Summary
We beschrijven hier protocollen voor de analyse en visualisatie van de structuur en de Grondwet van hele antilichaam repertoires. Het gaat hierbij om de overname van grote sequenties van antilichaam RNA met behulp van de volgende generatie sequencing.
Abstract
Het enorme aanpassingsvermogen van antigeen erkenning door antilichamen is de basis van het verworven immune systeem. Ondanks ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de productie van het enorme repertoire van antilichamen door het verworven immune systemen, heeft het niet nog gelukt om te komen tot een totaalbeeld van een volledige antilichaam-repertoire. In het bijzonder, werden B-cel repertoires beschouwd als een zwarte doos vanwege hun astronomische aantal antilichaam klonen. Echter zijn volgende-generatie sequencing technologieën doorbraken te vergroten van ons begrip van het repertoire van de B-cel inschakelen. In dit verslag beschrijven we een eenvoudige en efficiënte methode om te visualiseren en analyseren van geheel afzonderlijke muis en menselijk antilichaam repertoires. Van immune organen was representatief van milt in muizen en perifere bloed mononucleaire cellen bij de mens, totaal RNA bereid, omgekeerde getranscribeerd en versterkt met behulp van de methode 5'-RACE. Met behulp van een universele voorwaartse primer en antisense inleidingen voor de constante domeinen van klasse-specifieke antilichaam, werden antilichaam mRNAs gelijkmatig versterkt in verhoudingen als gevolg van hun frequenties in de antilichaam-populaties. De waarbij waren sequenced door volgende-generatie sequentiebepaling (NGS), opbrengst van meer dan 105 antilichaam reeksen per immunologische monster. We beschrijven de protocollen voor antilichaam reeks analyses, met inbegrip van V (D) J-gen-segment aantekening, een vogelperspectief van het antilichaam-repertoire, en onze rekenmethoden.
Introduction
De antilichaam-systeem is een van de fundamenten van het verworven immune systeem. Het is zeer potent tegen invasie ziekteverwekkers als gevolg van de enorme verscheidenheid, fijne antigeen erkenning specificiteit en de klonale uitbreiding van antigeen-specifieke B-cellen. Het repertoire van B-cellen produceren van antilichaam wordt geschat op meer dan 1015 in een enkele individuele1. Deze enorme verscheidenheid wordt gegenereerd met behulp van VDJ recombinatie van het gen in de immunoglobuline genetische loci2. Beschrijving van de gehele B-cel repertoires en hun dynamische veranderingen in reactie op het antigeen-immunisatie is dus uitdagende, maar essentieel voor een compleet begrip van de antistofrespons tegen invasie ziekteverwekkers.
Vanwege hun astronomische diversiteit, werden B-cel repertoires beschouwd als een zwarte doos; echter heeft de komst van NGS technologie doorbraken tot een verbeterde begrip van hun complexiteit3,4ingeschakeld. Hele antilichaam repertoires hebben met succes geanalyseerd, om te beginnen in de zebravis5, dan muizen6, en mensen6,7. Hoewel NGS nu een krachtig instrument in de studie van de adaptieve immuunrespons geworden, ontbreken fundamentele analyses van de raakvlakken en verschillen in antilichaam repertoires onder individuele dieren.
Bij muizen, werd gemeld dat de IgM-repertoires bijna identiek tussen individuen, zijn terwijl die van IgG1 en IgG2c aanzienlijk tussen individuen8 verschillen. Naast V-gen gebruik profiel is de waargenomen frequentie van VDJ-profiel in de perifere B-cellen naïef zeer vergelijkbaar tussen individuen8. De analyse van het aminozuur sequenties van de VDJ-regio bleek het vóórkomen van de dezelfde regulates sequenties ook veel vaker dan eerder gedachte8in verschillende muizen. Deze resultaten wijzen erop dat de mechanismen voor de vorming van antilichaam repertoire deterministische in plaats van stochastische5,8,9kunnen zijn. Het proces van de ontwikkeling van het repertoire van het antilichaam in muizen heeft ook met succes geanalyseerd met behulp van NGS verder wil het potentieel van NGS te ontdekken van het immuunsysteem antilichamen in detail10.
In dit verslag beschrijven we een eenvoudige en efficiënte methode om te visualiseren en analyseren van een antilichaam repertoire op mondiaal niveau.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de institutionele en met de goedkeuring van het nationale Instituut van besmettelijke ziekten Animal Care en gebruik Comité. Bemonstering van PBMCs van gezonde volwassen vrijwilligers, gebruikt als het representatief resultaat in dit verslag werd uitgevoerd met de goedkeuring van de ethische commissie van het National Institute of Infectious Diseases, Tokio, Japan, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van iedere deelnemer een ethische commissie goedgekeurde formulier te gebruiken.
1. primer Design
- Ontwerpen van een universele voorwaartse primer aan cDNA te versterken van de immunoglobuline mRNA zonder vooringenomenheid van PCR primers, zoals gebruikt in de 5'-RACE11,12 en SMART-PCR13 technieken.
- Voor de immunoglobuline VH gene amplificatie, ontwerpt u de immunoglobuline klasse-specifieke opeenvolgingen in de constante regio als omgekeerde inleidingen8,14 (figuur 1A).
Opmerking: Multiplex label sequenties kunnen worden toegevoegd aan een van deze inleidingen op het etiket van de moleculen van de bibliotheek uit verschillende monster bronnen. Sequenties voor genestelde PCR kunnen ook toegevoegd worden, volgens de handleiding van de kit gebruikt15.
| Universele voorwaartse primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' |
| Omgekeerde inleidingen voor de muis immunoglobulinen (Ref.8) | |
| IgM_CH1: | 5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 ' |
| IgG1_CH1: | 5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 ' |
| IgG2c_CH1: | 5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 ' |
| IgG3_CH1: | 5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3' |
| IgA_CH1: | 5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3' |
| Igκ_CH1: | 5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 ' |
| Omgekeerde inleidingen voor de humane immunoglobulines (Ref.14) | |
| IgM_CH1: | 5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 ' |
| IgG_CH1: | 5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 ' |
| IgD_CH1: | 5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 ' |
| IgA_CH1: | 5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 ' |
| IgE1_CH1: | 5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 ' |
| IgE2_CH1: | 5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 ' |
| Igκ_CH1: | 5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 ' |
| Igλ_CH1: | 5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 ' |
Tabel 1: Primer sequenties voor PCR-amplificatie van immunoglobulinen
2. nucleïnezuur isolatie van Immune cellen en weefsels
Opmerking: De onderstaande procedure is voor de extractie van nucleic zuren van de milt van de muis. Het is echter van toepassing op andere immuun weefsel en menselijke cellen zoals lymfklieren of perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) (figuur 1B).
- Ontleden de weefsel, bijvoorbeeld, de milt van de muis van een 8-week-oude C57BL/6 en het passeren van een roestvrij stalen gaas (200 tot 400 µm) met 2 mL PBS buffer te verkrijgen van verspreide cellen. De celsuspensie overbrengen in een tube van 2,0 mL microcentrifuge en centrifuge voor 5 min op 600 × g - en 4 ˚C. Verwijder het supernatant.
- 800 µL van ACK lysing buffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM nb2EDTA, pH 7,2) toevoegen aan de pellet en incubeer op ijs gedurende 2 minuten lyse van rode bloedcellen in het weefsel.
- Wassen van de weefselcellen met 2 mL PBS 3 x, gevolgd door centrifugeren voor 5 min op 600 × g - en 4 ˚C.
- 800 µL van fenol/guanidine isothiocyanaat reagens toevoegen aan de pellet, vortex grondig, en Incubeer bij ongeveer 25 ˚C gedurende 5 minuten.
- Chloroform (200 µL) toevoegen, schudden handmatig voor 15 s, en vervolgens Incubeer gedurende 2 min op ongeveer 25 ˚C.
- Scheiden van de fasen door centrifugeren gedurende 15 minuten op 12.000 × g en 25 ˚C en de bovenste waterfase overbrengen in een verse buis.
- Toevoegen van een volume van 70% ethanol, vortex kort en toepassen op de silica spin kolom.
- Elueer de RNA met 30-100 µL van water.
- Kwantificeren van RNA beginconcentratie met behulp van een Fluorimeter (Tabel van materialen).
- Bewaar de gezuiverde RNA bij-80 ˚C.
3. cDNA synthese en PCR versterking
Opmerking: De onderstaande methode is gebaseerd op de 5'-RACE11,12 en SMART-PCR technieken13. De details en de optimalisatie van de reactie worden beschreven in de handleiding van de kit- 15. De grondstoffen voor muis immunoglobuline zijn de steekproef uit stap 2.10. De grondstoffen voor menselijk immunoglobuline zijn de steekproef uit menselijke weefsels, ex. PBMC, behandeld zoals beschreven in stappen 2.3 tot en met 2.10.
- De eerste fronten cDNA van 2 tot 10 µg totaal RNA sjabloon met behulp van de 5'-RACE CDS primer (oligo-dT-bevattende) en SMART-PCR-oligonucleotide (Tabel of Materials) volgens de fabrikant instructies15synthetiseren.
- Voor de muis immunoglobuline, cDNA PCR-versterken met hifi-de Polymerase van DNA met behulp van de universele voorwaartse primer en immunoglobuline klasse-specifieke omgekeerde inleidingen (tabel 1). De thermische fietsen voorwaarden als: 94 ˚C voor 2 minuten, dan 40 cycli van 94 ˚C voor 30 s, 59 ˚C voor 30 s, en 72 ˚C voor 30 s, gevolgd door een stap van de laatste uitbreiding op 72 ˚C gedurende 5 minuten.
Opmerking: Typische experimenten versterken IgM, IgG1, IgG2c, Igk en Igl immunoglobulin klassen om te kijken naar de naïeve, Th1-afhankelijke en Th2-afhankelijke B cellen (Figuur 3). - Voor het menselijk immunoglobuline, verrichten de 1st PCR met behulp van de universele voorwaartse primer en immunoglobuline klasse-specifieke omgekeerde inleidingen (tabel 1) met label sequenties. Opnemen van de sequenties van de index voor elk monster door 2nd PCR gebruikend index reeks inleidingen. Gebruik de volgende PCR voorwaarden en de polymerase van Taq: 94 ˚C gedurende 2 minuten, 21 cycli (1st PCR) of 32 cycles (2nd PCR) op 94 ˚C voor 30 s, 59 ˚C voor 30 s, 72 ˚C voor 30 s.
Opmerking: Typische experimenten versterken IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 en IgG4), IgA (IgA1 en IgA2), IgE, Igk en Igl immunoglobuline-klassen om te kijken naar alle B-cel populaties (Figuur 4).
- Voor de muis immunoglobuline, cDNA PCR-versterken met hifi-de Polymerase van DNA met behulp van de universele voorwaartse primer en immunoglobuline klasse-specifieke omgekeerde inleidingen (tabel 1). De thermische fietsen voorwaarden als: 94 ˚C voor 2 minuten, dan 40 cycli van 94 ˚C voor 30 s, 59 ˚C voor 30 s, en 72 ˚C voor 30 s, gevolgd door een stap van de laatste uitbreiding op 72 ˚C gedurende 5 minuten.
- De PCR producten op een agarose gel electrophorese en te zuiveren van 600 tot 800 bp fragmenten een silica membraan spin-kolom gebruiken.
- Het monster van 3.2.1 of 3.2.2 op 2% agarose gel electrophorese.
- Visualiseren van de DNA-bands op UV-transilluminator en de accijnzen het gel-segment met de brede band tussen 600 tot 800 bp.
- Voeg 10 mL van de membraan bindoplossing per 10 mg gel segment. Meng en Incubeer bij 50-65 ° C, totdat het segment gel volledig is opgelost.
- Breng de gel-oplossing op silica membraan spin-kolom. Een keer wassen met wassen buffer en elueer DNA met 50 mL nuclease-gratis water (Tabel van materialen).
- Kwantificeren van de gezuiverde waarbij met een Fluorimeter en zwembad waarbij van elke klasse van immunoglobulin in gelijke hoeveelheden voor NGS sequencing.
Opmerking: Doorgaans, 2-10 mg amplicon DNA werd teruggevonden voor elke klasse van immunoglobulin. Meng elke monsteroplossing even in DNA bedrag om stijging 50 mL oplossing met 10-20 ng DNA/mL te geven. - Bepalen de grootte en de concentratie van bibliotheken met behulp van een micro-capillair gebaseerde elektroforese met DNA sizing chip (Tabel van materialen). Opslaan van de bibliotheken bij - 20 ° C.
4. NGS sequentiebepaling van bibliotheken
- Genereren van een SampleSheet.cvs voor de volgorde uitvoeren opgeven monster naam, indexgegevens en instrueren .fastq-bestanden alleen downloaden.
- Ontdooi de reagens cartridge (Tabel van materialen) en de bibliotheken.
- Maken van 0,2 N NaOH en Verdun de bibliotheken om te verkrijgen van de gewenste Molaire concentratie.
- Spoel en droog de stroom-cel. Voeg 600 mL verdunde en gedenatureerde bibliotheek oplossing in het putje van de reagens cartridge.
- Start de volgorde uitvoeren.
5. controle van de kwaliteit van de gegevens van het NGS
- Het uitvoeren van controle op de kwaliteit van FASTQ gegevens met behulp van de "FASTX-Toolkit"16.
Opmerking: Een eenvoudig voorbeeld van de parameterinstellingen gebruikt is als volgt:
fastq_quality_trimmer - v -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastq_quality_filter - v - q 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] - Formaat van de output bestanden te "fasta, nucleic zuur (.fna)" door het volgende commando:
fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]
6. extractie en analyse van immunoglobuline-sequenties van .fna gegevens
Opmerking: Het voorbeeld programma's werden uitgevoerd in een UNIX-omgeving. Gebruik ze als een voorbeeld verwijst naar omdat de prestatie kan afhangen van het besturingssysteem en de hardware milieu. De auteurs accepteren geen enkele aansprakelijkheid voor fouten of weglatingen. De programmeertalen, Perl17R18en benodigde modules moeten worden geïnstalleerd volgens de aanwijzingen op de genoemde websites. het IgBLAST-programma moet worden geïnstalleerd volgens de aanwijzingen op de juiste website19,20.
- Downloaden van de volgende voorbeelden van interne programma's voor analyses van het repertoire van https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
03_PipeLine_Mouse.zip; Een aantal voorbeeld programma's voor de analyses van muis antilichaam sequenties.
05_PipeLine_Human.zip; Een aantal voorbeeld programma's voor de analyses van sequenties van menselijke antilichamen. - Extract het antilichaam in de sequencedata leest: uittreksel van de sequenties van de immunoglobuline (Ig) van elke Ig-klasse uit de gegevens (.fna) door een Perl programma dat de handtekening sequenties in elke constante regio van immunoglobuline (tabel 2 zoekt).
- Voor de muis immunoglobulin zware ketting (IgH) genen, pak de leest door het volgende commando:
$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [Input bestandsnaam] [Output bestandsnaam (achtervoegsel)] - Voor de muis immunoglobulin lichtketting uitpakken (IgL) genen de leest door het volgende commando:
$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [Input bestandsnaam] [Output bestandsnaam (achtervoegsel)] - Voor de genen van het menselijk immunoglobuline zware ketting (IgH), pak het leest door de volgende opdracht:
$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [Input bestandsnaam] [Output bestandsnaam (achtervoegsel)] - Voor de genen van het menselijk immunoglobuline lichtketting (IgL), pak het leest door de volgende opdracht:
$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [Input bestandsnaam] [Output bestandsnaam (achtervoegsel)]
- Voor de muis immunoglobulin zware ketting (IgH) genen, pak de leest door het volgende commando:
- Aantekeningen en de productiviteit van V (D) J gen recombinatie controleren:
Opmerking: De hieronder beschreven methode maakt gebruik van standalone IgBLAST19 voor de aantekening van V (D) J gen segmenten in de reeks. De database voor de genen van V (D) J en de parameterinstellingen voor IgBLAST als beschreven20instellen.- Aantekeningen de muis immunoglobulin zware ketting (IgH) genen door het volgende commando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organisme muis - domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Aantekeningen de muis immunoglobulin lichtketting (IgL) genen door het volgende commando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organisme muis - domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Aantekeningen van de genen van het menselijk immunoglobuline zware ketting (IgH) door het volgende commando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organisme menselijke - domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Aantekeningen van de genen van het menselijk immunoglobuline lichtketting (IgL) door het volgende commando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organisme menselijke - domain_system imgt-query. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
- Aantekeningen de muis immunoglobulin zware ketting (IgH) genen door het volgende commando:
- Visualiseer de globale functie van een antilichaam-repertoire.
- Visualiseer de muis IgH repertoire door het volgende commando:
$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
Nota: De input file is filename.fna (sequencedata), bij voorkeur het uitvoerbestand van 6.2.1. Dit bestand moet worden geplaatst in een lagere directory (map) met de naam "bestandsnaam". Toewijzen in 50 lijn van de shell-script, een "bestandsnaam" voor Para_4. - Visualiseer de menselijke IgH repertoire door het volgende commando:
$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
Nota: De input file is filename.fna sequencedata, bij voorkeur het uitvoerbestand van 6.2.3. Dit bestand moet worden geplaatst in de lagere directory (map) die naam is "bestandsnaam". Toewijzen in lijn 46 van de shell-script, een "bestandsnaam" voor Para_4. - Visualiseer de muis IgL repertoire door het volgende commando:
$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
Opmerking: Met deze pijpleiding, Igk en Igl verwerkt gelijktijdig. Het invoerbestand is filename.fna (sequencedata), bij voorkeur het uitvoerbestand van 6.2.2. Dit bestand moet worden geplaatst in de lagere directory (map) met de naam "bestandsnaam". Toewijzen in regel 53 van het shellscript, een "bestandsnaam" voor Para_4. De output bestandsnaam, eindigend met "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" geeft de coördinaten van een twee-dimensionale staafdiagram (Figuur 3, IgL). - Visualiseer de menselijke IgL repertoire door het volgende commando:
$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
Opmerking: Met deze pijpleiding, Igk en Igl verwerkt gelijktijdig. Het invoerbestand is filename.fna sequencedata, bij voorkeur het uitvoerbestand van 6.2.4. Dit bestand moet worden geplaatst in een lagere directory (map) met de naam "bestandsnaam". In regel 53 van het shellscript, toewijzen "bestandsnaam" voor Para_4. De output bestandsnaam eindigend met "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" geeft de coördinaten van een twee-dimensionale staafdiagram (Figuur 4, IgL).
- Visualiseer de muis IgH repertoire door het volgende commando:
Representative Results
Antilichaam repertoires van muis
Een perspectief van een lymfkliertest antilichaam repertoire als geheel kan worden verkregen van cellen of weefsels zoals de milt, het beenmerg, lymfeklieren of bloed. Figuur 3 toont representatieve resultaten van IgM, IgG1, IgG2c en immunoglobuline lichtketting (IgL) repertoires van een naïef muis milt. De samenvatting van de Lees getallen wordt weergegeven in tabel 3. Bijvoorbeeld, 166,175/475,144 leest bevatte IgM-specifieke handtekening volgnummer (tabel 2) en 133,371/166,175 leest waren VDJ-productieve afgeleid door IgBLAST19.
Figuur 3 toont een repertoire-Profiel van VDJ-omlegging door 3D-VDJ-plot, waarin de grootte van elke bal het relatieve aantal leest vertegenwoordigt; met andere woorden, het aantal antilichaam mRNAs in hele B cellen. De 3D-Maas bestaat uit 110 IGHV, 12 IGHD en 4 IGHJ, die zijn aangepast aan hun volgorde op het chromosoom. Daarnaast werden de genen die dubbelzinnige toegewezen door IgBLAST afzonderlijk wordt ingezameld in de laatste positie voor elke IGHV, IGHD en IGHJ lijn, die aanleiding geven tot 7,215 knooppunten in de balk.
Ook, getoond in Figuur 3 is een 2D-VJ-plot weergegeven: het profiel van VJ-omlegging in het IgL repertoire. De lengte van elke balk op dit perceel vertegenwoordigt het relatieve aantal leest. De x-as staat 101 IGLVκ en 3 IGLVλ genen en de y-as voor 4 IGLJκ en 3 IGLJλ genen. De unannotated V - en J-genen zijn vertegenwoordigd in de juiste grens.
De complementariteit-bepalen regio 3 (CDR3) sequenties van deze productieve leest, die aanleiding tot de meerderheid van de antigeen-bindende specificiteit geven, worden gegeven in IgBLAST uitgangen. De CDR3 sequenties kunnen statistisch worden geanalyseerd, met inbegrip van biologische of technische replicaten, als eerder beschreven8,10.
Menselijk antilichaam repertoires
Een perspectief van een menselijk antilichaam repertoire als geheel kan worden geanalyseerd vanuit verschillende weefsels, met inbegrip van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) of pathologische weefsels. Figuur 4 toont representatieve resultaten van IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 en IgG4) totale, totale IgA (IgA1 en IgA2), IgD, IgE en IgL repertoires van normale PBMCs. Een samenvatting van de Lees getallen wordt weergegeven in tabel 3. Bijvoorbeeld, 90,238/1,582,754 leest bevatte IgM-specifieke handtekening sequentie en 67,896/90,238 leest VDJ-productief waren.
De repertoire-Profiel van VDJ omlegging is zichtbaar op een 3D-VDJ-perceel waarin de grootte van elke bal het relatieve aantal leest vertegenwoordigt; met andere woorden, het aantal antilichaam mRNAs van hele PBMCs (Figuur 4). De 3D-Maas bestaat uit 56 IGHV, 27 IGHD en 6 IGHJ, uitgelijnd in de volgorde waarin ze worden weergegeven op het chromosoom. Daarnaast zijn genen tweeslachtig toegewezen door IgBLAST afzonderlijk vertegenwoordigd in de laatste positie voor elke IGHV, IGHD en IGHJ lijn, die aanleiding geven tot 11,172 knooppunten in de balk.
Het profiel van VJ-omlegging in het IgL repertoire wordt afgebeeld in een 2D-VJ-complot waarin de lengte van elke staaf het relatieve aantal luidt als volgt (Figuur 4 vertegenwoordigt). 41 IGLVκ en 32 IGLVλ genen Hiermee geeft u de x-as en de y-as vertegenwoordigt 5 IGLJκ en 5 IGLJλ genen. De un-geannoteerde V - en J-genen zijn vertegenwoordigd in de juiste grens.
De menselijke CDR3-sequenties zijn gegeven in IgBLAST uitgangen en statistisch zoals eerder beschreven8,10kan worden geanalyseerd.
| Immunoglobuline klasse | Zin | Antisense |
| Muis immunoglobulin zware kettingen (C57BL/6) | ||
| IgM | AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC | GACATTTGGGAAGGACTGACT |
| IgG1 | AAAACGACACCCCCATCTGTC | GACAGATGGGGGTGTCGTTTT |
| (De variant van de IgG1) | AAAACAACACCCCCATCAGTC | GACTGATGGGGGTGTTGTTTT |
| IgG2c | AAAACAACAGCCCCATCGGTC | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgG3 | GTGATCCCGTGATAATCGGCT | AGCCGATTATCACGGGATCAC |
| IgA | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG |
| Muis immunoglobulin lichte kettingen (C57BL/6) | ||
| Igκ | CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC | GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG |
| Igλ1 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG | CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ2 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG | CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ3 | TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG | CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ4 | TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG | CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA |
| Menselijk immunoglobuline zware kettingen | ||
| IgM | GGGAGTGCATCCGCCCCAAC | GTTGGGGCGGATGCACTCCC |
| IgG | GCTTCCACCAAGGGCCCATC | GATGGGCCCTTGGTGGAAGC |
| IgA | GCATCCCCGACCAGCCCCAA | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgD | GCACCCACCAAGGCTCCGGA | TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC |
| IgE | GCCTCCACACAGAGCCCATC | GATGGGCTCTGTGTGGAGGC |
| Menselijk immunoglobuline lichte kettingen | ||
| Igκ | ACTGTGGCTGCACCATCTGC | GCAGATGGTGCAGCCACAGT |
| Igλ1, 2, 6 | GTCACTCTGTTCCCGCCCTC | GAGGGCGGGAACAGAGTGAC |
| Igλ3, 7 | GTCACTCTGTTCCCACCCTC | GAGGGTGGGAACAGAGTGAC |
Tabel 2: Overzicht van de immunoglobuline handtekening sequenties
| Muis IgH | Totaal leest | IgM | IgG1 | IgG2c | ||
| Input | 475,144 | |||||
| IgC-bevattende | 166,175 | 229,671 | 36,628 | |||
| VDJ-productieve | 133,371 | 196,583 | 31,446 | |||
| Muis IgL | Totaal leest | IgKappa | IgLambda | |||
| Input | 527,668 | |||||
| IgC-bevattende | 178,948 | 21,446 | ||||
| VJ-productieve | 160,924 | 16,988 | ||||
| Menselijke IgH | Totaal leest | IgM | IgG | IgA | IgD | IgE |
| Input | 1,582,754 | |||||
| IgC-bevattende | 90,238 | 5,298 | 94,061 | 75,549 | 2,932 | |
| VDJ-productieve | 67,896 | 2,775 | 78,203 | 56,495 | 3 | |
| Menselijke IgL | Totaal leest | IgKappa | IgLambda | |||
| Input | 1,582,754 | |||||
| IgC-bevattende | 120,316 | 64,148 | ||||
| VJ-productieve | 97,169 | 52,324 |
Tabel 3: Samenvatting van de Lees getallen in de experimenten
Figuur 1: schematische weergave van het rangschikken strategie voor het analyseren van antilichaam repertoires in individuele muizen. (A) totaal RNA van de immune cellen of weefsels was omgekeerde-transcribeerde en PCR-versterkt met behulp van de universele voorwaartse primer en immunoglobuline klasse-specifieke omgekeerde inleidingen. De waarbij van elke klasse van immunoglobulin werden samengevoegd en weergegeven voor het rangschikken van de volgende generatie. (B) de biologische repliceert zoals milt van C57BL/6 muizen werden behandeld als volgt: totale RNAs werden gezuiverd van milt monsters, en cDNAs werden versterkt door 5'-RACE met behulp van de universele primer en antilichaam klasse-specifieke primer. Ze werden vervolgens weergegeven voor het rangschikken van de volgende generatie met het labelen van inleidingen voor individuele muizen. Delen van de figuur zijn aangepast van8 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: schematische van gegevensverwerking stroomdiagram voor het analyseren van antilichaam repertoires in individuele muizen. Amplicon leest verkregen na volgende-generatie rangschikkend werden als volgt verwerkt: (1) Lees sequenties werden gecontroleerd op de aanwezigheid van antilichaam klasse-specifieke handtekening sequenties; (2) sequenties werden onderzocht voor de V, D, en J gen fragmenten met behulp van IMGT/HighV-Quest en/of IgBLAST; (3) de sequenties met een productieve VDJ junction werden verzameld; en (4) deze sequenties werden gebruikt voor de analyse van de algehele repertoire functies, CDR3, etc. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Global data visualisatie voor muis antilichaam repertoires. De algemene profielen van het repertoire van elke klasse van antilichaam waren gevisualiseerd door 3D-VDJ-plot. De x-as vertegenwoordigt 110 IGHV genen besteld als op het chromosoom. De y - en z - as vertegenwoordigt 12 IGHD en 4 IGHJ genen, respectievelijk. Het volume van bollen op elk knooppunt vertegenwoordigt het aantal leest. Rode bollen: un-geannoteerde V, D en J-genen. De IgL Lees distributies worden weergegeven op een 2D-VJ-perceel waarin de lengte van elke staaf het relatieve aantal leest vertegenwoordigt. 101 x IGLVκ en 3 x IGLVλ genen Hiermee geeft u de x-as en de y-as vertegenwoordigt 4 x IGLJκ en 3 x IGLJλ genen. De un-geannoteerde V en J genen zijn vertegenwoordigd in de juiste grens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Global data visualisatie voor menselijk antilichaam repertoires. De algemene profielen van het repertoire van elke klasse van antilichaam waren gevisualiseerd door 3D-VDJ-plot. De x-as vertegenwoordigt 56 IGHV genen besteld als op het chromosoom. De y - en z - as vertegenwoordigt 27 IGHD en 6 IGHJ genen, respectievelijk. Het volume van bollen op elk knooppunt vertegenwoordigt het aantal leest. Rode bollen: un-geannoteerde V, D en J-genen. De IgL leest zijn gekleed op het 2D-VJ-perceel waarin de lengte van elke staaf het relatieve aantal het luidt als volgt vertegenwoordigt. 41 x IGLVκ en 32 x IGLVλ genen Hiermee geeft u de x-as en de y-as vertegenwoordigt 5 x IGLJκ en 5 x IGLJλ genen. De un-geannoteerde V - en J-genen zijn vertegenwoordigd in de juiste grens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
De hier beschreven methode maakt gebruik van NGS voor antilichaam RNA versterkt met behulp van de methode 5'-RACE. In tegenstelling tot methoden die gebruikmaken van de gedegenereerde 5'-VH gene inleidingen, worden mRNAs van elke klasse van antilichaam versterkt gelijkmatig gebruikend universele voorwaartse inleidingen. Bovendien is het gebruik van antisense primers specifiek voor de constante-regio 1 (CH1) van de antilichaam-gen kan repertoire profilering van specifieke immunoglobulin klassen. Dit is zeer gunstig voor de ontrafeling van de Filipijnse-specifieke antilichaamrespons, alsmede voor het vergelijken van naïef en geïmmuniseerde repertoires8,9.
Een meest waarschijnlijke valkuil van de methode is een schaarste van versterkte immunoglobulin berichten. De diepte van antilichaam repertoire aanzienlijk door dit protocol verkregen, hangt af van de PCR versterking beschreven in stap 3.1 en 3.2. Als de diepte repertoire niet goed verkregen is, wordt wijzigen van de ratio's van sjabloon cDNA- en grondlagen in stappen 3.2.1 of 3.2.2 sterk aangeraden.
In het algemeen, zijn ongeveer 20% van het antilichaam luidt geproduceerd door NGS dubbelzinnig sequenties21. Zelfs met gevestigde "correctie methoden", 5-10% blijven dubbelzinnig3. Wij, daarom geanalyseerd van de volgorde en gefilterd rauwe leest met handtekening reeksen overeenkomt met immunoglobuline constante regio's (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, enz.). Vandaar moet de analyse van somatische hyper-mutaties zorgvuldig onderzoeken.
Een van de beperkingen van deze methode is dat immunoglobulin zwaar en lichtketting paar niet kan worden afgeleid. Vandaar is de repertoire-weergave volgens deze methode verkregen geen holistische. Het is echter mogelijk de top-ranking-paren door statistische analyse van de gegevens10onderling aan te passen. Ook een nieuwe methode in reeks de immunoglobuline paren werd onlangs gemeld3,4.
De immunoglobuline-sequenties in de uitvoergegevens .fna werden gehaald op basis van de aanwezigheid van immunoglobuline handtekening gensequenties. De V en D J gen segmenten werden vervolgens geannoteerde en de productiviteit van V (D) J herschikkingen werden beoordeeld. De complementariteit-bepalen regio 3 (CDR3) sequenties werden ook aantekeningen. Deze systematische onderzoeken van immunoglobuline sequenties in .fna gegevens werden nuttig verstrekt door de IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Bouw van een pijpleiding van de geautomatiseerde verwerking heeft echter de verdienste om de grote experimentele gegevens te analyseren. De pijpleiding aangepast voor elk doel kan worden ingesteld met behulp van de standalone IgBLAST protocol19. Deze aanpak moet programmeren basiskennis maar is erg handig voor gedetailleerde analyses van de immunoglobuline-systeem. De pijpleidingen die beschreven zijn de voorbeelden van de aangepaste protocol (Figuur 2).
Het aantal antilichaam leest krijgt in verhouding staan tot het bedrag van de RNAs antilichaam in de steekproef, als gevolg van de antilichaam-bestanddelen van het antilichaam-systeem op tijd punten5,8,25. De hier beschreven methode geeft een bird's eye view van de Grondwet van V (D) J van een antilichaam repertoire met behulp van R programma's8,18,26.
Het totaalbeeld van IgM antilichamen repertoires van individuele naïef muizen bleek een zeer geconserveerde VDJ-profiel in vergelijking met die van IgG1 of IgG2c8. Het was gemeld dat VDJ combinaties van onrijpe zebrafish zeer stereotiep9 zijn. In tegenstelling, zijn menselijke VDJ combinaties gemeld zeer scheef6. De zeer geconserveerde deterministische VDJ-profielen in naïef B cellen zijn waarschijnlijk gegenereerde ofwel door scheef VDJ-herschikkingen of negatieve selectie met auto-antigenen gepresenteerd in het lichaam. Bijvoorbeeld IGHV11-2 is bij voorkeur uitgedrukt in de foetale IgM repertoire27 en deze dominante wordt toegeschreven aan de autoreactivity van IGHV11-2 tegen verouderend erytrocyten27. Interessant, was IGHV11-2 ook de meest voorkomende grote repertoire in onze eerder gepubliceerde analyse van naïeve IgM8.
De hier beschreven methode is nuttig voor het ontcijferen van antigeen-responsieve antilichaam repertoires door het kunnen analyseren van de ruimte van de antilichaam-repertoire gegenereerd in afzonderlijke organen, het vermijden van onbedoelde weglating van belangrijke antilichaam repertoires8, 10. Deze methode maakt het ook mogelijk het onderzoek van gedetailleerde antilichaam netwerk dynamiek, die zou vergemakkelijken versnelde ontdekking van beschermende antistoffen tegen het nieuwe ziekteverwekkers.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van AMED onder Grant nummer JP18fk0108011 (KO en SI) en JP18fm0208002 (TS KO en YO), en een Grant-in-Aid van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (15K 15159) aan KO. Wij danken Sayuri Yamaguchi en Satoko Sasaki voor de waardevolle technische bijstand. We zouden graag bedanken Editage (www.editage.jp) voor het bewerken van de Engelse taal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
References
- Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
- Tonegawa, S.
- Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
- Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
- Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
- Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).
- Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
- Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
- Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
- Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
- Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
- Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
- SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
- FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
- Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
- Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
- IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
- Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404 (2011).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
- Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
- IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
- Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
- rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
- Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).
