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Immunology and Infection

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा माउस और मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स की पहचान

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58804
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4,5, 4, 4, 6, 7,8, 4,5, 9, 2, 9,10
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research, National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology, National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases, Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE, Hokkaido University, 9Department of Immunology, National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

Summary

यहां, हम विश्लेषण और संरचना और पूरे एंटीबॉडी रिपरटोअर्स के गठन के दृश्य के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन । यह एंटीबॉडी आरएनए के विशाल दृश्यों का अधिग्रहण अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग शामिल है ।

Abstract

एंटीबॉडी द्वारा प्रतिजन मांयता की अपार अनुकूलनशीलता अर्जित प्रतिरक्षा प्रणाली का आधार है । आणविक अधिग्रहण प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा एंटीबॉडी के विशाल प्रदर्शनों की प्रक्रिया के उत्पादन अंतर्निहित तंत्र की हमारी समझ के बावजूद, यह अभी तक एक पूर्ण एंटीबॉडी प्रदर्शनों की दर के एक वैश्विक दृष्टिकोण पर पहुंचने के लिए संभव नहीं किया गया है । विशेष रूप से, बी सेल रिपरटोयर्स एंटीबॉडी क्लोन की उनकी खगोलीय संख्या की वजह से एक ब्लैक बॉक्स के रूप में माना गया है । हालांकि, अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों सफलताओं को सक्षम करने के लिए बी सेल प्रदर्शनों की संख्या के बारे में हमारी समझ में वृद्धि कर रहे हैं । इस रिपोर्ट में, हम एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करने के लिए कल्पना और पूरे व्यक्तिगत माउस और मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स विश्लेषण । प्रतिरक्षा अंगों से, मानव में चूहों और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में तिल्ली से प्रतिनिधित्व, कुल आरएनए तैयार किया गया था, रिवर्स transcribed, और 5 '-दौड़ विधि का उपयोग कर प्रवर्धित. एंटीबॉडी वर्ग विशिष्ट निरंतर डोमेन के लिए एक यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और एंटीसेंस प्राइमरों का प्रयोग, एंटीबॉडी mRNAs समान रूप से एंटीबॉडी आबादी में उनकी आवृत्तियों को दर्शाती अनुपात में परिलक्षित थे । amplicons अगली पीढ़ी अनुक्रमण (ngs), प्रतिरक्षा नमूना प्रति 10 से अधिक5 एंटीबॉडी दृश्यों से उपज द्वारा अनुक्रम थे । हम एंटीबॉडी अनुक्रम विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन वी सहित (डी) जे जीन-खंड एनोटेशन, एक पक्षी है एंटीबॉडी प्रदर्शनों की श्रृंखला के नेत्र दृश्य, और हमारे कंप्यूटेशनल तरीकों ।

Introduction

एंटीबॉडी प्रणाली अधिग्रहण प्रतिरक्षा प्रणाली की बुनियादी बातों में से एक है । यह अत्यधिक अपने विशाल विविधता, ठीक प्रतिजन मांयता विशिष्टता के कारण रोगजनकों आक्रमण के खिलाफ शक्तिशाली है, और प्रतिजन विशिष्ट बी कोशिकाओं के क्लोनी विस्तार । एंटीबॉडी उत्पादक बी कोशिकाओं के प्रदर्शनों की एक एकल व्यक्ति1में 1015 से अधिक होने का अनुमान है । इस अपार विविधता इम्युनोग्लोबुलिन आनुवंशिक loci2में vdj जीन पुनर्संयोजन की मदद से उत्पंन होता है । पूरे बी सेल रिपरटोअर्स और antigen-प्रतिरक्षण के जवाब में उनके गतिशील परिवर्तन का विवरण इसलिए चुनौतीपूर्ण है, लेकिन आक्रमण रोगजनकों के खिलाफ एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की एक पूरी समझ के लिए आवश्यक है ।

उनकी खगोलीय विविधता के कारण बी सेल रिपरटोअर्स को ब्लैक बॉक्स माना गया है; हालांकि, ngs प्रौद्योगिकी के आगमन उनकी जटिलता3,4के एक बढ़ाया समझ के लिए सफलताओं सक्षम है । पूरे एंटीबॉडी रिपरटोअर्स सफलतापूर्वक विश्लेषण किया गया है, सबसे पहले zebrafish में5, फिर6चूहों, और मनुष्यों6,7. हालांकि NGS अब अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है, समानताएं और व्यक्तिगत जानवरों के बीच एंटीबॉडी रिपरटोअर्स में मतभेदों के बुनियादी विश्लेषण की कमी है ।

चूहों में, यह बताया गया है कि IgM repertoires लगभग व्यक्तियों के बीच समान हैं, जबकि IgG1 और IgG2c के उन व्यक्तियों के बीच काफी अलग हैं8. वी के अलावा जीन उपयोग प्रोफ़ाइल, भोली परिधीय बी कोशिकाओं में VDJ-प्रोफाइल की मनाया आवृत्ति अत्यधिक8व्यक्तियों के बीच समान है । VDJ-क्षेत्र के अमीनो एसिड दृश्यों का विश्लेषण भी अलग चूहों में एक ही जंक्शन दृश्यों की घटना से अधिक बार पहले सोचा था कि8दिखाया । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एंटीबॉडी प्रदर्शनों की प्रक्रिया के गठन के लिए तंत्र के बजाय प्रसंभाव्य5,8,9निर्धारणात्मक हो सकता है । चूहों में एंटीबॉडी प्रदर्शनों की क्रिया विकास की प्रक्रिया को भी सफलतापूर्वक NGS का उपयोग करने के लिए और अधिक विस्तार से एंटीबॉडी प्रतिरक्षा प्रणाली को उजागर करने के लिए NGS की क्षमता को उजागर विश्लेषण किया गया है10।

इस रिपोर्ट में, हम एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करने के लिए कल्पना और एक वैश्विक स्तर पर एक एंटीबॉडी प्रदर्शनों की रिपोर्ट का विश्लेषण ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार और राष्ट्रीय संक्रामक रोग पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया । स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों, इस रिपोर्ट में प्रतिनिधि परिणाम के रूप में इस्तेमाल से PBMCs के नमूने, राष्ट्रीय संक्रामक रोग संस्थान, टोक्यो, जापान की आचार समिति के अनुमोदन के साथ प्रदर्शन किया गया था, और लिखित सूचित सहमति प्राप्त किया गया था एक आचार समिति-अनुमोदित फार्म का उपयोग कर प्रत्येक भागीदार से ।

1. प्राइमरी डिजाइन

  1. 5-रेस11,12 और स्मार्ट-पीसीआर13 तकनीकों में प्रयुक्त के रूप में, पीसीआर प्राइमरों से पूर्वाग्रह के बिना इम्यूनेस्टोबुलिन एमआरएनए को बढ़ाना करने के लिए cdna के लिए एक यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर डिजाइन ।
  2. इम्युनोग्लोबुलिन वीएच जीन प्रवर्धन के लिए, रिवर्स प्राइमरों8,14 के रूप में लगातार क्षेत्र में इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग विशेष दृश्यों डिजाइन (चित्रा 1a).
    नोट: मल्टीप्लेक्स टैग दृश्यों को विभिन्न नमूना स्रोतों से लाइब्रेरी अणुओं को लेबल करने के लिए इनमें से किसी भी प्राइमरों में जोड़ा जा सकता है. नेस्टेड पीसीआर के लिए जुगाड़ भी जोड़ा जा सकता है, किट के मैनुअल के अनुसार15प्रयोग किए जाते हैं ।
यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर 5 '-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 '
माउस इम्युनोग्लोबुलिन (Ref .8) के लिए रिवर्स प्राइमरों
IgM_CH1: 5 '-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 '
IgG1_CH1: 5 '-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 '
IgG2c_CH1: 5 '-GTACCTCCACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 '
IgG3_CH1: 5 '-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3 '
IgA_CH1: 5 '-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3 '
Igκ _CH1: 5 '-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 '
Igλ _CH1: 5 '-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGAAACA-3 '
मानव इम्युनोग्लोबुलिन के लिए रिवर्स प्राइमरों (Ref. 14)
IgM_CH1: 5 '-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 '
IgG_CH1: 5 '-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 '
IgD_CH1: 5 '-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 '
IgA_CH1: 5 '-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 '
IgE1_CH1: 5 '-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 '
IgE2_CH1: 5 '-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 '
Igκ _CH1: 5 '-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 '
Igλ _CH1: 5 '-AGAGGAGCGGGAACAGAGTGA-3 '

तालिका 1: पीसीआर-इम्युनोग्लोबुलिन के प्रवर्धन के लिए प्राइमरी दृश्यों

2. प्रतिरक्षा कोशिकाओं और ऊतकों से न्यूकोइक अम्ल अलगाव

नोट: नीचे दी गई प्रक्रिया, माउस प्लीहा से न्यूक्लिक अम्ल निकालने के लिए है । हालांकि, यह अन्य प्रतिरक्षा ऊतकों और मानव कोशिकाओं पर लागू होता है जैसे लिम्फ नोड्स या परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल (PBMCs) (चित्र 1b).

  1. ऊतक काटना, उदाहरणके लिए, एक 8 सप्ताह पुराने C57BL/6 माउस से तिल्ली और यह एक स्टेनलेस स्टील मेष (२०० से ४०० μm) के माध्यम से पारित pbs बफर के 2 मिलीलीटर के साथ बिखरे हुए कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए । सेल निलंबन एक २.० मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण, और 5 मिनट के लिए ६०० × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज । अधिनतांत को त्यागें ।
  2. ACK lysing बफर के ८०० μL जोड़ें (१५० मिमी एनएच4सीएल, 1 मिमी khco3, ०.१ मिमी एनए2edta, पीएच ७.२) गोली करने के लिए, और 2 मिनट के लिए बर्फ पर सेते ऊतक में लाल रक्त कोशिकाओं lysing करने के लिए ।
  3. पीबीएस 3x के 2 मिलीलीटर के साथ ऊतक कोशिकाओं को धो, ६०० × जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया ।
  4. पेलेट, भंवर को अच्छी तरह से, और 5 मिनट के लिए के बारे में 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए phenol के ८०० μL जोड़ें/
  5. क्लोरोफॉर्म (२०० μl) जोड़ें, 15 एस के लिए मैंयुअल रूप से हिला, और फिर के बारे में 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते ।
  6. १२,००० × छ और 25 ° c पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रण द्वारा चरणों अलग और एक ताजा ट्यूब के लिए ऊपरी जलीय चरण हस्तांतरण ।
  7. ७०% इथेनॉल की एक मात्रा जोड़ें, संक्षेप भंवर और यह सिलिका स्पिन कॉलम के लिए लागू होते हैं ।
  8. पानी की 30-100 μL के साथ आरएनए Elute ।
  9. मात्रा प्रारंभिक आरएनए एकाग्रता एक फ्लोरोमीटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर ।
  10. प्यूरिफाइड आरएनए पर-८० डिग्री सेल्सियस की दुकान ।

3. cDNA संश्लेषण और पीसीआर प्रवर्धन

नोट: नीचे बताई गई विधि 5 '-रेस11,12 और स्मार्ट-पीसीआर तकनीकों13पर आधारित है । विवरण और प्रतिक्रिया का अनुकूलन किट 15के मैनुअल में वर्णित हैं । माउस इम्युनोग्लोबुलिन के लिए प्रारंभिक सामग्री २.१० कदम से नमूना हैं । मानव इम्यूनेस्टोबुलिन के लिए शुरू सामग्री मानव ऊतकों से नमूना हैं, पूर्व. PBMC, चरणों में वर्णित के रूप में इलाज २.३ करने के लिए २.१०.

  1. 5 '-रेस सीडी प्राइमर (ओलिगो-डीटी युक्त) और स्मार्ट-पीसीआर oligonucleotide (सामग्री की तालिका) के अनुसार 2 से 10 μg के लिए कुल आरएनए टेम्पलेट का उपयोग करने वाले पहले-भूग्रस्त Cdna संश्लेषी निर्माता के निर्देश15।
    1. माउस इम्युनोग्लोबुलिन के लिए, पीसीआर-उच्च विश्वस्तता डीएनए polymerase यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग विशिष्ट रिवर्स प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग कर के साथ cdna बढ़ाना । थर्मल सायक्लिंग शर्तों के रूप में सेट करें: 2 मिनट के लिए ९४ ° c, उसके बाद ४० चक्र के लिए ९४ ° c 30 s, ५९ ° c 30 s के लिए, और ७२ ° c 30 s के लिए, इसके बाद 5 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार कदम ।
      नोट: ठेठ प्रयोगों बढ़ाना igm, IgG1, IgG2c, igm और आईजीएल इम्युनोग्बुलिन वर्गों भोले, Th1 निर्भर और Th2 पर निर्भर बी कोशिकाओं को देखने के लिए (चित्रा 3).
    2. मानव इम्युनोग्लोबुलिन के लिए, 1सेंट पीसीआर यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग विशिष्ट रिवर्स प्राइमरों का उपयोग कर प्रदर्शन (तालिका 1) टैग दृश्यों के साथ. सूचकांक अनुक्रम primers का उपयोग कर 2एन डी सी पीसीआर द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए सूचकांक अनुक्रम शामिल करें । निम्नलिखित पीसीआर शर्तों और Taq polymerase का प्रयोग करें: ९४ डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट, 21 चक्र (1अनुसूचित जनजाति पीसीआर) या ३२ चक्र (2एन डी पी सी) 30 एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर, 30 s के लिए ५९ डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस.
      नोट: ठेठ प्रयोगों बढ़ाना igm, igm, igm (IgG1, IgG2, IgG3 और IgG4), iga (IgA1 और IgA2), iga, igm और igm इम्युनोग्लोबुलिन वर्गों सभी बी सेल आबादी को देखने के लिए (चित्रा 4).
  2. electrophorese एक ऐगेरोस जेल पर पीसीआर उत्पादों और एक सिलिका झिल्ली स्पिन-कॉलम का उपयोग ६०० को ८०० बीपी टुकड़े को शुद्ध ।
    1. electrophorese से नमूना 3.2.1 या 3.2.2 पर 2% ऐगेरोस जेल.
    2. यूवी-ट्रांसप्रकाशक और आबकारी जेल-६०० से ८०० बीपी के बीच ब्रॉड बैंड युक्त टुकड़ा पर डीएनए बैंड कल्पना ।
    3. 10 मिलीग्राम जेल स्लाइस के प्रति १० मिलीलीटर झिल्ली बाइंडिंग समाधान जोड़ें । मिश्रण और 50-65 डिग्री सेल्सियस पर सेते जब तक जेल टुकड़ा पूरी तरह से भंग है ।
    4. सिलिका झिल्ली स्पिन-कॉलम पर जेल समाधान स्थानांतरण । धोने बफर और elute डीएनए के साथ एक बार धोने के साथ ५० मिलीलीटर के nuclease मुक्त पानी (सामग्री की मेज) ।
  3. एक फ्लोरोमीटर और पूल amplicons प्रत्येक इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग से ngs अनुक्रमण के लिए बराबर मात्रा में के साथ शुद्ध amplicons quantify ।
    नोट: आमतौर पर, 2-10 मिलीग्राम amplicon डीएनए प्रत्येक इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग के लिए बरामद किया गया था । डीएनए की राशि में समान रूप से प्रत्येक नमूना घोल को मिलाकर ५० एमएल समाधान 10-20 एनजी डीएनए/एमएल से युक्त करें ।
  4. डीएनए साइज़िंग चिप (सामग्रियों की तालिका) के साथ माइक्रो केशिका आधारित वैद्यक-वैद्युत-संचलन का उपयोग करते हुए पुस्तकालयों के आकार और सांद्रता का निर्धारण करना । -20 डिग्री सेल्सियस पर पुस्तकालयों स्टोर ।

4. पुस्तकालयों के NGS अनुक्रमण

  1. एक samplesheet. cvs के लिए अनुक्रमण रन नमूना नाम निर्दिष्ट करें, अनुक्रमणिका जानकारी जनरेट करें और केवल. fastq फ़ाइलें प्राप्त करने के लिए निर्देश दें ।
  2. गल अभिकर्मक कारतूस (सामग्री की मेज) और पुस्तकालयों ।
  3. ०.२ N naoh बनाओ और पुस्तकालयों को पतला करने के लिए वांछित दाढ़ एकाग्रता प्राप्त करते हैं ।
  4. कुल्ला और फ्लो सेल सूखी । अभिकर्मक कारतूस के कुआं में पतला और विकृत पुस्तकालय समाधान के ६०० मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. अनुक्रमण चलाएं प्रारंभ करें ।

5. NGS डेटा की गुणवत्ता नियंत्रण

  1. "FASTQ-टूलकिट"16का उपयोग कर fastq डेटा की गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें ।
    नोट: उपयोग किया गया पैरामीटर सेटिंग्स का एक मूल उदाहरण निम्नानुसार है:
    fastq_quality_trimmer-v-t 20-l २००-i [इंइनएनाका. fastq]-o [इंइनमें. fastq]
    fastq_quality_filter-v-q 20-p ८०-i [इंइनएनाका. fastq]-o [इंइनमें. fastq]
    fastx_reverse_complement-v-i [इंइनएनाका. fastq]-o [इंइनमें. fastq]
  2. "fasta न्यूक अम्ल (. fna)" के लिए आउटपुट फ़ाइलों को निम्न आदेश द्वारा स्वरूपित करें:
    fastq_to_fasta-v-n-i [इनफ्लेम. fastq]-o [इनफ्लेम. fna]

6. निष्कर्षण और. Fna डेटा से Immunoglobulin दृश्यों का विश्लेषण

नोट: उदाहरण प्रोग्राम एक UNIX वातावरण में लागू किए गए थे । कृपया उंहें एक उदाहरण के संदर्भ के रूप में उपयोग करें क्योंकि प्रदर्शन ऑपरेटिंग सिस्टम और हार्डवेयर वातावरण पर निर्भर हो सकता है । लेखक त्रुटियों या चूक के लिए किसी भी दायित्व को स्वीकार नहीं करते । प्रोग्रामिंग भाषाओं, Perl17, आर18, और आवश्यक मॉड्यूल उद्धृत वेबसाइटों पर निर्देशों के अनुसार स्थापित करने की आवश्यकता है । igblast कार्यक्रम उपयुक्त वेबसाइट19,20पर निर्देशों के अनुसार स्थापित करने की आवश्यकता है ।

  1. https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine से प्रदर्शनों की सूची विश्लेषण के लिए में घर कार्यक्रमों के निंनलिखित उदाहरण डाउनलोड करें:
    03_PipeLine_Mouse. zip; माउस एंटीबॉडी दृश्यों के विश्लेषण के लिए उदाहरण के कार्यक्रमों का एक सेट ।
    05_PipeLine_Human. zip; मानव एंटीबॉडी दृश्यों के विश्लेषण के लिए उदाहरण कार्यक्रमों का एक सेट ।
  2. प्रतिपिंड को निकालें अनुक्रम डेटा में पढ़ता है: एक perl प्रोग्राम है कि प्रत्येक इम्युनोग्लोबुलिन निरंतर क्षेत्र (तालिका 2) में हस्ताक्षर दृश्यों खोजों द्वारा डेटा (. fna) से प्रत्येक Ig-वर्ग के इम्युनोग्लोबुलिन (़) अनुक्रम निकालें ।
    1. माउस इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (igh) जीन के लिए, निम्न आदेश द्वारा पढ़ता निकालें:
      $ पर्ल 01_kzmftigcmgggantdver3_kz160607. pl [इनपुट फ़ाइलनाम] [आउटपुट फ़ाइलनाम (प्रत्यय)]
    2. माउस इम्युनोग्लोबुलिन प्रकाश श्रृंखला (आईजीएल) जीन के लिए निंनलिखित कमांड द्वारा पढ़ता है निकालें:
      $ पर्ल 01_kzmftckltntdver1_170810. pl [इनपुट फ़ाइलनाम] [आउटपुट फ़ाइलनाम (प्रत्यय)]
    3. मानव इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (igh) जीन के लिए, निम्न कमांड द्वारा पढ़ता निकालें:
      $ पर्ल 01_kzmfhuighcmgadentdver1_kz180312. pl [इनपुट फ़ाइलनाम] [आउटपुट फ़ाइलनाम (प्रत्यय)]
    4. मानव इम्युनोग्लोबुलिन प्रकाश श्रृंखला (आईजीएल) जीन के लिए, निम्नलिखित कमांड द्वारा पढ़ता निकालें:
      $ पर्ल 01_kzmfhuigckltntd_180316. pl [इनपुट फ़ाइलनाम] [आउटपुट फ़ाइलनाम (प्रत्यय)]
  3. एनोटेट और वी (डी) जे जीन पुनर्संयोजन की उत्पादकता की जांच:
    नोट: विधि नीचे वर्णित V (D) जंमू जीन खंडों के अनुक्रम में एनोटेशन के लिए स्टैंडअलोन IgBLAST19 का इस्तेमाल करता है । V (D) J जीन के लिए डेटाबेस सेट करें और IgBLAST के लिए पैरामीटर सेटिंग्स के रूप में वर्णित20.
    1. निंनलिखित कमांड द्वारा माउस इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (igh) जीन एनोटेट:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/Imtgmouseighv_ntddb.txt-germline_db_D $IGDATA/Imtgmouseighv_ntddb.txt-जीव माउस-domain_system imgt-क्वेरी./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/ file/mouse_gl. aux-show_translation-outfmt 7 > >./$OutName
    2. निंनलिखित कमांड द्वारा माउस इम्युनोग्लोबुलिन प्रकाश श्रृंखला (आईजीएल) जीन एनोटेट:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/Imtgmouseigkv_ntddb.txt-जीव माउस-domain_system imgt-क्वेरी./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/ file/mouse_gl. aux-show_translation-outfmt 7 > >./$OutName
    3. निंनलिखित कमांड द्वारा मानव इम्युनोग्लोबुलिन भारी श्रृंखला (igh) जीन एनोटेट:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/Imtghumanighv_ntddb.txt-germline_db_D $IGDATA/Imtghumanighv_ntddb.txt-जीव मानव-domain_system imgt-query./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl. aux-show_translation-outfmt 7 > >./$OutName
    4. निंनलिखित कमांड द्वारा मानव इम्युनोग्लोबुलिन प्रकाश श्रृंखला (आईजीएल) जीन एनोटेट:
      $ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/Imtघुमारanigkj_ntddb.txt-germline_db_D $IGDATA/Imtghumanigkv_ntddb.txt-जीव मानव-domain_system imgt-query./$InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/human_gl. aux-show_translation-outfmt 7 > >./$OutName
  4. एक एंटीबॉडी रिपरटॉयर की वैश्विक विशेषता कल्पना ।
    1. निंन कमांड द्वारा माउस IgH प्रदर्शनों की कल्पना:
      $ . 00A1_3dview_ Moigh_kz180406. श
      नोट: इनपुट फ़ाइल फ़ाइलनाम. fna (अनुक्रम डेटा), अधिमानतः 6.2.1 से आउटपुट फ़ाइल है । इस फ़ाइल को किसी निंन निर्देशिका (फ़ोल्डर) में "filename" नाम से रखा जाना आवश्यक है । शेल स्क्रिप्ट की पंक्ति ५० में, Para_4 के लिए एक "फ़ाइलनाम" असाइन करें ।
    2. निंनलिखित कमांड द्वारा मानव IgH प्रदर्शनों की गाड़ी कल्पना:
      $ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411. श
      नोट: इनपुट फ़ाइल है फ़ाइलनाम. fna अनुक्रम डेटा, 6.2.3 के आउटपुट फ़ाइल अधिमानतः । इस फ़ाइल को निंन निर्देशिका (फ़ोल्डर) में रखा जाना चाहिए जिसका नाम "filename" है । शेल स्क्रिप्ट की पंक्ति ४६ में, Para_4 के लिए एक "फ़ाइलनाम" असाइन करें ।
    3. निंन कमांड द्वारा माउस IgL प्रदर्शनों की कल्पना:
      $ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406. श
      नोट: इस पाइपलाइन के साथ, Igk और Igk concomitantly संसाधित कर रहे हैं. इनपुट फ़ाइल फ़ाइलनाम. fna (अनुक्रम डेटा), अधिमानतः 6.2.2 से आउटपुट फ़ाइल है । इस फ़ाइल को निचली निर्देशिका (फ़ोल्डर) में "filename" नाम से रखा जाना चाहिए । शेल स्क्रिप्ट की पंक्ति ५३ में, Para_4 के लिए एक "फ़ाइलनाम" असाइन करें । आउटपुट फ़ाइल का नाम, "_ Igklcount. txtDim2Rpm. txt" के साथ समाप्त होने पर एक द्वि-आयामी बार ग्राफ़ (चित्र 3, igl) के लिए निर्देशांक देता है.
    4. निंनलिखित कमांड द्वारा मानव IgL प्रदर्शनों की तसवीर कल्पना:
      $ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319. श
      नोट: इस पाइपलाइन के साथ, Igk और Igk concomitantly संसाधित कर रहे हैं. इनपुट फ़ाइल फ़ाइलनाम. fna अनुक्रम डेटा, अधिमानतः 6.2.4 के आउटपुट फ़ाइल है । इस फ़ाइल को किसी निंन निर्देशिका (फ़ोल्डर) में "filename" नाम से रखा जाना आवश्यक है । शेल स्क्रिप्ट की पंक्ति ५३ में, Para_4 के लिए "फ़ाइलनाम" असाइन करें । "_ Igklcount. txtDim2Rpm. txt" के साथ समाप्त होने वाला आउटपुट फ़ाइल नाम दो-आयामी बार ग्राफ़ के निर्देशांक देता है (चित्र 4, igl).

Representative Results

माउस के एंटीबॉडी रिपरटोअर्स

एक पूरे के रूप में एक म्यूरिन एंटीबॉडी रिपरटोइरे का एक परिप्रेक्ष्य कोशिकाओं या ऊतकों से प्राप्त किया जा सकता है जैसे प्लीहा, अस्थि मज्जा, लिम्फ नोड, या रक्त. चित्रा 3 igm, IgG1, IgG2c के प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है, और इम्युनोग्लोबुलिन प्रकाश श्रृंखला (आईजीएल) एक भोली माउस तिल्ली से repertoires. पठन संख्याओं का सारांश तालिका 3में दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, IgM-विशिष्ट हस्ताक्षर अनुक्रम (तालिका 2) में 166175/475144 पढ़ता है और 133371/166175 पढ़ता igm19द्वारा अनुमानित vdj-उत्पादक थे.

चित्रा 3 3 डी-vdj-साजिश है, जिसमें प्रत्येक गेंद का आकार पढ़ता के सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है द्वारा vdj-पुनर्विन्यास के एक प्रदर्शनों की स्थिति प्रोफ़ाइल से पता चलता है; दूसरे शब्दों में, पूरे बी कोशिकाओं में एंटीबॉडी mRNAs की संख्या । 3-डी मेष में ११० इघव, 12 इघद, और 4 इघज होते हैं, जो गुणसूत्र पर उनके क्रम को दर्शाने के लिए संरेखित होते हैं । इसके अलावा, IgBLAST द्वारा दिए गए अस्पष्ट जीन प्रत्येक IGHV के लिए अंतिम स्थिति में अलग से एकत्र किए गए थे, IGHV और IGHV लाइन, cuboid में ७,२१५ नोड्स को जंम दे रही है ।

इसके अलावा, चित्रा 3 में दिखाया गया है एक 2D-Vj-igl प्रदर्शनों की संख्या में vj पुनर्विन्यास के प्रोफ़ाइल दिखा साजिश है । इस प्लॉट पर प्रत्येक पट्टी की लंबाई पढ़ता की सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । x-अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है १०१ IGLVκ और 3 IGLVλ जीन, और y-अक्ष 4 IGLJκ और 3 IGLJλ रक्तप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है । अएनोटेटेड वी-और जे-जीन सही सीमा रेखा पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

पूरक-निर्धारण क्षेत्र 3 (CDR3) इन उत्पादक पढ़ता है, जो antigen-बाध्यकारी विशिष्टता के बहुमत को जंम देने के दृश्यों, IgBLAST outputs में दिए गए हैं । CDR3 दृश्यों सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है, जैविक या तकनीकी replicates सहित, पहले8,10वर्णित के रूप में ।

मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स

एक पूरे के रूप में एक मानव एंटीबॉडी प्रदर्शनों की स्थिति का एक परिप्रेक्ष्य परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) या रोग के ऊतकों सहित विभिन्न ऊतकों से विश्लेषण किया जा सकता है । चित्रा 4 igm के प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है, कुल Igm (IgG1, IgG2, IgG3, और IgG4), कुल iga (IgA1 और IgA2), Igm, iga और आईजीएल repertoires सामान्य PBMCs से. पठन संख्याओं का सारांश तालिका 3में दिखाया गया है । उदाहरण के लिए, IgM-विशिष्ट हस्ताक्षर अनुक्रम 90238/1582754 पढ़ता है और 67896/90238 पढ़ता VDJ-उत्पादक थे ।

VDJ पुनर्विन्यास के प्रदर्शनों की रूपरेखा एक 3 डी-VDJ-साजिश है जिसमें प्रत्येक गेंद का आकार पढ़ता के सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है पर दिखाया गया है; दूसरे शब्दों में, पूरे PBMCs से एंटीबॉडी mRNAs की संख्या (चित्रा 4) । 3-डी मेष में ५६ IGHV, 27 IGHV, और 6 IGHV, क्रम वे गुणसूत्र पर दिखाई देते हैं संरेखित होते हैं । इसके अलावा, IgBLAST द्वारा निर्दिष्ट जीन अस्पष्ट प्रत्येक IGHV के लिए अंतिम स्थिति में अलग प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, IGHV और IGHV लाइन, cuboid में ११,१७२ नोड्स को जंम दे रही है ।

आईजीएल रिपरटोइयर में वीजे-पुनर्विन्यास की रुपरेखा को 2D-वीजे-प्लॉट में दर्शाया गया है जिसमें प्रत्येक बार की लंबाई, पठित की सापेक्ष संख्या (चित्र 4) दर्शाती है । x-अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है ४१ IGLVκ और ३२ IGLVλ जीन, और y-अक्ष 5 IGLJκ और 5 IGLJλ रक्तप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है । संयुक्त राष्ट्र एनोटेटेड वी और जे जीन सही सीमा रेखा पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

मानव CDR3 दृश्यों igblast outputs में दिया जाता है और सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है पहले8,10के रूप में वर्णित है ।

इम्युनेस्टोब्युलिन वर्ग भावना Antisense
माउस इम्युनोग्लोबुलिन भारी जंजीरों (C57BL/
आईजीएम AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC GACATTTGGGAAGGACTGएकमेकाअधिनियम
IgG1 AAAACGACACCCCCATCTGTC GACAGATGGGGGTGTCGTTTT
(IgG1 variant) AAAACACACCCCCATCAGTC GACTGATGGGGGTGTTGTTTT
IgG2c AAAACAACAGCCCCATCGGTC GACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgG3 GTGATCCCGTGATAATCGGCT AGCCGATTATCACGGGATCAC
Iga TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG
माउस इम्युनोग्लोबुलिन प्रकाश जंजीरों (C57BL/
Igκ CTGTATCCATCTTCCCACCATC-गैग GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
Igλ1 TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGAAACA
Igλ2 TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGAAACA
Igλ3 TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGAAACA
Igλ4 TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGAACA
ह्यूमन इम्युनेस्टोब्युलिन हैवी चेन
आईजीएम GGGAGTGCATCCGCCCCAAC GTTGGGGCGGATGCACTCCC
आईजीजी GCTTCCACCAAGGGCCCATC GATGGGCCCTTGGTGGAAGC
Iga GCATCCCCGACCAGCCCCAA GACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgD GCACCCACCAAGGCTCCGGA TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC
Ige GCCTCCACACAGAGCCCATC GATGGGCTCTGTGTGGAGGC
ह्यूमन इम्युनेस्टोब्युलिन लाइट चेन
Igκ ACTGTGGCTGCACCATCTGC GCAGATGGTGCAGCCACAGT
Igλ1, 2, 6 GTCACTCTGTTCCCGCCCTC GAGGGCGGGAACAGAGTGAC
Igλ3, 7 GTCACTCTGTTCCCACCCTC GAGGGTGGGAACAGTGAC

तालिका 2: इम्युनेस्टोब्युलिन हस्ताक्षर दृश्यों का सारांश

माउस IgH कुल पढ़ता आईजीएम IgG1 IgG2c
इनपुट ४७५,१४४
IgC-युक्त १६६,१७५ २२९,६७१ ३६,६२८
VDJ-उत्पादक १३३,३७१ १९६,५८३ ३१,४४६
माउस आईजीएल कुल पढ़ता IgKappa इगलंबदा
इनपुट ५२७,६६८
IgC-युक्त १७८,९४८ २१,४४६
वीजे-उत्पादक १६०,९२४ १६,९८८
मानव IgH कुल पढ़ता आईजीएम आईजीजी Iga IgD Ige
इनपुट १,५८२,७५४
IgC-युक्त ९०,२३८ ५,२९८ ९४,०६१ ७५,५४९ २,९३२
VDJ-उत्पादक ६७,८९६ २,७७५ ७८,२०३ ५६,४९५ 3
मानव आईजीएल कुल पढ़ता IgKappa इगलंबदा
इनपुट १,५८२,७५४
IgC-युक्त १२०,३१६ ६४,१४८
वीजे-उत्पादक ९७,१६९ ५२,३२४

तालिका 3: प्रयोगों में पठन संख्याओं का सारांश

Figure 1
चित्रा 1: व्यक्तिगत चूहों में एंटीबॉडी रिपरटोअर्स का विश्लेषण करने के लिए अनुक्रमण रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (क) प्रतिरक्षा कोशिकाओं या ऊतकों से कुल आरएनए रिवर्स-transcribed और यूनिवर्सल फॉरवर्ड प्राइमर और इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग विशिष्ट रिवर्स primers का उपयोग कर पीसीआर प्रवर्धित किया गया था । प्रत्येक इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग से amplicons परित और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए गाया गया था । (ख) C57BL/6 चूहों से spleens के रूप में जैविक प्रतिकृति इस प्रकार माना जाता था: कुल rnas प्लीहा नमूनों से शुद्ध थे, और cdnas 5 ' द्वारा परिलक्षित थे-दौड़ यूनिवर्सल प्राइमरी और एंटीबॉडी वर्ग विशिष्ट प्राइमरी का उपयोग कर । वे तो व्यक्तिगत चूहों के लिए लेबलिंग प्राइमरों के साथ अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए गाया गया था । चित्रा के कुछ हिस्सों की अनुमति के साथ8 से अनुकूलित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: व्यक्तिगत चूहों में एंटीबॉडी रिपरटोअर्स का विश्लेषण करने के लिए डेटा-प्रोसेसिंग फ्लो चार्ट की योजनाबद्ध । amplicon पढ़ता प्राप्त के बाद अगली पीढ़ी अनुक्रमण के रूप में संसाधित किए गए थे: (1) पठन दृश्यों एंटीबॉडी वर्ग-विशिष्ट हस्ताक्षर दृश्यों की उपस्थिति के लिए जाँच की गई; (2) वी, डी के लिए दृश्यों की जांच की गई, और जे जीन टुकड़े IMGT/HighV-खोज और/या IgBLAST का उपयोग कर; (3) एक उत्पादक VDJ जंक्शन युक्त दृश्यों एकत्र किए गए; और (४) इन दृश्यों का उपयोग समग्र रिपरटॉयर सुविधाओं, CDR3 आदि के विश्लेषण के लिए किया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: माउस एंटीबॉडी रिपरटोअर्स के लिए वैश्विक डेटा विज़ुअलाइज़ेशन । प्रत्येक एंटीबॉडी वर्ग के समग्र प्रदर्शनों की संख्या प्रोफाइल 3 डी-vdj-साजिश द्वारा कल्पना थे । x-अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है ११० IGHV जीन गुणसूत्र पर के रूप में आदेश दिया । y-और z-अक्ष क्रमशः 12 IGHD और 4 IGHD जीन का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक नोड पर क्षेत्रों की मात्रा पढ़ता की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । लाल क्षेत्रों: संयुक्त राष्ट्र एनोटेटेड वी, डी, और जंमू जीन । IgL पठन distributions 2D-VJ-प्लॉट जिसमें प्रत्येक पट्टी की लंबाई पढ़ता की सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है पर दिखाए जाते हैं । x-अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है १०१ x IGLVκ और 3 x IGLVλ जीन, और y-अक्ष 4 x IGLJκ और 3 x IGLJλ रक्तप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है । संयुक्त राष्ट्र एनोटेटेड वी और जे जीन सही सीमा रेखा पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स के लिए वैश्विक डेटा विज़ुअलाइज़ेशन । प्रत्येक एंटीबॉडी वर्ग के समग्र प्रदर्शनों की संख्या प्रोफाइल 3 डी-vdj-साजिश द्वारा कल्पना थे । x-अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है ५६ IGHV जीन गुणसूत्र पर के रूप में आदेश दिया । y-और z-अक्ष क्रमशः 27 IGHD और 6 IGHD जीन का प्रतिनिधित्व करता है । प्रत्येक नोड पर क्षेत्रों की मात्रा पढ़ता की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । लाल क्षेत्रों: संयुक्त राष्ट्र एनोटेटेड वी, डी, और जंमू जीन । आईजीएल पढ़ता 2 डी-वीजे-प्लॉट, जिसमें प्रत्येक पट्टी की लंबाई पढ़ता के सापेक्ष संख्या का प्रतिनिधित्व करता है पर arrayed हैं । x-अक्ष का प्रतिनिधित्व करता है ४१ x IGLVκ और ३२ x IGLVλ जीन, और y-अक्ष 5 x IGLJκ और 5 x IGLJλ रक्तप्रवाह का प्रतिनिधित्व करता है । संयुक्त राष्ट्र एनोटेटेड वी और जे जीन सही सीमा रेखा पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

विधि यहां वर्णित एंटीबॉडी आरएनए के लिए NGS का इस्तेमाल 5 '-दौड़ विधि का उपयोग प्रवर्धित । के विपरीत विधियों का उपयोग करें कि अपभ्रष् ट 5 '-VH जीन primers, प्रत्येक एंटीबॉडी वर्ग के mrnas समान रूप से परिलक्षित होते है सार्वभौमिक आगे primers का उपयोग कर । इसके अलावा, एंटीसेंस के उपयोग के लिए विशिष्ट प्राइमरों स्थिरांक-क्षेत्र 1 (CH1) एंटीबॉडी जीन के विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन कक्षाओं के प्रदर्शनों की रूपरेखा सक्षम बनाता है । यह वर्ग विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रिया विदारक के लिए बहुत फायदेमंद है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में भोली और प्रतिरक्षित repertoires8,9की तुलना के लिए ।

इस विधि का सबसे संभावित रूप से होने वाला नुकसान प्रवर्धित इम्युनेस्टोबुलिन संदेशों की कमी है । इस प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त एंटीबॉडी रिपरटॉयर की गहराई काफी हद तक चरण ३.१ और ३.२ में वर्णित पीसीआर प्रवर्धन पर निर्भर करती है । यदि रिपरटॉयर गहराई ठीक से प्राप्त नहीं है, कदम 3.2.1 या 3.2.2 में टेम्पलेट cdna और प्राइमरों के अनुपात में परिवर्तन दृढ़ता से सिफारिश की है.

आम तौर पर, NGS द्वारा उत्पादित एंटीबॉडी पढ़ता का लगभग 20% अस्पष्ट दृश्यों21हैं । यहां तक कि स्थापित "सुधार विधियों" के साथ, 5-10% अस्पष्ट3रहते हैं । इसलिए हम, अनुक्रम और फ़िल्टर्ड कच्चे हस्ताक्षर इम्युनोग्लोबुलिन निरंतर क्षेत्रों (cμh1, Cγ1H1, Cγ2cH1, आदि) के अनुरूप दृश्यों युक्त पढ़ता विश्लेषण किया । इसलिए दैहिक हाइपर-म्यूटेशन के विश्लेषण के लिए सावधान परीक्षाओं की जरूरत होती है.

इस विधि की सीमाओं में से एक यह है कि इम्युनोग्लोबुलिन भारी और प्रकाश श्रृंखला जोड़ी inferred करने में असमर्थ है । इसलिए इस विधि द्वारा प्राप्त प्रदर्शनों की दृष्टि समग्र नहीं है । हालांकि, यह डेटा10के सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा शीर्ष रैंकिंग जोड़े अनुमानित करने के लिए संभव है । इसके अलावा, इम्युनोग्लोबुलिन जोड़े अनुक्रम करने के लिए एक उपंयास विधि हाल ही में3,4की सूचना दी थी ।

इम्युनोग्लोबुलिन आउटपुट में अनुक्रम. fna डेटा इम्युनोग्लोबुलिन जीन हस्ताक्षर दृश्यों की उपस्थिति के आधार पर निकाले गए. इसके बाद वी, डी, और जे जीन सेगमेंट को एनोटेटेड किया गया और वी (डी) जे पुनर्व्यवस्था की उत्पादकता का आकलन किया गया. पूरकता-निर्धारण क्षेत्र 3 (CDR3) दृश्यों को भी एनोटेटेड किया गया । . fna डेटा में इम्युनोग्लोबुलिन दृश्यों की इन व्यवस्थित परीक्षाओं के लिए उपयोगी imgt/highv-क्वेस्ट सर्वर22,23,24द्वारा प्रदान किए गए थे । हालांकि, एक स्वचालित प्रसंस्करण पाइप लाइन के निर्माण के लिए बड़े प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण करने के लिए योग्यता है । पाइपलाइन प्रत्येक उद्देश्य के लिए अनुकूलित स्टैंडअलोन IgBLAST प्रोटोकॉल19का उपयोग करके स्थापित करने के लिए संभव है । यह दृष्टिकोण बुनियादी प्रोग्रामिंग साक्षरता की जरूरत है, लेकिन इम्युनोग्लोबुलिन प्रणाली का विस्तृत विश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी है । वर्णित पाइपलाइनों अनुकूलित प्रोटोकॉल (चित्रा 2) के उदाहरण हैं ।

एंटीबॉडी पढ़ता की संख्या नमूना में एंटीबॉडी rnas की राशि के लिए आनुपातिक है, प्रतिरशि के घटकों को दर्शाते समय अंक5,8,25पर एंटीबॉडी सिस्टम । यहां वर्णित विधि वी (डी) जंमू एक एंटीबॉडी प्रदर्शनों की सूची का उपयोग कर के एक पक्षी के नेत्र देख देता है आर कार्यक्रम8,18,26।

व्यक्तिगत भोली चूहों के IgM एंटीबॉडी रिपरटोअर्स की वैश्विक दृष्टि से IgG1 या IgG2c8के उन लोगों की तुलना में एक अत्यधिक संरक्षित vdj-प्रोफ़ाइल का पता चला । यह बताया गया है कि अपरिपक्व zebrafish के vdj संयोजन अत्यधिक टकसाली9रहे हैं । इसके विपरीत, मानव VDJ संयोजन करने के लिए अत्यधिक विषम6सूचित कर रहे हैं. भोले बी कोशिकाओं में अत्यधिक संरक्षित निर्धारणात्मक VDJ-प्रोफाइल शायद या तो विषम VDJ द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं-rearrangements या ऑटो के साथ नकारात्मक चयन-शरीर में प्रस्तुत एंटीजन. उदाहरण के लिए, IGHV11-2 भ्रूण igm प्रदर्शनों की क्रिया27 में बेहतर ढंग से व्यक्त की है और इस प्रबलता IGHV11 की autoreactivity के लिए जिंमेदार ठहराया है-2 सेनेसेंट एरिथ्रोसाइट्स के खिलाफ27। दिलचस्प है, IGHV11-2 भी भोले IgM8के हमारे पहले प्रकाशित विश्लेषण में सबसे आम प्रमुख प्रदर्शनों की खबर थी ।

यहां वर्णित विधि एंटीबॉडी-रिपरटॉयर व्यक्तिगत निकायों में उत्पन्न अंतरिक्ष का विश्लेषण करके antigen-उत्तरदायी एंटीबॉडी रिपरटोअर्स गूढ़ रहस्य के लिए उपयोगी है, कुंजी एंटीबॉडी प्रदर्शनों की जाँच8के असावधानीवश चूक से बचने, 10. इस विधि भी विस्तृत एंटीबॉडी नेटवर्क गतिशीलता की परीक्षा है, जो नए उभरते रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षात्मक एंटीबॉडी की त्वरित खोज की सुविधा होगी की अनुमति देता है ।

Disclosures

लेखकों के हित का कोई विरोध प्रकट करना है.

Acknowledgments

यह काम अनुदान संख्या JP18fk0108011 (KO और SI) और JP18fm0208002 (टीएस, KO, और यो) के तहत एमएड से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (15K15159) से अनुदान में सहायता को KO । बहुमूल्य तकनीकी सहायता के लिए हम सय्री यामागुची और सतोको ससाकी को धन्यवाद देते हैं । हम अंग्रेजी भाषा संपादन के लिए एडीटेज (www.editage.jp) का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL Strip Tubes Thermo Fisher Scientific AB0452 120 strips
100 bp DNA Ladder TOYOBO DNA-035 0.5 mL
2100 Bioanalyzer Systems Agilent Technologies G2939BA /2100
Acetic Acid Wako 017-00256 500 mL
Agarose, NuSieve GTG Lonza 50084
Ammonium Chloride Wako 017-02995 500 g
Chloroform Wako 038-02606 500 mL
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” NISSUI  08192
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) Wako 345-01865 500 g
Falcon 40 µm Cell Strainer Falcon 352340 50/Case
ling lock tube 1.7 mL BM EQUIPMENT BM-15
ling lock tube 2.0 mL BM EQUIPMENT BM-20
MiSeq Reagent Kit v2 illumina MS-102-2003 500 cycles
MiSeq System illumina SY-410-1003
NanoDrop 2000c Spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
Potassium Hydrogen Carbonate Wako 166-03275 500 g
PureLink RNA Mini Kit life technologies 12183018A
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854 500 assays
SMARTer RACE 5’/3’ Kit  Clontech  634858
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version  Takara Bio Inc.  RR006A 
Trizma base Sigma T6066 1 kg
TRIzol Reagent AmbionThermo Fisher Scientific 15596026 100 mL
Ultra Clear qPCR Caps Thermo Fisher Scientific AB0866 120 strips
UltraPure Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega  A9282

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अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा माउस और मानव एंटीबॉडी रिपरटोअर्स की पहचान
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