름에 대해 분석 하 적응 될 수 있다. 따라서, 그것은이 분석 결과 사용 하 여 조건의 종합 패널 백혈구의 광범위 한 범위를 체계적으로 분석 가능 합니다.

MZBs, 마우스에서 발견 되는 비장에 셔틀만 B 세포의 인구는 여 포의 인테리어와 한계 영역6,7,,89. 한계 영역 면역 세포 약 5-10 셀 두께의 계층입니다. 셀 레이어 봉투 뿌리 하 고 MZBs와 대 식 세포 또한 고정 자연적인 살인자 T (iNKT) 세포, 모 수석 세포 (DCs), 및 호 중구, 다른 사람의 사이에서10주로 이루어져. 한계 영역에서 셀은 뿌리를 둘러싼 한계 부 비 동에 종료 비장 동맥에서 발생 하는 단방향 혈에 노출 됩니다. 혈액 한계 영역을 통해 한계 공동에 구멍에서 흐르는 고 빨간 펄프에서 정 맥 sinuses에 수집 이며 순환11복원. 혈액의 자유로운 흐름은 MZBs 이상 세척 하 고 혈액에 항 원에 노출. MZBs와 혈액에 노출 되지 않습니다, 뿌리의 내부 한계 영역 사이 자동으로 왕복 하 여 뿌리에 항을 수행. 따라서, 뿌리 쪽으로 MZBs 셔틀로 그들은 혈액 흐름12 (그림 1A)의 전단 힘을 마이그레이션 해야 합니다.

이 프로토콜에서 양적 어떻게 면역 세포와 같은 MZBs 아무 흐름 또는 높은 흐름 체 외에 응답을 결정 하는 방법을 설명, 그들은 어떻게 공개 하기 에 비보를 마이그레이션할 프로그램. 첫 번째 단계에서 MZBs 자석 구슬 상용 키트에서 항 체 결합을 사용 하 여 마우스 비장에서 순화 된다. 갓 격리 MZBs 흐름 챔버 슬라이드의 우물에 도입, integrin ligands에 정착 수 있으며 펌프 시스템 (그림 2A)를 사용 하 여 마이그레이션 버퍼의 흐름에 노출. 셀 시간 경과 비디오 현미경 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있습니다. 이미지 무료 ImageJ 플러그인, MTrack213,14, 셀을 자동으로 추적 하는 분석에 대 한 처리 됩니다. 트랙 속도, 직진도, 및 마이그레이션 인덱스를 포함 하 여 다양 한 매개 변수를 확인 하려면 무료 Ibidi Chemotaxis 도구15 다음 측정할 수 있습니다. 이러한 값 vivo에서 면역 세포 움직임을 제어 하는 힘을 이해 하기 위해서는 전단 흐름 유도 마이그레이션에 마이그레이션 억제제, 세포 자극, 발산, 및 다른 마이그레이션에 영향을 미치는 화학 물질의 효과 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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Protocol

동물의 사용을 포함 하는 모든 실험은 이전 OVGU 마그데부르크 대학교의 의학 교수진의 모든 지침에 따라 Landesverwaltungsamt 할레 (작센안할트), 독일에 의해 승인 되었습니다.

1. MZB 셀 정화

  1. 백혈구를 격리 합니다.
    1. 16 주-오래 된 마우스를 8을 희생 하 고 비장16를 제거 합니다. 얼음 처럼 차가운 셀 버퍼의 5 mL에 비장 해리 [인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) + 0.5% 지방산 무료 소 혈 청 알 부 민 (BSA)], 조직 dissociator를 사용 하거나 부드럽게 6-잘 접시에 잘으로 70 µ m 셀 여과기 메시 통해 비장을 mashing에 의해 5 mL 주사기에서 플런저와.
    2. 15 mL 원뿔 튜브로 셀 셀 버퍼에 전송 합니다. 조직 dissociator 튜브 또는 우물에서 나일론 메쉬를 얼음 처럼 차가운 셀 버퍼의 또 다른 5 mL을 추가 하 여 추가 셀을 수집 합니다. 셀 버퍼 플러스 셀의 추가 5 mL 원뿔 튜브에 전송. 실 온 (RT, 20 ° C)에서 10 분 동안 300 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
  2. 적혈구 세포를 수행 합니다.
    1. 다시 1 ml의 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼 (150mm NH4Cl, 10 m m KHCO3, 0.1 mM EDTA)를 실시간 추가 RBC 세포의 용 해 버퍼의 추가 1.5 mL를 미리 데워 진 셀 펠 릿을 일시 중지 하 고 혼합에 소용돌이. 다시는 펠 릿을 일시 중단 하는 데 필요한 시간을 포함 하 여 2 분의 총에 대 한 실시간 (20 ° C)에서 품 어.
    2. 중지는 세포에 세포 현 탁 액에 얼음 처럼 차가운 셀 버퍼의 7.5 mL를 추가 합니다. G 와 10 분 동안 4 ° C x 300에 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
    3. 다시 셀 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿을 일시 중지 하 고 셀 버퍼의 추가 9 mL를 추가 합니다. 세포 파편을 제거 하는 새로운 15 mL 원뿔 관으로 30 µ m 사전 분리 필터를 통해 10 mL 세포 현 탁 액을 플라스틱.
    4. G 와 10 분 동안 4 ° C x 300에서 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한. 다시 셀 버퍼의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 셀 차가운 절차의 모든 이후 단계까지 계속 흐름 챔버 슬라이드에서 부 화.
  3. MZBs 정화.
    1. CD43 (에 비 B 세포), CD4 (T 세포)에, (에 미 성숙한 B 세포), CD93 및 Ter119 (적혈구)에 포함 하 여 모든 원치 않는 셀에 대 한 상용 키트에서 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액 biotin 결합 항 체의 50 µ L를 추가 합니다. 흔들어 또는 혼합, 하지만 하지 소용돌이 셀을 부드럽게 튜브를 터치 합니다. 원뿔 튜브 얼음 거의 평면 각도 15 분 동안 25 rpm에서 바위의 침대에 누워.
    2. 마그네틱 구슬 안티 비오 틴 항 체 세포 현 탁 액을 100 µ L의 전체 볼륨에 결합을 추가 합니다. 300 x g 에서 centrifuging 셀 버퍼의 5 mL와 10 분, 4 ° C를 추가 하 고 삭제는 상쾌한 여 20 분 세척에 대 한 얼음에 25 rpm에 세포 현 탁 액 셀 락을 계속. 다시 셀 셀 버퍼의 1 ml에서를 일시 중단 합니다.
    3. 마그네틱 열에 그들을 유지 하 여 자석 구슬 결합 세포의 세포 현 탁 액을 고갈 합니다. 삭제 (모든 비-B 세포 및 미 성숙한 B 세포) 셀을 표시 합니다. MZBs에 의해 일반적인 접착을 방지 하기 위해 셀 버퍼의 5 mL의 간단한 응용 프로그램을 미리 코팅 된 15 mL 원뿔 튜브에 표시 되지 않은 셀 (성숙한 B 세포)를 수집 합니다.
    4. 세포 현 탁 액 셀 버퍼의 5 mL로 씻는 다. G 와 10 분 동안 4 ° C x 300에 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 다시 셀 셀 버퍼의 90 µ L 일시 중단 하 고 안티 CD23 결합 하는 구슬의 10 µ L를 추가 합니다. 암 세포 현 탁 액 25 rpm에서 20 분 동안 얼음에 부드럽게.
    5. 세포 현 탁 액 셀 버퍼의 5 mL로 씻는 다. G 와 10 분 동안 4 ° C x 300에 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 다시 셀 셀 버퍼의 1 ml에서를 일시 중단 합니다.
    6. 마그네틱 열에 그들을 유지 하 여 자석 구슬 결합 세포의 세포 현 탁 액을 고갈 합니다. 레이블이 지정 된 셀 (소 낭 모양 B 세포)를 삭제 합니다. 셀 버퍼의 5 mL의 간단한 응용 프로그램을 미리 코팅 15 mL 원뿔 튜브에 표시 되지 않은 셀 (MZBs)를 수집 합니다. 세 고 순도 검사에 대 한 셀의 50 µ L을 제거 합니다.
  4. 순도를 확인 하려면 정렬된 MZBs 얼룩.
    1. 10, 000 셀 50 µ L에 Fc 블록의 10% 볼륨 (5 µ L)를 추가 하 고 5 분 추가 50 µ L 0.3 µ L 각 B220 FITC의를 포함 하는 셀 버퍼의 4 ° C에서 품 어 (0.15 µ g), CD21-PE (0.06 µ g), 그리고 CD23-APC (0.06 µ g) 105 µ L (각 항 체 희석 1:350)의 전체 볼륨에 또는 15 분 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 셀 소 낭 모양 B 세포와 MZBs 얼룩 사이 구별을 위한 fluorophores의 다른 조합.
    2. 씻으십시오 스테인드 셀 셀 버퍼의 1 mL을 한 번. G와 5 분 동안 4 ° C x 300에 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 셀 버퍼의 300 µ L에서 resuspend 하 고 교류 cytometer 및 표준 메서드를 사용 하 여 샘플을 확보. 라이브 세포에서 다음 B220에 게이트+ 세포, 그리고 마지막으로에 CD23낮은 CD21높은 세포 (그림 1B).
      참고: 절차는 C57B/6 마우스에서 비장 당 500000 MZBs 일반적으로 생성합니다.
  5. 흐름 마이그레이션에 대 한 MZBs를 준비 합니다.
    1. 워시는 양이온을 포함 하는 마이그레이션 버퍼 잔여 양이온 무료 PBS 버퍼에 의해 희석 하지 있도록 콜드 마이그레이션 버퍼 [행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 포함 양이온, 10 mM Hepes, 0.2% 지방산 무료 BSA] 1-2 mL에 한 번 MZBs를 정화. G 와 10 분 동안 4 ° C x 300에 centrifuge 고는 상쾌한 삭제. 다시 30 µ L (흐름 챔버 슬라이드의 한 잘에서 로드 하는 금액에 해당) 당 50000 MZBs의 농도에 콜드 마이그레이션 버퍼에 MZBs를 일시 중단 합니다.
      참고: 갓 격리 된 MZBs 가능한 빨리 사용 되어야 한다. 그러나, 그들은 여전히 그들은 얼음에 보관으로 최대 8 h 또는 더에 대 한 실험의 시작 후에 대 한 마이그레이션 수 있습니다. 최적의 온도 다른 세포 유형에 대 한 시험 되어야 한다. 예를 들어 마이그레이션 시작까지 37 ° C에서 배양된 T 세포를 유지 하는 더 나은 수 있습니다.

2. 흐름 실험

  1. Integrin ligand와 슬라이드 코트.
    1. 실험 전에 하루에 녹여 ICAM-1의 약 수 (400 µ g/mL). 5 µ g/mL의 최종 농도 도달 하는 PBS에 1:80의 요인에 의해 ICAM-1 희석. 필요한 모든 마이그레이션 영화에 대 한 흐름 슬라이드에 하나의 실로 ICAM-1의 30 µ L를 추가 합니다. 하룻밤에 4 ° C에서 습 한 챔버 슬라이드를 품 어.
      참고: 각 슬라이드 6 챔버를 포함 하 고 한 세션 8 영화까지 기록 될 수 있습니다 쉽게.
  2. 차단 코팅된 웰 스.
    1. 실험 당일 한 잘에 PBS의 100 µ L를 추가 하 고 챔버의 다른 우물에서 100 µ L를 철수 하 여 챔버를 씻어. 챔버를 블로킹 버퍼 (2% 지방산 무료 BSA PBS에) 100 µ L을 추가 하 고 1.5 h에 대 한 실시간에 습기가 챔버 슬라이드를 품 어.
    2. 약 실에는 다른, 다음 추가 100 µ L의 마이그레이션 버퍼에서 철수 한 잘에 PBS의 100 µ L을 추가 하 여 챔버를 씻어. 실험까지 RT에서 습 한 챔버에 슬라이드를 저장 합니다.
  3. 응용 장치를 준비 합니다.
    1. 유체 펌프에 연결, 응용 장치를 부착 하 고 펌프 소프트웨어 설정. 마이그레이션 버퍼의 5-10 mL와 함께 한 번 튜브를 세척 후 두 저수지를 동등 하 게 마이그레이션 버퍼의 11.7 mL를 추가 하 고 공기 방울을 제거.
    2. 튜브 커넥터 부분에서 약 10cm 클램프. 현미경에 온수 보육 실에서 유체 단위를 놓습니다.
    3. 소프트웨어에서 슬라이드 선택 "µ-슬라이드 6 0.4"와 "백색" 튜브를 설정 합니다. 원하는 전단 응력 (예를 들어, 4 dyn cm-2)를 설정 합니다. 30 분에 화상의 시간을 설정 합니다.
    4. 다른의 한 저수지에서 흐름을 2로 나누어 버퍼의 2 mL에 필요한 시간은 mL/분 측정 튜브를 통해 유량을 결정 하 여 튜브 보정 요소를 설정 합니다. 4 측정 정확도 대 한 확인 합니다. 사용 하 여 실제 유량 펌프 소프트웨어에 값을 입력 하 여 원하는 흐름 속도 전단 응력을 설정.
  4. 이미징 시스템을 준비 합니다.
    1. 미리 따뜻하게 현미경 인큐베이션 챔버, 응용 장치, 및 마이그레이션 버퍼 aliquots 37 ° c (그림 2B). 테스트 마이그레이션 버퍼는 저수지에서 앞뒤로 흐르는 고 공기 함으로써 유체 펌프 시스템에 거품.
  5. 슬라이드에 세포를 로드 합니다.
    1. 에탄올을 묻힌 티슈로 슬라이드의 하단을 청소. 챔버의 한 잘에 세포 현 탁 액의 30 µ L을 추가 하 고 다른 우물에서 30 µ L를 철회. 에 연결할 셀 수 있도록 30 분 동안 37 ° C에 증발을 방지 하기 위해 커버와 슬라이드를 품 어.
    2. 천천히까지 긍정적인 초승달 모양 우물에서 상승 흐름 챔버 슬라이드의 각 음을 미리 데워 마이그레이션 버퍼를 추가 하 고 피 펫 팁 모든 기포를 제거.
  6. 응용 장치에 슬라이드를 연결 합니다.
    1. 현미경 단계를 슬라이드 클램프. 커넥터 조각에서 유체 배관의 표시 면을 제거 하 고 공기 방울 없이 긍정적인 초승달 모양 끝에서 상승 때까지 마이그레이션 버퍼 끝을 채우기.
    2. 이상의 튜브의 끝을 플립 하 고 휴지로 흘리 며 버퍼 정리 흐름 챔버의 최고 우물에 삽입. 고정 튜브를 유지 하면서 튜브의 표시 된 끝에 대 한 절차를 반복 합니다.
  7. 셀을 이미지.
    1. 셀에 포커스를 설정 하려면 "라이브" 이미징 시스템을 전환 합니다. 보기는 슬라이드 가운데의 필드를 선택 합니다. 드 셀을 셀의 검은 윤곽선을 강화 하 고 다음 자동된 추적 프로그램으로 사용 하기 위해 흰색 바탕에 둥근 검은 세포 모양에 thresholded 수 있는 화이트 인테리어를 생산에 약간 초점을 맞춥니다.
    2. 이미지 시퀀스 프로그램을 시작 하 고 레코드 1 이미지 마다 5 30 분 건조 목표 x 10을 사용 하 여에 대 한 s. 튜브에서 클램프를 제거 하 고 설정 펌프, 비 부착 한 세포를 씻어 것 이다 그리고 부착 세포 마이그레이션할 시작 됩니다. 30 분 또는 원하는 대로 x 목표 이상, 10를 사용 하 여 더 이상에 대 한 이미지. 라벨 및 영화를 저장 합니다.
  8. 슬라이드에서 유체 장치를 분리 합니다.
    1. 이미징 프로그램의 끝에, 다시 다음 실험에 대 한 펌프: 다시 연결 하는 튜브에 클램프, 슬라이드에서 튜브를 제거, 다시 연결 하는 커넥터 조각, 클램프를 열고 한 reserv에서 버퍼의 몇 mL를 펌프의 수동 제어를 사용 하 여 공기 방울을 제거 하려면 다른 oir. 클램프를 다시 연결 하 고 영화에 대 한 현미경 스테이지에 클램핑 된 튜브를 하다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 무기한 여기. 억제제 또는 행동의 모드에 따라 세포 이동의 한정자를 사용 하는 경우 마이그레이션 챔버에 정착 하기 전에 셀 정지 또는 마이그레이션 버퍼 유체 장치에 그것을 추가 합니다.

3. 마이그레이션 트랙 분석

참고: 셀 MTrack2 플러그인을 사용 하 여 자동으로 추적할 수 있습니다 또는 수동 추적 플러그인17을 사용 하 여 손으로. 자동 쉽게 임계값 셀의 이미지는 흰색 바탕에 검은 개체 때문에이 세포는 주로 원형 및 마이그레이션, 하는 동안이 방법으로 계속에 MZBs와 함께 잘 작동을 추적. 자동 추적은 다른 세포 유형 사용 됩니다와 같은 교양, 활성화 된 CD8 + T 세포, 때문에 이러한 셀 마이그레이션 중 밖으로 기지개 하 고 약간 투명 하 게, 가장자리를 정의 하 고 어려운 경우 더 어렵습니다. 이 경우에, 중 (1) 세포 thresholded 검은 개체 흰색 배경, 이미지 세분화 및 가장자리 탐지 될 수 있습니다와 같은 셀 개요 (2) 다른 프로그램에 표시 될 수 있는 이미지를 생산 하는 내부 중요 한 형광 염료로 얼룩이 질 수 있다 사용. 수동 추적 셀 윤곽선의 높은 콘트라스트 이미지를 생산 하는 경우 유용한 옵션 불가능입니다.

  1. 플러그인을 사용 하 여 수동 추적을 수행 합니다.
    1. ImageJ "수동 추적" 플러그인을 설치 하 고 ImageJ에 영화를 엽니다. "수동 추적" 메뉴에서 "새로운 트랙 추가" 선택 합니다. 영화 발전 자동으로 프레임-의해-프레임으로는 셀의 가운데를 클릭 합니다. 모든 프레임에서 셀을 선택 하면 추가 선택 합니다"새로운 트랙" 새로운 셀 다음 시작.
    2. 트랙을 기록 하는 후 데이터 스프레드시트에 출력 결과 복사 합니다. 소수점 후 제로 장소에 모든 스프레드시트 셀에 대 한 10 진수 표시 형식을 변경 합니다. 이후 분석 "탭 정지 분리".txt 파일로 파일을 저장 합니다.
      참고: 일반적으로 50-100 셀 추적 됩니다, 약 240 프레임의 20 분 영화에 대 한 완료 하는 데 약 1 시간 소요.
  2. MTrack2 플러그인을 사용 하 여 자동 추적을 수행 합니다. 다운로드 및 파일 (추가 코딩 파일 참조)에 지시에 따라 MTrack2 kt 플러그인을 설치.
    1. 임계값 셀 마이그레이션 영화에서 이미지. ImageJ 이미지 스택을 엽니다. 프로세스에서 비디오를 변환할 ImageJ에서 이미지 (그림 3A)는 흰색 바탕에 검은 개체로 셀을 보여주는 이미지를 색상.
      1. 두 번 이미지를 선명 하 게, 얼룩 제거, 이미지와 8 비트 이미지를 변환. 선택은 "이미지 | 밝기/대비 조정"하위 메뉴를 넣어 최대 대비에서 대비 슬라이더 다음 셀 검은 배경에 흰색으로 표시 됩니다. 선택은 "이미지 | 임계값을 조정"셀 흰색 바탕에 검은색으로 표시 되도록 하위 메뉴.
    2. 자동 셀 추적 플러그인 "MTrack2 kt" 실행 ( 추가 코딩 파일참조). 옵션 화면에서 다음 매개 변수를 설정 합니다.
      1. 설정 1 픽셀에 최소 입자 크기와 입자 크기 최대 30 픽셀에서 MZBs에 대 한.
      2. (동영상의 연속 프레임에 2 입자 사이의 최대 거리), 속도 대 한 슬라이드에 세포 밀도 높은 경우,이 값 설정 트랙 것을 피하기 위해 낮은 "점프" 한 셀에서 다른. MZBs,이 값 설정 캡처 outliers, 10 픽셀에 있지만 MZBs 일반적으로 초과 하지 5 연속 프레임에 2 픽셀 떨어져 s.
      3. 추적할 수 있어야 하는 입자는 프레임의 최소 수 MZBs에 대 한 영화에 프레임 수에이 값을 설정 (예:, 240) 12 프레임/min 20 분 영화. 그러나, 세포 이미징의 끝 전에 시야를 두고 충분히 빨리 인 경우 다음 설정 프레임의 최소 수는 영화의 기간 보다는 더 적은에서. 예를 들어 빠른 속도로 움직이는 T 세포, 이미징의 5-10 분의 동등 물에 최소 수를 설정 합니다.
        참고: 다음이 단계 (임계 처리 및 MTrack2 kt) 절차의이 부분을 자동화 하 여 시간을 절약의 매크로 기록 ( 추가 코딩 파일참조). ImageJ에 동영상을 자동으로 추적 하는 매크로 사용 하 여 1 분 미만 소요 됩니다.
    3. 데이터를 스프레드시트에 출력 결과 복사 합니다. 소수점 후 제로 장소에 모든 스프레드시트 셀에 대 한 10 진수 표시 형식을 변경 합니다. 스프레드시트에서 셀 트랙의 상단에 빈 행을 추가 하 고 "D" 열을 삭제 합니다. Ibidi Chemotaxis 도구에 후속 분석을 위해 "탭 정지 분리".txt 파일로 파일을 저장 합니다.
      참고: MTrack2 플러그인 출력 75 병렬 열 행에서 셀 트랙. Ibidi chemotaxis 도구 분석, 셀 트랙 단일 열에 있어야 합니다. 출력을 변환 하려면 MTrack2 플러그인 하나를 출력 하도록 수정 되었습니다 원래 형식에서 또는 단일 열 (그림 3B) 로 ( 추가 코딩 파일 "MTrack2 kt",이 Java에서 작성 된 참조). ImageJ 플러그인 폴더에.java 파일을 복사 합니다. ImageJ에서 "플러그인 > 컴파일 및 실행"을 선택 합니다. 다시 시작 ImageJ, 그리고 MTrack2의 수정된 버전 플러그인 메뉴에 표시 됩니다.
  3. Ibidi Chemotaxis 도구로 셀 트랙을 분석, ("독립 실행형") Ibidi Chemotaxis 및 마이그레이션 도구 v 2.0을 다운로드 하 고 프로그램을 엽니다.
    1. "데이터 가져오기"를 선택 하 고.txt 셀 트랙 파일. 동시에 여러 파일을 선택할 수 있습니다. 가져온된 파일은 빨간색으로 "Dataset" 창에 나타납니다. 그들 모두를 선택 하 고 다음 설정을 적용 하려면 아래의 "초기화" 메뉴에서 올바른 값을 입력 합니다.
    2. 정확한 수 또는 조각 (영화에서 프레임 수) 수의 범위를 입력 합니다.
    3. 교정 메뉴에서 (X / Y 교정), 입력 한 픽셀의 크기. 동영상의 속성 파일에서이 정보를 찾습니다. MZBs, 1.14 µ m의 픽셀 크기를 주는 10 배 목표 사용 되었습니다. "교정 메뉴 | 시간 간격", 영화에서 프레임 사이 시간 길이 입력 합니다.
    4. 설정을 적용 합니다. 선택 "데이터 플롯"을 보려면 트랙 음모 추적 파일이 열립니다 확인. 이 시점에서 많은 옵션은 사용할 수 있는 다른 속성에 따라 다른 색상으로 표시 하는 트랙을 포함 하 여 프로그램에 대 한 설명서에 설명 되어 있습니다 및 마이그레이션 전달 속도 대 한 개별 또는 평균 값 인덱스, 똑 바 름, 그리고 더 많은 (그림 3B).
      참고: MZBs를 감지 하 여 셀의 흐름-앞으로 포인트를 자신의 integrin 단지 편광 여 아마도 흐름에 응답 약 10 분 소요. 시간이 지남에 따라 마이그레이션 인덱스의 그래프는 해당 셀에 노출 되는 흐름, 앞으로 마이그레이션 인덱스 값은 양수 될 때까지 위쪽으로 점진적 상승 다음 분의 처음 몇 하 영 초기 드롭을 표시 됩니다. 이 과정은 관심 하지 않는 한 따라서, 최종 계산에서이 첫 번째 분을 제외 하는 것이 가장 좋습니다 있을 수 있습니다.

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Representative Results

우리는 마이그레이션 MZBs의 흐름 (0 dyn/cm2) 없이 ICAM-1-코팅 슬라이드에 비교 하 여 위에 약술 된 프로토콜을 사용 하 고 전단 흐름 (4 dyn/cm2)에 노출. 세포는 아무 흐름 (0 dyn/cm2) 및 (4 dyn/cm2) 분포를 보여 셀 마이그레이션 영화와 트랙 (그림 4A)의 모양에 MTrack2, 및 결과 추적 파일이 중첩 된 자동 추적 했다. 셀 트랙 다음 트랙 (그림 4B) 각 영화의 플롯을 생성 하기 위해 Ibidi Chemotaxis 도구 (ICT)으로 수입 했다. 평균 마이그레이션 인덱스 (ICT에서 "FMIy" 라고 함), 속도, 직진도 ("ICT에서 똑 바 름" 이라고 함), 및 4 영화 두 조건이 각각에서 계산 된 셀 트랙의 직선 거리 (ICT "유클리드 거리" 라고 함)는 Chemotaxis 도구 "측정 값" 명령을 사용 하 여. 이 평균 값 다음 그래프를 생성 하 고 통계적 의미 (그림 4C) 계산을 위한 GraphPad Prism으로 복사 했다.

Figure 1
그림 1: MZB 였죠. (A) 모델의 MZB 한계 영역 및 비장에 여 포 사이 였죠. MZBs는 여 포를 입력 하려면 S1PR1, S1P, 고 기능 CXCR5, CXCL13 chemokine에 대 한 수용 체에 대 한 수용 체의 국제화를 필요 합니다. 또한, 뿌리에 도달, MZBs 뿌리 봉투 한계 부 비 동에 있는 숨 구멍에서 나오는 혈액 흐름의 힘에 대 한 마이그레이션 해야 합니다. MZB ICAM-1, LFA-1 integrin 위한 리간드로 접착을 잃는다 면 그것은 밀어 빨간 펄프에 흐름의 힘에 의해 어디 VCAM-1, VLA-4, ligand의 증가 금액 지원 하지 않습니다 마이그레이션. (B)의 순도 테스트 하는 전략을 게이팅 cytometry MZBs B220, CD23, 및 CD21에 대하여 항 체를 사용 하 여 정렬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 응용 시스템, 펌프, 현미경, 그리고 보육 실의 설치. (A)와 연결 된 응용 장치 소프트웨어를 실행 하는 노트북 펌프를 제어 하는 펌프의 구성 된과 펌프 시스템 (Ibidi18)의 이미지. 높은 확대 이미지: 흐름 챔버 슬라이드 6 흐름 챔버와 함께 첫 번째는 응용 장치의 튜브에 연결 되어. (B) 흐름에 대 한 MZBs의 생체 외에서 마이그레이션을 측정 하기 위한 일반적인 설정. 응용 장치를 포함 하는 난방 챔버 (블랙 박스) 장착 현미경 현미경 외부 펌프 (현미경의 오른쪽 파란색 사각형 개체)에 연결 합니다. 높은 확대 이미지: 현미경 열 챔버 내부 응용 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 데이터를 이미징의 정량화. 마이그레이션하는 영화에서 프레임의 대표 이미지 (A) MZBs 하기 전 (왼쪽)과 후 (오른쪽) 임계 셀 흰색 바탕에 검은 개체를 변환할 이미지 처리. 모두 낮은 높은 확대 이미지에 바 규모 = 100 µ m. (B) 왼쪽된 위원회: MTrack2 (열 출력) 플러그인에서 전형적인 결과 출력의 이미지. 오른쪽 패널: 이미지의 MZBs과는 "값" 평균 속도, 마이그레이션 인덱스와 똑 바 름 (를 포함 하 여 매개 변수를 표시 하는 창을 표시 마이그레이션 트랙 줄거리를 보여주는 MTrack2 결과의 입력 후 Ibidi Chemotaxis 및 마이그레이션 2.0 도구 녹색 상자), 다른 사람의 사이에서. 픽셀 당 1.14 µ m의 픽셀 해상도 5의 시간 간격을 포함 하는 교정 설정 표시 동영상 프레임 당 s (0.083 분). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: MZB 였죠 측정 하는 프로토콜을 사용 하 여 결과의 예. (A) 담당자의 스틸 ImageJ 플러그인 "MTrack2 kt"에서 트랙의 오버레이 마이그레이션 MZBs. 참고: 트랙 색상은 임의로 설정한 "수동 추적" 플러그인 ImageJ를 위한 합니다. 모두 낮은 높은 확대 인세트 바 규모 = 100 µ m. (B) 대표 트랙의 음모 마이그레이션 Ibidi Chemotaxis 및 마이그레이션 2.0 도구에서 MZBs. 빨간 선과 검은 라인 셀 트랙을 각각 아래 또는 가로 축 위를 종료를 나타냅니다. (A)와 (B): 왼쪽, MZBs 마이그레이션 아무 흐름 (0 dyn/cm2); 바로, MZBs 4 dyn/cm2 흐름에. (C) 마이그레이션 인덱스 (FMIy), 속도, 직진도 (똑 바 름), 및 MZBs 없이 마이그레이션에 대 한 거리 (0 dyn/cm2) 흐름 또는 흐름 (4 dyn/cm2) (n = 4 별도 실험에서 4 쥐). 오차 막대 = 평균 ± SD; 학생의 t 시험, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 파일 1: MTrack2_kt.java. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.  

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Discussion

여기 전단 흐름의 힘을 감지 하 고 그들의 마이그레이션 변경 하 여 응답 하는 셀의 마이그레이션 분석 하는 방법을 설명 합니다. MZBs의 분석이 보여주었다 MZBs 마이그레이션 저절로 ICAM-1과 흐름의 존재, 흐름을 마이그레이션할 것입니다. 우리의 이전 작품에서는, 우리는 MZBs VCAM-1에 흐름을 마이그레이션하지 마십시오 하지만 대신 자리에 고정 남아 보였다. Murine 비장 한계 영역 되어 주로 ICAM-1, 빨간 펄프 ICAM-1와 VCAM-1 모두 포함 됩니다. 이러한 데이터에서 MZBs 동안 흐름 빨간 펄프에만 한계 영역을 마이그레이션할 것이 유추 될 수 있습니다. 분석 흐름12의 힘에 의해 비장 빨간 펄프를 mislocalized 했다 결함이 접착으로 MZBs를 사용 하 여 생체 내에서 검증 되었다. 이러한 이유로, MZBs 시스템은 다른 세포 유형 공부에 사용 하는 경우에 여기에 설명 된 흐름 마이그레이션 시스템을 테스트 하기 위한 좋은 긍정적인 제어를 나타냅니다.

절차의 가장 중요 한 측면은 일관성 셀 슬라이드에 처리 하도록 하 고 있다. 세포 이동의 같지는 측면을 셀 슬라이드에 준수 하는 정도에 따라 달라 집니다, 때문에 세포 접착의 어떤 감소 것 재현할 결과 어렵게 만들. 감소 세포 접착 마이그레이션 버퍼 또는 온수 보육 상자의 온도 포함 한 여러 요인에 불일치에서 발생할 수 있습니다 (감기 접착 감소), 세포 현 탁 액에서 양이온의 수준 (양이온에 영향을 미칠 integrin 바인딩), 슬라이드 처리 (도청 또는 슬라이드를 flexing 셀 꺼내 수), 밀도 세포 (세포 사이 충돌 영향을 미칠 수 마이그레이션 매개 변수). 다른 민감한 절차 동안 포함 하지 슬라이드 웰 스 (로이 세포 접착을 줄일 수) 튜브를 연결 하 고 모든 실험 (에서 일관성 프로토콜 단계에 필요한 시간을 유지 하기 전에 너무 많은 힘으로 버퍼를 pipetting 셀 안정화 시간 수에 영향을 접착). 요약 하자면, 세포 접착에 있는 가능한 영향 유지 해야 안정적인 셀 마이그레이션 데이터를 생산 하는 반복을 통해 일관 된.

이 메서드는 이후 상업적으로 사용 가능한 장비를 사용 하 여 공급 및 단계의 필요한 고급 명령 설정 하기 쉽습니다. 교양된 CD8 등 다른 세포 유형으로 MZB, 분석에 대 한+ T 세포, 다양 한 integrin ligands와 슬라이드 코팅 마이그레이션 흐름을 관찰 하는 것 충분 하다. 다양 한 integrin ligands 흐름 유도 마이그레이션 응답 공부 활성 integrins의 직접 식별 가능성이 공개 메커니즘 MZB 마이그레이션 ICAM-1 하지만 VCAM-1에 흐름을 vivo에서 기능에 관련 된 세포 표면에 리드. 그러나, 그것은 또한 흐름 챔버에는 내 피 세포 층을 추가할 수입니다. 면역 세포 마이그레이션 전단 흐름에 의해 영향을의 한 예로 내 피 레이어3T 셀 넘쳐 흐름 이다. 이 절차는 활성화 integrins를 통해 T 세포 접착, 풀, 그리고 발산, 그리고 혈액-뇌 장벽을 통해 모델 림프 구 마이그레이션 해명 하 사용 되었다. 이 방법으로 분석할 수 있는 셀에 대 한 유일한 제한은 그들이 방향 신호 흐름의 힘을 느낄 수 있어야 합니다 이다.

여기에 설명 된 메서드는 속도 등도 세포 행동 특성 사용, 그것은 또한 이동의 분자 측면의 분석을 확장할 수 있습니다. 분자 단지 흐름 유도 마이그레이션, integrins LFA-1과 그들의 cytoskeletal 어댑터 등을 포함 한 관련 200 내 것 슬라이드, 의무가 TIRF 현미경으로 시각화의 표면의 nM. 메서드에이 또한 integrin 또는 골격 관련 단백질에 돌연변이와 쥐에서 세포를 공부에 대 한 이상적인 것입니다. 많은 면역 세포는 혈액 이나 림프 흐름을 통해 그들의 개발의 여러 단계에서 마이그레이션, 생체 외에서 마이그레이션 설명 흐름과 어떻게 세포가 공개에 대 한 응답에 대 한 교양 또는 기본 백혈구의 많은 종류를 체계적으로 테스트에 사용할 수 있습니다. vivo에서 면역 반응을 마이그레이션할 프로그램. 결론적으로, 여기서 설명 하는 분석 결과 또한 다른 셀 형식으로 확장할 수 있는 MZBs의 흐름 유도 마이그레이션 분석 하기 위한 안정적이 고 간단한 방법을 제공 한다.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

이 작품 K. 시티에 "도이치 가운데" SFB 854/TP11에서 교부 금에 의해 지원 되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

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References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
  5. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  6. Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
  7. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
  9. Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
  10. Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
  11. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
  12. Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
  13. ImageJ. MTrack2. , Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018).
  14. MTrack2. , Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018).
  15. ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018).
  16. Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).
  17. ImageJ. Manual Tracking. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018).
  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

면역학 그리고 감염 문제점 141 B 세포 한계 영역 마이그레이션 전단 흐름 integrins 접착 세포 접착 분자-1 (ICAM-1) 혈관 세포 접착 분자 1 (VCAM-1)
분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션
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Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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