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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Murine सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवासन का विश्लेषण इन विट्रो में

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) फिर से कतरनी प्रवाह के बल का जवाब-उनके प्रवास के प्रवाह को पथ उंमुख । इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कैसे रिकॉर्ड और एक fluidics इकाई, पंप, माइक्रोस्कोप इमेजिंग प्रणाली, और मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रवास का विश्लेषण ।

Abstract

सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) बी कोशिकाओं की आबादी है कि माउस प्लीहा सीमांत क्षेत्रों में रहते है कि रोम ढंक रहे हैं । रोम तक पहुंचने के लिए, MZBs रक्त प्रवाह की कतरनी बल माइग्रेट करना चाहिए । हम यहाँ इस प्रवाह-प्रेरित MZB माइग्रेशन इन विट्रो में विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । सबसे पहले, MZBs माउस तिल्ली से अलग कर रहे हैं । दूसरा, MZBs प्रवाह चैंबर स्लाइड में integrin लाइगैंडों पर बसे हैं, कतरनी प्रवाह को उजागर, और एक खुर्दबीन के नीचे imaged जबकि पलायन । तीसरा, पलायन MZBs की छवियों ImageJ के लिए MTrack2 स्वचालित सेल ट्रैकिंग प्लगइन का उपयोग संसाधित कर रहे हैं, और परिणामस्वरूप सेल पटरियों Ibidi chemotaxis उपकरण का उपयोग quantified हैं । माइग्रेशन डेटा यह प्रकट करता है कि कक्ष कितनी तेजी से चलते हैं, वे कितनी बार दिशा बदलते हैं, चाहे कतरनी प्रवाह वेक्टर उनकी माइग्रेशन दिशा को प्रभावित करे, और जिसमें integrin लाइगैंडों शामिल हों । हम MZBs का उपयोग करते हैं, विधि आसानी से कतरनी प्रवाह के बल पर प्रतिक्रिया करता है कि किसी भी ल्युकोसैट के प्रवास का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मानव शरीर में सबसे अधिक गतिशील कोशिकाओं रहे है और अक्सर रक्त और लसीका प्रवाह से कतरनी बल के साथ संघर्ष करना चाहिए । हालांकि, ल्यूकोसाइट्स1,2,3,4,5के कतरनी बल-प्रेरित प्रवास पर तुलनात्मक रूप से कुछ अध्ययन कर रहे हैं । हम यहां एक विश्वसनीय और मात्रात्मक प्रोटोकॉल के लिए एक प्रतिरक्षा कोशिका की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए इन विट्रो में प्रवाह प्रस्तुत करते हैं । परख प्रदर्शन घटकों के निर्माण की आवश्यकता नहीं है, और सभी उपकरणों और उपभोग्य सामग्रियों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । कक्ष शुद्धिकरण और माइग्रेशन विश्लेषण सहित प्रोटोकॉल, एक ही दिन में किया जा सकता है । अंत में, यद्यपि हम सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं (MZBs) के प्रवास का वर्णन, प्रोटोकॉल के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अंय प्रकार के प्रवाह के खिलाफ प्रवास का विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है । इसलिए, यह संभव है कि इस परख का उपयोग करने के लिए व्यवस्थित शर्तों के एक व्यापक पैनल के साथ ल्यूकोसाइट्स की एक विस्तृत रेंज का विश्लेषण ।

MZBs बी कोशिकाओं की आबादी है कि, माउस में, केवल तिल्ली और रोम के इंटीरियर और सीमांत क्षेत्रों6,7,8,9के बीच शटल में पाए जाते हैं । सीमांत क्षेत्र प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक परत लगभग 5 – 10 मोटी कोशिकाओं है । कोशिका परत कूप ढंक और MZBs और मैक्रोफेज के मुख्य रूप से होते हैं, लेकिन यह भी अपरिवर्तनीय प्राकृतिक खूनी टी (iNKT) कोशिकाओं, वृक्ष कोशिकाओं (dc), और न्यूट्रोफिल, अंय लोगों के अलावा10। सीमांत क्षेत्र में कोशिकाओं एकतरफ़ा रक्त प्लीहा धमनियों कि कूप आसपास के एक सीमांत साइनस में समाप्त होने से उत्पंन प्रवाह को उजागर कर रहे हैं । रक्त सीमांत क्षेत्र के माध्यम से सीमांत साइनस में छेद से बहती है और फिर लाल लुगदी में शिरापरक साइनस में एकत्र और संचलन11में बहाल । रक्त के मुक्त प्रवाह MZBs पर बहाकर और उन्हें रक्त में किए गए एंटीजन को उजागर करता है । MZBs के कूप में प्रतिजन ले स्वचालित रूप से सीमांत क्षेत्र और कूप है, जो रक्त के संपर्क में नहीं है के अंदर के बीच । इस प्रकार, कूप की ओर MZBs शटल के रूप में, वे रक्त प्रवाह12 (आंकड़ा 1a) की कतरनी बल विस्थापित करना होगा ।

इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन कैसे मात्रात्मक कैसे MZBs के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को या तो कोई प्रवाह या इन विट्रो में उच्च प्रवाह का जवाब निर्धारित करने के लिए, ताकि वे vivo मेंमाइग्रेट करने के लिए क्रमादेशित रहे है प्रकट करने के लिए । पहले चरण में, MZBs एक माउस तिल्ली वाणिज्यिक उपलब्ध किट से एंटीबॉडी के लिए मिलकर चुंबकीय मोतियों का उपयोग से शुद्ध कर रहे हैं. हौसले से पृथक MZBs एक प्रवाह चैंबर स्लाइड के कुआं में पेश कर रहे हैं, integrin लाइगैंडों पर बसने की अनुमति दी, और माइग्रेशन बफर के प्रवाह को उजागर एक पंप प्रणाली (चित्रा 2a) का उपयोग कर । कोशिकाओं को एक समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर imaged रहे हैं । छवियों तो एक मुक्त ImageJ प्लगइन, MTrack213,14, के साथ विश्लेषण के लिए स्वचालित रूप से कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए संसाधित कर रहे हैं । पटरियों तो वेग, सीधे, और माइग्रेशन सूचकांक सहित विभिन्न मापदंडों का निर्धारण करने के लिए मुक्त Ibidi Chemotaxis उपकरण15 के साथ quantified जा सकता है. ये मान माइग्रेशन अवरोधकों, सेल के उत्तेजितकों, chemokines, और अंय माइग्रेशन-कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवास पर रसायनों को प्रभावित करने के क्रम में vivo में प्रतिरक्षा सेल आंदोलन को नियंत्रित करने बलों को समझने के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

पशुओं के उपयोग से जुड़े सभी प्रयोगों को पहले Landesverwaltungsamt हाले (Saxony-Anhalt), जर्मनी, मैगडेबर्ग के OVGU विश्वविद्यालय के चिकित्सा संकाय के सभी दिशानिर्देशों के अनुसार अनुमोदित किया गया है ।

1. MZB कोशिका शुद्धि

  1. अलग ल्यूकोसाइट्स ।
    1. एक 8 से 16 सप्ताह पुराने माउस त्यागें और तिल्ली16निकालें. अलग कर देना में तिल्ली की 5 मिलीलीटर बर्फ-शीत सेल बफर [फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) + ०.५% फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA)], या तो एक ऊतक dissociator का उपयोग करके या धीरे एक 6-अच्छी तरह से थाली पर एक अच्छी तरह से एक ७० µm सेल छलनी जाल के माध्यम से तिल्ली मसल एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से गोताख़ोर के साथ.
    2. कक्ष बफ़र में कक्षों को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करना । ऊतक dissociator ट्यूब या अच्छी तरह से में नायलॉन जाल के लिए बर्फ शीत सेल बफर के एक और 5 मिलीलीटर जोड़कर अतिरिक्त कोशिकाओं को इकट्ठा । शंकु ट्यूब के लिए सेल बफर प्लस कोशिकाओं के अतिरिक्त 5 मिलीलीटर स्थानांतरण । ३०० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में कमरे के तापमान (आरटी, 20 डिग्री सेल्सियस) और supernatant त्यागें ।
  2. लाल रक्त कोशिका lysis प्रदर्शन ।
    1. पुन: निलंबित लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर के 1 मिलीलीटर में सेल गोली (१५० मिमी एनएच4सीएल, 10 मिमी KHCO3, ०.१ मिमी EDTA) है कि पूर्व-आरटी के लिए गर्म है । आरबीसी lysis बफर और भंवर के एक अतिरिक्त १.५ मिलीलीटर जोड़ें मिश्रण करने के लिए । आर टी पर (20 ° c) 2 मिनट की कुल के लिए, फिर से गोली निलंबित करने के लिए आवश्यक समय सहित मशीन ।
    2. lysis को रोकने के लिए सेल सस्पेंशन के लिए ७.५ मिलीलीटर आइस-कोल्ड सेल बफर जोड़ें । 10 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
    3. कक्ष बफ़र के 1 मिलीलीटर में कक्ष की गोली पुन: निलंबित करें और एक अतिरिक्त 9 मिलीलीटर कक्ष बफ़र जोड़ें । पिपेट सेल मलबे को हटाने के लिए एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक 30 µm पूर्व जुदाई फिल्टर के माध्यम से 10 मिलीलीटर सेल निलंबन ।
    4. 10 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c पर कोशिकाओं केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । कक्ष बफ़र के ५०० µ l में कक्ष गोली पुन: निलंबित । प्रक्रिया के सभी क्रमिक चरणों में शीत कोशिकाओं के प्रवाह चैंबर स्लाइड में जब तक ठंडा रखें ।
  3. शुद्ध MZBs ।
    1. बायोटिन की ५० µ एल जोड़ें-सभी अवांछित कोशिकाओं के खिलाफ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से युग्मित एंटीबॉडी, CD43 (नॉन-बी कोशिकाओं पर), CD4 (टी कोशिकाओं पर), CD93 (अपरिपक्व बी कोशिकाओं पर), और Ter119 (एरिथ्रोसाइट्स पर), एक शंकु ट्यूब में सेल निलंबन करने के लिए शामिल हैं । शेक या ट्यूब धीरे मिश्रण करने के लिए झटका, लेकिन भंवर कोशिकाओं नहीं है । 15 मिनट के लिए 25 rpm पर लगभग सपाट कोण और चट्टान पर बर्फ के एक बिस्तर पर शंकु ट्यूब करना ।
    2. सेल निलंबन करने के लिए १०० µ एल की कुल मात्रा में विरोधी बायोटिन एंटीबॉडी के लिए युग्मित चुंबकीय मोती जोड़ें । 20 मिनट के लिए बर्फ पर 25 rpm पर सेल निलंबन रॉक करने के लिए जारी रखें सेल बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा कोशिकाओं को धो, ३०० x g और 4 ° c 10 मिनट के लिए पर केंद्रापसारक, और supernatant त्याग । कक्ष बफ़र के 1 मिलीलीटर में कक्ष पुन: निलंबित ।
    3. चुंबकीय-मनका-युग्मित कोशिकाओं के कोशिका निलंबन को एक चुंबकीय स्तम्भ पर रख कर चूस लीजिये । लेबल किए गए कक्षों को छोड़ें (सभी नॉन-बी कक्ष और अपरिपक्व b कक्ष). गैर-लेबल कोशिकाओं (परिपक्व बी कोशिकाओं) में एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब है कि सेल बफर के 5 मिलीलीटर के एक संक्षिप्त आवेदन के साथ पूर्व में लेपित किया गया है, क्रम में MZBs द्वारा गैर विशिष्ट आसंजन को रोकने के लिए ले लीजिए ।
    4. कक्ष बफ़र के 5 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन धो लें । 10 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । सेल बफर के ९० µ एल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित और विरोधी CD23-युग्मित मोतियों की 10 µ एल जोड़ें । रॉक सेल 25 आरपीएम पर 20 मिनट के लिए बर्फ पर धीरे से निलंबन ।
    5. कक्ष बफ़र के 5 मिलीलीटर के साथ सेल निलंबन धो लें । 10 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । कक्ष बफ़र के 1 मिलीलीटर में कक्ष पुन: निलंबित ।
    6. चुंबकीय-मनका-युग्मित कोशिकाओं के कोशिका निलंबन को एक चुंबकीय स्तम्भ पर रख कर चूस लीजिये । लेबल किए गए कक्षों (तोंसिल्लितिस B कक्षों) को छोड़ें । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब है कि सेल बफर के 5 मिलीलीटर के एक संक्षिप्त आवेदन के साथ पूर्व में लेपित किया गया है में गैर लेबल कोशिकाओं (MZBs), लीजिए । गिनती और शुद्धता की जाँच के लिए कोशिकाओं के ५० µ एल निकालें.
  4. सॉर्ट MZBs शुद्धता के लिए जांच करने के लिए दाग ।
    1. 10% मात्रा (5 µ एल) एफसी ब्लॉक के ५० µ एल में १०,००० कोशिकाओं को जोड़ें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । कक्ष बफ़र के ५० µ l जोड़ें ०.३ µ l प्रत्येक के B220-FITC (०.१५ µ g), CD21-PE (०.०६ µ g), और CD23-APC (०.०६ µ g) की कुल मात्रा में १०५ µ l (प्रत्येक एंटीबॉडी पतला 1:350) , या फुफ्फुसीय बी कोशिकाओं और MZBs. दाग के बीच भेद के लिए fluorophores के किसी भी अन्य संयोजन 15 मिनट के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं.
    2. सेल बफर के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार सना हुआ कोशिकाओं को धो लें । 5 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । सेल बफर के ३०० µ एल में resuspend और एक प्रवाह cytometer और मानक तरीकों का उपयोग कर नमूने प्राप्त । लाइव लिम्फोसाइटों पर गेट, फिर B220+ कोशिकाओं पर, और अंत में CD23कम CD21उच्च कोशिकाओं पर (आंकड़ा 1b).
      नोट: प्रक्रिया आम तौर पर एक C57B/6 माउस से तिल्ली प्रति ५००,००० MZBs पैदावार ।
  5. प्रवाह माइग्रेशन के लिए MZBs तैयार करें ।
    1. धो शुद्ध MZBs एक बार में 1 – 2 शीत प्रवास बफर की मिलीलीटर [हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) युक्त cations, 10 मिमी Hepes, ०.२% फैटी एसिड मुक्त BSA] सुनिश्चित करने के लिए कि कटियन-युक्त प्रवास बफर अवशिष्ट कटियन-मुक्त पंजाबियों बफर द्वारा पतला नहीं है । 10 मिनट के लिए ३०० x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक और supernatant त्यागें । MZBs शीत प्रवास बफर में 30 µ एल प्रति ५०,००० MZBs की एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित (एक अच्छी तरह से एक प्रवाह चैंबर स्लाइड के एक में भरी हुई राशि के बराबर) ।
      नोट: हौसले से पृथक MZBs का उपयोग यथासंभव शीघ्र किया जाना चाहिए । हालांकि, वे अभी भी जब तक वे बर्फ पर रखा जाता है के लिए प्रयोग की शुरुआत के बाद 8 घंटे या उससे अधिक के लिए पलायन करने में सक्षम हैं । इष्टतम तापमान अंय सेल प्रकार के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, जब माइग्रेशन प्रारंभ होने तक ३७ ° c पर कल्चर्ड टी कोशिकाओं को रखना बेहतर हो सकता है ।

2. प्रवाह प्रयोग

  1. कोट integrin ligand के साथ स्लाइड ।
    1. प्रयोग के पहले दिन, गल िकैम-1 (४०० µ g/एमएल) के एक aliquot । 1:80 का एक पहलू से िकैम-1 पतला पंजाब में 5 µ g/एमएल के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । हर माइग्रेशन मूवी की आवश्यकता के लिए प्रवाह स्लाइड पर िकैम-1 से एक कक्ष में 30 µ l जोड़ें । रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड की मशीन ।
      नोट: प्रत्येक स्लाइड में 6 चैंबर होते हैं और एक सत्र में 8 फिल्में आसानी से रिकॉर्ड की जा सकती हैं.
  2. लेपित कुओं को रोकेंगे ।
    1. प्रयोग के दिन, एक अच्छी तरह से और चैंबर के दूसरे चहेतों से १०० µ एल को वापस लेने के लिए पंजाब के १०० µ एल जोड़कर चैंबर धोने । जोड़ें १०० µ अवरुद्ध बफर के एल (2% फैटी एसिड-पंजाब में मुक्त BSA) एक चैंबर के लिए और आरटी पर १.५ एच के लिए एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड मशीन ।
    2. एक अच्छी तरह से पंजाब के १०० µ एल जोड़कर चैंबर धो, यह दूसरे से अच्छी तरह से वापस लेने, तो चैंबर के लिए माइग्रेशन बफर के १०० µ एल जोड़ने. प्रयोग के समय तक आरटी पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड की दुकान ।
  3. fluidics यूनिट तैयार करें ।
    1. एक द्रव पंप में प्लग, fluidics इकाई देते हैं, और पंप सॉफ्टवेयर पर बारी । एक बार टयूबिंग धो 5 के साथ-10 माइग्रेशन बफर के मिलीलीटर, तो माइग्रेशन बफर के ११.७ मिलीलीटर समान रूप से दोनों जलाशयों को जोड़ने और हवा के बुलबुले को हटा दें ।
    2. संबंधक टुकड़ा से 10 सेमी के बारे में टयूबिंग दबाना । माइक्रोस्कोप पर गरम मशीन कक्ष में द्रवित इकाई रखें ।
    3. "µ-स्लाइड VI ०.४" और सॉफ्टवेयर में "सफेद" करने के लिए टयूबिंग के लिए स्लाइड विकल्प सेट करें । वांछित कतरनी तनाव सेट (जैसे, 4 dyn cm-2) । 30 मिनट के लिए इमेजिंग का समय निर्धारित करें ।
    4. मिलीलीटर में टयूबिंग के माध्यम से प्रवाह की दर निर्धारित करके टयूबिंग अंशांकन कारक सेट/दूसरे के एक जलाशय से प्रवाह करने के लिए बफर के 2 मिलीलीटर के लिए आवश्यक समय को मापने और 2 से विभाजित । सटीकता के लिए न्यूनतम 4 माप करें । वास्तविक प्रवाह की दर का उपयोग करने के लिए वांछित प्रवाह दर और कतरनी तनाव सेट पंप सॉफ्टवेयर में मूल्यों में प्रवेश करके ।
  4. इमेजिंग सिस्टम तैयार करें ।
    1. पूर्व गर्म माइक्रोस्कोप मशीन चैंबर, fluidics इकाई, और माइग्रेशन बफर ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा बी) के लिए aliquots । यह सुनिश्चित करना कि प्रवास बफर जलाशयों में आगे और पीछे बहती है और है कि वहां कोई हवा में बुलबुले है द्वारा द्रव पंप परीक्षण प्रणाली ।
  5. स्लाइड पर कक्षों को लोड करना ।
    1. एक इथेनॉल-भीगा ऊतक के साथ स्लाइड के नीचे साफ । चैंबर के एक कुआं में सेल सस्पेंशन के 30 µ एल जोड़ें और दूसरी अच्छी तरह से 30 µ l को वापस ले । पर एक आवरण के साथ स्लाइड मशीन 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर वाष्पीकरण को रोकने के लिए कोशिकाओं संलग्न करने की अनुमति दें ।
    2. धीरे से एक सकारात्मक meniscus के बाहर अच्छी तरह से उगता है और पिपेट टिप के साथ किसी भी हवा में बुलबुले को दूर जब तक प्रवाह चैंबर स्लाइड के प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व गर्म प्रवास बफर जोड़ें ।
  6. स्लाइड को fluidics इकाई में अनुलग्न करें ।
    1. माइक्रोस्कोप चरण के लिए स्लाइड दबाना । कनेक्टर टुकड़ा से द्रव ट्यूबिंग के अचिह्नित पक्ष निकालें और हवा के बुलबुले के बिना एक सकारात्मक meniscus अंत से बाहर उगता है जब तक माइग्रेशन बफर के साथ अंत को भरने ।
    2. पर ट्यूबिंग के अंत फ्लिप और यह प्रवाह चैंबर के ऊपर अच्छी तरह से डालने के लिए, एक ऊतक के साथ गिरा बफर mopping । जबकि टयूबिंग clamped रखते हुए, टयूबिंग के रूप में चिह्नित अंत के लिए प्रक्रिया को दोहराने ।
  7. छवि कोशिकाओं ।
    1. इमेजिंग प्रणाली को "लाइव" पर स्विच करने के लिए कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित सेट । दृश्य के किसी फ़ील्ड का चयन करें जो स्लाइड के मध्य में है । De-कोशिकाओं को थोड़ा ध्यान केंद्रित करने के लिए सेल की काली रूपरेखा बढ़ाने के लिए और एक सफेद इंटीरियर, जो एक सफेद पृष्ठभूमि पर एक स्वचालित ट्रैकिंग कार्यक्रम के साथ प्रयोग के लिए एक गोल काले सेल आकार के लिए सीमा हो सकती है उपज ।
    2. इमेजिंग अनुक्रम कार्यक्रम और रिकॉर्ड 1 छवि हर 5 30 मिनट के लिए 10x शुष्क उद्देश्य का उपयोग कर शुरू करते हैं । टयूबिंग से दबाना निकालें और पर पंप बारी है, तो गैर अनुयाई कोशिकाओं को धोना होगा और अनुयाई कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए शुरू हो जाएगा । 30 मिनट या अब एक 10x उद्देश्य या उच्च का उपयोग कर के लिए छवि, के रूप में वांछित । चलचित्र को लेबल करें और सहेजें ।
  8. द्रवित इकाई को स्लाइड से अलग कर ᱶ ।
    1. इमेजिंग कार्यक्रम के अंत में, अगले प्रयोग के लिए पंप रीसेट: फिर से ट्यूबिंग को दबाना, स्लाइड से टयूबिंग हटाने, पुनः कनेक्टर टुकड़ा संलग्न, दबाना खुला है, और पंप के मैनुअल नियंत्रण का उपयोग करने के लिए एक reserv से बफर के कई मिलीलीटर धक्का हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए दूसरे को oir । फिर से दबाना और अगली फिल्म के लिए माइक्रोस्कोप मंच पर clamped टयूबिंग करना ।
      नोट: प्रोटोकॉल को अनिश्चितकाल के लिए यहां रोका जा सकता है । यदि कक्ष माइग्रेशन के किसी अवरोधक या संशोधक का उपयोग, इसके क्रिया मोड के आधार पर, तो माइग्रेशन कक्ष में बसने से पहले या द्रवित इकाई में माइग्रेशन बफ़र के लिए उसे या तो कक्ष निलंबन में जोड़ें ।

3. प्रवासन ट्रैक विश्लेषण

नोट: कोशिकाओं को स्वचालित रूप से MTrack2 प्लगइन का उपयोग कर या हाथ से ट्रैक किया जा सकता है मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन17का उपयोग कर । स्वचालित ट्रैकिंग MZBs के साथ अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि इन कोशिकाओं को मुख्य रूप से गोल कर रहे हैं और इस तरह रहते हैं, जबकि पलायन, यह एक सफेद पृष्ठभूमि पर काली वस्तुओं के लिए कोशिकाओं की छवि दहलीज के लिए आसान बना रही है. स्वचालित ट्रैकिंग अधिक कठिन होती है यदि अन्य कक्ष प्रकार उपयोग किए जाते हैं, जैसे कि cultureed, सक्रिय सीडी 8 + T कक्ष, क्योंकि ये कोशिकाएँ माइग्रेशन के दौरान बाहर निकलती हैं और कुछ हद तक पारदर्शी हो जाती हैं, जिससे किनारों को परिभाषित करना कठिन हो जाता है. इस मामले में, या तो (1) कोशिकाओं को एक इंट्रा-महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट डाई छवियों है कि एक सफेद पृष्ठभूमि, या (2) अंय कार्यक्रमों के लिए इस तरह के रूप में कोशिकाओं की रूपरेखा के लिए सीमा हो सकती है उत्पादन के साथ दाग हो सकता है छवि विभाजन और/ इस्तेमाल किया. मैनुअल ट्रैकिंग एक उपयोगी विकल्प है जब सेल रूपरेखा के एक उच्च विपरीत छवि का निर्माण संभव नहीं है ।

  1. प्लगइन का उपयोग कर मैनुअल ट्रैकिंग करते हैं ।
    1. ImageJ में "मैनुअल ट्रैकिंग" प्लगइन स्थापित करें और ImageJ में फिल्म खोलें । "मैन्युअल ट्रैकिंग" मेनू के अंतर्गत, "नया ट्रैक जोड़ें" चुनें. किसी कक्ष के केंद्र के रूप में चलचित्र अग्रिम स्वचालित रूप से फ़्रेम-दर-फ़्रेम क्लिक करें । जब कक्ष को प्रत्येक फ़्रेम में चयनित किया गया हो, तो नए कक्ष का अनुसरण करना प्रारंभ करने के लिए "नया ट्रैक जोड़ें" का चयन करें.
    2. पटरियों रिकॉर्ड किया गया है के बाद, एक डेटा स्प्रेडशीट में उत्पादन परिणामों की प्रतिलिपि. दशमलव के बाद सभी स्प्रेडशीट कक्षों के लिए शूंय स्थानों के लिए दशमलव प्रदर्शन के लिए स्वरूप परिवर्तित करें । बाद में विश्लेषण के लिए एक "टैब स्टॉप-सेपरेटेड". txt फ़ाइल के रूप में फ़ाइल सहेजें ।
      नोट: आमतौर पर, 50-100 कोशिकाओं को ट्रैक कर रहे हैं, जो लगभग २४० फ्रेम के एक 20 मिनट की फिल्म के लिए पूरा करने के बारे में 1 ज लेता है ।
  2. MTrack2 प्लगइन का उपयोग कर स्वत: ट्रैकिंग प्रदर्शन । डाउनलोड करें और फ़ाइल में निर्देशों के अनुसार MTrack2 टी. ए. प्लगइन स्थापित करें (पूरक कोडिंग फ़ाइल देखें) ।
    1. कक्ष माइग्रेशन चलचित्र से छवियां थ्रेशोल्ड । ImageJ में छवि स्टैक खोलें । प्रक्रिया ImageJ में छवियों को रंग से उच्च कंट्रास्ट छवियों को एक सफेद पृष्ठभूमि (3ए) पर काली वस्तुओं के रूप में दिखा कोशिकाओं को बदलने के लिए ।
      1. छवियों despeckle दो बार, छवियों पैनापन, और 8 बिट करने के लिए छवियों को परिवर्तित. चुनें "छवि । चमक/कंट्रास्ट समायोजित करें "उप-मेनू और कंट्रास्ट स्लाइडर को अधिकतम कंट्रास्ट पर रखें, फिर कक्ष सफ़ेद ऑब्जेक्ट्स के रूप में एक काली पृष्ठभूमि पर प्रकट होंगे । चुनें "छवि । यह सुनिश्चित करने के लिए थ्रेशोल्ड "उप-मेनू समायोजित करें कि कक्ष सफ़ेद पृष्ठभूमि पर काले ऑब्जेक्ट्स के रूप में दिखाई देते हैं.
    2. भागो स्वत: सेल ट्रैकिंग प्लगइन "MTrack2 टी सी" ( पूरक कोडिंग फ़ाइलदेखें) । विकल्प स्क्रीन पर निम्न पैरामीटर्स सेट करें ।
      1. MZBs के लिए 30 पिक्सेल पर 1 पिक्सेल और कण आकार अधिकतम पर ंयूनतम कण आकार सेट करें ।
      2. वेग के लिए (फिल्म की लगातार फ्रेम पर 2 कणों के बीच अधिकतम दूरी), यदि स्लाइड पर सेल घनत्व उच्च है, इस मूल्य कम सेट करने के लिए ट्रैक "कूद" एक सेल से दूसरे करने के लिए होने से बचने के लिए । MZBs के लिए, outliers कैप्चर करने के लिए 10 पिक्सेल पर यह मान सेट करें, हालांकि MZBs सामांयत: 5 s के अलावा क्रमिक फ़्रेम पर 2 पिक्सेल से अधिक नहीं होगा ।
      3. किसी कण को ट्रैक किए जाने के लिए मौजूद होने के लिए फ़्रेम की ंयूनतम संख्या के लिए, MZBs (उदा., २४०) के लिए चलचित्र में फ़्रेंस की संख्या पर यह मान सेट करें 12 फ़्रेम/ हालांकि, यदि कक्ष इमेजिंग के अंत से पहले दृश्य के फ़ील्ड को छोड़ने के लिए पर्याप्त तेज होते हैं, तो चलचित्र की अवधि से कम पर फ़्रेम की ंयूनतम संख्या सेट करें । उदाहरण के लिए, तेज़-गतिमान T कक्षों के साथ, न्यूनतम संख्या को इमेजिंग के 5-10 min के समतुल्य पर सेट करें.
        नोट: प्रक्रिया के इस भाग को स्वचालित करने के लिए इन चरणों (थ्रेशोल्ड और MTrack2-टी) के एक मैक्रो रिकॉर्ड और समय बचाने के लिए ( पूरक कोडिंग फ़ाइलदेखें). ImageJ में किसी चलचित्र को स्वचालित रूप से ट्रैक करने के लिए मैक्रो का उपयोग करना एक मिनट से कम लेता है ।
    3. एक डेटा स्प्रेडशीट में आउटपुट परिणामों की प्रतिलिपि बनाएं । दशमलव के बाद सभी स्प्रेडशीट कक्षों के लिए शूंय स्थानों के लिए दशमलव प्रदर्शन के लिए स्वरूप परिवर्तित करें । स्प्रेडशीट में कक्ष ट्रैक के शीर्ष पर एक रिक्त पंक्ति जोड़ें और "D" स्तंभ हटाएँ. Ibidi Chemotaxis उपकरण में अनुवर्ती विश्लेषण के लिए एक "टैब स्टॉप-सेपरेटेड". txt फ़ाइल के रूप में फ़ाइल सहेजें ।
      नोट: MTrack2 प्लगइन ७५ समानांतर कॉलम की पंक्तियों में सेल पटरियों outputs । Ibidi chemotaxis उपकरण में विश्लेषण के लिए, कक्ष ट्रैक्स किसी एकल स्तंभ में होना चाहिए । आउटपुट परिवर्तित करने के लिए, MTrack2 प्लगइन उत्पादन के लिए या तो मूल प्रारूप में या एक कॉलम (चित्र बी) के रूप में संशोधित किया गया था ( पूरक कोडिंग फ़ाइल देखें "MTrack2 टी", जो जावा में लिखा है) । ImageJ प्लगइंस फ़ोल्डर के लिए. java फ़ाइल की प्रतिलिपि बनाएं । ImageJ में, "प्लगइंस > संकलित करें और चलाएं" चुनें । ImageJ पुनरारंभ करें, और MTrack2 का संशोधित संस्करण प्लगइंस मेनू में प्रकट होना चाहिए ।
  3. Ibidi Chemotaxis उपकरण के साथ सेल पटरियों का विश्लेषण करने के लिए, Ibidi Chemotaxis और माइग्रेशन उपकरण v 2.0 ("अकेले खड़े हो जाओ") डाउनलोड करें और प्रोग्राम खोलें ।
    1. "आयात डेटा" चुनें और. txt सेल ट्रैक फ़ाइलों पर नेविगेट करें. एक ही समय में एकाधिक फ़ाइलों का चयन किया जा सकता है । आयातित फ़ाइलें लाल रंग में "datasets" फलक में दिखाई देते हैं । उन सभी का चयन करें और निंन सेटिंग्स लागू करने के लिए नीचे "Initialisation" मेनू में सही मान दर्ज करें ।
    2. या तो सही संख्या या स्लाइस की संख्या की एक सीमा (फिल्म में फ्रेम की संख्या) दर्ज करें ।
    3. अंशांकन मेनू (X/Y अंशांकन) में, पिक्सेल का आकार दर्ज करें । चलचित्र के गुण फ़ाइल में यह जानकारी ढूंढें । MZBs के लिए, एक 10x उद्देश्य इस्तेमाल किया गया था, १.१४ µm के एक पिक्सेल आकार दे रही है । में "अंशांकन मेनू । समय अंतराल ", फिल्म में फ्रेम के बीच समय की लंबाई दर्ज करें ।
    4. सेटिंग्स लागू करें । ट्रैक भूखंडों को देखने के लिए "भूखंड डेटा" का चयन करें और ट्रैक फ़ाइलें खुल जाएगा कि पुष्टि. इस बिंदु से, कई विकल्प उपलब्ध है जो कार्यक्रम के लिए प्रलेखन में वर्णित हैं, विभिंन गुणों के आधार पर विभिंन रंगों के साथ पटरियों अंकन और वेग के लिए व्यक्तिगत या औसत मूल्यों को प्रदर्शित करने सहित, आगे प्रवास सूचकांक, निर्देशन, और अधिक (चित्र बी) ।
      नोट: MZBs के बारे में 10 मिनट लेने के लिए पता लगाने और प्रवाह का जवाब है, संभवतः प्रवाह के लिए अपने integrin परिसरों ध्रुवीकरण द्वारा सेल के आगे बिंदु । समय के साथ माइग्रेशन अनुक्रमणिका का ग्राफ़ एक आरंभिक ड्रॉप शून्य से नीचे दिखाई देगा, जो कि कक्ष को प्रवाह के लिए दिखाया जाता है, जिसके बाद आगे माइग्रेशन अनुक्रमणिका मान सकारात्मक होने तक क्रमिक रूप से ऊपर की ओर बढ़ते हैं. इस प्रकार, यह अंतिम गणना में पहले मिनट के बाहर करने के लिए इष्टतम हो सकता है, जब तक यह प्रक्रिया ब्याज की है ।

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Representative Results

हम ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया िकैम पर MZBs के प्रवास की तुलना-1-प्रवाह के बिना लेपित स्लाइड (0 dyn/सेमी2) और कतरनी प्रवाह को उजागर (4dyn/ कक्ष स्वचालित रूप से MTrack2 के साथ ट्रैक किए गए थे, और जिसके परिणामस्वरूप ट्रैक फ़ाइलें नहीं प्रवाह (0 dyn/cm2) और (4 dyn/cm2) के सेल माइग्रेशन फिल्मों पर मढ़ा गया था और पटरियों के वितरण और आकार (चित्र 4a) को दिखाने के लिए । सेल पटरियों तो Ibidi Chemotaxis उपकरण (आईसीटी) में आयात के लिए प्रत्येक फिल्म (चित्रा 4B) के ट्रैक भूखंडों उत्पंन किया गया । औसत प्रवास सूचकांक (कहा जाता है "FMIy" आईसीटी में), वेग, सीधे (बुलाया "प्रत्यक्षता" आईसीटी में), और सीधे लाइन दूरी (कहा जाता है "इयूक्लिडियन दूरी" आईसीटी में) 4 फिल्मों से सेल पटरियों की दोनों स्थितियों के लिए प्रत्येक में गणना की गई Chemotaxis "मापा मान" आदेश का उपयोग कर उपकरण । इन औसत मूल्यों तो रेखांकन पैदा करने और सांख्यिकीय महत्व (चित्र 4c) की गणना के लिए GraphPad चश्मे में नकल की गई ।

Figure 1
चित्रा 1: MZB गढ़शंकर । (क) MZB गढ़शंकर के सीमांत क्षेत्र और तिल्ली में कूप के बीच मॉडल. MZBs S1PR1 के internalization की आवश्यकता होती है, S1P के लिए एक रिसेप्टर, और कार्यात्मक CXCR5, CXCL13 chemokine के लिए एक रिसेप्टर, कूप में प्रवेश करने के लिए. इसके अतिरिक्त, कूप तक पहुंचने के लिए, MZBs रक्त सीमांत साइनस कि कूप ढंक में pores से उत्पंन प्रवाह के बल के खिलाफ विस्थापित करना चाहिए । यदि एक MZB िकैम-1 के लिए आसंजन खो देता है, एलएफए-1 integrin के लिए ligand, यह प्रवाह के बल द्वारा लाल लुगदी में धकेल दिया है, जहां VCAM-1 की वृद्धि हुई मात्रा, ligand-4 के लिए VLA, माइग्रेशन का समर्थन नहीं होता । (ख) B220, CD23, और CD21 के विरुद्ध एंटीबॉडी का प्रयोग करते हुए क्रमबद्ध MZBs की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए cytometry गेटिंग कार्यनीति का प्रवाह. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: fluidics प्रणाली, पंप, माइक्रोस्कोप, और मशीन चैंबर का सेटअप । (एक) पंप प्रणाली की छवि (Ibidi18) जुड़े fluidics इकाई और लैपटॉप के साथ एक पंप से मिलकर पंप नियंत्रण सॉफ्टवेयर चल रहा है । उच्च आवर्धन छवि: 6 प्रवाह कक्षों के साथ फ्लो चैंबर स्लाइड, पहले जिनमें से fluidics इकाई की टयूबिंग से जुड़ा है । (ख) इन विट्रो प्रवास MZBs प्रवाह के खिलाफ में मापने के लिए ठेठ सेटअप । एक एक हीटिंग चैंबर के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप (ब्लैक बॉक्स) fluidics इकाई युक्त एक पंप से जुड़ा (माइक्रोस्कोप के निचले सही करने के लिए नीला वर्ग वस्तु) माइक्रोस्कोप के बाहर. उच्च आवर्धन छवि: माइक्रोस्कोप हीटिंग चैंबर के अंदर fluidics इकाई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: इमेजिंग डेटा का ठहराव । (एक) से पहले MZBs पलायन की एक फिल्म से एक फ्रेम के प्रतिनिधि छवियां (बाएं) और उसके बाद (दाएं) एक सफेद पृष्ठभूमि पर काले वस्तुओं के लिए कोशिकाओं को बदलने के लिए छवि थ्रेसहोल्ड । दोनों कम और उच्च आवर्धन छवियों में स्केल सलाखों = १०० µm. (ख) बाएँ पैनल: MTrack2 (एकल स्तंभ उत्पादन) प्लगइन से ठेठ परिणाम उत्पादन की छवि. दायां फलक: Ibidi Chemotaxis और माइग्रेशन २.० उपकरण की छवि MTrack2 परिणामों के इनपुट के बाद MZBs माइग्रेट करने का एक ट्रैक प्लॉट दिखाती है और एक "मापा मान" प्रदर्शन विंडो वेग, माइग्रेशन अनुक्रमणिका, और direction सहित पैरामीटर्स का औसत दिखाती है ( हरे बक्से), दूसरों के बीच में । अंशांकन की गई सेटिंग्स में पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन १.१४ µm प्रति पिक्सेल और चलचित्र फ़्रेम के प्रति 5 s (०.०८३ min) का समय अंतराल शामिल होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: MZB गढ़शंकर को मापने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग कर परिणामों का उदाहरण । (एक) ImageJ प्लगइन "MTrack2 के टी सी से पटरियों के एक ओवरले के साथ MZBs पलायन के प्रतिनिधि अब भी" । नोट: ट्रैक रंग मनमाने ढंग से ImageJ के लिए "मैनुअल ट्रैकिंग" प्लगइन द्वारा निर्धारित किया गया । दोनों कम और उच्च आवर्धन presets में स्केल सलाखों = १०० µm. (ख) Ibidi Chemotaxis और प्रवासन २.० उपकरण से पलायन MZBs के प्रतिनिधि ट्रैक भूखंडों । लाल रेखाएं और काली रेखाएं कक्ष ट्रैक्स का प्रतिनिधित्व करती है जो क्रमश: क्षैतिज अक्ष के नीचे या ऊपर समाप्त होते हैं । में (क) और (ख): वाम, MZBs कोई प्रवाह के साथ पलायन (0 dyn/ ठीक है, एक 4 dyn/सेमी2 प्रवाह के लिए पलायन MZBs । (ग) प्रवासन सूचकांक (FMIy), वेग, सीधीता (direction), और कोई प्रवाह के साथ पलायन MZBs के लिए दूरी (0 dyn/cm2) या प्रवाह (4 dyn/cm2) (n = 4 चूहों 4 अलग प्रयोगों में) । त्रुटि बार्स = ± एसडी मतलब; छात्र का t परीक्षण, * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 1: MTrack2_kt. जावा. कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।  

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Discussion

हम यहां कोशिकाओं के प्रवास का विश्लेषण है कि कतरनी प्रवाह के बल का पता लगाने और उनके प्रवास फेरबदल द्वारा प्रतिक्रिया के लिए एक विधि का वर्णन । MZBs के एक विश्लेषण से पता चला है कि MZBs िकैम पर सहज प्रवास-1 और प्रवाह की उपस्थिति में, ऊपर की ओर पलायन करेंगे । हमारे पिछले काम में, हमने दिखाया है कि MZBs ऊपर VCAM-1 पर प्रवाह को स्थानांतरित नहीं करते हैं, लेकिन जगह में तय रहने के बजाय । murine प्लीहा सीमांत क्षेत्र में मुख्यतः िकैम-१ है, जबकि लाल लुगदी में िकैम-१ और VCAM-१ दोनों शामिल हैं. इन आंकड़ों से, यह आस्थगित किया जा सकता है कि MZBs प्रवाह जबकि सीमांत क्षेत्र में नहीं बल्कि लाल लुगदी में विस्थापित होगा । विश्लेषण vivo में मान्य किया गया था MZBs का उपयोग कर दोषपूर्ण आसंजन कि प्लीहा लाल लुगदी को स्थानीय प्रवाह12के बल द्वारा किया गया । इन कारणों के लिए, MZBs यहां वर्णित प्रवाह प्रवास प्रणाली के परीक्षण के लिए एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं, भले ही सिस्टम के लिए एक अलग सेल प्रकार का अध्ययन किया जाता है ।

प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलू स्लाइड पर कक्ष हैंडलिंग में एकरूपता सुनिश्चित करना है । क्योंकि सेल प्रवास के quantifiable पहलुओं की डिग्री है जो करने के लिए कोशिकाओं स्लाइड का पालन पर निर्भर करता है, सेलुलर आसंजन के किसी भी कमी reproducible परिणाम मुश्किल बना होगा । घटी हुई सेलुलर आसंजन कई कारकों में विसंगति से परिणाम सकता है, प्रवास बफर के तापमान या गर्म मशीन बॉक्स (ठंड आसंजन कम कर देता है सहित), सेल निलंबन में cations के स्तर (cations integrin बाइंडिंग को प्रभावित), स्लाइड हैंडलिंग (टेप या स्लाइड ठोके कोशिकाओं को उखाड़ कर सकते हैं), और कोशिका घनत्व (कोशिकाओं के बीच टकराव माइग्रेशन मापदंडों को प्रभावित कर सकता). प्रक्रिया के दौरान अंय संवेदनशील बिंदुओं को बहुत बल के साथ स्लाइड कुओं में बफर नहीं pipetting शामिल टयूबिंग संलग्न करने से पहले (के रूप में यह सेल आसंजन को कम कर सकता है) और प्रोटोकॉल हर प्रयोग में लगातार कदम के लिए आवश्यक समय रखने ( सेल निपटाने के समय आसंजन को प्रभावित कर सकता है) । संक्षेप में, सेल आसंजन पर किसी भी संभावित प्रभाव को पुनरावृत्ति भर में लगातार विश्वसनीय सेल माइग्रेशन डेटा का उत्पादन करने के लिए रखा जाना चाहिए ।

यह विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों और आपूर्ति और चरणों में से कोई भी उन्नत अनुदेश की आवश्यकता का उपयोग करता है के बाद से स्थापित करने के लिए आसान है । MZB के विश्लेषण के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में अंय प्रकार के रूप में प्रसंस्कृत सीडी 8+ टी कोशिकाओं, कोटिंग विभिन्न integrin लाइगैंडों के साथ स्लाइड प्रवाह ऊपर प्रवास का पालन करने के लिए पर्याप्त है । विभिंन integrin लाइगैंडों के लिए प्रवाह प्रेरित प्रवासन प्रतिक्रिया का अध्ययन सेल की सतह पर सक्रिय integrins की प्रत्यक्ष पहचान की ओर जाता है, संभवतः के रूप में vivo में कार्य करने के लिए प्रासंगिक तंत्र का खुलासा MZB प्रवास पर प्रवाह िकैम-1 नहीं बल्कि VCAM-1 । हालांकि, यह भी प्रवाह कक्षों के लिए एक endothelial सेल परत जोड़ने के लिए संभव है । एक उदाहरण के प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन कि कतरनी प्रवाह से प्रभावित है टी सेल extravasation endothelial परतों के माध्यम से3है । यह प्रक्रिया integrins, selectins, और chemokines के माध्यम से टी सेल आसंजन के सक्रियण को खंडित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और रक्त मस्तिष्क बाधा के माध्यम से मॉडल लिम्फोसाइट प्रवास के लिए । कोशिकाओं है कि इस विधि के साथ विश्लेषण किया जा सकता है केवल सीमा है कि वे एक दिशात्मक संकेत के रूप में प्रवाह के बल भावना करने में सक्षम होना चाहिए ।

हालांकि यहां उल्लिखित विधि वेग और मोड़ के रूप में सेलुलर व्यवहार की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है, यह भी प्रवास के आणविक पहलुओं के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है । एलएफए-1 और उनके cytoskeletal एडेप्टर के रूप में integrins सहित प्रवाह प्रेरित प्रवास के लिए प्रासंगिक आणविक परिसरों, स्लाइड की सतह के २०० एनएम के भीतर स्थित हो जाएगा, TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ दृश्य के लिए उत्तरदायी. विधि के लिए यह अतिरिक्त integrin में उत्परिवर्तनों के साथ चूहों से कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए आदर्श होगा-या cytoskeleton-संबंधित प्रोटीन । के रूप में कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं को रक्त या लसीका प्रवाह के माध्यम से अपने विकास में विभिंन चरणों में विस्थापित, इन विट्रो में प्रवास के लिए योजनाबद्ध या प्राथमिक ल्यूकोसाइट्स के प्रवाह और पता चलता है कि कैसे कोशिकाओं रहे है के लिए कई प्रकार के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णित vivo में एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में माइग्रेट करने के लिए क्रमादेशित । अंत में, परख यहां वर्णित प्रवाह का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय और सरल विधि प्रदान करता है-प्रेरित MZBs के प्रवास है कि अंय प्रकार के सेल को भी बढ़ाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

यह काम "ड्यूश Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 से K.-D.F से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४१ बी कोशिकाओं सीमांत क्षेत्र प्रवास कतरनी प्रवाह integrins आसंजन सेलुलर आसंजन अणु-1 (िकैम-1) संवहनी कोशिका आसंजन अणु-1 (VCAM-1)
Murine सीमांत क्षेत्र बी कोशिकाओं के कतरनी प्रवाह प्रेरित प्रवासन का विश्लेषण इन विट्रो में
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Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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