Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكولات للتحليل والتصور للهيكل والدستور لجسم كله مبدع. وهذا ينطوي على الحصول على تسلسل واسعة لاستخدام الجيل التالي تسلسل الحمض النووي الريبي جسم.
Abstract
التكيف الهائلة مستضد الاعتراف بالأجسام المضادة هو الأساس لنظام المناعة المكتسبة. على الرغم من فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء إنتاج مرجع الشاسعة من الأجسام المضادة بالمناعة المكتسبة، لم ممكن للتوصل إلى رؤية عالمية لمرجع جسم كاملة. على وجه الخصوص، تعتبر الخلية بمبدع كمربع الأسود بسبب عددها الفلكية من جسم الحيوانات المستنسخة. ومع ذلك، تمكن تقنيات الجيل التالي تسلسل اختراقات لزيادة فهمنا لمرجع الخلية ب. وفي هذا التقرير، يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل الماوس الفردية كاملة ومبدع جسم الإنسان. من أجهزة المناعة، بالإسم من الطحال في الفئران وخلايا الدم المحيطية وحيدات النوى في البشر، ومجموع الجيش الملكي النيبالي كان مستعدا، عكس نسخها، والتوسع في استخدام أسلوب 5 '--سباق. استخدام تمهيدي إلى الأمام عالمي والعقاقير كبسولة تفجير للمجالات جسم ثابت فئة معينة، تم تضخيم مرناس جسم موحد بنسب تعكس تلك الترددات في جسم السكان. كانت متسلسلة أمبليكونس من الجيل التالي التسلسل (خ ع)، مما أسفر عن أكثر من 10 تسلسلات جسم5 كل عينة المناعية. يصف لنا البروتوكولات لتحاليل تسلسل جسم بما في ذلك الشرح الخامس (د) ي-جين-الجزء، عرضاً بديعا لمرجع الأجسام المضادة، ولدينا طرق حسابية.
Introduction
نظام الأجسام المضادة واحد من المبادئ الأساسية لنظام المناعة المكتسبة. أنها قوية للغاية ضد غزو الجراثيم بسبب تنوعها واسعة، مستضد غرامة الاعتراف بخصوصية، والتوسع في الاستنساخ من خلايا ب حدة مستضد. مرجع الخلايا المنتجة للأجسام المضادة ب يقدر بأكثر من 1015 في كل واحدة1. يتم إنشاء هذا التنوع الهائل بمساعدة فدج المورثات جزئ في المكاني الوراثي الغلوبولين المناعي2. وصف مبدع بالخليه بأكملها وعلى التغيرات الدينامية في الاستجابة للتحصين مستضد فصعبة ولكن ضرورية لفهم كامل لاستجابة الأجسام المضادة ضد غزو العوامل الممرضة.
بسبب تنوعها الفلكية، تعتبر الخلية بمبدع كمربع الأسود؛ ومع ذلك، قد مكن ظهور التكنولوجيا خ ع اختراقات لفهم أفضل لما تعقد3،4. مبدع جسم كله قد تم بنجاح تحليلها، أولاً في الزرد5، ثم من الفئران،6، والبشر6،7. على الرغم من أن خ ع أصبحت الآن أداة قوية في دراسة الاستجابة المناعية التكيفية، تفتقر إلى التحليلات الأساسية لأوجه التشابه والاختلاف في جسم مبدع بين الحيوانات الفردية.
في الفئران، أفيد بأن مبدع IgM تكاد تكون متطابقة بين الأفراد، بينما IgG1 و IgG2c تختلف اختلافاً كبيرا بين الأفراد8. بالإضافة إلى استخدام الجين الخامس الشخصية، تواتر فدج-الشخصية في السذاجة الطرفية ب خلايا الملاحظة متشابهة جداً بين الأفراد8. تحليل سلاسل الأحماض الأمينية فدج-المنطقة كما أظهرت حدوث نفس تسلسل هالة في الفئران مختلفة أكثر بكثير مما سبق الفكر8في كثير من الأحيان. تشير هذه النتائج إلى أن الآليات اللازمة لتشكيل جسم مرجع يمكن أن تكون قطعية بدلاً من العشوائية5،،من89. عملية التنمية مرجع الأجسام المضادة في الفئران قد أيضا تم بنجاح تحليل استخدام خ ع لزيادة تسليط الضوء على إمكانات خ ع للكشف عن الأجسام المضادة المناعي في التفصيل10.
في هذا التقرير، يصف لنا طريقة بسيطة وفعالة لتصور وتحليل جسم مرجع ممارسات مجلس الأمن على الصعيد عالمي.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، وبناء على موافقة لجنة الاستخدام الوطني المعهد للمعدية الأمراض الحيوانية الرعاية و. وتم الحصول على عينات ببمكس من المتطوعين البالغين صحية، كنتيجة الممثل في هذا التقرير، كان يؤديها بموافقة "لجنة الأخلاقيات" للمعهد الوطني للأمراض المعدية، طوكيو، اليابان، وكتب الموافقة المستنيرة من كل مشارك باستخدام نموذج الموافقة على لجنة أخلاقيات.
1-التمهيدي التصميم
- تصميم تمهيدي إلى الأمام عالمي لكدنا لتضخيم الغلوبولين المناعي مرناً دون تحيز من PCR الإشعال، كما تستخدم في 5 '--سباق11،12 والتقنيات الذكية-بكر13 .
- للتضخيم مورثة VH الغلوبولين المناعي، تصميم التسلسل فئة معينة الغلوبولين المناعي في المنطقة مستمرة ككبسولة تفجير عكس8،14 (الشكل 1A).
ملاحظة: يمكن إضافة تسلسلات علامة متعدد لأي من هذه كبسولة تفجير لتسمية الجزيئات المكتبة من مصادر مختلفة من عينة. يمكن أيضا إضافة تسلسلات لبكر متداخلة، وفقا لدليل أدوات تستخدم15.
| التمهيدي إلى الأمام العالمي | --آجكاجتجتاتكاكجكاجاجت 5 '-3' |
| عكس كبسولة تفجير للماوس المناعية (Ref.8) | |
| IgM_CH1: | 5-كاككاجاتكتاتكاجاكاججججكتكتك-3 ' |
| IgG1_CH1: | 5-كاتكككاججتكاككاتجاجتاجتتج-3 ' |
| IgG2c_CH1: | 5-جتاككتككاكاكاكاجججككاجتجاتاج-3 ' |
| IgG3_CH1: | --أتجتجتكاكتجكاجككاججاككاججا 5 '-3' |
| IgA_CH1: | --جاتكاجكاجككجاتاتكاكججاتكاك 5 '-3' |
| Igκ_CH1: | 5-جكتكاكتجاتجتججاجاتجاتاكاج-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5-كتبجاجكتسيتكاجرجاجتجااكا-3 ' |
| عكس كبسولة تفجير المناعية البشرية (Ref.14) | |
| IgM_CH1: | 5-ججاتكتكاكاجاجاكج-3 ' |
| IgG_CH1: | 5-آجاككجاتججكككتج-3 ' |
| IgD_CH1: | 5-ججتجتكتجكاكككتجاتا-3 ' |
| IgA_CH1: | 5-جاجاككتتجججكتغت-3 ' |
| IgE1_CH1: | 5-جاجاكجاتججكتكتجت-3 ' |
| IgE2_CH1: | 5-تجكاجكاجكججتكاجج-3 ' |
| Igκ_CH1: | 5-تجكتكاتكاجاتجكججاجات-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5-أجاجاججكججاكاجاجتجا-3 ' |
الجدول 1: تسلسل التمهيدي للتضخيم بكر من المناعية
2-الحمض النووي في معزل عن الخلايا المناعية والأنسجة
ملاحظة: الإجراء أدناه لاستخراج الأحماض النووية من الطحال الماوس. ومع ذلك، أنها تنطبق على سائر الأنسجة المناعية والخلايا البشرية مثل الغدد الليمفاوية أو خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) (الشكل 1B).
- تشريح الأنسجة، مثلاً، والطحال من ماوس C57BL/6 8 عاماً في أسبوع وتمريرها من خلال شبكة الفولاذ المقاوم للصدأ (200 إلى 400 ميكرون) مع 2 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني للحصول على خلايا متفرقة. نقل تعليق خلية أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 2.0، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 × ز و 4 ˚C. تجاهل المادة طافية.
- إضافة 800 ميليلتر من المخزن المؤقت ليسينج ACK (150 مم NH4Cl، 1 مم كهكو3مم 0.1 غ2يدتا، الرقم الهيدروجيني 7.2) إلى بيليه، واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة خلايا الدم الحمراء في الأنسجة.
- يغسل خلايا الأنسجة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 3 x، متبوعاً بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 × ز و 4 ˚C.
- إضافة 800 ميليلتر من الفينول/غوانيدين isothiocyanate كاشف لبيليه، دوامة جيدا، واحتضان في حوالي 25 ˚C لمدة 5 دقائق.
- إضافة كلوروفورم (200 ميليلتر)، اهتز يدوياً لمدة 15 ثانية، واحتضان ثم لمدة 2 دقيقة في ˚C حوالي 25.
- المراحل منفصلة بالطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12,000 × ز و 25 ˚C ونقل المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد.
- إضافة مجلد واحد من الإيثانول 70%، دوامة بإيجاز وتطبيقه على العمود تدور والسليكا.
- الوت الجيش الملكي النيبالي مع 30 – 100 ميليلتر من الماء.
- كوانتيتاتي تركيز الحمض النووي الريبي الأولية باستخدام فلوروميتير (جدول المواد).
- تخزين الجيش الملكي النيبالي المنقاة في ˚C-80.
3-كدنا التوليف و "التضخيم بكر"
ملاحظة: الطريقة الموضحة أدناه على أساس 5 '--سباق11،12 و التقنيات الذكية-بكر13. تفاصيل والأمثل لرد فعل موصوفة في دليل المستخدم ل مجموعة 15. المواد انطلاق للماوس الغلوبولين المناعي هي العينة من الخطوة 2، 10. انطلاق المواد اللازمة لجسم الإنسان هي العينة من الأنسجة البشرية، مثلاً: ببمك، تعامل كما هو موضح في الخطوات 2.3 إلى 2.10.
- توليف كدنا حبلا الأولى من 2 إلى 10 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي قالب باستخدام 5 '--سباق اسطوانات التمهيدي (اليغو-dT-تتضمن) والذكية-بكر اليغنوكليوتيد (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة15.
- للماوس الغلوبولين المناعي، كدنا تضخيم PCR مع بوليميريز الحمض النووي عالية الدقة باستخدام العالمي التمهيدي إلى الأمام والغلوبولين المناعي فئة معينة عكس كبسولة تفجير (الجدول 1). تعيين شروط الدراجات الحرارية ك: ˚C 94 ل 2 دقيقة، ثم دورات 40 94 ˚C لمدة 30 ثانية، ˚C 59 30 s، و 72 ˚C لمدة 30 s، تليها خطوة تمديد نهائي في ˚C 72 لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تجارب نموذجية تضخيم صفوف الغلوبولين المناعي IgM، IgG1، IgG2c، إيجك، و Igl ننظر إلى السذاجة، وتعتمد على Th1 وب Th2-تعتمد على الخلايا (الشكل 3). - لجسم الإنسان، أداء 1st PCR باستخدام العالمي التمهيدي إلى الأمام والغلوبولين المناعي فئة معينة عكس كبسولة تفجير (الجدول 1) مع تسلسل العلامة. تشمل تسلسل فهرس لكل عينة من 2nd PCR باستخدام مؤشر تسلسل الإشعال. استخدام بوليميريز بوليميراز وبكر الشروط التالية: ˚C 94 لمدة 2 دقيقة، دورات 21 (1st PCR) أو دورات 32 (2nd PCR) في 94 ˚C لمدة 30 ثانية، ˚C 59 30 s، ˚C 72 لمدة 30 s.
ملاحظة: تجارب نموذجية تضخيم IgM، IgD، مفتش (IgG1 و IgG2، IgG3 و IgG4)، إيغا (IgA1 و IgA2)، فريق الخبراء الحكومي الدولي، إيجك و Igl الطبقات الغلوبولين المناعي إلقاء نظرة على كل خلية بالسكان (الشكل 4).
- للماوس الغلوبولين المناعي، كدنا تضخيم PCR مع بوليميريز الحمض النووي عالية الدقة باستخدام العالمي التمهيدي إلى الأمام والغلوبولين المناعي فئة معينة عكس كبسولة تفجير (الجدول 1). تعيين شروط الدراجات الحرارية ك: ˚C 94 ل 2 دقيقة، ثم دورات 40 94 ˚C لمدة 30 ثانية، ˚C 59 30 s، و 72 ˚C لمدة 30 s، تليها خطوة تمديد نهائي في ˚C 72 لمدة 5 دقائق.
- اليكتروفوريسي منتجات PCR على [اغروس] هلام وتنقية 600 إلى 800 شركة بريتيش بتروليوم شظايا والسليكا غشاء تدور-عمود باستخدام.
- اليكتروفوريسي العينة من 3.2.1 أو 3.2.2 على 2% [اغروس] هلام.
- تصور العصابات الحمض النووي في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية والمكوس الهلام-الشريحة التي تحتوي على النطاق الواسع بين 600 إلى 800 شركة بريتيش بتروليوم.
- أضف 10 مل من غشاء ملزمة حل كل 10 مغ شريحة هلام. خلط واحتضان في 50 – 65 درجة مئوية حتى يذوب الشريحة جل تماما.
- نقل الحل هلام السليكا غشاء تدور-العمود. أغسل مرة واحدة مع الغسيل المخزن المؤقت والوت الحمض النووي مع 50 مل مياه خالية من نوكلاس (جدول المواد).
- قياس أمبليكونس المنقي مع أمبليكونس فلوروميتير، وتجمع من كل فئة الغلوبولين المناعي في كميات متساوية لتسلسل خ ع.
ملاحظة: عادة، تم انتشال 2-10 ملغ أمبليكون الحمض النووي لكل فئة الغلوبولين المناعي. مزيج من كل حل عينة على قدم المساواة في مقدار الحمض النووي لإعطاء الارتفاع 50 مل محلول يحتوي على 10-20 نانوغرام الحمض النووي/مل. - تحديد حجم وتركيز للمكتبات باستخدام التفريد أساس الشعرية الصغرى مع الحمض النووي التحجيم رقاقة (جدول المواد). تخزين المكتبات في-20 درجة مئوية.
4. خ ع التسلسل للمكتبات
- تولد من SampleSheet.cvs لتسلسل التشغيل تحديد نموذج الاسم، ومعلومات الفهرس وإصدار تعليمات للحصول على ملفات.fastq فقط.
- ذوبان الجليد خرطوشة كاشف (جدول المواد) والمكتبات.
- جعل 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم وتمييع المكتبات للحصول على تركيز مولى المرجوة.
- شطف وتجفيف الخلية التدفق. إضافة 600 مل من محلول مخفف والتشويه والتحريف مكتبة في بئر خرطوشة كاشف.
- بدء تشغيل تسلسل.
5-مراقبة جودة بيانات خ ع و
- إجراء مراقبة جودة البيانات فستق باستخدام فاستكس--مجموعة أدوات "16.
ملاحظة: مثال أساسي للمعلمة الإعدادات المستخدمة كما يلي:
fastq_quality_trimmer-v-t 20-l 200 س--i [InFilename.fastq] [InFilename.fastq]
fastq_quality_filter-v-q 20-80 ف س--i [InFilename.fastq] [InFilename.fastq]
fastx_reverse_complement-v-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fastq] - تنسيق ملفات الإخراج إلى "fasta الحمض النووي (.fna)" بالأمر التالي:
fastq_to_fasta-v-n-i [InFilename.fastq]-o [InFilename.fna]
6-استخراج وتحليل تسلسل الغلوبولين المناعي من البيانات.fna
ملاحظة: تم تنفيذ البرامج المثال في بيئة UNIX. الرجاء استخدامها كمثال على مراجع لأن الأداء قد تعتمد على نظام التشغيل والبيئة الأجهزة. المؤلفين لا نقبل أية مسؤولية عن الأخطاء أو الإغفالات. لغات البرمجة وبيرل17، ص18، والوحدات النمطية المطلوبة تحتاج إلى تثبيت وفقا للإرشادات الموجودة في المواقع المذكورة. البرنامج إيجبلاست تحتاج إلى تثبيت وفقا للإرشادات الموجودة في الموقع المناسب من19،20.
- تحميل الأمثلة التالية من برامج داخلية لتحليلات مرجع من https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
03_PipeLine_Mouse.zip؛ مجموعة من البرامج مثال لتحليل تسلسل جسم الماوس.
05_PipeLine_Human.zip؛ مجموعة من البرامج مثال لتحليل تسلسل جسم الإنسان. - استخراج جسم يقرأ في تسلسل البيانات: استخراج تسلسل الغلوبولين المناعي (Ig) من كل صنف Ig-من البيانات (.fna) باستخدام برنامج بيرل يبحث في تسلسل التوقيع في كل منطقة ثابتة الغلوبولين المناعي (الجدول 2).
- لجينات السلسلة الثقيلة (IgH) غلوبيولين مناعي الماوس، استخراج على ما يلي بالأمر التالي:
$ بيرل 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [اسم ملف الإدخال] [اسم ملف الإخراج (لاحقة)] - للسلسلة الخفيفة الغلوبولين المناعي الماوس استخراج الجينات (IgL) على ما يلي بالأمر التالي:
$ بيرل 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [اسم ملف الإدخال] [اسم ملف الإخراج (لاحقة)] - لجينات السلسلة الثقيلة (IgH) الغلوبولين المناعي البشري، استخراج على ما يلي بالأمر التالي:
$ بيرل 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [اسم ملف الإدخال] [اسم ملف الإخراج (لاحقة)] - لجينات السلسلة الخفيفة (IgL) الغلوبولين المناعي البشري، استخراج على ما يلي بالأمر التالي:
$ بيرل 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [اسم ملف الإدخال] [اسم ملف الإخراج (لاحقة)]
- لجينات السلسلة الثقيلة (IgH) غلوبيولين مناعي الماوس، استخراج على ما يلي بالأمر التالي:
- إضافة تعليقات توضيحية وتحقق إنتاجية جزئ الجين الخامس (د) ي:
ملاحظة: يستخدم الأسلوب هو موضح أدناه مستقل إيجبلاست19 للتعليق التوضيحي لشرائح الجين الخامس (د) ي في التسلسل. تعيين قاعدة البيانات للجينات الخامس (د) ي وإعدادات المعلمة إيجبلاست ك وصف20.- إضافة تعليق توضيحي جينات السلسلة الثقيلة (IgH) غلوبيولين مناعي الماوس بالأمر التالي:
$ إيجبلاستن-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-حي الفأر-إيمجت domain_system-الاستعلام./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation-أووتفمت 7 >>./$OutName - إضافة تعليق توضيحي جينات السلسلة الخفيفة (IgL) غلوبيولين مناعي الماوس بالأمر التالي:
$ إيجبلاستن-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-حي الفأر-إيمجت domain_system-الاستعلام./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation-أووتفمت 7 >>./$OutName - إضافة تعليق توضيحي جينات السلسلة الثقيلة (IgH) الغلوبولين المناعي البشري بالأمر التالي:
$ إيجبلاستن-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-الكائن البشري-إيمجت domain_system-الاستعلام./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation-أووتفمت 7 >>./$OutName - إضافة تعليق توضيحي جينات السلسلة الخفيفة (IgL) الغلوبولين المناعي البشري بالأمر التالي:
$ إيجبلاستن-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-الكائن البشري-إيمجت domain_system-الاستعلام./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/human_gl.aux-show_translation-أووتفمت 7 >>./$OutName
- إضافة تعليق توضيحي جينات السلسلة الثقيلة (IgH) غلوبيولين مناعي الماوس بالأمر التالي:
- تصور الميزة العالمية جسم مرجع.
- تصور مرجع فائق الماوس بالأمر التالي:
$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
ملاحظة: ملف الإدخال هو filename.fna (تسلسل البيانات)، يفضل أن يكون ملف الإخراج من 6.2.1. هذا الملف يجب أن يوضع في دليل السفلي (مجلد) المسمى "اسم الملف". في خط 50 قذيفة النصي، قم بتعيين "اسم ملف" ل Para_4. - تصور مرجع فائق البشرية بالأمر التالي:
$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
ملاحظة: ملف الإدخال هو filename.fna تسلسل البيانات، يفضل أن يكون ملف الإخراج من 6.2.3. يجب أن يوضع هذا الملف في الدليل السفلي (مجلد) هو أن الاسم "اسم الملف". في البند 46 من شيل، قم بتعيين "اسم ملف" ل Para_4. - تصور مرجع IgL الماوس بالأمر التالي:
$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
ملاحظة: مع هذا الأنبوب، إيجك و Igl تجهز في الوقت ذاته. ملف الإدخال هو filename.fna (تسلسل البيانات)، يفضل أن يكون ملف الإخراج من 6.2.2. هذا الملف يجب أن يوضع في الدليل السفلي (مجلد) المسمى "اسم الملف". في السطر 53 من شيل، قم بتعيين "اسم ملف" ل Para_4. اسم ملف الإخراج، تنتهي مع "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" يعطي إحداثيات لرسم شريط ثنائي الأبعاد (الشكل 3، IgL). - تصور مرجع IgL البشرية بالأمر التالي:
$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
ملاحظة: مع هذا الأنبوب، إيجك و Igl تجهز في الوقت ذاته. ملف الإدخال هو filename.fna تسلسل البيانات، يفضل أن يكون ملف الإخراج من 6.2.4. هذا الملف يجب أن يوضع في دليل السفلي (مجلد) المسمى "اسم الملف". في السطر 53 من شيل، قم بتعيين "اسم الملف" ل Para_4. اسم ملف الإخراج تنتهي مع "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" يعطي إحداثيات لرسم شريط ثنائي الأبعاد (الشكل 4، IgL).
- تصور مرجع فائق الماوس بالأمر التالي:
Representative Results
مبدع الضد من الماوس
يمكن الحصول على منظور مرجع جسم مورين ككل من الخلايا أو الأنسجة مثل الطحال، ونخاع العظام، والعقدة الليمفاوية، أو الدم. ويبين الشكل 3 نتائج تمثيلية IgM، IgG1، IgG2c، وإعطاء الغلوبولين المناعي مبدع سلسلة الخفيفة (IgL) من طحال ماوس ساذج. ويرد موجز لقراءة الأرقام في الجدول 3. على سبيل المثال، ما يلي: 166,175/475,144 الواردة محددة IgM التوقيع تسلسل (الجدول 2) ويقرأ 133,371/166,175 كانت فدج-الإنتاجية الاستدلال إيجبلاست19.
ويبين الشكل 3 ملف تعريف مرجع لإعادة ترتيب فدج من 3D-فدج-الأرض، الذي يمثل حجم كل الكرة العدد النسبي لما يلي؛ وبعبارة أخرى، عدد مرناس جسم بأكمله ب الخلايا. مش ثلاثي الأبعاد يتكون من 110 إيغف، إيغد 12، وإيغج 4، الذي يتم محاذاته إلى تعكس ترتيبها على الصبغي. وباﻹضافة إلى ذلك، جمعت الجينات مبهمة يسندها إيجبلاست بشكل منفصل في الموضع الأخير لكل خط إيغف وإيغد وإيغج، مما أدى إلى عقد 7,215 في متوازي المستطيلات.
أيضا، هو مبين في الشكل 3 هو مؤامرة 2D الجيش اليوغوسﻻفي عرض التشكيل الجانبي لإعادة ترتيب الجيش اليوغوسﻻفي في مرجع IgL. ويمثل طول كل شريط في هذه المؤامرة العدد النسبي لما يلي. ويمثل المحور السيني 101 IGLVκ و 3 IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 4 IGLJκ و 3 IGLJλ الجينات. يتم تمثيل في أونانوتاتيد الخامس-ي-الجينات وعلى الشريط الحدودي اليمنى.
منطقة تحديد التكامل 3 (CDR3) تعطي تسلسل هذه القراءة المنتجة، التي تؤدي إلى غالبية خصوصية مستضد ملزمة، في النواتج إيجبلاست. CDR3 تسلسل يمكن تحليلها إحصائيا، بما في ذلك replicates البيولوجية أو التقنية، كما هو موضح سابقا8،10.
مبدع جسم الإنسان
يمكن تحليلها من منظور مرجع جسم الإنسان ككل من مختلف الأنسجة بما في ذلك خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو الأنسجة المرضية. ويبين الشكل 4 نتائج تمثيلية من IgM، مجموع مفتش (IgG1 و IgG2، IgG3 و IgG4)، ومجموع إيغا (IgA1 و IgA2) وفريق الخبراء الحكومي الدولي و IgD IgL مبدع من ببمكس العادية. ويرد موجز لقراءة الأرقام في الجدول 3. على سبيل المثال، ما يلي: 90,238/1,582,754 الواردة تسلسل التوقيع IgM على حدة ويقرأ 67,896/90,238 كانت فدج الإنتاجية.
الشخصية مرجع لإعادة ترتيب فدج المعروضة في 3D--فدج-مؤامرة الذي يمثل حجم كل الكرة العدد النسبي لما يلي؛ وبعبارة أخرى، عدد مرناس جسم من أسرة ببمكس (الشكل 4). مش ثلاثي الأبعاد يتكون من إيغف 56 و 27 إيغد إيغج 6، الانحياز في ترتيب ظهورها في الكروموسوم. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تمثيل الجينات مبهمة يسندها إيجبلاست كل على حدة في الموضع الأخير لكل خط إيغف وإيغد وإيغج، مما أدى إلى عقد 11,172 في متوازي المستطيلات.
التشكيل الجانبي لإعادة ترتيب الجيش اليوغوسﻻفي في مرجع IgL يرد في 2D-VJ-مؤامرة الذي يمثل طول كل شريط العدد النسبي لما يلي (الشكل 4). ويمثل المحور السيني 41 IGLVκ و 32 IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 5 IGLJκ و 5 IGLJλ الجينات. الأمم المتحدة المشروح الخامس-ي-الجينات وممثله في الشريط الحدودي اليمنى.
وترد في تسلسل CDR3 البشرية في إيجبلاست النواتج ويمكن تحليلها إحصائيا كما هو موضح سابقا8،10.
| الطبقة الغلوبولين المناعي | معنى | أنتيسينسي |
| ماوس سلاسل ثقيلة الغلوبولين المناعي (C57BL/6) | ||
| IgM | أجتكاجتككتكككااتجتك | جاكاتتججاجاكتجاكت |
| IgG1 | آآآكجاكاكككككاتكتجتك | جاكاجاتججججتجتكجتتت |
| (IgG1 المتغير) | آآآكاكاكككككاتكاجتك | جاكتجاتججججتجتجتتت |
| IgG2c | آآآكاكاجككككاتكجتك | جاككجاتجججكتجتجتتت |
| IgG3 | جتجاتكككجتجاتاتكجكت | أجككجاتاتكاكججاتكاك |
| إيغا | تكككتجتكككتجكتجكاج | تكككتجتكككتجكتجكاج |
| ماوس الغلوبولين المناعي سلاسل خفيفة (C57BL/6) | ||
| Igκ | كتجتاتككاتكتكككاككاتككاجتجاجك | جكتكاكتجاتجتججاجاتجاتاكاج |
| Igλ1 | تجتتككاككتككتكتجاجاجكتكجاج | كتكجاجكتكتكاجاجاجتجااكا |
| Igλ2 | تجتتككاككتككتكتجاجاجكتكاج | كتجاجكتككتكاجاجاجتجااكا |
| Igλ3 | تجتتككاككتككككتجاجاجكتككاج | كتجاجكتككتكاجججاجتجااكا |
| Igλ4 | تجتكككاككتككتكتجاجاجكتكاج | كتتجاجكتكتكاجاجاجتججاكا |
| سلاسل ثقيلة الغلوبولين المناعي البشري | ||
| IgM | ججاجتجكاتككجككككاك | جتجججكجاتجكاكتككك |
| مفتش | جكتككاككاججكككاتك | جاتججكككتجتجاجك |
| إيغا | جكاتككككجاككاجككككا | جاككجاتجججكتجتجتتت |
| IgD | جكاكككاككاجكتككجا | تككجاجككتجتججتجك |
| فريق الخبراء الحكومي الدولي | جككتككاكاكاجاجكككاتك | جاتججكتكتجتجتجاجك |
| الغلوبولين المناعي البشري سلاسل خفيفة | ||
| Igκ | أكتجتجكتجكاككاتكتجك | جكاجاتجتجكاجككاكاجت |
| Igλ1، 2, 6 | جتكاكتكتجتكككجكككتك | جاججكججاكاجاجتجاك |
| Igλ3, 7 | جتكاكتكتجتكككاكككتك | جاججتججاكاجاجتجاك |
الجدول 2: موجز لتسلسل التوقيع الغلوبولين المناعي
| فائق الماوس | مجموع ما يلي: | IgM | IgG1 | IgG2c | ||
| الإدخال | 475,144 | |||||
| المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية | 166,175 | 229,671 | 36,628 | |||
| فدج الإنتاجية | 133,371 | 196,583 | 31,446 | |||
| IgL الماوس | مجموع ما يلي: | إيجكابا | إيجلامبدا | |||
| الإدخال | 527,668 | |||||
| المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية | 178,948 | 21,446 | ||||
| الجيش اليوغوسﻻفي الإنتاجية | 160,924 | 16,988 | ||||
| الإنسان فائق | مجموع ما يلي: | IgM | مفتش | إيغا | IgD | فريق الخبراء الحكومي الدولي |
| الإدخال | 1,582,754 | |||||
| المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية | 90,238 | 5,298 | 94,061 | 75,549 | 2,932 | |
| فدج الإنتاجية | 67,896 | 2,775 | 78,203 | 56,495 | 3 | |
| IgL البشرية | مجموع ما يلي: | إيجكابا | إيجلامبدا | |||
| الإدخال | 1,582,754 | |||||
| المحتوية على اللجنة الحكومية الدولية | 120,316 | 64,148 | ||||
| الجيش اليوغوسﻻفي الإنتاجية | 97,169 | 52,324 |
الجدول 3: موجز لقراءة الأرقام في التجارب
رقم 1: التمثيل التخطيطي لتسلسل الاستراتيجية لتحليل مبدع الأجسام المضادة في الفئران الفردية- (A) الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المناعية أو الأنسجة تم نسخها من الاتجاه المعاكس وتضخيم PCR باستخدام الدليل العالمي إلى الأمام، وعكس الغلوبولين المناعي فئة معينة كبسولة تفجير. أمبليكونس من كل فئة الغلوبولين المناعي المجمعة والمقدمة لتسلسل الجيل القادم. (ب) يتطابق البيولوجية مثل الطحال من الفئران C57BL/6 يعاملون كما يلي: الكشف التام من تنقيته من عينات الطحال، وتم تضخيم كدناس 5 '--سباق استخدام التمهيدي عالمي وجسم فئة معينة التمهيدي. ثم أنها قدمت لتسلسل الجيل المقبل بوصفها كبسولة تفجير للفئران الفردية. أجزاء من هذا الرقم يتم تكييفها من8 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التخطيطي لمخطط انسيابي تجهيز البيانات لتحليل مبدع الأجسام المضادة في الفئران الفردية- تم تجهيز ما يلي أمبليكون التي تم الحصول عليها بعد تسلسل الجيل القادم كما يلي: تم التحقق من تسلسل قراءة (1) لوجود جسم تسلسل التوقيع فئة معينة؛ (2) وبحثت تسلسل الخامس، د، والجين ي الأجزاء باستخدام إيمجت/حايف-كويست و/أو إيجبلاست؛ (3) وقد جمعت التسلسل التي تحتوي على مفترق فدج إنتاجية؛ (4)، وقد استخدمت هذه التسلسلات لتحليل ميزات مرجع ممارسات مجلس الأمن عموما، CDR3، وما إلى ذلك الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التصور البيانات العالمية للماوس جسم مبدع. كانت تصور الملامح مرجع الشامل لكل فئة جسم من 3D-فدج-المؤامرة. ويمثل المحور السيني 110 إيغف الجينات أمر على كروموسوم. Y-و z المحور المحور يمثل إيغد 12 و 4 إيغج الجينات، على التوالي. ويمثل حجم المجالات على كل عقده عدد القراءات. مجالات حمراء: الجينات الخامس ود ي الأمم المتحدة المشروح. IgL قراءة تظهر التوزيعات في 2D-VJ-مؤامرة الذي يمثل طول كل شريط العدد النسبي لما يلي. ويمثل المحور السيني 101 x IGLVκ و 3 x IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 4 x IGLJκ و 3 x IGLJλ الجينات. يتم تمثيل الجينات V و J الأمم المتحدة المشروح في الشريط الحدودي حق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التصور البيانات العالمية لجسم الإنسان مبدع. كانت تصور الملامح مرجع الشامل لكل فئة جسم من 3D-فدج-المؤامرة. ويمثل المحور السيني 56 جينات إيغف أمر على كروموسوم. Y-و z المحور المحور يمثل إيغد 27 و 6 إيغج الجينات، على التوالي. ويمثل حجم المجالات على كل عقده عدد القراءات. مجالات حمراء: الجينات الخامس ود ي الأمم المتحدة المشروح. هي صفت يقرأ IgL في 2D-VJ-المؤامرة التي يمثل طول كل شريط العدد النسبي من ما يلي. المحور السيني يمثل 41 x IGLVκ و 32 x IGLVλ الجينات، ويمثل المحور الصادي 5 x IGLJκ و 5 x IGLJλ الجينات. الأمم المتحدة المشروح الخامس-ي-الجينات وممثله في الشريط الحدودي اليمنى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
ويستخدم الأسلوب الموصوفة هنا خ ع للجيش الملكي النيبالي جسم تضخيم استخدام الأسلوب 5 '--سباق. على النقيض من الأساليب التي تستخدم منحط 5 '-Vح الجينات الإشعال، تتضخم مرناس كل فئة جسم بالتساوي باستخدام كبسولة تفجير الأمام العالمي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام العقاقير كبسولة تفجير محددة لمنطقة الثابت 1 (CH1) من الجينات جسم مرجع التنميط لفئات محددة الغلوبولين المناعي. وهذا مفيد جداً لتشريح استجابة جسم فئة معينة، فضلا عن مقارنة ساذجة ومبدع المحصنين8،9.
شرك الأسلوب الأكثر احتمالاً ندرة رسائل تضخيم الغلوبولين المناعي. عمق جسم المرجع التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول إلى حد كبير يعتمد على التضخيم PCR هو موضح في الخطوات 3.1 و 3.2. تغيير نسب كدنا القالب والإشعال في الخطوات 3.2.1 أو 3.2.2 ينصح بشدة إذا لم يتم الحصول بشكل صحيح على عمق مرجع ممارسات مجلس الأمن،.
وبصفة عامة، هي حوالي 20% القراءات الأجسام المضادة التي تنتجها خ ع تسلسلات غامضة21. حتى مع إنشاء "طرق التصحيح"، 5-10% تبقى غامضة3. ولذلك، نحن، تحليل التسلسل وتصفية يقرأ الخام التي تحتوي على تسلسلات التوقيع المقابلة لمناطق ثابتة الغلوبولين المناعي (CμH1، Cγ1H1، Cγ2cH1، إلخ.). ومن ثم تحليل فرط الطفرات الجسدية يحتاج الفحص الدقيق.
واحد أوجه القصور في هذا الأسلوب هو أن جسم ثقيل وزوج سلسلة الخفيفة غير قادر على الاستدلال. ومن ثم رأي المرجع التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة ليس كلي. ومع ذلك، من الممكن لتقريب أزواج كبار بالتحليل الإحصائي ل البيانات10. أيضا، وطريقة جديدة لتسلسل أزواج الغلوبولين المناعي وقد أفادت مؤخرا3،4.
استخرجت في تسلسل الغلوبولين المناعي في البيانات.fna الإخراج استناداً إلى وجود الغلوبولين المناعي مورثة تسلسل التوقيع. تم تقييم الجين الخامس ود ي ثم تم المشروح شرائح وإنتاجية الخامس (د) ي ترتيبات جديدة. منطقة تحديد التكامل 3 (CDR3) كما كان المشروح متواليات. وقدمت هذه الفحوص المنتظمة لتسلسل الغلوبولين المناعي في البيانات.fna مفيد23،22،الخادم إيمجت/هيغف--كويست24. ومع ذلك، بناء خط أنابيب معالجة إليه بميزة لتحليل البيانات التجريبية كبيرة. خط الأنابيب مخصصة لكل غرض من الممكن إعداد باستخدام مستقل إيجبلاست البروتوكول19. هذا النهج يحتاج محو الأمية البرمجة الأساسية ولكن مفيد جداً لتحليلات مفصلة للنظام المناعي. خطوط الأنابيب ووصف أمثلة لبروتوكول مخصص (الشكل 2).
يقرأ العدد من الأجسام المضادة النسبي لكمية الأجسام المضادة الكشف في العينة، مما يعكس مكونات نظام الأجسام المضادة في جسم تعطي الوقت النقاط5،،من825. الأسلوب الموصوفة هنا يعطي رأي العين طائر من دستور الخامس (د) ي مرجع جسم استخدام البحث والتطوير البرامج8،،من1826.
العالمية ويرى مبدع الأجسام المضادة IgM الفئران فردية ساذجة كشفت فدج-الشخصية مصانة عاليا بالمقارنة مع تلك التي IgG1 أو IgG2c8. وذكر أن مجموعات فدج من الزرد غير ناضجة جداً النمطية9. وفي المقابل، يقال البشرية فدج تركيبات منحرفة جداً6. هي العالية حافظ فدج-التشكيلات الجانبية القطعية في الخلايا من السذاجة ب التحديد ربما ولدت أما بانحراف فدج-ترتيبات جديدة أو السلبية مع السيارات-مولدات المضادات في الجسم. على سبيل المثال، IGHV11-2 يتم التعبير عن تفضيلي في مرجع IgM الجنين27 وهيمنة هذا يعزى إلى أوتوريكتيفيتي IGHV11-2 ضد الكريات الحمراء مسن27. من المثير للاهتمام، IGHV11-2 هو أيضا مرجع الرئيسية الأكثر شيوعاً في تحليلنا المنشورة سابقا من السذاجة IgM8.
الأسلوب الموصوفة هنا مفيد لفك رموز مبدع جسم مستضد المستجيبة من خلال تحليل الفضاء جسم-مرجع ممارسات مجلس الأمن التي تم إنشاؤها في الهيئات كل على حدة، تجنب إغفال غير مقصود من جسم الرئيسية مبدع8، جامعاً 10. يسمح هذا الأسلوب أيضا دراسة مفصلة جسم شبكة دينامية، مما ييسر تسارع اكتشاف أجسام مضادة واقية ضد الناشئة حديثا ومسببات الأمراض.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
بتأييد هذا العمل بمنحه من أوسطي تحت رقم المنحة JP18fk0108011 (كو و SI) و JP18fm0208002 (TS وكو ويو)، ومعونات من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (15 ك 15159) إلى كو. ونشكر ياماغوتشي سايوري وساتوكو ساساكي للمساعدة التقنية القيمة. ونود أن نشكر اديتاجي (www.editage.jp) لتحرير اللغة الإنجليزية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
References
- Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
- Tonegawa, S.
- Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
- Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
- Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
- Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).
- Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
- Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
- Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
- Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
- Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
- Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
- SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
- FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
- Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
- Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
- IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
- Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404 (2011).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
- Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
- IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
- Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
- rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
- Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).
