Summary
Her beskriver vi protokoller for analyse og visualisering af strukturen og forfatning af hele antistof repertoirer. Dette indebærer erhvervelse af enorme sekvenser af antistof RNA ved hjælp af næste generation sequencing.
Abstract
Den enorme tilpasningsevne af antigen anerkendelse af antistoffer er grundlaget for den erhvervede immune system. Trods vores forståelse for de molekylære mekanismer bag produktionen af de store repertoire af antistoffer af de erhvervede immunforsvar, har det ikke endnu kunnet nå frem til et samlet overblik over en komplet antistof repertoire. Især har B-celle repertoirer været betragtet som en sort boks på grund af deres astronomiske antal antistof kloner. Dog næste generation sequencing teknologier gør det muligt gennembrud for at øge vores forståelse af B-celle repertoire. I denne rapport beskriver vi en enkel og effektiv metode til at visualisere og analysere hele individuelle mus og humant antistof repertoirer. Fra den immune organer var repræsentativt fra milten i mus og perifert blod mononukleære celler i mennesker, total RNA parat, reverse transskriberet og forstærkes ved hjælp af metoden 5'-RACE. Ved hjælp af en universel fremad primer og antisense primere for antistof klasse-specifikke konstante domæner, var antistof mRNAs ensartet forstærkes i proportioner afspejler deres frekvenser i antistof populationer. Amplikoner blev sekventeret af næste generation sequencing (NGS), giver mere end 105 antistof sekvenser pr. immunologiske prøve. Vi beskriver protokollerne for antistof sekvens analyser herunder V D J-gen-segment annotation, en fugleperspektiv af antistof repertoire, og vores beregningsmetoder.
Introduction
Antistof-systemet er et af de grundlæggende principper for den erhvervede immune system. Det er yderst potent mod invaderende patogener på grund af sin store mangfoldighed, fine antigen anerkendelse specificitet og den klonal ekspansion af antigen-specifikke B-celler. Repertoire af antistof-producerende celler, B er anslået til at være mere end 1015 i en enkelt individuel1. Denne enorme mangfoldighed er genereret ved hjælp af VDJ gen rekombination i immunoglobulin genetiske loci2. Beskrivelse af hele B celle repertoirer og deres dynamiske ændringer i svar til antigen-vaccination er derfor udfordrende, men afgørende for en fuldstændig forståelse af antistofrespons mod invaderende patogener.
På grund af deres astronomiske mangfoldighed, har B-celle repertoirer været betragtet som en sort boks; dog, fremkomsten af NGS teknologi har aktiveret gennembrud til en øget forståelse af deres kompleksitet3,4. Hele antistof repertoirer er blevet med held analyseret, først og fremmest i zebrafisk5, derefter mus6, og mennesker6,7. Selvom NGS er nu blevet et stærkt værktøj i studiet af den adaptive immunrespons, mangler grundlæggende analyser af fællestræk og forskelligheder i antistof repertoirer blandt enkelte dyr.
I mus, blev det rapporteret, at IgM repertoirer er næsten identiske mellem enkeltpersoner, mens IgG1 og IgG2c er væsentligt forskellige mellem enkeltpersoner8. Ud over V-gen usage profile er observerede frekvens i VDJ-profil i naive perifere B celler meget lignende mellem enkeltpersoner8. Analyse af aminosyresekvenser af regionen VDJ viste også forekomsten af de samme junctional sekvenser i forskellige mus meget hyppigere end tidligere troede8. Disse resultater viser, at mekanismer til repertoire antistofdannelse kan være deterministiske snarere end stokastiske5,8,9. Processen med antistof repertoire udvikling i mus har også været med succes analyseret ved hjælp af NGS yderligere fremhæve NGS potentiale til at afdække antistof immunsystemet i detaljer10.
I denne rapport beskriver vi en enkel og effektiv metode til at visualisere og analysere et antistof repertoire på verdensplan.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført efter institutionelle retningslinjer og med samtykke fra det nationale Institut for smitsomme sygdomme Animal Care og brug udvalg. Prøvetagning af PBMC fra raske voksne frivillige, brugt som repræsentativt resultatet i denne betænkning, blev udført med godkendelse af den etiske komité af det nationale Institut for smitsomme sygdomme, Tokyo, Japan, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager ved hjælp af en etisk komité-godkendt form.
1. primer Design
- Designe en universel fremad primer til cDNA til at forstærke immunoglobulin mRNA uden bias fra PCR primere, som anvendes i 5'-RACE11,12 og SMART-PCR13 teknikker.
- Immunglobulin VH gen amplifikation, designe immunoglobulin klasse-specifikke sekvenser i regionen konstant som reverse primere8,14 (figur 1A).
Bemærk: Multiplex tag sekvenser kan føjes til nogen af disse primere til at mærke bibliotek molekylerne fra forskellige eksempelkilder. Sekvenser for indlejrede PCR kan også tilføjes, ifølge manualen kit bruges15.
| Universal fremad primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' |
| Omvendt primere for musen immunoglobuliner (Ref.8) | |
| IgM_CH1: | 5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 ' |
| IgG1_CH1: | 5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 ' |
| IgG2c_CH1: | 5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 ' |
| IgG3_CH1: | 5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3' |
| IgA_CH1: | 5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3' |
| Igκ_CH1: | 5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 ' |
| Omvendt primere for de humane immunglobuliner (Ref.14) | |
| IgM_CH1: | 5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 ' |
| IgG_CH1: | 5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 ' |
| IgD_CH1: | 5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 ' |
| IgA_CH1: | 5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 ' |
| IgE1_CH1: | 5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 ' |
| IgE2_CH1: | 5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 ' |
| Igκ_CH1: | 5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 ' |
Tabel 1: Primer sekvenser til PCR-amplifikation af immunoglobuliner
2. nukleinsyre Isolation fra immun celler og væv
Bemærk: Proceduren nedenfor er for udvinding af nukleinsyrer fra mus milten. Det er imidlertid gælder for andre immun væv og celler som lymfeknuder eller perifert blod mononukleære celler (PBMC) (figur 1B).
- Dissekere væv, f.eks., milt fra en 8-uge-forhenværende C57BL/6 mus og passerer en rustfrit stål mesh (200-400 µm) med 2 mL PBS buffer til at få spredt celler. Overføre cellesuspension til en 2,0 mL microcentrifuge rør, og der centrifugeres i 5 min. ved 600 × g og 4 ˚C. Supernatanten.
- Tilføje 800 µL af ACK lysing buffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7,2) til pellet, og der inkuberes i isbad i 2 min til at lyse røde blodlegemer i vævet.
- Vaske væv celler med 2 mL PBS 3 x, efterfulgt af centrifugering i 5 min. ved 600 × g og 4 ˚C.
- Tilføje 800 µL af fenol/guanidin isothiocyanat reagens til pellet, vortex grundigt, og der inkuberes ved ca. 25 ˚C i 5 min.
- Tilføj chloroform (200 µL), omrystes manuelt i 15 s, og derefter inkuberes i 2 min på ca. 25 ˚C.
- Adskille faserne efter centrifugering i 15 min. ved 12.000 × g og 25 ˚C og overføre den øverste vandige fase til en frisk tube.
- Tilføje et bind af 70% ethanol, vortex kort og anvende det til kolonnen silica spin.
- Elueres RNA med 30 – 100 µL vand.
- Kvantificere RNA begyndelseskoncentration ved hjælp af en fluorometer (Tabel af materialer).
- Gemme den oprensede RNA på-80 ˚C.
3. cDNA syntese og PCR-amplifikation
Bemærk: Metoden beskrevet nedenfor er baseret på 5'-RACE11,12 og SMART-PCR teknikker13. Detaljer og optimering af reaktionen er beskrevet i manualen om kit 15. Udgangsmaterialer for musen immunglobulin er udsnit fra trin 2.10. Udgangsmaterialer for Humant immunglobulin er udsnit fra humane væv, ex. PBMC, behandles som beskrevet i trin 2.3 til 2.10.
- Syntetisere første-streng cDNA fra 2 til 10 µg af total RNA skabelon ved hjælp af 5'-RACE cd'er primer (oligo-dT-holdige) og SMART-PCR oligonukleotid (Table of Materials) ifølge producentens instruktioner15.
- For mus immunoglobulin, PCR-Forstærk cDNA med high-fidelity DNA Polymerase ved hjælp af universelle fremad primer og immunoglobulin klasse-specifikke omvendt primere (tabel 1). Termisk cykling betingelserne som: 94 ˚C for 2 min og derefter 40 cyklusser af 94 ˚C til 30 s, 59 ˚C til 30 s og 72 ˚C til 30 s, efterfulgt af en sidste udvidelse skridt på 72 ˚C i 5 min.
Bemærk: Typisk eksperimenter forstærke IgM, IgG1, IgG2c, Igk og Igl immunoglobulin klasser at se på den naive, Th1-afhængige og Th2-afhængige B celler (figur 3). - Foretage den 1st PCR ved hjælp af universelle fremad primer og immunoglobulin klasse-specifikke omvendt primere (tabel 1) med tag sekvenser af humant immunglobulin. Omfatter indeks sekvenser for hver prøve af 2nd PCR ved hjælp af indeks sekvens primere. Brug følgende PCR betingelser og Taq-polymerase: 94 ˚C i 2 min., 21 cyklusser (1st PCR) eller 32 cyklusser (2nd PCR) på 94 ˚C til 30 s, 59 ˚C til 30 s, 72 ˚C til 30 s.
Bemærk: Typisk eksperimenter forstærke IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4), IgA (IgA1 og IgA2), IgE, Igk og Igl immunoglobulin klasser at se på alle B-cellepopulationer (figur 4).
- For mus immunoglobulin, PCR-Forstærk cDNA med high-fidelity DNA Polymerase ved hjælp af universelle fremad primer og immunoglobulin klasse-specifikke omvendt primere (tabel 1). Termisk cykling betingelserne som: 94 ˚C for 2 min og derefter 40 cyklusser af 94 ˚C til 30 s, 59 ˚C til 30 s og 72 ˚C til 30 s, efterfulgt af en sidste udvidelse skridt på 72 ˚C i 5 min.
- Electrophorese PCR-produkter på en agarosegel og rense 600 til 800 bp fragmenter ved hjælp af en silica membran spin-kolonne.
- Electrophorese prøve fra 3.2.1 eller 3.2.2 på 2%-agarosegel.
- Visualisere DNA bands på UV-transilluminator og punktafgifter gel-skive der indeholder det bredt bånd mellem 600-800 bp.
- Der tilsættes 10 mL af membran bindende løsning pr. 10 mg af gel skive. Blandes og inkuberes ved 50 – 65 ° C, indtil gel skive er helt opløst.
- Oploesningen gel på silica membran spin-kolonne. Vask en gang med vask buffer og elueres DNA med 50 mL nukleasen-gratis vand (Tabel af materialer).
- Kvantificere de rensede amplikoner med en fluorometer og pool amplikoner fra hver immunoglobulin klasse i lige store mængder til NGS sekvensering.
Bemærk: Normalt 2-10 mg amplikon DNA blev gendannet for hver immunoglobulin klasse. Bland hver prøveopløsning ligeligt i DNA mængde give anledning 50 mL opløsning indeholdende 10-20 ng DNA/mL. - Bestemme størrelsen og koncentration af biblioteker ved hjælp af en mikro-kapillær baseret elektroforese med DNA dimensionering chip (Tabel af materialer). Gemme biblioteker ved - 20 ° C.
4. NGS sekventering af biblioteker
- Generere en SampleSheet.cvs til sekvensering køre angive prøve navn indeksoplysninger og instruere til at anskaffe .fastq filer kun.
- Tø reagens patron (Table of Materials) og bibliotekerne.
- Gøre 0,2 N NaOH og fortyndes biblioteker for at opnå den ønskede molære koncentration.
- Skyl og tørlæg cellen flow. Tilsættes 600 mL fortyndet og denatureret bibliotek i brønden af reagens patron.
- Start sekventering Kør.
5. kvalitetskontrol af NGS Data
- Udføre kvalitetskontrol af FASTQ data ved hjælp af "FASTX-Toolkit"16.
Bemærk: En grundlæggende eksempel på parameterindstillingerne brugt er som følger:
fastq_quality_trimmer - v -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastq_quality_filter - v - q 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] - Formatere output-filer til "fasta nukleinsyre (.fna)" med følgende kommando:
fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]
6. udvinding og analyse af Immunoglobulin sekvenser fra .fna Data
Bemærk: Eksempel programmer blev gennemført i et UNIX-miljø. Kan du bruge dem som et eksempel henvisninger fordi ydeevne kan afhænge af det operativsystem og hardwaremiljø. Forfatterne påtager sig intet ansvar for fejl eller udeladelser. Programmeringssprog, Perl17, R18og nødvendige moduler skal installeres efter anvisningerne på den citerede hjemmesider. IgBLAST program skal være installeret i overensstemmelse med instruktionerne på passende hjemmeside19,20.
- Download følgende eksempler på interne programmer for repertoire analyser fra https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
03_PipeLine_Mouse.zip; Et sæt eksempel programmer for analyser af musen antistof sekvenser.
05_PipeLine_Human.zip; Et sæt eksempel programmer for analyser af humant antistof sekvenser. - Uddrag antistoffet læser i sekvens data: uddrag immunglobulin (Ig) sekvenser af hver Ig-klasse fra data (.fna) af et Perl-program, der søger signatur sekvenser i hver immunoglobulin konstant region (tabel 2).
- Musen immunoglobulin tunge kæde (indvendige gearnav) gener, uddrag læser af følgende kommando:
$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [Input filnavn] [Output filnavn (suffiks)] - For mus immunoglobulin lys kæde uddrag (IgL) gener læser af følgende kommando:
$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [Input filnavn] [Output filnavn (suffiks)] - Humant immunglobulin tunge kæde (indvendige gearnav) gener, uddrag læser af følgende kommando:
$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [Input filnavn] [Output filnavn (suffiks)] - Humant immunglobulin lys kæde (IgL) gener, uddrag læser af følgende kommando:
$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [Input filnavn] [Output filnavn (suffiks)]
- Musen immunoglobulin tunge kæde (indvendige gearnav) gener, uddrag læser af følgende kommando:
- Anmærke og kontrollere V (D) Jørgensen gen rekombination produktivitet:
Bemærk: Metoden beskrevet nedenfor udnytter standalone IgBLAST19 for anmærkning af V (D) Jørgensen gen segmenter i sekvensen. Indstille database for V (D) Jørgensen gener og parameterindstillinger for IgBLAST som beskrevet20.- Anmærke mus immunoglobulin tunge kæde (indvendige gearnav) gener af følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organisme mus - domain_system imgt-forespørgsel. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Anmærke mus immunoglobulin lys kæde (IgL) gener af følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organisme mus - domain_system imgt-forespørgsel. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Anmærke Humant immunglobulin tunge kæde (indvendige gearnav) gener af følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organisme human - domain_system imgt-forespørgsel. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Anmærke Humant immunglobulin lys kæde (IgL) gener af følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organisme human - domain_system imgt-forespørgsel. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.AUX-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
- Anmærke mus immunoglobulin tunge kæde (indvendige gearnav) gener af følgende kommando:
- Visualisere den globale funktionen af et antistof repertoire.
- Visualisere mus indvendige gearnav repertoire af følgende kommando:
$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
Bemærk: Inputfilen er filename.fna (sekvens data), helst outputfilen fra 6.2.1. Denne fil skal placeres i en lavere bibliotek (omslag) navnet "filename". I line 50 af shellscript, skal du tildele en "filnavn" for Para_4. - Visualisere den menneskelige indvendige gearnav repertoire af følgende kommando:
$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
Bemærk: Inputfilen er filename.fna rækkefølge data, helst output-fil af 6.2.3. Denne fil skal placeres i den nederste bibliotek (omslag) denne hedder "filnavn". I linje 46 af shellscript, skal du tildele en "filnavn" for Para_4. - Visualisere mus IgL repertoire af følgende kommando:
$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
Bemærk: Med denne rørledning, Igk og Igl behandles samtidig. Inputfilen er filename.fna (sekvens data), helst outputfilen fra 6.2.2. Denne fil skal placeres i den lavere bibliotek (omslag) navnet "filename". I linje 53 af shellscript, skal du tildele en "filnavn" for Para_4. Output-fil navn, slutter med "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" giver koordinater for en to-dimensionel søjlediagrammet (figur 3, IgL). - Visualisere den menneskelige IgL repertoire af følgende kommando:
$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
Bemærk: Med denne rørledning, Igk og Igl behandles samtidig. Inputfilen er filename.fna rækkefølge data, helst output-fil af 6.2.4. Denne fil skal placeres i en lavere bibliotek (omslag) navnet "filename". I linje 53 af shellscript, skal du tildele "filnavn" for Para_4. Outputfilnavn slutter med "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" giver koordinater for en to-dimensionel søjlediagrammet (figur 4, IgL).
- Visualisere mus indvendige gearnav repertoire af følgende kommando:
Representative Results
Antistof repertoirer af mus
Et perspektiv af en murine antistof repertoire som helhed kan være fremstillet af celler eller væv som milt, knoglemarv, lymfeknude eller blod. Figur 3 viser repræsentative resultater af IgM, IgG1, IgG2c og immunoglobulin lys kæde (IgL) repertoirer fra en naiv mus milt. Resumé af de Læs tal er vist i tabel 3. For eksempel, 166,175/475,144 læser indeholdt IgM-specifikke signatur sekvens (tabel 2) og 133,371/166,175 læser var VDJ-produktive udledes af IgBLAST19.
Figur 3 viser en repertoire profil af VDJ-omlejring af 3D-VDJ-plot, hvor størrelsen af hver kugle repræsenterer det relative antal læsninger; med andre ord, antallet af antistof mRNAs i hele B-celler. Den 3D-mesh består af 110 IGHV, 12 IGHD og 4 IGHJ, som er justeret til at afspejle deres rækkefølge på kromosom. Desuden blev gener tvetydigt tildelt af IgBLAST indsamlet særskilt i den sidste position for hver IGHV, IGHD og IGHJ linje, giver anledning til 7,215 noder i kasse.
Også, vist i figur 3 er en 2D-VJ-plot viser VJ-omlejring profil i IgL repertoire. Længden af hver bar på dette plot repræsenterer det relative antal læsninger. X-aksen repræsenterer 101 IGLVκ og 3 IGLVλ gener, og y-aksen repræsenterer 4 IGLJκ og 3 IGLJλ gener. Unannotated V - og J-gener er repræsenteret på de rigtige borderline.
Regionen komplementaritet-bestemmelse 3 (CDR3) sekvenser af disse produktive læser, som giver anledning til fleste af antigen-bindende specificitet, er givet i IgBLAST udgange. Den CDR3 sekvenser kan analyseres statistisk, herunder biologiske eller tekniske replikater, som tidligere beskrevet8,10.
Humant antistof repertoirer
Et perspektiv af et humant antistof repertoire som helhed kan analyseres fra forskellige væv, herunder perifert blod mononukleære celler (PBMC) eller patologisk væv. Figur 4 viser repræsentative resultater af IgM, total IgG (IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4), total IgA (IgA1 og IgA2), IgD og IgE IgL repertoirer fra normale PBMC. Et resumé af de Læs tal er vist i tabel 3. For eksempel, 90,238/1,582,754 læser indeholdt IgM-specifikke signatur sekvens og 67,896/90,238 læser var VDJ-produktive.
Profilen repertoire af VDJ omlejring er vist på en 3D-VDJ-plot, hvor størrelsen af hver kugle repræsenterer det relative antal læsninger; med andre ord, antallet af antistof mRNAs fra hele PBMC (figur 4). Den 3D-mesh består af 56 IGHV, 27 IGHD og 6 IGHJ, justeret i den rækkefølge, de vises på kromosom. Derudover repræsenteres gener tvetydigt tildelt af IgBLAST særskilt i den sidste position for hver IGHV, IGHD og IGHJ linje, giver anledning til 11,172 noder i kasse.
Profil af VJ-omlejring i IgL repertoire er afbildet i et 2D-VJ-plot, hvor længden af hver søjle repræsenterer det relative antal læsninger (figur 4). X-aksen repræsenterer 41 IGLVκ og 32 IGLVλ gener, og y-aksen repræsenterer 5 IGLJκ og 5 IGLJλ gener. Un-kommenteret V - og J-gener er repræsenteret på de rigtige borderline.
De menneskelige CDR3 sekvenser er givet i IgBLAST udgange og kan analyseres statistisk som tidligere beskrevet8,10.
| Immunglobulin klasse | Forstand | Antisensstoffer |
| Musen immunoglobulin tunge kæder (C57BL/6) | ||
| IgM | AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC | GACATTTGGGAAGGACTGACT |
| IgG1 | AAAACGACACCCCCATCTGTC | GACAGATGGGGGTGTCGTTTT |
| (IgG1 variant) | AAAACAACACCCCCATCAGTC | GACTGATGGGGGTGTTGTTTT |
| IgG2c | AAAACAACAGCCCCATCGGTC | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgG3 | GTGATCCCGTGATAATCGGCT | AGCCGATTATCACGGGATCAC |
| IgA | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG |
| Musen immunoglobulin lys kæder (C57BL/6) | ||
| Igκ | CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC | GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG |
| Igλ1 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG | CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ2 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG | CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ3 | TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG | CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ4 | TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG | CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA |
| Humant immunglobulin tunge kæder | ||
| IgM | GGGAGTGCATCCGCCCCAAC | GTTGGGGCGGATGCACTCCC |
| IgG | GCTTCCACCAAGGGCCCATC | GATGGGCCCTTGGTGGAAGC |
| IgA | GCATCCCCGACCAGCCCCAA | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgD | GCACCCACCAAGGCTCCGGA | TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC |
| IgE | GCCTCCACACAGAGCCCATC | GATGGGCTCTGTGTGGAGGC |
| Humant immunglobulin Lyskæder | ||
| Igκ | ACTGTGGCTGCACCATCTGC | GCAGATGGTGCAGCCACAGT |
| Igλ1, 2, 6 | GTCACTCTGTTCCCGCCCTC | GAGGGCGGGAACAGAGTGAC |
| Igλ3, 7 | GTCACTCTGTTCCCACCCTC | GAGGGTGGGAACAGAGTGAC |
Tabel 2: Oversigt over immunoglobulin signatur sekvenser
| Musen IgH | I alt læser | IgM | IgG1 | IgG2c | ||
| Input | 475,144 | |||||
| Regeringskonferencen-holdige | 166,175 | 229,671 | 36,628 | |||
| VDJ-produktive | 133,371 | 196,583 | 31,446 | |||
| Musen IgL | I alt læser | IgKappa | IgLambda | |||
| Input | 527,668 | |||||
| Regeringskonferencen-holdige | 178,948 | 21,446 | ||||
| VJ-produktive | 160,924 | 16,988 | ||||
| Menneskelige IgH | I alt læser | IgM | IgG | IgA | IgD | IgE |
| Input | 1,582,754 | |||||
| Regeringskonferencen-holdige | 90,238 | 5,298 | 94,061 | 75,549 | 2,932 | |
| VDJ-produktive | 67,896 | 2,775 | 78,203 | 56,495 | 3 | |
| Menneskelige IgL | I alt læser | IgKappa | IgLambda | |||
| Input | 1,582,754 | |||||
| Regeringskonferencen-holdige | 120,316 | 64,148 | ||||
| VJ-produktive | 97,169 | 52,324 |
Tabel 3: Oversigt over Læs numrene i eksperimenter
Figur 1: skematisk fremstilling af sekventering strategi til at analysere antistof repertoirer i individuelle mus. (A) total RNA fra immun celler eller væv var omvendt-transskriberet og PCR-forstærket ved hjælp af den universelle fremad primer og immunoglobulin klasse-specifikke reverse primere. Amplikoner fra hver immunoglobulin klasse blev samlet og gjort til næste generations sekvensering. (B) biologiske replikater såsom milt fra C57BL/6 mus blev behandlet som følger: samlede RNA'er blev renset fra milt prøver, og cDNAs blev forstærket af 5'-RACE ved hjælp af universelle primer og antistof klasse-specifikke primer. De blev derefter gjort til næste generation sequencing med mærkning primere for individuelle mus. Dele af figuren er tilpasset fra8 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af edb-rutediagram til analyse af antistof repertoirer i individuelle mus. Amplikon læser fremstillet efter næste generation sequencing blev behandlet som følger: (1) Læs sekvenser blev kontrolleret for tilstedeværelse af antistof klasse-specifikke signatur sekvenser; (2) sekvenser blev undersøgt for V, D, og J-gen fragmenter ved hjælp af IMGT/HighV-søgen og/eller IgBLAST; (3) de sekvenser, der indeholder en produktiv VDJ junction blev indsamlet; og (4) disse sekvenser blev brugt til analyse af samlede repertoire funktioner, CDR3, etc. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: globale datavisualisering for musen antistof repertoirer. De samlede repertoire profiler for hver antistof klasse blev visualiseret ved 3D-VDJ-plot. X-aksen repræsenterer 110 IGHV gener bestilt som på kromosom. Y - og z - aksen repræsenterer 12 IGHD og 4 IGHJ gener, henholdsvis. Mængden af kugler på hver node repræsenterer antallet læsninger. Røde kugler: un-kommenteret V, D og J gener. IgL læse distributioner er vist på en 2D-VJ-plot, hvor længden af hver søjle repræsenterer det relative antal læsninger. X-aksen repræsenterer 101 x IGLVκ og 3 x IGLVλ gener, og y-aksen repræsenterer 4 x IGLJκ og 3 x IGLJλ gener. De un-kommenteret V og J gener er repræsenteret på de rigtige borderline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: globale datavisualisering for humant antistof repertoirer. De samlede repertoire profiler for hver antistof klasse blev visualiseret ved 3D-VDJ-plot. X-aksen repræsenterer 56 IGHV gener bestilt som på kromosom. Y - og z - aksen repræsenterer 27 IGHD og 6 IGHJ gener, henholdsvis. Mængden af kugler på hver node repræsenterer antallet læsninger. Røde kugler: un-kommenteret V, D og J gener. IgL læsninger er klædt på 2D-VJ-plot, hvor længden af hver søjle repræsenterer det relative antal af læser. X-aksen repræsenterer 41 x IGLVκ og 32 x IGLVλ gener, og y-aksen repræsenterer 5 x IGLJκ og 5 x IGLJλ gener. Un-kommenteret V - og J-gener er repræsenteret på de rigtige borderline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Metoden beskrevet her udnytter NGS for antistof RNA forstærkes ved hjælp af metoden 5'-RACE. I modsætning til metoder, der bruger degenererede 5'-VHansen gen primere, forstærkes mRNAs af hver antistof klasse jævnt ved hjælp af universelle fremad primere. Anvendelse af antisense primere specifikke for konstant-region 1 (CH1) af antistof-genet kan desuden repertoire profilering af specifikke immunoglobulin klasser. Dette er meget gavnligt for dissekere den klasse-specifikke antistofrespons samt for sammenligning af naiv og immuniserede repertoirer8,9.
En allersnarest faldgrube i metoden er en mangel på forstærkede immunoglobulin meddelelser. Dybden af antistof repertoire fremstillet ved denne protokol betydeligt afhænger af PCR-amplifikation beskrevet i trin 3.1 og 3.2. Hvis repertoire dybde ikke opnås ordentligt, anbefales skiftende forhold til skabelon cDNA og primere i trin 3.2.1 eller 3.2.2 kraftigt.
Generelt, ca 20% af antistof læser produceret af NGS er tvetydig sekvenser21. Selv med etableret "korrektion metoder", 5-10% forblive tvetydig3. Vi, derfor analyseret sekvensen og filtreret rå læsninger indeholdende signatur sekvenser svarende til immunoglobulin konstant regioner (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, osv.). Dermed behov analyse af somatiske hyper-mutationer de omhyggelige undersøgelser.
En af begrænsningerne ved denne metode er at tunge immunoglobulin og lys kæde par ikke kan udledes. Visningen repertoire ved denne metode er derfor ikke holistisk. Det er dog muligt at tilnærme de top-ranking par af statistisk analyse af data10. Også, en roman metode til sekvens immunoglobulin par blev rapporteret seneste3,4.
Immunglobulin sekvenser i .fna outputdata blev udvundet, baseret på tilstedeværelsen af immunoglobulin signatur gensekvenser. V, D og J genet segmenter blev derefter kommenteret og produktiviteten i V (D) Jørgensen rearrangementer blev vurderet. Regionen komplementaritet-bestemmelse 3 (CDR3) sekvenser var også kommenteret. Disse systematiske undersøgelser af immunoglobulin sekvenser i .fna data blev med fordel fastsat af IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Opbygning af et automatiseret behandling pipeline har imidlertid merit til at analysere store eksperimentelle data. Rørledningen tilpasset til hvert formål er muligt at konfigurere ved hjælp af standalone IgBLAST protokol19. Denne tilgang har brug for grundlæggende programmering færdigheder men er meget nyttigt for detaljerede analyser af immunglobulin-systemet. Rørledningerne beskrevet er eksempler på tilpassede protokollen (figur 2).
Antallet af antistof læser, er proportional med mængden af antistof RNA'er i prøven, som afspejler antistof bestanddele af antistof system på givet tid point5,8,25. Metoden beskrevet her giver et fugleperspektiv af V (D) Jørgensen forfatningen af en antistof repertoire ved hjælp af R programmer8,18,26.
Den globale opfattelse af IgM-antistof repertoirer af individuelle naive mus viste en særdeles velbevarede VDJ-profil i forhold til de af IgG1 eller IgG2c8. Det blev rapporteret, at VDJ kombinationer af umodne zebrafisk er meget stereotype9. Derimod er menneskelige VDJ kombinationer rapporteret til at være meget skæv6. De yderst velbevarede deterministiske VDJ-profiler i naive B-celler er sandsynligvis genereret enten af skæv VDJ-rearrangementer eller negative udvalg med auto-antigener præsenteret i kroppen. For eksempel, IGHV11-2 udtrykkes fortrinsvis i føtal IgM repertoire27 og denne overvægt er tilskrevet autoreactivity af IGHV11-2 mod senescent erytrocytter27. Interessant, var IGHV11-2 også den mest almindelige store repertoire i vores tidligere udgivne analyse af naive IgM8.
Metoden beskrevet her er nyttig for decifrere antigen-responderende antistof repertoirer af portintervallet analysere antistof-repertoire plads genereret i individuelle organer, undgå utilsigtet udeladelsen af vigtige antistof repertoirer8, 10. Denne metode giver også mulighed for undersøgelse af detaljerede antistof netværk dynamik, der ville lette accelereret opdagelsen af beskyttende antistoffer mod nye patogener.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra AMED under tilskud antal JP18fk0108011 (KO og SI) og JP18fm0208002 (TS, KO og YO), og en licensbetaling fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi (15K 15159) til KO. Vi takker Sayuri Yamaguchi og Satoko Sasaki for de værdifulde tekniske bistand. Vi vil gerne takke Editage (www.editage.jp) til Dansk sprog redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
References
- Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
- Tonegawa, S.
- Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
- Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
- Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
- Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).
- Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
- Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
- Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
- Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
- Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
- Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
- SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
- FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
- Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
- Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
- IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
- Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404 (2011).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
- Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
- IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
- Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
- rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
- Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).
