Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור ניתוח ו ויזואליזציה של המבנה ואת חוקת כל נוגדן repertoires. פעולה זו כוללת הרכישה של רצפי העצום של שימוש הדור הבא רצפי RNA נוגדן.
Abstract
יכולת ההתאמה העצום של זיהוי אנטיגן באמצעות נוגדנים היא הבסיס של המערכת החיסונית הנרכש. למרות הבנתנו המנגנונים המולקולריים שבבסיס הייצור של הרפרטואר העצום של נוגדנים על ידי מערכות החיסון נרכש, זה עדיין לא התקבלה ניתן להגיע ראיה כוללת של רפרטואר נוגדן מלאה. בפרט, repertoires תא B התייחסו כקופסא שחורה בגלל שלהם מספר אסטרונומי של נוגדן שיבוטים. עם זאת, מפעיל טכנולוגיות הדור הבא רצף פריצות דרך להגדיל את ההבנה שלנו של הרפרטואר תא B. בדו ח זה, אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לחזות ולנתח נוגדן האנושי repertoires של עכבר נפרדות לגמרי. האיברים המערכת החיסונית, representatively מן הטחול בעכברים תאי תאי דם היקפיים בבני אדם, RNA הכולל היה מוכן, להפוך עיבד, הוגדל באמצעות שיטת 5'-מרוץ. באמצעות פריימר לפנים אוניברסלי antisense תחל לגבי התחומים קבועה מחלקה ספציפי נוגדן, נוגדן mRNAs היו מוגבר בצורה אחידה בפרופורציות המשקף את התדרים שלהם על האוכלוסיות נוגדן. Amplicons היו רציף על ידי הדור הבא רצפי (הגדרות), מניב יותר מ- 10 רצפים נוגדן5 עבור דגימה אימונולוגי. אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור ניתוחים רצף נוגדן כולל V (D) J-ג'ין-קטע ביאור, תצוגה ממעוף הציפור של הרפרטואר נוגדן ושיטות חישובית שלנו.
Introduction
מערכת נוגדנים היא אחד היסודות של מערכת החיסון נרכש. . זה חזק מאוד נגד הפולשים פתוגנים המגוון העצום שלה, ירידה לפרטים זיהוי אנטיגן בסדר וכתוצאה משובט הרחבה של אנטיגן ספציפי B תאים. הרפרטואר של תאי B מייצרי מוערך ביותר מ15 1יחידה של בודדים. המגוון עצום נוצר בעזרת VDJ ג'ין רקומבינציה גנטית לוקוסים בנוגדנים2. תיאור של repertoires את כל התא B ושינויים דינמיים שלהם בתגובה אנטיגן-חיסונים ולכן מאתגר, אבל חיוני להבנה מלאה של התגובה נוגדן נגד פולשים גורמי מחלה.
בגלל השונוּת אסטרונומיים, repertoires תא B התייחסו כקופסא שחורה; עם זאת, הופעתו של המיתרים הטכנולוגיה אפשרה פריצות דרך להבנה משופרת של המורכבות שלהם,3,4. כל נוגדן repertoires יש בהצלחה נותחו, קודם כל דג זברה5, אז עכברים6, ואת בני6,7. למרות המיתרים הפך כלי רב עוצמה במחקר של התגובה החיסונית אדפטיבית, ניתוח בסיסי של מכנה משותף, הבדלים נוגדן repertoires בקרב חיות בודדות חסרים.
בעכברים, נמסר כי repertoires IgM הם כמעט זהה בין אנשים, ואילו אלה שונה באופן מהותי בין יחידים8IgG1 ו IgG2c. בנוסף בפרופיל השימוש V-ג'ין, נצפתה שכיחות VDJ-פרופיל בתאי B היקפיים תמים דומה מאוד בין יחידים8. הניתוח של רצפי חומצות אמינו VDJ-באזור גם הראה את המופע של הרצף מהחיבור באותו בעכברים שונים בתדירות גבוהה הרבה יותר מאשר בעבר מחשבה8. תוצאות אלו מצביעים על כך מנגנוני היווצרות נוגדנים רפרטואר יכול להיות דטרמיניסטי ולא סטוכסטי5,8,9. תהליך ההתפתחות רפרטואר נוגדן בעכברים גם בהצלחה נותחה באמצעות הגדרות להדגיש עוד יותר את הפוטנציאל של המיתרים לחשוף את המערכת החיסונית של נוגדנים תוך פירוט10.
בדו ח זה, אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה כדי להמחיש וניתוח של רפרטואר נוגדן ברמה הגלובלית.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיים ובאישור ראש הוועדה הלאומית המכון של זיהומיות מחלות בעלי חיים טיפול שימוש. דגימה של PBMCs של מתנדבים מבוגרים בריאים, משמש התוצאה נציג בדו ח זה, היה לבצע עם האישור של ועדת האתיקה של לאומי המכון של המחלות הזיהומיות, טוקיו, יפן, ונכתב מדעת הושג מכל אחד מהמשתתפים באמצעות טופס שאושרו על-ידי ועדת האתיקה.
1. פריימר עיצוב
- עיצוב אוניברסלי פריימר לפנים כדי cDNA כדי להגביר את בנוגדנים mRNA ללא הטיה של PCR תחל ב- 5'-מרוץ11,12 וטכניקות13 חכם-PCR.
- עבור הגברה ג'ין VH בנוגדנים, לעצב את רצפי מחלקה ספציפי בנוגדנים באזור קבוע תחל הפוכה8,14 (איור 1 א').
הערה: ניתן להוסיף תג מולטיפלקס רצפים מכל אלה תחל לסמן מולקולות ספריית מקורות דגימה שונים. רצפי ה-PCR מקוננים ניתן גם להוסיף, לפי ספר ההוראות של ערכת שימוש15.
| פריימר לפנים אוניברסלי | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' |
| צבעי יסוד הפוך העכבר immunoglobulins (Ref.8) | |
| IgM_CH1: | 5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3' |
| IgG1_CH1: | 5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3' |
| IgG2c_CH1: | 5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3' |
| IgG3_CH1: | 5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3' |
| IgA_CH1: | 5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3' |
| Igκ_CH1: | 5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3' |
| Igλ_CH1: | 5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3' |
| צבעי יסוד הפוך האדם immunoglobulins (Ref.14) | |
| IgM_CH1: | 5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3' |
| IgG_CH1: | 5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3' |
| IgD_CH1: | 5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3' |
| IgA_CH1: | 5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3' |
| IgE1_CH1: | 5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3' |
| IgE2_CH1: | 5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3' |
| Igκ_CH1: | 5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3' |
| Igλ_CH1: | 5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3' |
טבלה 1: פריימר רצפי ה-PCR-הגברה של immunoglobulins
2. בידוד חומצת גרעין של תאים חיסוניים ורקמות
הערה: הנוהל כדלקמן הוא להפקת חומצות גרעין של הטחול העכבר. עם זאת, החלים על אחרים המערכת החיסונית רקמות, תאים אנושיים כגון בלוטות הלימפה או תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) (איור 1B).
- לנתח את רקמות, למשל, הטחול מ העכבר C57BL/6 בן שבוע 8, להעביר את זה דרך רשת נירוסטה (200-400 מיקרומטר) עם 2 מ של PBS מאגר להשיג התאים התפזרו. העברת התליה תא צינור microcentrifuge 2.0 mL, ו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 600 × g ו- 4 הלעפה תרוטרפמט. למחוק את תגובת שיקוע.
- להוסיף µL 800 ACK מאגר lysing (150 מ מ NH4קלרנית, KHCO 1 מ3, 0.1 מ מ נה2EDTA, pH 7.2) בגדר, דגירה על קרח למשך 2 דקות lyse תאי דם אדומים בתוך הרקמה.
- לשטוף את תאי רקמות עם 2 מ של PBS 3 x, ואחריו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 600 × g ו- 4 הלעפה תרוטרפמט.
- להוסיף µL 800 של ריאגנט isothiocyanate פנול/guanidine בגדר, מערבולת ביסודיות, דגירה -כ-25 הלעפה תרוטרפמט במשך 5 דקות.
- להוסיף כלורופורם (200 µL), לנער ידנית 15 s, ואז דגירה למשך 2 דקות כ-25 הלעפה תרוטרפמט.
- להפריד את השלבים על ידי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 12,000 × g ו- 25 הלעפה תרוטרפמט ולהעביר מימית השלב העליון צינור טריים.
- הוסף אמצעי אחסון אחד של 70% אתנול, מערבולת בקצרה ולהחיל אותו על העמודה ספין סיליקה.
- Elute את הרנ א עם 30 – 100 µL של מים.
- Quantitate הריכוז RNA ראשוני באמצעות של fluorometer (טבלה של חומרים).
- אחסן את הרנ א מטוהרים ב-80 הלעפה תרוטרפמט.
3. cDNA סינתזה ו- PCR-הגברה
הערה: בשיטה המתוארת להלן מבוסס על 5'-מרוץ11,12 ו חכם-PCR טכניקות13. הפרטים ואת אופטימיזציה של התגובה מתוארים בספר ההדרכה של ערכת ה- 15. החומרים ההתחלה עבור העכבר בנוגדנים הם הדוגמה מהצעד 2.10. חומרי המוצא בנוגדנים האדם הן דגימת רקמות אנושיות, אקס PBMC, התייחס כמתואר בצעדים 2.3 ל 2.10.
- לסנתז את cDNA הראשון-strand 2 עד 10 µg של תבנית הרנ א סה כ באמצעות פריימר תקליטורים 5'-מרוץ (oligo-dT-מכיל) ו- oligonucleotide חכם-PCR (טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן15.
- עבור העכבר נוגדנים cDNA להגביר את-PCR עם אמינות גבוהה DNA פולימראז באמצעות פריימר לפנים אוניברסלי בנוגדנים ספציפיים מחלקה הפוכה תחל (טבלה 1). הגדר את תנאי הרכיבה תרמי כמו: 94 הלעפה תרוטרפמט במשך 2 דקות, ואז 40 מחזורי הלעפה תרוטרפמט 94 ב-30 s, הלעפה תרוטרפמט 59 ב-30 s, ו- 72 הלעפה תרוטרפמט ב-30 s, ואחריו צעד סופי סיומת ב 72 הלעפה תרוטרפמט במשך 5 דקות.
הערה: ניסויים טיפוסי להגביר את שיעורי נוגדן IgM, IgG1, IgG2c, Igk, Igl להיראות תמים, תלויי-Th1 ו Th2 תלוית B תאים (איור 3). - עבור בנוגדנים אנושי, לבצע 1סנט באמצעות פריימר לפנים אוניברסלי בנוגדנים ספציפיים מחלקה הפוכה תחל (טבלה 1) עם תג רצפי ה-PCR. לכלול את רצפי אינדקס עבור כל דגימה על-ידי 2nd PCR באמצעות אינדקס רצף תחל. השתמש התנאים הבאים PCR של אנזימים: 94 הלעפה תרוטרפמט למשך 2 דקות, 21 מחזורים (1סנט PCR) או מחזורי 32 (2nd PCR) ב 94 הלעפה תרוטרפמט עבור 30 s, הלעפה תרוטרפמט 59 ב-30 s, הלעפה תרוטרפמט 72 ב-30 s.
הערה: ניסויים טיפוסי להגביר IgM IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ו- IgG4), איגה (IgA1 ו- IgA2), IgE, Igk Igl בנוגדנים ושיעורי להסתכל על כל האוכלוסיות תא B (איור 4).
- עבור העכבר נוגדנים cDNA להגביר את-PCR עם אמינות גבוהה DNA פולימראז באמצעות פריימר לפנים אוניברסלי בנוגדנים ספציפיים מחלקה הפוכה תחל (טבלה 1). הגדר את תנאי הרכיבה תרמי כמו: 94 הלעפה תרוטרפמט במשך 2 דקות, ואז 40 מחזורי הלעפה תרוטרפמט 94 ב-30 s, הלעפה תרוטרפמט 59 ב-30 s, ו- 72 הלעפה תרוטרפמט ב-30 s, ואחריו צעד סופי סיומת ב 72 הלעפה תרוטרפמט במשך 5 דקות.
- Electrophorese המוצרים PCR ג'ל agarose ולטהר 600-800 bp שברי באמצעות סיליקה ממברנה ספין-טור.
- Electrophorese המדגם 3.2.1 או 3.2.2 על 2% agarose ג'ל.
- לדמיין את הלהקות DNA UV-transilluminator, בלו הפרוסה-הג'ל המכיל את הלהקה רחבה בין 600-800 bp.
- להוסיף 10 מ של קרום מחייב פתרון לכל 10 מ ג של ג'ל פרוסה. לערבב, דגירה ב 50-65 ° C עד הפרוסה ג'ל היא התפרקה לחלוטין.
- העברת הפתרון ג'ל סיליקה ממברנה ספין-בעמודה. לשטוף פעם עם שטיפה מאגר, elute DNA עם 50 מ של מים נטולי נוקלאז (טבלה של חומרים).
- לכמת את amplicons מטוהרים עם amplicons fluorometer ובריכה מ בכל כיתה בנוגדנים בכמויות שוות על המיתרים רצף.
הערה: בדרך כלל, 2-10 מ"ג אמפליקון DNA שוחזר עבור כל מחלקה בנוגדנים. מערבבים כל פתרון מדגם באותה מידה בכמות הדנ א כדי לתת פתרון 50 מ ל עלייה המכיל 10-20 ng DNA/mL. - לקבוע את גודל ואת ריכוז של ספריות באמצעות אלקטרופורזה המבוסס על מיקרו-נים עם ה-DNA שנקודות צ'יפ (טבלה של חומרים). לאחסן את הספריות ב- 20 º C.
4. הגדרות רצף של ספריות
- צור SampleSheet.cvs עבור רצף הפעלה המציין לדוגמה השם, אינדקס מידע ולהורות להשיג .fastq קבצים בלבד.
- להפשיר את מחסנית ריאגנט (טבלה של חומרים) לבין הספריות.
- להפוך 0.2 N NaOH, לדלל את ספריות כדי להשיג את ריכוז מולרי הרצוי.
- שוטפים ומייבשים את התא זרימה. הוסף 600 מ של ספריית מדולל וחסר שפגע בסימני פתרון לתוך הבאר של מיכל הדיו מגיב.
- התחל רצף הפעלה.
5. בקרת איכות של הגדרות נתונים
- לבצע את בקרת האיכות של FASTQ נתונים באמצעות ה-"FASTX-ערכת"16.
הערה: דוגמה בסיסית של קביעות הפרמטר המשמש הוא כדלקמן:
fastq_quality_trimmer - v -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastq_quality_filter - v - q 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] - לעצב את קבצי פלט "חומצת גרעין fasta (.fna)" על ידי ביצוע הפקודה:
fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]
6. חילוץ וניתוח של אימונוגלובולינים רצפים מנתונים .fna
הערה: התוכניות דוגמה ךלהמב בסביבת UNIX. נא להשתמש בהם כמו למשל הפניות כי הביצועים תלויים מערכת ההפעלה ואת סביבת החומרה. המחברים לא מקבלים כל אחריות עבור שגיאות או השמטות. שפות תכנות, Perl17, R18ומודולים נדרש צריך להיות מותקן בהתאם להוראות מצוטט באתר אינטרנט. התוכנית IgBLAST צריך להיות מותקן בהתאם להוראות19,האתר המתאים20.
- הורד את הדוגמאות הבאות של תוכניות ללא צורך במיקור חוץ עבור ניתוח רפרטואר של https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
03_PipeLine_Mouse.zip; סט של תוכניות דוגמא עבור הניתוחים של העכבר נוגדן רצפים.
05_PipeLine_Human.zip; סט של תוכניות דוגמא עבור הניתוחים של רצפי נוגדנים אנושיים. - תמצית הנוגדן קורא נתונים רצף: לחלץ את רצפי אימונוגלובולינים (Ig) של כל מחלקה-Ig מן הנתונים (.fna) על-ידי תוכנית Perl הסורקת את רצפי חתימה בכל אזור קבוע אימונוגלובולינים (טבלה 2).
- על הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים העכבר, לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:
$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)] - עבור העכבר בנוגדנים שרשרת אור גנים (IgL) לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:
$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)] - על הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים אנושי, לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:
$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)] - על הגנים שרשרת אור (IgL) בנוגדנים אנושי, לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:
$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)]
- על הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים העכבר, לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:
- ביאור ולבדוק את הפרודוקטיביות של רקומבינציה גנים V (D) J:
הערה: בשיטה המתוארת להלן מנצל העצמאי IgBLAST19 הביאור מקטעי גנים V (D) J ברצף. להגדיר את מסד הנתונים עבור הגנים V (D) J קביעות הפרמטר עבור IgBLAST כמו שמתואר20.- ביאור הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים העכבר על ידי ביצוע הפקודה:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-אורגניזם העכבר - domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - ביאור הגנים שרשרת אור (IgL) בנוגדנים העכבר על ידי ביצוע הפקודה:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-אורגניזם העכבר - domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - ביאור הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים האנושית על ידי ביצוע הפקודה:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-אורגניזם אנושי - domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - ביאור הגנים שרשרת אור (IgL) בנוגדנים האנושית על ידי ביצוע הפקודה:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-אורגניזם אנושי - domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
- ביאור הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים העכבר על ידי ביצוע הפקודה:
- דמיינו התכונה העולמית של רפרטואר נוגדן.
- דמיינו את הרפרטואר וקשתות של עכבר על ידי ביצוע הפקודה:
$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
הערה: קובץ הקלט הוא filename.fna (רצף נתונים), רצוי בקובץ הפלט מ 6.2.1. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריה התחתון (תיקיה) בשם "filename". בשורה 50 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות שם "קובץ" עבור Para_4. - לדמיין את הרפרטואר IgH האנושית על ידי ביצוע הפקודה:
$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
הערה: קובץ הקלט הוא filename.fna רצף נתונים, רצוי בקובץ הפלט של 6.2.3. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריה התחתון (תיקיה) השם זה "filename". קו 46 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות שם "קובץ" עבור Para_4. - דמיינו את הרפרטואר IgL העכבר על ידי ביצוע הפקודה:
$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
הערה: עם צינור זה, Igk ו- Igl מעובדים/ת. קובץ הקלט הוא filename.fna (רצף נתונים), רצוי בקובץ הפלט מ 6.2.2. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריית התחתון (תיקיה) בשם "filename". קו 53 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות שם "קובץ" עבור Para_4. השם של קובץ הפלט, הסוף עם "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" נותן את קואורדינטות גרף עמודות דו-ממדי (איור 3, IgL). - דמיינו את הרפרטואר IgL האנושית על ידי ביצוע הפקודה:
$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
הערה: עם צינור זה, Igk ו- Igl מעובדים/ת. קובץ הקלט הוא filename.fna רצף נתונים, רצוי בקובץ הפלט של 6.2.4. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריה התחתון (תיקיה) בשם "filename". קו 53 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות "filename" עבור Para_4. שם הקובץ פלט המסתיימים "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" נותן את קואורדינטות גרף עמודות דו-ממדי (איור 4, IgL).
- דמיינו את הרפרטואר וקשתות של עכבר על ידי ביצוע הפקודה:
Representative Results
נוגדנים repertoires של העכבר
ניתן להשיג פרספקטיבה של רפרטואר נוגדן מאתר ככלל תאים או רקמות כגון הטחול, מוח עצם, הצומת לימפה או דם. איור 3 מראה תוצאות נציג של IgM, IgG1, IgG2c בנוגדנים שרשרת אור (IgL) repertoires מ הטחול בעכבר נאיבי. התקציר של המספרים שנקראו מוצג בטבלה3. לדוגמה, 166,175/475,144 קריאות הכיל רצף החתימה IgM ספציפי (טבלה 2), 133,371/166,175 קריאות היו VDJ פרודוקטיבי להסיק על ידי IgBLAST19.
איור 3 מראה פרופיל רפרטואר של VDJ-סידור על-ידי תלת-ממד-VDJ-עלילה, שבו הגודל של כל כדור מייצג את המספר היחסי של קריאות; במילים אחרות, מספר נוגדנים mRNAs בתאי B שלם. רשת השינוי תלת-ממדי מורכב 110 IGHV 12 IGHD, 4 IGHJ, אשר מיושרים כדי לשקף הסדר בכרומוזום. בנוסף, הגנים בצורה דו-משמעית שהוקצה על-ידי IgBLAST נאספו בנפרד במצב האחרון עבור כל קו IGHV, IGHD, IGHJ, והוליד צמתים 7,215 קוביות סטנדרטיות.
כמו כן, מוצגות באיור 3 2D-VJ-מגרש מציג את הפרופיל של VJ-התמורות ברפרטואר IgL. האורך של כל עמודה על מגרש זה מייצג את המספר היחסי של קריאות. ציר ה-x מייצג 101 IGLVκ ו- 3 גנים IGLVλ, ציר ה-y ומייצג 4 IGLJκ 3 גנים IGLJλ. Unannotated V - ו J-הגנים מיוצגים על הגבול הנכון.
האזור שקובעים משלימים את החסר 3 (CDR3) רצפים הקריאות האלה פרודוקטיבי, אשר מעוררים הרוב של אנטיגן מחייב ירידה לפרטים, ניתנות ב IgBLAST פלטי. CDR3 רצפי ניתן לנתח סטטיסטית, כולל ביולוגי או טכנית משכפל, כפי שתואר לעיל8,10.
נוגדנים אנושיים repertoires
נקודת מבט של רפרטואר נוגדן האנושית בכללותה ניתן לנתח מן הרקמות כולל תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) או רקמות פתולוגיים שונים. איור 4 מראה תוצאות נציג של IgM, סה כ IgG (IgG1 IgG2, IgG3, IgG4), סה כ איגה (IgA1 ו- IgA2), IgD, IgE, IgL repertoires מן PBMCs רגילה. תקציר של המספרים שנקראו מוצג בטבלה3. לדוגמה, 90,238/1,582,754 קריאות הכיל IgM הספציפי החתימה רצף, קריאות 67,896/90,238 היו VDJ-פרודוקטיבי.
לפרופיל רפרטואר של שחלוף VDJ מוצג ב- 3D-VDJ-מגרש שבו הגודל של כל כדור מייצג את המספר היחסי של קריאות; במילים אחרות, מספר נוגדנים mRNAs של כל PBMCs (איור 4). רשת השינוי תלת-ממדי מורכב 56 IGHV 27 IGHD, IGHJ 6, מיושרים לפי סדר הופעתם בכרומוזום. בנוסף, הגנים בצורה דו-משמעית שהוקצה על-ידי IgBLAST מיוצגים בנפרד במצב האחרון עבור כל קו IGHV, IGHD, IGHJ, והוליד צמתים 11,172 קוביות סטנדרטיות.
הפרופיל של VJ-התמורות ברפרטואר IgL מתואר ב- 2D-VJ-מגרש שבו האורך של כל עמודה מייצגת את המספר היחסי של קריאות (איור 4). ציר ה-x מייצג 41 IGLVκ, גנים IGLVλ 32, ציר ה-y ומייצג 5 IGLJκ 5 גנים IGLJλ. האו ם המבואר V - ו J-הגנים מיוצגים על הגבול הנכון.
הרצף האנושי CDR3 מקבלים IgBLAST פלטי, ניתן לנתח סטטיסטית כפי שתואר לעיל8,10.
| מחלקה אימונוגלובולינים | הגיוני | Antisense |
| העכבר בנוגדנים שרשראות כבדות (C57BL/6) | ||
| IgM | AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC | GACATTTGGGAAGGACTGACT |
| IgG1 | AAAACGACACCCCCATCTGTC | GACAGATGGGGGTGTCGTTTT |
| (IgG1 משתנה) | AAAACAACACCCCCATCAGTC | GACTGATGGGGGTGTTGTTTT |
| IgG2c | AAAACAACAGCCCCATCGGTC | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgG3 | GTGATCCCGTGATAATCGGCT | AGCCGATTATCACGGGATCAC |
| איגה | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG |
| העכבר בנוגדנים שרשראות אור (C57BL/6) | ||
| Igκ | CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC | GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG |
| Igλ1 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG | CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ2 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG | CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ3 | TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG | CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ4 | TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG | CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA |
| שרשראות כבדות בנוגדנים אנושי | ||
| IgM | GGGAGTGCATCCGCCCCAAC | GTTGGGGCGGATGCACTCCC |
| אג | GCTTCCACCAAGGGCCCATC | GATGGGCCCTTGGTGGAAGC |
| איגה | GCATCCCCGACCAGCCCCAA | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgD | GCACCCACCAAGGCTCCGGA | TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC |
| IgE | GCCTCCACACAGAGCCCATC | GATGGGCTCTGTGTGGAGGC |
| שרשראות אור בנוגדנים אנושי | ||
| Igκ | ACTGTGGCTGCACCATCTGC | GCAGATGGTGCAGCCACAGT |
| Igλ1, 2, 6 | GTCACTCTGTTCCCGCCCTC | GAGGGCGGGAACAGAGTGAC |
| Igλ3, 7 | GTCACTCTGTTCCCACCCTC | GAGGGTGGGAACAGAGTGAC |
טבלה 2: סיכום של הרצף החתימה אימונוגלובולינים
| העכבר וקשתות | סכום קוראת | IgM | IgG1 | IgG2c | ||
| קלט | 475,144 | |||||
| הועידה הבין-ממשלתית המכילים | 166,175 | 229,671 | 36,628 | |||
| VDJ-פרודוקטיבי | 133,371 | 196,583 | 31,446 | |||
| העכבר IgL | סכום קוראת | IgKappa | IgLambda | |||
| קלט | 527,668 | |||||
| הועידה הבין-ממשלתית המכילים | 178,948 | 21,446 | ||||
| VJ-פרודוקטיבי | 160,924 | 16,988 | ||||
| להכרזות אנושי | סכום קוראת | IgM | אג | איגה | IgD | IgE |
| קלט | 1,582,754 | |||||
| הועידה הבין-ממשלתית המכילים | 90,238 | 5,298 | 94,061 | 75,549 | 2,932 | |
| VDJ-פרודוקטיבי | 67,896 | 2,775 | 78,203 | 56,495 | 3 | |
| האדם IgL | סכום קוראת | IgKappa | IgLambda | |||
| קלט | 1,582,754 | |||||
| הועידה הבין-ממשלתית המכילים | 120,316 | 64,148 | ||||
| VJ-פרודוקטיבי | 97,169 | 52,324 |
טבלה 3: סיכום של המספרים שנקראו בניסויים
איור 1: ייצוג סכמטי של רצף אסטרטגיה לניתוח נוגדן repertoires בעכברים בודדים. (א) רנ א הכולל תאים חיסוניים או רקמות היה הפוך-עיבד ו PCR-מוגבר באמצעות פריימר לפנים אוניברסלי של, אימונוגלובולינים מחלקה ספציפית להפוך תחל. Amplicons של כל מחלקה בנוגדנים איחדו, שניתנו עבור הדור הבא רצפי. (B) הביולוגי משכפל כגון טחולים מ- C57BL/6 עכברים טופלו כדלקמן: RNAs סה כ היו מטוהרים מדגימות את הטחול ולאחר cDNAs היו מוגבר על ידי 5'-מרוץ באמצעות פריימר אוניברסלי נוגדן ספציפי מחלקה פריימר. הם היו אז שניתנו עבור הדור הבא רצפי עם תיוג צבעי יסוד עכברים בודדים. חלקים של הדמות מותאמים מ-8 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סכימטי של זרימה עיבוד הנתונים לניתוח נוגדן repertoires בעכברים בודדים. אמפליקון קריאות שהושג לאחר הדור הבא רצפי עובדו כדלקמן: רצפים קריאה (1) נבדקו נוכחות של נוגדנים ספציפיים מחלקה החתימה רצפים; (2) רצפים נבדקו לצורך המבקר, D, ו- J ג'ין שברים בעזרת IMGT/HighV-Quest ו/או IgBLAST; (3) רצפים המכיל צומת VDJ פרודוקטיבי נאספו; ו- (4) רצפים אלה שימשו לניתוח של תכונות הרפרטואר הכללי, CDR3, וכו אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ויזואליזציה של נתונים גלובלי עבור העכבר נוגדן repertoires. הפרופילים הרפרטואר הכללי של כל מחלקה נוגדן היו דמיינו ידי תלת-ממד-VDJ-עלילה. ציר ה-x מייצג את הגנים IGHV 110 הורה גם על כרומוזום. Y - ו z ציר מייצג 12 IGHD גנים IGHJ 4, בהתאמה. הנפח של הספירות בכל צומת מייצג את מספר הקריאות. כדורים אדומים: האו ם המבואר גנים V, D ו- J. IgL לקרוא הפצות מוצגים ב- 2D-VJ-מגרש שבו האורך של כל עמודה מייצגת את המספר היחסי של קריאות. ציר ה-x מייצג 101-IGLVκ ו- 3 גנים x IGLVλ, ומייצג ציר y 4-IGLJκ ו- 3 גנים x IGLJλ. הגנים V ו- J המבואר משולחים שאינם מיוצגים על הגבול הנכון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ויזואליזציה של נתונים גלובלי עבור האדם נוגדן repertoires. הפרופילים הרפרטואר הכללי של כל מחלקה נוגדן היו דמיינו ידי תלת-ממד-VDJ-עלילה. ציר ה-x מייצג את הגנים IGHV 56 הורה גם על כרומוזום. Y - ו z ציר מייצג 27 IGHD, גנים IGHJ 6, בהתאמה. הנפח של הספירות בכל צומת מייצג את מספר הקריאות. כדורים אדומים: האו ם המבואר גנים V, D ו- J. קריאות IgL נערכים ב- 2D-VJ-העלילה שבה האורך של כל עמודה מייצגת את המספר היחסי של קריאות. ציר ה-x מייצג 41-IGLVκ ו- 32 הגנים x IGLVλ וציר ה-y מייצג 5-IGLJκ ו- 5 גנים x IGLJλ. האו ם המבואר V - ו J-הגנים מיוצגים על הגבול הנכון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
השיטה המתוארת כאן מנצל הגדרות עבור RNA נוגדן מוגבר באמצעות שיטת 5'-מרוץ. בניגוד בשיטות המשתמשות מנוונת-5' VH ג'ין תחל, mRNAs של כל מחלקה נוגדנים הם מוגבר באופן שווה באמצעות תחל קדימה אוניברסלי. בנוסף, השימוש antisense תחל ספציפיות עבור אזור הקבוע 1 (CH1) של הגן נוגדן מאפשר רפרטואר פרופיל של מחלקות אימונוגלובולין ספציפי. . זה מועיל מאוד ניקוד התגובה נוגדן ספציפי הכיתה, כמו גם לצורך השוואת תמים וחיסון repertoires8,9.
כנחותים הסביר ביותר של השיטה היא דלות הודעות בנוגדנים מוגבר. העומק של נוגדן רפרטואר מתקבל באופן משמעותי על ידי פרוטוקול זה תלוי הגברה PCR שתואר בשלבים 3.1 ו- 3.2. אם עומק הרפרטואר לא מתקבל כראוי, לשנות את היחס של תבנית cDNA, תחל בשלבים 3.2.1 או 3.2.2 מומלץ מאוד.
בדרך כלל, כ-20% הקריאות נוגדן המיוצר על ידי המיתרים הם רצפים רב-משמעי21. אפילו עם הוקמה "שיטות תיקון", 5-10% נותרים רב-משמעי3. אנו, לכן, ניתח את הרצף, מסוננים קריאות גלם המכיל רצפי החתימה המתאימה לאזורים בנוגדנים קבוע (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, וכו '.). ומכאן הניתוח של היפר-מוטציות סומאטית זקוק הבחינות זהיר.
אחת המגבלות של שיטה זו הוא כי בנוגדנים כבד ולא שרשרת אור זוג מסוגלת להסיק. ומכאן התצוגה רפרטואר המתקבלות בשיטה זו אינה הוליסטית. עם זאת, ייתכן לאמוד את הזוגות בראש הדירוג לפי ניתוח סטטיסטי של נתוני ה-10. כמו כן, שיטה לרצף זוגות בנוגדנים היה דיווח לאחרונה3,4.
רצפי בנוגדנים בנתונים .fna פלט חולצו המבוסס על הנוכחות של אימונוגלובולינים ג'ין החתימה רצפים. הגן V, D ו- J מקטעים היו ואז מבואר ואת הפרודוקטיביות של V (D) J rearrangements היו העריכו. האזור שקובעים משלימים את החסר 3 (CDR3) רצפים היו גם מבואר. בדיקות אלה שיטתית של רצפי בנוגדנים בנתונים .fna מועיל נמסרו בידי IMGT/HighV-QUEST שרת22,23,24. אולם, בניית צינור לעיבוד ממוכן של יש את הכשרון לנתח את הנתונים ניסיוני הגדול. הצינור אישית לכל מטרה אפשרית להקים על-ידי שימוש העצמאי את פרוטוקול IgBLAST19. גישה זו אוריינות תכנות בסיסי אך הוא מאוד שימושי עבור ניתוח מפורט של מערכת בנוגדנים. הצינורות המתוארים הם הדוגמאות של פרוטוקול מותאם אישית (איור 2).
המספר של נוגדן קורא יחסי לסכום של נוגדן RNAs במדגם, המשקף את המרכיבים נוגדן של מערכת נוגדן-ניתנת זמן נקודות5,8,25. השיטה המתוארת כאן נותן ממעוף הציפור חוקת V (D) J רפרטואר נוגדן באמצעות R תוכניות8,18,26.
הנוף הכללית של נוגדן IgM repertoires של עכברים תמים בודדים חשף פרופיל VDJ שנשמרת מאוד לעומת אלה של IgG1 או IgG2c8. דווח כי VDJ שילובים של דג זברה לא בוגרת הם מאוד הסטראוטיפי9. לעומת זאת, האדם VDJ שילובים מדווחים להיות מוטה מאוד6. מאוד שנשמרת דטרמיניסטי VDJ-הפרופילים בתאים תמים B הם הבחירה כנראה גם שנוצר על ידי VDJ מוטה-rearrangements או שלילי עם auto-אנטיגנים מוצגים בגוף. לדוגמה, IGHV11-2 מתבטאת מעדיפים רפרטואר עוברית IgM27 , דומיננטיות זו מיוחסת את autoreactivity של IGHV11-2 נגד אריתרוציטים senescent27. מעניין, IGHV11-2 היה גם הרפרטואר העיקרי הנפוץ ביותר בניתוח שפורסמו בעבר שלנו של תמים IgM8.
השיטה המתוארת כאן הוא שימושי עבור פענוח מגיב אנטיגן נוגדן repertoires על-ידי ניתוח כולל את שטח נוגדן-רפרטואר שנוצר בודדים גופות, הימנעות השמטה מכוונת של מפתח נוגדנים repertoires8, 10. שיטה זו גם מאפשרת הבחינה של נוגדן מפורט רשת דינמיות, אשר להקל מואצת גילוי נוגדנים נגד החדשים המתעוררים פתוגנים.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של AMED תחת גרנט מספר JP18fk0108011 (KO ו- SI) ו JP18fm0208002 (TS KO, יו), ואת מענק הסיוע של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (15K 15159) כדי KO. אנו מודים Sayuri יאמאגוצ'י, סאסאקי Satoko לסיוע טכני יקר. ברצוננו להודות Editage (www.editage.jp) עבור עריכה בשפה האנגלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
References
- Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
- Tonegawa, S.
- Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
- Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
- Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
- Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).
- Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
- Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
- Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
- Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
- Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
- Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
- SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
- FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
- Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
- Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
- IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
- Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404 (2011).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
- Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
- IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
- Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
- rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
- Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).
