Summary
Hier beschreiben wir Protokolle für die Analyse und Visualisierung der Struktur und Verfassung des ganzen Antikörper-Repertoire. Dies beinhaltet den Erwerb von riesigen Sequenzen Antikörper RNA Sequenzierung der nächsten Generation mit.
Abstract
Die immense Anpassungsfähigkeit der Antigen-Anerkennung durch Antikörper ist die Grundlage des erworbenen Immunsystems. Trotz unser Verständnis der molekularen Mechanismen der Produktion von großen Repertoire von Antikörpern durch das erworbene Immunsystem, wurde es noch nicht möglich, einen globalen Überblick über eine komplette Antikörper-Repertoire zu erreichen. B-Zell-Repertoires sind insbesondere wegen ihrer astronomischen Anzahl von Antikörper-Klone als Black Box betrachtet worden. Next Generation Sequencing Technologien ermöglichen jedoch Durchbrüche, unser Verständnis des B-Zell-Repertoires zu erhöhen. In diesem Bericht beschreiben wir eine einfache und effiziente Methode zum visualisieren und analysieren Sie ganz individuelle Maus und menschliche Antikörper-Repertoire. Aus den immun Organen war repräsentativ aus Milz bei Mäusen und peripheren mononukleären Blutzellen in den Menschen, Gesamt-RNS bereit, umgekehrte transkribiert, und verstärkt mit der 5'-RACE-Methode. Mit einer universellen vorwärts Grundierung und antisense Primer für die Antikörper klassenspezifische konstante Domänen, wurden Antikörper mRNAs einheitlich in Proportionen reflektieren ihre Frequenzen in der Bevölkerung Antikörper verstärkt. Der Amplifikate wurden von Next Generation Sequencing (NGS), Gewinnung von mehr als 105 Antikörper Sequenzen pro immunologische Probe sequenziert. Wir beschreiben die Protokolle für Antikörper Sequenzanalysen einschließlich V (D) J-gen-Segment Annotation, die Antikörper-Repertoire und unsere computergestützten Methoden der Vogelperspektive.
Introduction
Das Antikörper-System ist eine der Grundlagen des erworbenen Immunsystems. Es ist sehr stark gegen eingedrungene Krankheitserreger aufgrund seiner großen Vielfalt, feine Antigen-Anerkennung-Spezifität und die klonale Expansion der Antigen-spezifische B-Zellen. Das Repertoire von Antikörper-produzierenden B-Zellen wird geschätzt, dass mehr als 1015 in eine einzelne1. Diese immense Vielfalt wird mit Hilfe von VDJ gen Rekombination in der Immunglobulin-genetische Loci-2erzeugt. Beschreibung der gesamten B-Zell-Repertoires und deren dynamische Veränderungen in Reaktion auf Antigen-Immunisierung ist daher schwierig, aber unerlässlich für ein vollständiges Verständnis der Antikörperantwort gegen eindringende Krankheitserreger.
Wegen ihrer astronomischen Vielfalt gelten B-Zell-Repertoires als eine Black Box; Allerdings hat das Aufkommen der NGS Technologie Durchbrüche zu einem verbesserten Verständnis ihrer Komplexität3,4aktiviert. Ganze Antikörper-Repertoire wurden erfolgreich analysiert, erstens im Zebrafisch5, dann Mäuse6, und Menschen6,7. Obwohl NGS ein mächtiges Werkzeug in der Studie der adaptiven Immunantwort geworden ist, fehlen grundlegende Analysen über die Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Antikörper-Repertoire unter den einzelnen Tieren.
Bei Mäusen wurde berichtet, dass die IgM-Repertoire zwischen Individuen, nahezu identisch sind, während diejenigen von IgG1 und IgG2c zwischen Einzelpersonen8erheblich unterschiedlich sind. Neben Nutzungsprofil V-gen ist die beobachtete Häufigkeit der VDJ-Profil in naiven peripheren B-Zellen zwischen Einzelpersonen8sehr ähnlich. Die Analyse der Aminosäure-Sequenzen der VDJ-Region zeigte auch das Vorkommen der gleichen Knoten Sequenzen in verschiedene Mäuse viel häufiger als früher dachte8. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mechanismen für die Antikörperbildung Repertoire deterministische als stochastische5,8,9sein können. Der Prozess der Antikörper-Repertoire-Entwicklung bei Mäusen wurde auch erfolgreich analysiert mit NGS das Potenzial der NGS aufzudecken das Immunsystem Antikörper im Detail10hervorheben.
In diesem Bericht beschreiben wir eine einfache und effiziente Methode zur Visualisierung und Analyse einer Antikörper-Repertoire auf globaler Ebene.
Protocol
Alle Tierversuche wurden nach institutionellen Richtlinien und mit Zustimmung der nationalen Institut der ansteckenden Krankheiten Animal Care und Use Committee durchgeführt. Probenahme von PBMCs von gesunden Erwachsenen Probanden, als das repräsentative Ergebnis in diesem Bericht wurde mit Zustimmung der Ethik-Kommission des National Institute of Infectious Diseases, Tokio, Japan, aufgeführt und schriftliche Einwilligung verwendet wurde erhalten mit Hilfe von jedem Teilnehmer eine Ethik-Ausschuss genehmigt-Form.
(1) besser gekleideteres Design
- Eine universelle vorwärts Grundierung, cDNA, verstärken die Immunglobulin-Design mRNA ohne Voreingenommenheit von PCR-Primer, wie in der 5'-RACE11,12 und SMART-PCR13 Techniken verwendet.
- Für die Immunglobulin VH gen Verstärkung design Immunglobulin klassenspezifische Sequenzen in die konstante Region als reverse Primer8,14 (Abb. 1A).
Hinweis: Multiplex-Variablen Sequenzen können eines dieser Primer, beschriften Sie die Bibliothek-Moleküle aus unterschiedlichen Quellen hinzugefügt werden. Sequenzen für die verschachtelten PCR können auch hinzugefügt werden, gemäß dem Handbuch der Kit verwendet15.
| Universelle forward primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 " |
| Reverse Primer für die Maus Immunglobuline (Ref.8) | |
| IgM_CH1: | 5'-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 " |
| IgG1_CH1: | 5'-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 " |
| IgG2c_CH1: | 5'-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 " |
| IgG3_CH1: | 5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3 " |
| IgA_CH1: | 5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3 " |
| Igκ_CH1: | 5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 " |
| Igλ_CH1: | 5'-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 " |
| Reverse Primer für humane Immunglobuline (Ref.14) | |
| IgM_CH1: | 5'-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 " |
| IgG_CH1: | 5'-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 " |
| IgD_CH1: | 5'-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 " |
| IgA_CH1: | 5'-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 " |
| IgE1_CH1: | 5'-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 " |
| IgE2_CH1: | 5'-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 " |
| Igκ_CH1: | 5'-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 " |
| Igλ_CH1: | 5'-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 " |
Tabelle 1: Primer-Sequenzen für PCR-Amplifikation von Immunglobulinen
2. Nukleinsäure-Isolierung aus Zellen und Geweben
Hinweis: Die unten angegebene Verfahren ist für die Gewinnung von Nukleinsäuren aus der Maus Milz. Es gilt jedoch zu anderen immun Gewebe und menschlichen Zellen wie Lymphknoten oder peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) (Abbildung 1 b).
- Sezieren Sie das Gewebe, z.B., Milz von einem 8 Wochen alten C57BL/6-Maus zu und durchlaufen Sie eine Edelstahl Filtergewebe (200 bis 400 µm) mit 2 mL PBS-Puffer, verteilte Zellen zu erhalten. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 5 min bei 600 × g und 4 ° c. Verwerfen Sie den überstand.
- Das Pellet 800 µL ACK Lysiereinrichtung Puffer (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0, 1 mM Na2EDTA, pH 7,2) hinzu, und inkubieren Sie für 2 min zur lyse der roten Blutkörperchen in das Gewebe auf Eis.
- Waschen Sie die Gewebezellen mit 2 mL PBS 3 X, gefolgt durch Zentrifugation für 5 min bei 600 × g und 4 ° c.
- Das Pellet 800 µL Phenol/Guanidin erfolgt Reagenz hinzufügen Wirbel gründlich, und bei etwa 25 ° c für 5 min inkubieren.
- Chloroform (200 µL) hinzufügen, schütteln Sie manuell für 15 s, und dann für 2 min bei ca. 25 ° c inkubieren.
- Trennung der Phasen durch Zentrifugation für 15 min bei 12.000 × g und 25 ° c und die oberen wässrige Phase zu einem frischen Schlauch übertragen.
- Fügen Sie ein Volumen von 70 % Ethanol, Wirbel kurz und der Kieselsäure Spin Spalte zuweisen.
- Eluieren Sie die RNA mit 30-100 µL Wasser.
- Quantitate RNA Ausgangskonzentration mit einem Fluorometer (Table of Materials).
- Speichern Sie die gereinigte RNA bei-80 ° c.
(3) cDNA Synthese und PCR Verstärkung
Hinweis: Die unten beschriebene Methode basiert auf der 5'-RACE11,12 und SMART-PCR Techniken13. Die Details und die Optimierung der Reaktion sind im Handbuch des Kit- 15beschrieben. Die Ausgangsstoffe für Maus Immunglobulin sind die Probe aus Schritt 2.10. Die Ausgangsstoffe für Immunglobulin vom Menschen sind die Probe aus menschlichem Gewebe, z. B. PBMC, behandelt wie 2,3 bis 2.10 beschrieben.
- Die erste Strang cDNA von 2 bis 10 µg Gesamt RNA-Vorlage mit 5'-RACE-CDS-Primer (Oligo-dT-haltigen) und SMART-PCR Oligonukleotid (Table of Materials) laut des Herstellers Anweisungen15zu synthetisieren.
- Für die Maus Immunglobulin, PCR-verstärken cDNA mit High-Fidelity-DNA-Polymerase mit dem universellen vorwärts Grundierung und Immunglobulin klassenspezifische reverse Primer (Tabelle 1). Legen Sie die Radsport Thermik als: 94 ° c für 2 min, dann 40 Zyklen von 94 ° c für 30 s, 59 ° c für 30 s und 72 ° c für 30 s, gefolgt von einer letzten Erweiterung Schritt bei 72 ° c für 5 min.
Hinweis: Typische Experimente verstärken IgG1, IgG2c, Igk, IgM und Igl Immunglobulinklassen, naiv, Th1-abhängige und Th2-abhängigen B-Zellen (Abbildung 3) zu betrachten. - Durchführen Sie für Immunglobulin vom Menschen der 1St PCR mit dem universellen vorwärts Grundierung und Immunglobulin klassenspezifische reverse Primer (Tabelle 1) mit Tag-Sequenzen. Gehören die Index-Sequenzen für jede Probe durch 2Nd PCR unter Verwendung Index Sequenz Zündkapseln. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen und die Taq-Polymerase: 94 ° c für 2 min, 21 Zyklen (1St PCR) oder 32 Zyklen (2Nd PCR) bei 94 ° c für 30 s, 59 ° c für 30 s, 72 ° c für 30 s.
Hinweis: Typische Experimente verstärken, IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), IgA (IgA1 und IgA2), IgE, Igk und Igl Immunglobulinklassen zu betrachten alle B-Zell-Populationen (Abbildung 4).
- Für die Maus Immunglobulin, PCR-verstärken cDNA mit High-Fidelity-DNA-Polymerase mit dem universellen vorwärts Grundierung und Immunglobulin klassenspezifische reverse Primer (Tabelle 1). Legen Sie die Radsport Thermik als: 94 ° c für 2 min, dann 40 Zyklen von 94 ° c für 30 s, 59 ° c für 30 s und 72 ° c für 30 s, gefolgt von einer letzten Erweiterung Schritt bei 72 ° c für 5 min.
- Die PCR-Produkte auf einem Agarosegel electrophorese und reinigen von 600 bis 800 bp Fragmente mit einer Kieselsäure Membran Spin-Spalte.
- Die Probe von 3.2.1 und 3.2.2 auf 2 % Agarose-Gel electrophorese.
- Die DNA-Bänder auf UV-Transilluminator zu visualisieren und Verbrauchsteuern die Gel-Scheibe mit dem breiten Band zwischen 600 bis 800 bp.
- 10 mL der Membran verbindliche Lösung pro 10 mg Gel Slice hinzufügen. Mischen Sie und bei 50-65 ° C inkubieren Sie, bis das Gel Segment vollständig gelöst ist.
- Übertragen Sie die Gel-Lösung auf Kieselsäure Membran Spin-Spalte. Einmal waschen mit Waschpuffer und eluieren DNA mit 50 mL Nuklease-freies Wasser (Table of Materials).
- Die gereinigten Amplifikate mit einem Fluorometer und Pool Amplifikate aus jeder Immunglobulin-Klasse in gleicher Höhe für die NGS Sequenzierung zu quantifizieren.
Hinweis: In der Regel wurde 2-10 mg Amplikons DNA für jede Immunglobulin-Klasse erholt. Mischen Sie jede Probenlösung gleichermaßen in DNA-Menge, Aufstieg 50 mL Lösung enthält 10-20 ng DNA/mL zu geben. - Bestimmen Sie die Größe und Konzentration der Bibliotheken mit einer Mikro-Kapillare basierend Elektrophorese mit DNA-Dimensionierung Chip (Table of Materials). Speichern Sie die Bibliotheken bei - 20 ° C.
4. NGS Sequenzierung von Bibliotheken
- Erzeugen Sie eines SampleSheet.cvs für die Sequenzierung laufen die Angabe Probenname, Indexinformationen und weisen Sie an, um nur .fastq Dateien zu erhalten.
- Auftauen der Reagenzkassette (Table of Materials) und die Bibliotheken.
- Machen Sie 0,2 N NaOH zu und verdünnen Sie die Bibliotheken um die gewünschte molare Konzentration zu erhalten.
- Spülen und Trocknen der Messzelle. 600 mL verdünnt und denaturierte Bibliothek-Lösung in den Brunnen der Reagenzkassette hinzufügen.
- "Start" die Sequenzierung ausführen.
5. Kontrolle der Qualität von NGS Daten
- Führen Sie die Qualitätskontrolle der FASTQ Daten mit Hilfe der "FASTX-Toolkit"16.
Hinweis: Ein einfaches Beispiel für die Parameter-Einstellungen verwendet, lautet wie folgt:
Fastq_quality_trimmer - V -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
Fastq_quality_filter - V - Q 20 - p-80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
Fastx_reverse_complement - V -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] - Formatieren Sie die Ausgabedateien zu "Fasta-Nukleinsäure (.fna)" durch den folgenden Befehl:
Fastq_to_fasta - V - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]
6.-Extraktion und Analyse von Immunglobulin-Sequenzen von .fna Daten
Hinweis: Die Beispielprogramme wurden in einer UNIX-Umgebung implementiert. Bitte verwenden Sie sie als ein Beispiel Referenzen weil Leistung vom Betriebssystem und Hardware-Umgebung abhängig kann. Die Autoren keine Haftung für Fehler oder Auslassungen. Die Programmiersprachen, Perl17R18und benötigten Module müssen gemäß den Anweisungen auf den genannten Webseiten installiert werden. Das IgBLAST-Programm gemäß den Anweisungen auf der entsprechenden Webseite19,20installiert werden müssen.
- Die folgenden Beispiele von Inhouse-Programme für Repertoire Analysen von https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine herunterladen:
03_PipeLine_Mouse.zip; Eine Reihe von Beispiel-Programme für die Analysen von Maus-Antikörper-Sequenzen.
05_PipeLine_Human.zip; Eine Reihe von Beispiel-Programme für die Analysen von humanen Antikörpers Sequenzen. - Auszug der Antikörper in die Sequenzdaten liest: extrahieren Sie die Immunglobulin (Ig) Sequenzen der einzelnen Ig-Klassen aus den Daten (.fna) durch ein Perl-Programm, das die Signatur-Sequenzen in jedes Immunglobulin konstante Region (Tabelle 2) sucht.
- Extrahieren Sie für die Maus Immunglobulin schwere Kette (IgH) Gene die Lesevorgänge durch den folgenden Befehl:
$ Perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [Input Dateiname] [Ausgabe Dateiname (Suffix)] - Für die Maus Immunglobulin Leichtketten extrahieren (IgL) Gene die Lesevorgänge durch den folgenden Befehl:
$ Perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [Input Dateiname] [Ausgabe Dateiname (Suffix)] - Extrahieren Sie für die Immunglobulin vom Menschen schwere Kette (IgH) Gene die Lesevorgänge durch den folgenden Befehl:
$ Perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [Input Dateiname] [Ausgabe Dateiname (Suffix)] - Extrahieren Sie für die menschliche Immunglobulin Leichtketten (IgL) Gene die Lesevorgänge durch den folgenden Befehl:
$ Perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [Input Dateiname] [Ausgabe Dateiname (Suffix)]
- Extrahieren Sie für die Maus Immunglobulin schwere Kette (IgH) Gene die Lesevorgänge durch den folgenden Befehl:
- Kommentieren Sie und überprüfen Sie die Produktivität der V (D) J gen Rekombination:
Hinweis: Die unten beschriebene Methode nutzt Standalone IgBLAST19 für die Kommentierung der V (D) J gen-Abschnitte in der Reihenfolge. Die Datenbank für die V (D) J-Gene und die Parametereinstellungen für IgBLAST als beschrieben20festgelegt.- Beschriften Sie die Maus Immunglobulin schwere Kette (IgH) Gene durch den folgenden Befehl:
$ Igblastn-Germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-Germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-Germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-Organismus Maus - Domain_system Imgt-Abfrage. / $InFile-Auxiliary_data $IGDATA/Optional_ File/mouse_gl.AUX-Show_translation - Outfmt 7 >>. / $OutName - Beschriften Sie die Maus Immunglobulin Leichtketten (IgL) Gene durch den folgenden Befehl:
$ Igblastn-Germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-Germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-Germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-Organismus Maus - Domain_system Imgt-Abfrage. / $InFile-Auxiliary_data $IGDATA/Optional_ File/mouse_gl.AUX-Show_translation - Outfmt 7 >>. / $OutName - Beschriften Sie die Immunglobulin vom Menschen schwere Kette (IgH) Gene durch den folgenden Befehl:
$ Igblastn-Germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-Germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-Germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-Organismus Mensch - Domain_system Imgt-Abfrage. / $InFile-Auxiliary_data $IGDATA/Optional_ file/Human_gl.aux-Show_translation - Outfmt 7 >>. / $OutName - Beschriften Sie die Lichterkette (IgL) Gene Immunglobulin vom Menschen durch den folgenden Befehl:
$ Igblastn-Germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-Germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-Germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-Organismus Mensch - Domain_system Imgt-Abfrage. / $InFile-Auxiliary_data $IGDATA/Optional_ File/human_gl.AUX-Show_translation - Outfmt 7 >>. / $OutName
- Beschriften Sie die Maus Immunglobulin schwere Kette (IgH) Gene durch den folgenden Befehl:
- Visualisieren Sie die globale Funktion einer Antikörper-Repertoire.
- Visualisieren Sie die Maus Nabenschaltungen Repertoire mit dem folgenden Befehl:
$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
Hinweis: Die Eingabedatei ist filename.fna (Sequenzdaten), vorzugsweise die Ausgabedatei aus 6.2.1. Diese Datei muss in einem unteren Verzeichnis (Ordner) namens "Dateiname" platziert werden. Weisen Sie in Zeile 50 des Shell-Scripts ein "Dateiname" für Para_4. - Visualisieren Sie das menschliche IgH-Repertoire mit dem folgenden Befehl:
$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
Hinweis: Die Eingabedatei ist filename.fna Sequenzdaten, vorzugsweise der Ausgabedatei 6.2.3. Diese Datei muss im unteren Verzeichnis (Ordner), dass heißt "Dateiname". Weisen Sie in Zeile 46 der Shell-Skript zu "Dateiname" für Para_4. - Visualisieren Sie das Maus-IgL-Repertoire mit dem folgenden Befehl:
$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
Hinweis: Mit dieser Pipeline werden Igk und Igl begleitend bearbeitet. Die Eingabedatei ist filename.fna (Sequenzdaten), vorzugsweise die Ausgabedatei aus 6.2.2. Diese Datei muss im unteren Verzeichnis (Ordner) namens "Dateiname" platziert werden. Weisen Sie in Zeile 53 des Shell-Scripts ein "Dateiname" für Para_4. Die Ausgabe-Datei-Namen, endend mit "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" gibt die Koordinaten für ein zweidimensionales Balkendiagramm (Abbildung 3, IgL). - Visualisieren Sie das menschliche IgL-Repertoire mit dem folgenden Befehl:
$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
Hinweis: Mit dieser Pipeline werden Igk und Igl begleitend bearbeitet. Die Eingabedatei ist filename.fna Sequenzdaten, vorzugsweise der Ausgabedatei 6.2.4. Diese Datei muss in einem unteren Verzeichnis (Ordner) namens "Dateiname" platziert werden. Weisen Sie in Zeile 53 des Shell-Scripts zu "Dateiname" für Para_4. Der Name der Ausgabedatei endend mit "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" gibt die Koordinaten für ein zweidimensionales Balkendiagramm (Abbildung 4, IgL).
- Visualisieren Sie die Maus Nabenschaltungen Repertoire mit dem folgenden Befehl:
Representative Results
Antikörper-Repertoire der Maus
Eine Perspektive für ein murine Antikörper-Repertoire als Ganzes erhalten Sie von Zellen oder Geweben wie der Milz, dem Knochenmark, Lymphknoten oder Blut. Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse der IgM, IgG1, IgG2c und Immunglobulin Leichtketten (IgL) Repertoire aus einem naiven Maus Milz. Die Zusammenfassung der lesen Sie zahlen ist in Tabelle 3dargestellt. Z. B. 166.175/475.144 liest enthielt IgM-spezifische Signatur Sequenz (Tabelle 2) und 133.371/166.175 liest waren VDJ-produktive abgeleitet von IgBLAST19.
Abbildung 3 zeigt ein Repertoire-Profil von VDJ-Umlagerung von 3D-VDJ-Plot, in dem die Größe des jede Kugel die relative Anzahl der Lesevorgänge darstellt; Das heißt, die Anzahl der Antikörper mRNAs im ganzen B-Zellen. Das 3-d-Netz besteht aus 110 IGHV, 12 IGHD und 4 IGHJ, die entsprechend ihrer Reihenfolge auf dem Chromosom ausgerichtet sind. Darüber hinaus wurden die Gene doppeldeutig zugewiesen durch IgBLAST in der letzten Position für jede IGHV, IGHD und IGHJ Linie, was zu 7.215 Knoten in den Quader getrennt gesammelt.
Auch gezeigt in Abbildung 3 ein 2D-VJ-Plot zeigt das Profil der VJ-Neuordnung im IgL Repertoire. Die Länge der einzelnen Balken auf diesem Grundstück entspricht die relative Anzahl der Lesevorgänge. Die x-Achse repräsentiert 101 IGLVκ und 3 IGLVλ Gene, und die y-Achse steht für 4 IGLJκ und 3 IGLJλ Gene. Die Genomsequenz V - und J-Gene sind an der rechten Grenze vertreten.
Die Komplementarität-bestimmenden Region 3 (CDR3) Sequenzen von diesen produktiven liest, die die Mehrheit der Spezifität der Antigen-bindenen hervorrufen, werden gegeben in IgBLAST Ausgänge. Die CDR3, die Sequenzen statistisch analysiert werden können, einschließlich der biologischen oder technischen Wiederholungen als zuvor beschriebenen8,10.
Menschliche Antikörper-Repertoire
Eine Perspektive auf eine menschliche Antikörper-Repertoire als Ganzes kann aus verschiedenen Geweben einschließlich der peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) oder pathologische Gewebe analysiert werden. Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse der IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4) total, total (IgA1 und IgA2) IgA, IgD, IgE und IgL Repertoire von normalen PBMCs. Eine Zusammenfassung der lesen Sie zahlen ist in Tabelle 3dargestellt. Z. B. 90.238/1.582.754 liest enthielt IgM-spezifische Signatur Sequenz und 67.896/90.238 liest waren VDJ-produktiv.
Das Repertoire Profil VDJ Neuordnung zeigt sich auf einem 3D-VDJ-Grundstück in der Größe der jede Kugel die relative Anzahl der Lesevorgänge darstellt; Das heißt, die Anzahl der Antikörper mRNAs aus ganzen PBMCs (Abbildung 4). Das 3-d-Netz besteht aus 56 IGHV, 27 IGHD und 6 IGHJ, in der Reihenfolge wie auf dem Chromosom ausgerichtet. Darüber hinaus werden Gene doppeldeutig beauftragten IgBLAST separat in der letzten Position für jede IGHV, IGHD und IGHJ Linie, was zu 11.172 Knoten in den Quader dargestellt.
Das Profil von VJ-Neuordnung im IgL Repertoire ist in ein 2D-VJ-Plot dargestellt in dem die Länge der einzelnen Balken steht für die relative Anzahl der Lesevorgänge (Abbildung 4). Die x-Achse repräsentiert 41 IGLVκ und 32 IGLVλ Gene, und die y-Achse steht für 5 IGLJκ und 5 IGLJλ Gene. Die UN-kommentierte V - und J-Gene sind an der rechten Grenze vertreten.
Die menschlichen CDR3-Sequenzen sind in IgBLAST angegeben Ausgänge und statistisch wie zuvor beschrieben,8,10analysiert werden kann.
| Immunglobulin-Klasse | Sinn | Antisense |
| Maus-Immunglobulin schweren Ketten (C57BL/6) | ||
| IgM | AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC | GACATTTGGGAAGGACTGACT |
| IgG1 | AAAACGACACCCCCATCTGTC | GACAGATGGGGGTGTCGTTTT |
| (IgG1-Variante) | AAAACAACACCCCCATCAGTC | GACTGATGGGGGTGTTGTTTT |
| IgG2c | AAAACAACAGCCCCATCGGTC | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgG3 | GTGATCCCGTGATAATCGGCT | AGCCGATTATCACGGGATCAC |
| IgA | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG |
| Maus-Immunglobulin-Leichtketten (C57BL/6) | ||
| Igκ | CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC | GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG |
| Igλ1 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG | CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ2 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG | CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ3 | TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG | CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ4 | TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG | CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA |
| Schwere Ketten Immunglobulin vom Menschen | ||
| IgM | GGGAGTGCATCCGCCCCAAC | GTTGGGGCGGATGCACTCCC |
| IgG | GCTTCCACCAAGGGCCCATC | GATGGGCCCTTGGTGGAAGC |
| IgA | GCATCCCCGACCAGCCCCAA | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgD | GCACCCACCAAGGCTCCGGA | TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC |
| IgE | GCCTCCACACAGAGCCCATC | GATGGGCTCTGTGTGGAGGC |
| Lichterketten Immunglobulin vom Menschen | ||
| Igκ | ACTGTGGCTGCACCATCTGC | GCAGATGGTGCAGCCACAGT |
| Igλ1, 2, 6 | GTCACTCTGTTCCCGCCCTC | GAGGGCGGGAACAGAGTGAC |
| Igλ3, 7 | GTCACTCTGTTCCCACCCTC | GAGGGTGGGAACAGAGTGAC |
Tabelle 2: Übersicht über die Immunglobulin-Signatur-Sequenzen
| Maus-Nabenschaltungen | Gesamtanzahl der Lesezugriffe | IgM | IgG1 | IgG2c | ||
| Eingang | 475.144 | |||||
| IgC-haltigen | 166.175 | 229.671 | 36.628 | |||
| VDJ-produktiv | 133.371 | 196.583 | 31.446 | |||
| Maus-IgL | Gesamtanzahl der Lesezugriffe | IgKappa | IgLambda | |||
| Eingang | 527.668 | |||||
| IgC-haltigen | 178.948 | 21.446 | ||||
| VJ-produktiv | 160.924 | 16.988 | ||||
| Menschlichen Nabenschaltungen | Gesamtanzahl der Lesezugriffe | IgM | IgG | IgA | IgD | IgE |
| Eingang | 1.582.754 | |||||
| IgC-haltigen | 90.238 | 5.298 | 94.061 | 75.549 | 2.932 | |
| VDJ-produktiv | 67.896 | 2.775 | 78.203 | 56.495 | 3 | |
| Menschlichen IgL | Gesamtanzahl der Lesezugriffe | IgKappa | IgLambda | |||
| Eingang | 1.582.754 | |||||
| IgC-haltigen | 120.316 | 64.148 | ||||
| VJ-produktiv | 97.169 | 52.324 |
Tabelle 3: Zusammenfassung der lesen Sie zahlen in den Experimenten
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Sequenzierung Strategie für die Analyse von Antikörper-Repertoire in den einzelnen Mäusen. (A) Gesamt-RNS von den immunen Zellen oder Gewebe war umgekehrt transkribiert und PCR verstärkt mit der universellen forward Primer und Immunglobulin klassenspezifische reverse Primer. Der Amplifikate aus jeder Immunglobulin-Klasse wurden gebündelt und für Next Generation Sequencing gerendert. (B) die biologische repliziert, wie Milz von C57BL/6 Mäusen wurden wie folgt behandelt: total RNAs waren aus Milz Proben gereinigt und cDNAs wurden durch 5'-RACE mit dem universal Grundierung und Antikörper klassenspezifische Grundierung verstärkt. Sie wurden dann für die Sequenzierung der nächsten Generation mit Kennzeichnung Zündkapseln für individuelle Mäuse gerendert. Teile der Figur werden von8 mit Erlaubnis angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische der Datenverarbeitung Flussdiagramm für die Analyse von Antikörper-Repertoire in den einzelnen Mäusen. Amplifikate liest nach Sequenzierung der nächsten Generation erhalten wurden wie folgt verarbeitet: (1) lesen Sie Sequenzen wurden überprüft das Vorhandensein der Antikörper klassenspezifische Signatur Sequenzen; (2) Sequenzen wurden für den V, D, untersucht und J gen Fragmente mit IMGT/HighV-Quest und/oder IgBLAST; (3) die Sequenzen mit einer produktiven VDJ Kreuzung wurden gesammelt; und (4) diese Sequenzen wurden verwendet für die Analyse der gesamten Repertoire Funktionen, CDR3, etc. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: globale Daten-Visualisierung für Maus-Antikörper-Repertoire. Die gesamte Repertoire Profile jeder Antikörper-Klasse wurden durch 3D-VDJ-Plot visualisiert. Die x-Achse ist 110 IGHV Gene wie auf dem Chromosom bestellt. Die y - und z - Achse repräsentiert 12 IGHD und 4 IGHJ Gene, beziehungsweise. Das Volumen der Kugeln auf jedem Knoten repräsentiert die Anzahl der Lesevorgänge. Rote Kugeln: UN-kommentierte V, D und J Gene. Die IgL lesen Sie Distributionen auf einem 2D-VJ-Grundstück gezeigt werden, in denen die Länge der einzelnen Balken steht für die relative Anzahl der Lesevorgänge. Die x-Achse stellt 101 x IGLVκ und 3 X IGLVλ Gene und die y-Achse dar 4 x IGLJκ und 3 X IGLJλ Gene. Die UN-kommentierte V und J-Gene sind an der rechten Grenze vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: globale Daten-Visualisierung für menschliche Antikörper-Repertoire. Die gesamte Repertoire Profile jeder Antikörper-Klasse wurden durch 3D-VDJ-Plot visualisiert. Die x-Achse ist 56 IGHV Gene wie auf dem Chromosom bestellt. Die y - und z - Achse repräsentiert 27 IGHD und 6 IGHJ Gene bzw.. Das Volumen der Kugeln auf jedem Knoten repräsentiert die Anzahl der Lesevorgänge. Rote Kugeln: UN-kommentierte V, D und J Gene. Der IgL liest sind auf dem Grundstück-VJ-2D angeordnet, in denen die Länge der einzelnen Balken steht für die relative Anzahl der lautet. Die x-Achse repräsentiert 41 x IGLVκ und 32 X IGLVλ Gene und die y-Achse stellt 5 x IGLJκ und 5 X IGLJλ Gene. Die UN-kommentierte V - und J-Gene sind an der rechten Grenze vertreten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die hier beschriebene Methode nutzt NGS für Antikörper RNA verstärkt mit der 5'-RACE-Methode. Im Gegensatz zu Methoden, die entartete 5'-VH gen Primer verwenden, werden mRNAs jeder Antikörper-Klasse verstärkt gleichmäßig mit universal forward Primer. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von spezifischen antisense Primer für die konstante Region 1 (CH1) des Gens Antikörper Repertoire Profilierung der spezifischen Immunglobulinklassen. Dies ist sehr vorteilhaft für sezieren die klassenspezifischen Antikörperantwort sowie für naiv und immunisierten Repertoire8,9vergleichen.
Am ehesten Fallstrick der Methode ist ein Mangel an verstärkten Immunglobulin-Nachrichten. Die Tiefe der Antikörper-Repertoire im Wesentlichen durch dieses Protokoll erhalten richtet sich nach der PCR Verstärkung im Schritt 3.1 und 3.2 beschrieben. Wenn die Repertoire-Tiefe nicht ordnungsgemäß abgerufen wird, wird verändert die Verhältnisse der Vorlage cDNA und Grundierungen in Schritten 3.2.1 und 3.2.2 dringend empfohlen.
Im Allgemeinen sind etwa 20 % der Antikörper lautet produziert von NGS zweideutige Sequenzen21. Sogar mit "Korrekturmethoden", gegründet von 5-10 % bleiben zweideutig3. Wir, daher die Reihenfolge analysiert und roh liest mit Unterschrift Sequenzen Immunglobulin konstante Regionen (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, etc.) entsprechend gefiltert. Daher Bedarfsanalyse somatische hyper-Mutationen der sorgfältigen Untersuchungen.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass Immunglobulin schwere und leichte Kette paar ist hergeleitet werden. Daher ist die Repertoire-Ansicht erhalten durch diese Methode nicht ganzheitlich. Es ist jedoch möglich, die bestplatzierten Paare durch statistische Analyse der Daten10anzugleichen. Auch berichtet eine neuartige Methode zur Sequenz die Immunglobulin-Paare wurde vor kurzem,3,4.
Die Immunglobulin-Sequenzen in den Ausgangsdaten .fna wurden extrahiert, basierend auf das Vorhandensein von Immunglobulin-Gen-Signatur-Sequenzen. Das V, D und J gen, die Segmente dann kommentiert wurden und die Produktivität der V (D) J Umgestaltungen wurden bewertet. Die Bestimmung der Komplementarität Region 3 (CDR3) Sequenzen wurden auch kommentiert. Diese systematische Untersuchungen von Immunglobulin-Sequenzen in .fna Daten lieferten sinnvollerweise IMGT/HighV-QUEST Server22,23,24. Aufbau einer automatisierten Verarbeitung-Pipeline hat jedoch das Verdienst, die große experimentelle Daten zu analysieren. Die Pipeline, die individuell für jeden Zweck ist möglich, mithilfe der Standalone-Version IgBLAST Protokoll19eingerichtet. Dieser Ansatz braucht grundlegende Programmierung Lese aber ist sehr nützlich für detaillierte Analysen des Immunglobulin-Systems. Die Rohrleitungen beschrieben sind die Beispiele von kundenspezifischen Protokoll (Abbildung 2).
Die Anzahl der Antikörper liest sich Proportional zu der Menge des Antikörpers RNAs in der Probe reflektiert die Antikörper-Bestandteile des Systems der Antikörper auf Zeit Punkte5,8,25gegeben ist. Die hier beschriebene Methode gibt die V (D) J-Verfassung von einem Antikörper-Repertoire mit R Programme8,18,26aus der Vogelperspektive.
Die globale Sicht der IgM Antikörper Repertoires von individuellen naiv Mäusen ergab ein hoch konservierte VDJ-Profil im Vergleich zu denen der IgG1 oder IgG2c8. Es wurde berichtet, dass VDJ Kombinationen von unreifen Zebrafisch sehr Stereotype9. Im Gegensatz dazu sind menschliche VDJ Kombinationen berichtet, stark geneigten6. Die hoch konservierte deterministische VDJ-Profile in naive B-Zellen sind wahrscheinlich entweder durch schiefe VDJ-Rearrangements erzeugt oder negative Selektion mit Auto-Antigene in den Körper präsentiert. Z. B. IGHV11-2 wird bevorzugt in der fetalen IgM Repertoire27 ausgedrückt, und diese Dominanz ist zurückzuführen auf die Autoreactivity des IGHV11-2 gegen alternde Erythrozyten27. IGHV11-2 war interessanterweise auch die am häufigsten verwendeten großen Repertoire in unserer bisher veröffentlichten Analyse des naiven IgM8.
Die hier beschriebene Methode eignet sich für die Entschlüsselung Antigen reagierende Antikörper-Repertoire von pauschal Analyse in einzelnen Gremien, Vermeidung versehentlichen Auslassung wichtige Antikörper Repertoire8erzeugten Antikörper-Repertoire-Raum, 10. Diese Methode ermöglicht auch die Prüfung der detaillierten Antikörper Netzwerk Dynamik, die erleichtern würde beschleunigt Entdeckung von schützenden Antikörpern gegen neu auftretenden Erreger.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von AMED unter Grant Anzahl JP18fk0108011 (KO und SI) und JP18fm0208002 (TS, KO und YO), und eine Beihilfe aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (15K 15159) Ko. Wir danken Sayuri Yamaguchi und Satoko Sasaki für die wertvolle technische Hilfe. Wir möchten Editage (www.editage.jp) für die englische Sprache Bearbeitung zu danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
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