Summary
Här beskriver vi protokoll för analys och visualisering av strukturen och konstitutionen av hela antikropp repertoarer. Detta innebär förvärvet av stora sekvenser av antikropp RNA med hjälp av nästa generations sekvensering.
Abstract
Antigen erkännande av antikroppar enorma anpassningsförmåga är grunden för förvärvade immunsystemet. Trots vår förståelse av de molekylära mekanismerna bakom produktionen av den stora repertoaren av antikroppar av de förvärvade immunsystemet, har det ännu inte möjligt att komma fram till en övergripande bild av en fullständig antikropp repertoar. Särskilt har B-cell repertoarer betraktats som en svart låda på grund av deras astronomiska antal antikroppar kloner. Men möjliggör nästa generations sekvensering teknik genombrott att öka vår förståelse av B-cell repertoar. I den här rapporten beskriver vi en enkel och effektiv metod för att visualisera och analysera hela enskilda mus och human antikropp repertoarer. Från de immun organ var olikt från mjälten hos möss och perifera mononukleära blodceller hos människor, total-RNA beredda, omvänd transkriberas och förstärks med metoden 5'-RACE. Med en universell framåt primer och antisense primers för antikropp klass-specifika konstant domäner, var antikropp mRNA enhetligt förstärks i proportioner som återspeglar deras frekvenser i antikropp populationer. Amplikoner var sekvenserade av nästa generations sekvensering (NGS), vilket ger mer än 105 antikropp sekvenser per immunologiskt prov. Vi beskriver protokoll för antikropp sekvensanalys inklusive V D J-gen-segmentet kommentar, ett fågelperspektiv av antikropp repertoaren och våra beräkningsmetoder.
Introduction
Systemets antikropp är en av grunderna i förvärvade immunsystemet. Det är mycket potent mot invaderande patogener på grund av dess stora mångfald, fina antigen erkännande specificitet och den klonal expansionen av antigen-specifika B-celler. Repertoar av antikropp-B celler uppskattas till mer än 1015 i ett enda enskilda1. Denna enorma mångfald genereras med hjälp av VDJ gen rekombination i immunglobulin genregioner2. Beskrivning av hela B-cell repertoarer och deras dynamiska förändringar som svar på antigen-immunisering är därför utmanande, men avgörande för en fullständig förståelse av antikroppssvaret mot invaderande patogener.
På grund av deras astronomiska mångfald, har B-cell repertoarer betraktats som en svart låda; men har tillkomsten av NGS teknik gjort genombrott till en förbättrad förståelse av deras komplexitet3,4. Hela antikropp repertoarer har analyserats framgångsrikt, det första i Zebrafiskar5, sedan möss6, och människor6,7. Även om NGS har nu blivit ett kraftfullt verktyg i studiet av det adaptiva immunsvaret, saknas grundläggande analyser av likheter och skillnader i antikropp repertoarer bland enskilda djur.
Hos möss rapporterades det att IgM repertoarer är nästan identiska mellan individer, de av IgG1 och IgG2c skiljer sig avsevärt mellan individer8. Förutom V-gen användningsprofil är observerade frekvensen av VDJ-profil i naiva perifera B-celler mycket liknande mellan individer8. Analysen av de amino syra ordnar av VDJ-regionen visade också förekomsten av samma Junktional sekvenser i olika möss mycket oftare än tidigare trodde8. Dessa resultat tyder på att mekanismerna för den repertoar antikroppsbildning kan vara deterministiska i stället för stokastiska5,8,9. Processen för utveckling av antikroppar repertoar i möss har också varit framgångsrikt analyseras med NGS att ytterligare belysa NGS potential att avslöja immunförsvaret antikroppar i detalj10.
I den här rapporten beskriver vi en enkel och effektiv metod för att visualisera och analysera en antikropp repertoar på global nivå.
Protocol
Alla djurförsök har utförts enligt institutionella riktlinjer och med godkännande från nationella institutet för smittsamma sjukdomar djur vård och användning kommittén. Provtagning av PBMC från friska vuxna frivilliga, används som representativa resultatet i denna rapport utfördes med godkännande av den etiska kommittén av det nationella institutet för infektionssjukdomar, Tokyo, Japan, och skriftligt informerat samtycke erhölls från varje deltagare använder en etik kommittén-godkänd form.
1. primer Design
- Designa en universal framåt primer till cDNA att förstärka immunglobulin mRNA utan bias från PCR primers, som används i 5'-RACE11,12 och SMART-PCR13 tekniker.
- För immunglobulin VH gen förstärkning, design immunglobulin klass-specifika sekvenser i regionen konstant som omvänd primers8,14 (figur 1A).
Obs: Multiplex tagg sekvenser kan läggas till någon av dessa grundfärger att märka de bibliotek molekylerna från olika provkällor. Sekvenser för nästlade PCR kan också läggas, enligt handboken av kit används15.
| Universal framåt primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' |
| Omvänd primers för mus immunglobuliner (Ref.8) | |
| IgM_CH1: | 5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 ' |
| IgG1_CH1: | 5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 ' |
| IgG2c_CH1: | 5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 ' |
| IgG3_CH1: | 5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3' |
| IgA_CH1: | 5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3' |
| Igκ_CH1: | 5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 ' |
| Omvänd primers för de humana immunglobuliner (Ref.14) | |
| IgM_CH1: | 5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 ' |
| IgG_CH1: | 5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 ' |
| IgD_CH1: | 5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 ' |
| IgA_CH1: | 5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 ' |
| IgE1_CH1: | 5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 ' |
| IgE2_CH1: | 5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 ' |
| Igκ_CH1: | 5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 ' |
Tabell 1: Primer sekvenser för PCR-amplifiering av immunglobuliner
2. nukleinsyra isolering från immuna celler och vävnader
Obs: Det förfarande som anges nedan är för utdrager nukleinsyror från mus mjälte. Det är dock tillämpliga på andra immun vävnad och mänskliga celler såsom lymfkörtlar eller perifera mononukleära blodceller (PBMC) (figur 1B).
- Dissekera den vävnad, t.ex., mjälte från en 8-vecka-gammal C57BL/6 mus och passera den genom en rostfritt stål mesh (200 till 400 µm) med 2 mL PBS-bufferten att få spridda celler. Överföra cellsuspensionen till 2,0 mL mikrocentrifug rör och Centrifugera under 5 minuter på 600 × g och 4 ˚C. Kassera supernatanten.
- Tillsätt 800 µL ACK lyseringslösning buffert (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2) i pelleten och inkubera på is i 2 min att lysera röda blodkroppar i vävnaden.
- Tvätta vävnadsceller med 2 mL PBS 3 x, följt av centrifugering för 5 min på 600 × g och 4 ˚C.
- Tillsätt 800 µL fenol/guanidin Isotiocyanat reagens i pelleten, vortex grundligt, och inkubera vid ca 25 ° c i 5 min.
- Lägg till kloroform (200 µL), skaka manuellt för 15 s, och sedan Inkubera i 2 min vid ca 25 ˚C.
- Separera faserna genom centrifugering i 15 min på 12.000 × g och 25 ° c och överföra övre vattenfasen till en frisk slang.
- Lägga till en volym av 70% etanol, vortex kort och tillämpa den på kolumnen kiseldioxid spin.
- Eluera RNA med 30 – 100 µL av vatten.
- Kvantifiera inledande RNA-koncentrationen med en fluorometer (Tabell för material).
- Lagra den renade RNA vid-80 ˚C.
3. cDNA syntes och PCR-amplifiering
Obs: Den metod som beskrivs nedan är baserad på 5'-RACE11,12 och SMART-PCR teknik13. De detaljer och optimering av reaktionen beskrivs i manualen för kit 15. Utgångsmaterial för mus immunglobulin är provet från steg 2.10. Utgångsmaterial för humant immunglobulin är provet från mänskliga vävnader, ex. PBMC, behandlas enligt beskrivningen i steg 2,3 till 2.10.
- Syntetisera den första-strand cDNA från 2 till 10 µg av total RNA mall med hjälp av 5'-RACE CDS primer (oligo-dT-innehållande) och SMART-PCR oligonukleotiden (Tabell för material) enligt tillverkarens instruktioner15.
- För mus immunglobulin, PCR-Förstärk cDNA med HiFi-DNA polymeras med hjälp av universal framåt primer och immunglobulin klass-specifika omvänd primers (tabell 1). Inställd på termisk cykling villkor som: 94 ° c i 2 min, sedan 40 cykler av 94 ˚C för 30 s, 59 ˚C för 30 s och 72 ° c för 30 s, följt av en sista förlängning steg vid 72 ° c i 5 min.
Obs: Typisk experiment förstärka IgM, IgG1, IgG2c, Igk och Igl immunglobulin klasser att titta på den naiva, Th1-beroende och Th2-beroende B-celler (figur 3). - För humant immunglobulin, utföra 1st PCR med universal framåt primer och immunglobulin klass-specifika omvänd primers (tabell 1) med etiketten sekvenser. Omfatta de index sekvenserna för varje prov av 2nd PCR använder index sekvens primers. Använd följande PCR villkor och den Taq-polymerasen: 94 ° c i 2 min, 21 cykler (1st PCR) eller 32 cykler (2nd PCR) vid 94 ° c för 30 s, 59 ˚C för 30 s, 72 ° c för 30 s.
Obs: Typisk experiment förstärka IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 och IgG4), IgA (IgA1 och IgA2), IgE, Igk och Igl immunglobulin klasser för att titta på alla B-cells populationer (figur 4).
- För mus immunglobulin, PCR-Förstärk cDNA med HiFi-DNA polymeras med hjälp av universal framåt primer och immunglobulin klass-specifika omvänd primers (tabell 1). Inställd på termisk cykling villkor som: 94 ° c i 2 min, sedan 40 cykler av 94 ˚C för 30 s, 59 ˚C för 30 s och 72 ° c för 30 s, följt av en sista förlängning steg vid 72 ° c i 5 min.
- Electrophorese PCR-produkter på en agarosgel och rena 600 till 800 bp fragment med en kvarts membran spin-kolonn.
- Electrophorese provet från 3.2.1 eller 3.2.2 på 2% agarosgel.
- Visualisera de DNA-banden på UV-transilluminator och punktskatt gel-segmentet som innehåller breda bandet mellan 600 till 800 bp.
- Tillsätt 10 mL av membran bindande lösning per 10 mg för gel slice. Blanda och inkubera vid 50 – 65 ° C tills gel slice är helt upplöst.
- Överföra gellösningen på silica membran spin-kolumn. Tvätta en gång med tvätt buffert och eluera DNA med 50 mL nuclease-fritt vatten (Tabell för material).
- Kvantifiera den renade amplikoner med en pool och fluorometer amplikoner från varje immunglobulin klass i lika mängder för NGS sekvensering.
Obs: Normalt 2-10 mg amplikon DNA återfanns för varje immunglobulin klass. Blanda varje provlösning lika i DNA belopp ge upphov 50 mL lösning som innehåller 10-20 ng DNA/mL. - Bestämma storlek och koncentrationen av bibliotek med hjälp av en mikro-kapillär baserat elektrofores med DNA dimensionering chip (Tabell för material). Lagra biblioteken vid - 20 ° C.
4. NGS sekvensering av bibliotek
- Generera en SampleSheet.cvs för sekvensering kör ange prov namn, information om index och instruera få .fastq filer endast.
- Tina reagens patronen (Tabell av material) och biblioteken.
- Gör 0,2 N NaOH och späd biblioteken för att få önskad molar koncentration.
- Skölj och torka cellen flöde. Lägga till 600 mL utspädd och denaturerat bibliotek lösning i brunnen av reagens patronen.
- Start den sekvensering kör.
5. kvalitetskontroll av NGS Data
- Utföra kvalitetskontroll av FASTQ data med hjälp av ”FASTX-Toolkit”16.
Obs: Ett grundläggande exempel på parameterinställningarna används är följande:
fastq_quality_trimmer - v -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastq_quality_filter - v - q 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] - Formatera utdatafilerna till ”fasta nucleic acid (.fna)” av följande kommando:
fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]
6. extraktion och analys av immunglobulin sekvenser från .fna Data
Obs: De exempel på program genomfördes i en UNIX-miljö. Använd dem som exempel hänvisningar eftersom prestanda kan beror på operativsystem och hårdvara miljö. Författarna accepterar inte något ansvar för fel eller utelämnanden. Det programmeringsspråk, Perl17, R18och nödvändiga moduler måste installeras enligt instruktionerna på de citerade webbplatserna. IgBLAST programmet måste installeras enligt instruktionerna på lämplig webbplats19,20.
- Ladda ner i följande exempel på interna program för repertoar analyser från https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
03_PipeLine_Mouse.zip; En uppsättning exempel program för analyser av mus-antikropp sekvenser.
05_PipeLine_Human.zip; En uppsättning exempel program för analyser av human antikropp sekvenser. - Extrakt antikroppen läser i sekvensdata: extrahera immunglobulin (Ig) sekvenser av varje Ig-klass från data (.fna) genom ett Perl-program som söker sekvenserna som signatur i varje immunglobulin konstant region (tabell 2).
- För musen immunglobulin tung kedja (IgH) generna, extrahera läser du följande kommando:
$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [Input filnamn] [utgång filnamn (suffix)] - För musen immunglobulin lätta kedjan extrahera (IgL) gener läser du följande kommando:
$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [Input filnamn] [utgång filnamn (suffix)] - För humant immunglobulin tung kedja (IgH) generna, extrahera läser du följande kommando:
$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [Input filnamn] [utgång filnamn (suffix)] - För humant immunglobulin Ljusslinga (IgL) generna, extrahera läser du följande kommando:
$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [Input filnamn] [utgång filnamn (suffix)]
- För musen immunglobulin tung kedja (IgH) generna, extrahera läser du följande kommando:
- Kommentera och kontrollera V D J gen rekombination produktivitet:
Obs: Metoden beskrivs nedan utnyttjar fristående IgBLAST19 för annotering av V (D) J gen segment i sekvensen. Ställ in databasen för V D J generna och parameterinställningarna för IgBLAST som beskrivs20.- Kommentera mus immunglobulin tung kedja (IgH) gener genom följande kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organism mus - domain_system imgt-frågan. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Kommentera mus immunglobulin Ljusslinga (IgL) gener genom följande kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organism mus - domain_system imgt-frågan. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Kommentera de humana immunglobulin tung kedja (IgH) generna genom följande kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organism mänskliga - domain_system imgt-frågan. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Kommentera de humana immunglobulin Ljusslinga (IgL) generna genom följande kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organism mänskliga - domain_system imgt-frågan. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
- Kommentera mus immunglobulin tung kedja (IgH) gener genom följande kommando:
- Visualisera den globala funktionen av en antikropp repertoar.
- Visualisera mus IgH repertoaren genom följande kommando:
$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
Obs: Indatafilen är filename.fna (sequence data), företrädesvis utdatafilen från 6.2.1. Denna fil behöver placeras i en lägre katalog (mapp) som heter ”filnamn”. I linje 50 av shell script, tilldela en ”filnamn” för Para_4. - Visualisera den mänskliga IgH repertoaren av följande kommando:
$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
Obs: Indatafilen är filename.fna sekvensdata, helst utdatafilen av 6.2.3. Den här filen måste placeras i lägre katalog (mapp) som heter ”filnamn”. I linje 46 av shell script, tilldela en ”filnamn” för Para_4. - Visualisera mus IgL repertoaren genom följande kommando:
$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
Obs: Med denna rörledning, Igk Igl bearbetas och concomitantly. Indatafilen är filename.fna (sequence data), företrädesvis utdatafilen från 6.2.2. Den här filen måste placeras i den nedre katalog (mapp) som heter ”filnamn”. I linje 53 av shell script, tilldela en ”filnamn” för Para_4. Utdata filens namn slutar med ”_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” ger koordinaterna för ett tvådimensionellt diagram (figur 3, IgL). - Visualisera den mänskliga IgL repertoaren av följande kommando:
$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
Obs: Med denna rörledning, Igk Igl bearbetas och concomitantly. Indatafilen är filename.fna sekvensdata, helst utdatafilen av 6.2.4. Denna fil behöver placeras i en lägre katalog (mapp) som heter ”filnamn”. I linje 53 av shell script, tilldela ”filnamn” för Para_4. Den utfilnamet som slutar med ”_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” ger koordinaterna för ett tvådimensionellt diagram (figur 4, IgL).
- Visualisera mus IgH repertoaren genom följande kommando:
Representative Results
Antikropp repertoarer av mus
Ett perspektiv av en murin antikropp repertoar som helhet kan erhållas från celler eller vävnader som mjälte, benmärg, lymfkörtel eller blod. Figur 3 visar representativa resultat av IgM, IgG1, IgG2c och immunglobulin Ljusslinga (IgL) repertoarer från en naiv mus mjälte. Sammanfattningen av Läs numren visas i tabell 3. Till exempel 166,175/475,144 läsningar innehöll IgM-specifika underskrift sekvens (tabell 2) och 133,371/166,175 läsningar var VDJ-produktiva slutsatsen av IgBLAST19.
Figur 3 visar en repertoar profil av VDJ-rearrangering av 3D-VDJ-plot, där storleken på varje boll representerar det relativa antalet läsningar; med andra ord, antalet antikropp mRNA i hela B-celler. 3D-mesh består av 110 IGHV, 12 IGHD och 4 IGHJ, som justeras för att återspegla deras ordning på kromosomen. Dessutom samlades de gener som tvetydigt anvisat IgBLAST separat i den sista positionen för varje IGHV, IGHD och IGHJ, ger upphov till 7.215 noder i kub.
Dessutom visas i figur 3 är en 2D-VJ-tomt visar profilen för VJ-rearrangering IgL repertoar. Längden på varje stapel på denna tomt representerar det relativa antalet läsningar. X-axeln representerar 101 IGLVκ och 3 IGLVλ gener och y-axeln representerar 4 IGLJκ och 3 IGLJλ gener. Arter utan not V - och J-generna är representerade på rätt gränsen.
Regionen komplementaritet-bestämning 3 (CDR3) sekvenser av dessa produktiva läsningar, som ger upphov till majoriteten av antigen-bindande specificitet, ges i IgBLAST utgångar. Den CDR3 sekvenser kan analyseras statistiskt, inklusive biologiska eller tekniska replikat, som tidigare beskrivits8,10.
Human antikropp repertoarer
Ett perspektiv av en human antikropp repertoar som helhet kan analyseras från olika vävnader inklusive perifera mononukleära blodceller (PBMC) eller patologisk vävnad. Figur 4 visar representativa resultat av IgM, totalt IgG (IgG1, IgG2, IgG3 och IgG4), total IgA (IgA1 och IgA2), IgD, IgE och IgL repertoarer från normala PBMC. En sammanfattning av Läs numren visas i tabell 3. Till exempel 90,238/1,582,754 läsningar innehöll IgM-specifika underskrift sekvens och 67,896/90,238 läsningar var VDJ-produktiva.
VDJ rearrangering repertoar profil visas på en 3D-VDJ-tomt där storleken på varje boll representerar det relativa antalet läsningar; med andra ord, antalet antikropp mRNA från hela PBMC (figur 4). 3D-mesh består av 56 IGHV, 27 IGHD och 6 IGHJ, arrangera i rak linje i den ordning de visas på kromosomen. Dessutom representeras gener tvetydigt anvisat IgBLAST separat i den sista positionen för varje IGHV, IGHD och IGHJ, ger upphov till 11,172 noder i kub.
Profilen för VJ-rearrangering IgL repertoar är avbildad i en 2D-VJ-tomt där längden på varje stapel representerar det relativa antalet läsningar (figur 4). X-axeln representerar 41 IGLVκ och 32 IGLVλ gener och y-axeln representerar 5 IGLJκ och 5 IGLJλ gener. Un-kommenterad V - och J-generna är representerade på rätt gränsen.
Den mänskliga CDR3 sekvenser ges i IgBLAST utgångar och kan analyseras statistiskt som tidigare beskrivits8,10.
| Immunoglobulin klass | Känsla | Antisense |
| Mus immunglobulin tunga kedjor (C57BL/6) | ||
| IgM | AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC | GACATTTGGGAAGGACTGACT |
| IgG1 | AAAACGACACCCCCATCTGTC | GACAGATGGGGGTGTCGTTTT |
| (IgG1 variant) | AAAACAACACCCCCATCAGTC | GACTGATGGGGGTGTTGTTTT |
| IgG2c | AAAACAACAGCCCCATCGGTC | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgG3 | GTGATCCCGTGATAATCGGCT | AGCCGATTATCACGGGATCAC |
| IgA | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG |
| Mus immunglobulin lätta kedjor (C57BL/6) | ||
| Igκ | CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC | GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG |
| Igλ1 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG | CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ2 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG | CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ3 | TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG | CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ4 | TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG | CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA |
| Humant immunglobulin tunga kedjor | ||
| IgM | GGGAGTGCATCCGCCCCAAC | GTTGGGGCGGATGCACTCCC |
| IgG | GCTTCCACCAAGGGCCCATC | GATGGGCCCTTGGTGGAAGC |
| IgA | GCATCCCCGACCAGCCCCAA | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgD | GCACCCACCAAGGCTCCGGA | TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC |
| IgE | GCCTCCACACAGAGCCCATC | GATGGGCTCTGTGTGGAGGC |
| Humant immunglobulin lätta kedjor | ||
| Igκ | ACTGTGGCTGCACCATCTGC | GCAGATGGTGCAGCCACAGT |
| Igλ1, 2, 6 | GTCACTCTGTTCCCGCCCTC | GAGGGCGGGAACAGAGTGAC |
| Igλ3, 7 | GTCACTCTGTTCCCACCCTC | GAGGGTGGGAACAGAGTGAC |
Tabell 2: Sammanfattning av immunglobulin signatur sekvenser
| Mus IgH | Totalt läser | IgM | IgG1 | IgG2c | ||
| Ingång | 475,144 | |||||
| IgC-innehållande | 166,175 | 229,671 | 36 628 | |||
| VDJ-produktiva | 133,371 | 196,583 | 31,446 | |||
| Mus IgL | Totalt läser | IgKappa | IgLambda | |||
| Ingång | 527,668 | |||||
| IgC-innehållande | 178,948 | 21,446 | ||||
| VJ-produktiva | 160,924 | 16,988 | ||||
| Mänskliga IgH | Totalt läser | IgM | IgG | IgA | IgD | IgE |
| Ingång | 1,582,754 | |||||
| IgC-innehållande | 90,238 | 5,298 | 94,061 | 75,549 | 2 932 | |
| VDJ-produktiva | 67,896 | 2,775 | 78,203 | 56,495 | 3 | |
| Mänskliga IgL | Totalt läser | IgKappa | IgLambda | |||
| Ingång | 1,582,754 | |||||
| IgC-innehållande | 120,316 | 64,148 | ||||
| VJ-produktiva | 97,169 | 52,324 |
Tabell 3: Sammanfattning av Läs numren i experimenten
Figur 1: Schematisk bild av sekvensering strategi för att analysera antikroppar repertoarer i enskilda möss. A total-RNA från immun cellerna eller vävnaderna var omvänd-transkriberas och PCR-förstärkta med universal framåt primer och immunglobulin klass-specifika omvända primers. Amplikoner från varje immunglobulin klass var poolade och återges för nästa generations sekvensering. (B) biologiska replikerar såsom mjälte från C57BL/6 möss behandlades följande: totala RNAs var renas från mjälte prover, och cDNAs var förstärks av 5'-RACE med hjälp av universal primer och antikropp klass-specifika primer. De var sedan återges för nästa generations sekvensering med märkning primers för enskilda möss. Delar av figuren är anpassade från8 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk av databehandling flödesschema för att analysera antikroppar repertoarer i enskilda möss. Amplikon läsningar erhålls efter nästa generations sekvensering bearbetades enligt följande: (1) Läs sekvenser kontrollerades för förekomst av antikroppar klass-specifika signatur sekvenser; (2) sekvenser undersöktes för V, D och J gen fragment med IMGT/HighV-Quest eller IgBLAST; (3) sekvenser som innehåller en produktiv VDJ junction samlades; och (4) dessa sekvenser användes för analys av övergripande repertoar funktioner, CDR3, etc. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: globala datavisualisering för mus-antikropp repertoarer. Övergripande repertoar profiler för varje antikropp klass var visualiserat av 3D-VDJ-plot. X-axeln representerar 110 IGHV gener beställde som på kromosomen. Den y - och z - axeln representerar 12 IGHD och 4 IGHJ gener, respektive. Volymen av sfärer på varje nod representerar antalet läsningar. Röda områden: un-kommenterad V, D och J gener. IgL Läs distributioner visas på en 2D-VJ-tomt där längden på varje stapel representerar det relativa antalet läsningar. X-axeln representerar 101 x IGLVκ och 3 x IGLVλ gener och y-axeln representerar 4 x IGLJκ och 3 x IGLJλ gener. Un-kommenterad V och J generna finns representerade på rätt gränsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: globala datavisualisering för human antikropp repertoarer. Övergripande repertoar profiler för varje antikropp klass var visualiserat av 3D-VDJ-plot. X-axeln representerar 56 IGHV gener beställde som på kromosomen. Den y - och z - axeln representerar 27 IGHD och 6 IGHJ gener, respektive. Volymen av sfärer på varje nod representerar antalet läsningar. Röda områden: un-kommenterad V, D och J gener. Den IgL läser är klädd på 2D-VJ-tomten där längden på varje stapel representerar det relativa antalet läser. X-axeln representerar 41 x IGLVκ och 32 x IGLVλ gener och y-axeln representerar 5 x IGLJκ och 5 x IGLJλ gener. Un-kommenterad V - och J-generna är representerade på rätt gränsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den metod som beskrivs här använder NGS för antikropp RNA förstärks med metoden 5'-RACE. I motsats till metoder som använder degenererade 5'-VH gen primers, förstärks mRNA av varje antikropp klass jämnt med universella framåt primers. Dessutom möjliggör användningen av antisense grundfärger specifika för konstant-region 1 (CH1) av antikropp genen repertoar profilering av specifikt immunglobulin klasser. Detta är mycket fördelaktigt för dissekera klass-specifika antikroppssvaret samt jämföra naiva och immuniserade repertoarer8,9.
En troligen fallgrop för metoden är en brist på förstärkta immunglobulin meddelanden. Djupet av antikropp repertoar erhålls genom detta protokoll väsentligen beror på den PCR-amplifiering beskrivs i steg 3.1 och 3.2. Om repertoar djupet inte erhålls ordentligt, rekommenderas ändra företagets nyckeltal mall cDNA och primers i steg 3.2.1 eller 3.2.2 starkt.
Generellt är cirka 20% av antikropp läser produceras av NGS tvetydiga sekvenser21. Även med etablerade ”korrigering metoder”, 5-10% kvar tvetydiga3. Vi har därför analyseras sekvensen och filtreras raw-läsningar som innehåller signatur sekvenser motsvarar immunglobulin konstanta regioner (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, etc.). Därmed behov en analys av somatiska hyper-mutationer av noggranna undersökningar.
En av begränsningarna med denna metod är att immunglobulin tunga och lätta kedjan par kan inte utläsas. Därav är vyn repertoar som erhålls med denna metod inte holistisk. Det är dock möjligt att tillnärma de topprankade paren av statistisk analys av data10. Också, en ny metod för att sekvensen immunglobulin paren var rapporterade nyligen3,4.
Immunglobulin sekvenser i .fna utdata utvanns baserat på förekomsten av immunglobulin signatur gensekvenser. Genen V, D och J segment var sedan kommenterade och produktiviteten i V (D) J rearrangements bedömdes. Regionen komplementaritet-bestämning 3 (CDR3) sekvenser var också kommenterade. Dessa systematiska undersökningar av immunglobulin sekvenser i .fna data tillhandahölls med fördel av de IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Bygga en automatiserad bearbetning pipeline har dock fördelen att analysera stora experimentella data. Rörledningen anpassade för varje ändamål är möjligt att ställa in med hjälp av fristående IgBLAST protokoll19. Detta tillvägagångssätt måste grundläggande programmering läskunnighet men är mycket användbart för detaljerade analyser av immunglobulin systemet. De rörledningar som beskrivs är exempel på anpassade protokollet (figur 2).
Antalet antikropp läser ges i proportion till mängden antikroppar RNAs i provet, reflekterande antikropp beståndsdelarna av antikropp systemet på tid punkter5,8,25. Den metod som beskrivs här ger en fågelperspektiv av V (D) J konstitutionen av en antikropp repertoar använder R program8,18,26.
Global synvinkel IgM antikropp repertoarer av enskilda naiva möss visade en mycket VDJ-profil jämfört med de av IgG1 eller IgG2c8. Det rapporterades att VDJ kombinationer av omogna Zebrafiskar är mycket stereotypa9. Däremot redovisas mänskliga VDJ kombinationer vara mycket skev6. Mycket deterministiska VDJ-profilerna i naiva B-celler är förmodligen genereras antingen av skeva VDJ-omflyttningar eller negativa urval med auto-antigener presenteras i kroppen. Till exempel IGHV11-2 uttrycks prioriterat i fostrets IgM repertoar27 och denna dominans tillskrivs autoreactivity IGHV11-2 mot senescent erytrocyter27. Intressant, var IGHV11-2 också den vanligaste stora repertoaren i vår tidigare publicerade analys av naiva IgM8.
Den metod som beskrivs här är användbar för att dechiffrera antigen-lyhörd antikropp repertoarer av inklusive analysera antikropp-repertoar utrymmet genereras i enskilda organ, undvika oavsiktlig utelämnande av viktiga antikroppar repertoarer8, 10. Denna metod kan också granskningen av detaljerade antikropp nätverk dynamik, vilket skulle underlätta accelererade upptäckten av skyddande antikroppar mot nya framväxande patogener.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från AMED under Grant nummer JP18fk0108011 (KO och SI) och JP18fm0208002 (TS, KO, och YO), och ett bidrag från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik (15K 15159) till KO. Vi tackar Sayuri Yamaguchi och Satoko Sasaki med värdefulla tekniska bistånd. Vi vill tacka Editage (www.editage.jp) för engelska språket redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
References
- Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
- Tonegawa, S.
- Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
- Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
- Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
- Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).
- Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
- Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
- Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
- Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
- Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
- Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
- SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
- FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
- Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
- Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
- IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
- Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404 (2011).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
- Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
- IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
- Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
- rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
- Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).
