Hier beschreiben wir Protokolle für die Analyse und Visualisierung der Struktur und Verfassung des ganzen Antikörper-Repertoire. Dies beinhaltet den Erwerb von riesigen Sequenzen Antikörper RNA Sequenzierung der nächsten Generation mit.
Die immense Anpassungsfähigkeit der Antigen-Anerkennung durch Antikörper ist die Grundlage des erworbenen Immunsystems. Trotz unser Verständnis der molekularen Mechanismen der Produktion von großen Repertoire von Antikörpern durch das erworbene Immunsystem, wurde es noch nicht möglich, einen globalen Überblick über eine komplette Antikörper-Repertoire zu erreichen. B-Zell-Repertoires sind insbesondere wegen ihrer astronomischen Anzahl von Antikörper-Klone als Black Box betrachtet worden. Next Generation Sequencing Technologien ermöglichen jedoch Durchbrüche, unser Verständnis des B-Zell-Repertoires zu erhöhen. In diesem Bericht beschreiben wir eine einfache und effiziente Methode zum visualisieren und analysieren Sie ganz individuelle Maus und menschliche Antikörper-Repertoire. Aus den immun Organen war repräsentativ aus Milz bei Mäusen und peripheren mononukleären Blutzellen in den Menschen, Gesamt-RNS bereit, umgekehrte transkribiert, und verstärkt mit der 5′-RACE-Methode. Mit einer universellen vorwärts Grundierung und antisense Primer für die Antikörper klassenspezifische konstante Domänen, wurden Antikörper mRNAs einheitlich in Proportionen reflektieren ihre Frequenzen in der Bevölkerung Antikörper verstärkt. Der Amplifikate wurden von Next Generation Sequencing (NGS), Gewinnung von mehr als 105 Antikörper Sequenzen pro immunologische Probe sequenziert. Wir beschreiben die Protokolle für Antikörper Sequenzanalysen einschließlich V (D) J-gen-Segment Annotation, die Antikörper-Repertoire und unsere computergestützten Methoden der Vogelperspektive.
Das Antikörper-System ist eine der Grundlagen des erworbenen Immunsystems. Es ist sehr stark gegen eingedrungene Krankheitserreger aufgrund seiner großen Vielfalt, feine Antigen-Anerkennung-Spezifität und die klonale Expansion der Antigen-spezifische B-Zellen. Das Repertoire von Antikörper-produzierenden B-Zellen wird geschätzt, dass mehr als 1015 in eine einzelne1. Diese immense Vielfalt wird mit Hilfe von VDJ gen Rekombination in der Immunglobulin-genetische Loci-2erzeugt. Beschreibung der gesamten B-Zell-Repertoires und deren dynamische Veränderungen in Reaktion auf Antigen-Immunisierung ist daher schwierig, aber unerlässlich für ein vollständiges Verständnis der Antikörperantwort gegen eindringende Krankheitserreger.
Wegen ihrer astronomischen Vielfalt gelten B-Zell-Repertoires als eine Black Box; Allerdings hat das Aufkommen der NGS Technologie Durchbrüche zu einem verbesserten Verständnis ihrer Komplexität3,4aktiviert. Ganze Antikörper-Repertoire wurden erfolgreich analysiert, erstens im Zebrafisch5, dann Mäuse6, und Menschen6,7. Obwohl NGS ein mächtiges Werkzeug in der Studie der adaptiven Immunantwort geworden ist, fehlen grundlegende Analysen über die Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Antikörper-Repertoire unter den einzelnen Tieren.
Bei Mäusen wurde berichtet, dass die IgM-Repertoire zwischen Individuen, nahezu identisch sind, während diejenigen von IgG1 und IgG2c zwischen Einzelpersonen8erheblich unterschiedlich sind. Neben Nutzungsprofil V-gen ist die beobachtete Häufigkeit der VDJ-Profil in naiven peripheren B-Zellen zwischen Einzelpersonen8sehr ähnlich. Die Analyse der Aminosäure-Sequenzen der VDJ-Region zeigte auch das Vorkommen der gleichen Knoten Sequenzen in verschiedene Mäuse viel häufiger als früher dachte8. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Mechanismen für die Antikörperbildung Repertoire deterministische als stochastische5,8,9sein können. Der Prozess der Antikörper-Repertoire-Entwicklung bei Mäusen wurde auch erfolgreich analysiert mit NGS das Potenzial der NGS aufzudecken das Immunsystem Antikörper im Detail10hervorheben.
In diesem Bericht beschreiben wir eine einfache und effiziente Methode zur Visualisierung und Analyse einer Antikörper-Repertoire auf globaler Ebene.
Die hier beschriebene Methode nutzt NGS für Antikörper RNA verstärkt mit der 5′-RACE-Methode. Im Gegensatz zu Methoden, die entartete 5′-VH gen Primer verwenden, werden mRNAs jeder Antikörper-Klasse verstärkt gleichmäßig mit universal forward Primer. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von spezifischen antisense Primer für die konstante Region 1 (CH1) des Gens Antikörper Repertoire Profilierung der spezifischen Immunglobulinklassen. Dies ist sehr vorteilhaft für sezieren die klassenspezifischen Antikörperantwort sowie für naiv und immunisierten Repertoire8,9vergleichen.
Am ehesten Fallstrick der Methode ist ein Mangel an verstärkten Immunglobulin-Nachrichten. Die Tiefe der Antikörper-Repertoire im Wesentlichen durch dieses Protokoll erhalten richtet sich nach der PCR Verstärkung im Schritt 3.1 und 3.2 beschrieben. Wenn die Repertoire-Tiefe nicht ordnungsgemäß abgerufen wird, wird verändert die Verhältnisse der Vorlage cDNA und Grundierungen in Schritten 3.2.1 und 3.2.2 dringend empfohlen.
Im Allgemeinen sind etwa 20 % der Antikörper lautet produziert von NGS zweideutige Sequenzen21. Sogar mit “Korrekturmethoden”, gegründet von 5-10 % bleiben zweideutig3. Wir, daher die Reihenfolge analysiert und roh liest mit Unterschrift Sequenzen Immunglobulin konstante Regionen (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, etc.) entsprechend gefiltert. Daher Bedarfsanalyse somatische hyper-Mutationen der sorgfältigen Untersuchungen.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass Immunglobulin schwere und leichte Kette paar ist hergeleitet werden. Daher ist die Repertoire-Ansicht erhalten durch diese Methode nicht ganzheitlich. Es ist jedoch möglich, die bestplatzierten Paare durch statistische Analyse der Daten10anzugleichen. Auch berichtet eine neuartige Methode zur Sequenz die Immunglobulin-Paare wurde vor kurzem,3,4.
Die Immunglobulin-Sequenzen in den Ausgangsdaten .fna wurden extrahiert, basierend auf das Vorhandensein von Immunglobulin-Gen-Signatur-Sequenzen. Das V, D und J gen, die Segmente dann kommentiert wurden und die Produktivität der V (D) J Umgestaltungen wurden bewertet. Die Bestimmung der Komplementarität Region 3 (CDR3) Sequenzen wurden auch kommentiert. Diese systematische Untersuchungen von Immunglobulin-Sequenzen in .fna Daten lieferten sinnvollerweise IMGT/HighV-QUEST Server22,23,24. Aufbau einer automatisierten Verarbeitung-Pipeline hat jedoch das Verdienst, die große experimentelle Daten zu analysieren. Die Pipeline, die individuell für jeden Zweck ist möglich, mithilfe der Standalone-Version IgBLAST Protokoll19eingerichtet. Dieser Ansatz braucht grundlegende Programmierung Lese aber ist sehr nützlich für detaillierte Analysen des Immunglobulin-Systems. Die Rohrleitungen beschrieben sind die Beispiele von kundenspezifischen Protokoll (Abbildung 2).
Die Anzahl der Antikörper liest sich Proportional zu der Menge des Antikörpers RNAs in der Probe reflektiert die Antikörper-Bestandteile des Systems der Antikörper auf Zeit Punkte5,8,25gegeben ist. Die hier beschriebene Methode gibt die V (D) J-Verfassung von einem Antikörper-Repertoire mit R Programme8,18,26aus der Vogelperspektive.
Die globale Sicht der IgM Antikörper Repertoires von individuellen naiv Mäusen ergab ein hoch konservierte VDJ-Profil im Vergleich zu denen der IgG1 oder IgG2c8. Es wurde berichtet, dass VDJ Kombinationen von unreifen Zebrafisch sehr Stereotype9. Im Gegensatz dazu sind menschliche VDJ Kombinationen berichtet, stark geneigten6. Die hoch konservierte deterministische VDJ-Profile in naive B-Zellen sind wahrscheinlich entweder durch schiefe VDJ-Rearrangements erzeugt oder negative Selektion mit Auto-Antigene in den Körper präsentiert. Z. B. IGHV11-2 wird bevorzugt in der fetalen IgM Repertoire27 ausgedrückt, und diese Dominanz ist zurückzuführen auf die Autoreactivity des IGHV11-2 gegen alternde Erythrozyten27. IGHV11-2 war interessanterweise auch die am häufigsten verwendeten großen Repertoire in unserer bisher veröffentlichten Analyse des naiven IgM8.
Die hier beschriebene Methode eignet sich für die Entschlüsselung Antigen reagierende Antikörper-Repertoire von pauschal Analyse in einzelnen Gremien, Vermeidung versehentlichen Auslassung wichtige Antikörper Repertoire8erzeugten Antikörper-Repertoire-Raum, 10. Diese Methode ermöglicht auch die Prüfung der detaillierten Antikörper Netzwerk Dynamik, die erleichtern würde beschleunigt Entdeckung von schützenden Antikörpern gegen neu auftretenden Erreger.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von AMED unter Grant Anzahl JP18fk0108011 (KO und SI) und JP18fm0208002 (TS, KO und YO), und eine Beihilfe aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (15K 15159) Ko. Wir danken Sayuri Yamaguchi und Satoko Sasaki für die wertvolle technische Hilfe. Wir möchten Editage (www.editage.jp) für die englische Sprache Bearbeitung zu danken.
0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |