Summary
Her beskriver vi protokoller for analyse og visualisering av strukturen og Grunnloven av hele antistoff repertoar. Dette innebærer anskaffelse av store sekvenser av antistoff med neste generasjons sekvensering.
Abstract
Enorm tilpasningsevne antigen anerkjennelse av antistoffer er grunnlaget for det ervervet immun systemet. Til tross for vår forståelse av molekylære mekanismer underliggende produksjon av det store repertoaret av antistoffer av ervervet uimottakelig systems, er det ennå ikke mulig å komme frem til en global oversikt over et komplett antistoff repertoar. Spesielt har B celle repertoar vært betraktet som en svart boks på grunn av deres astronomiske antallet antistoff kloner. Neste generasjons sekvensering teknologi er imidlertid slik at gjennombrudd for å øke vår forståelse av B celle repertoaret. I denne rapporten beskriver vi en enkel og effektiv metode for å visualisere og analysere hele personlige musen og menneskelige antistoff repertoar. Fra immun organer var representatively fra milt i mus og perifert blod mononukleære celler hos mennesker, totalt RNA forberedt, reverse transkribert og forsterket med metoden 5'-løp. Bruke en universell frem primer og antisense primere for antistoff klasse-spesifikke konstant domenene, var antistoff mRNAs jevnt forsterket i proporsjoner reflekterer frekvenser antistoff bestander. Amplicons ble sekvensert av neste generasjons sekvensering (NGS), gir mer enn 105 antistoff sekvenser per immunologiske prøve. Vi beskriver protokollene for antistoff sekvens analyser inkludert V (D) J-gen-segmentet merknad, et fugleperspektiv av antistoff repertoar, og vår beregningsorientert metoder.
Introduction
Antistoff systemet er en av grunnleggende av ervervet immunsystemet. Det er svært potent mot invaderende patogener sin enorme mangfold, fine antigen anerkjennelse spesifisitet og klonal utvidelse av antigen-spesifikke B-celler. Repertoaret av antistoff-produserende B-celler er anslått til mer enn 1015 i en enkelt personlige1. Dette enorme mangfoldet genereres ved hjelp av VDJ genet rekombinasjon i immunglobulin genetisk loci2. Beskrivelse av hele B-cellen repertoar og deres dynamiske endringer i respons til antigen-immunisering er derfor utfordrende, men avgjørende for en fullstendig forståelse av antistoff respons mot invaderende patogener.
På grunn av deres astronomiske mangfold, har B celle repertoar vært betraktet som en svart boks; men har ankomsten av NGS teknologi aktivert gjennombrudd til en bedre forståelse av sine kompleksitet3,4. Hele antistoff repertoar er vellykket analysert, først i sebrafisk5, deretter mus6, og mennesker6,7. Selv om NGS har nå blitt et kraftig verktøy i studiet av adaptive immunforsvaret, mangler grunnleggende analyser av fellestrekk og forskjeller i antistoff repertoar blant enkelte dyr.
I mus, ble det rapportert at IgM repertoar er nesten identisk mellom individer, mens IgG1 og IgG2c er vesentlig forskjellig mellom individer8. V-genet bruksprofil er observerte frekvensen av VDJ profil i naiv perifere B-celler svært lignende mellom individer8. Analyse av amino acid sekvenser av VDJ-regionen viste også forekomsten av den samme junctional sekvenser i forskjellige mus mye oftere enn tidligere trodde8. Disse resultatene indikerer at mekanismene for antistoff repertoar dannelsen kan være deterministisk i stedet for Stokastisk5,8,9. Prosessen med antistoff repertoar utvikling i mus har også vært vellykket analysert ved hjelp av NGS ytterligere utheve potensialet i NGS å avdekke antistoff immunsystemet i detalj10.
I denne rapporten beskriver vi en enkel og effektiv metode for å visualisere og analysere et antistoff repertoar på et globalt nivå.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til institusjonelle retningslinjer og godkjenning av nasjonale Institute av smittsomme sykdommer Animal Care og bruk komiteen. Utvalg av PBMCs fra friske voksne frivillige, brukt som representant resultatet i denne rapporten ble utført med godkjenning av den etiske komiteen av de nasjonale Institute av smittsomme sykdommer, Tokyo, Japan, og skriftlig samtykke ble innhentet fra hver deltaker ved hjelp av en etisk komité-godkjent skjema.
1. primer Design
- Utforme en universell frem primer cDNA å forsterke immunglobulin mRNA uten bias fra PCR primere, som brukes i 5'-RACE11,12 og SMART PCR13 teknikker.
- For immunglobulin VH gene forsterkning, utforme immunglobulin klasse-spesifikke sekvenser i regionen konstant som omvendt primere8,14 (figur 1A).
Merk: Multiplex tag sekvenser kan legges til noen av disse veiledningene å merke biblioteket molekylene fra forskjellige prøvekilder. Sekvenser for nestede PCR kan også legges i henhold til veiledningen av kit brukes15.
| Universell frem primer | 5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 " |
| Omvendt primere for musen immunglobuliner (Ref.8) | |
| IgM_CH1: | 5-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 " |
| IgG1_CH1: | 5-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 " |
| IgG2c_CH1: | 5-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 " |
| IgG3_CH1: | 5-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3 " |
| IgA_CH1: | 5-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3 " |
| Igκ_CH1: | 5-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 " |
| Igλ_CH1: | 5-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 " |
| Omvendt primere for den menneskelige immunglobuliner (Ref.14) | |
| IgM_CH1: | 5-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 " |
| IgG_CH1: | 5-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 " |
| IgD_CH1: | 5-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 " |
| IgA_CH1: | 5-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 " |
| IgE1_CH1: | 5-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 " |
| IgE2_CH1: | 5-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 " |
| Igκ_CH1: | 5-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 " |
| Igλ_CH1: | 5-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 " |
Tabell 1: Primer sekvenser for PCR-forsterkning av immunglobuliner
2. nukleinsyre isolasjon fra immunceller og vev
Merk: Prosedyren nedenfor er for uttrekking nukleinsyrer fra musen milten. Men er det andre immun vev og menneskelige celler som lymfeknuter eller perifert blod mononukleære celler (PBMCs) (figur 1B).
- Dissekere den vev, f.eks, milt fra en 8-uke-gamle C57BL/6 musen og passere gjennom en rustfritt stål mesh (200 til 400 µm) med 2 mL PBS buffer å få spredte celler. Overføre celle suspensjon til en 2.0 mL microcentrifuge rør, og sentrifuge for 5 min på 600 × g og 4 grader. Kast nedbryting.
- Legg til 800 µL ACK lysing bufferen (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7.2) pellet, og ruge på isen i 2 minutter å lyse røde blod celler i vevet.
- Vask av vev celler med 2 mL PBS 3 x, etterfulgt av sentrifugering i 5 min på 600 × g og 4 grader.
- Legge til 800 µL av fenol/guanidine isothiocyanate reagensen pellets, vortex grundig, og Inkuber på rundt 25 grader i 5 min.
- Legge til kloroform (200 µL), riste manuelt for 15 s, og deretter Inkuber i 2 minutter på rundt 25 grader.
- Separate faser av sentrifugering i 15 min på 12.000 × g og 25 grader og overføre den øvre vandige fasen til en frisk rør.
- Legge ett volum med 70% etanol, vortex kort og bruke det til kolonnen silica spinn.
- Elute RNA med 30-100 µL av vann.
- Quantitate første RNA konsentrasjon ved hjelp av en fluorometer (Tabell for materiale).
- Lagre den renset RNA på-80 grader.
3. cDNA syntese og PCR forsterkning
Merk: Metoden beskrevet nedenfor er basert på 5'-RACE11,12 og SMART PCR teknikker13. Detaljene og optimalisering av reaksjonen er beskrevet i håndboken av kit 15. De starter materialene for musen immunglobulin er prøven fra trinn 2.10. De starter materialene for menneskelig immunglobulin er prøven fra menneskelig vev, ex. PBMC, behandlet som beskrevet i trinnene 2.3 til 2.10.
- Syntetisere første-strand cDNA fra 2 til 10 µg totale RNA malen bruker 5'-RACE CDer primer (oligo-dT-inneholder) og SMART PCR oligonucleotide (Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner15.
- For musen immunglobulin, PCR-forsterke cDNA med Hi-Fi-DNA Polymerase universell frem primer og immunglobulin klasse-spesifikke omvendt primere (tabell 1). Angi termisk sykling betingelsene som: 94 grader i 2 minutter, deretter 40 sykluser av 94 grader for 30 s, 59 grader for 30 s og 72 grader for 30 s, etterfulgt av en endelig utvidelse trinn på 72 grader i 5 min.
Merk: Typisk eksperimenter forsterke IgM, IgG1, IgG2c, Igk og Igl immunglobulin klasser å se på naiv, Th1-avhengige og Th2-avhengige B-celler (Figur 3). - Den menneskelige immunglobulin, utføre 1st PCR ved hjelp av universal frem primer og immunglobulin klasse-spesifikke omvendt primere (tabell 1) med tag sekvenser. Inkluderer indeks sekvenser for hvert utvalg av 2nd PCR bruker indeks sekvens primere. Bruk følgende PCR og Taq utvalg: 94 grader i 2 minutter, 21 sykluser (1st PCR) eller 32 sykluser (2nd PCR) på 94 grader for 30 s, 59 grader for 30 s, 72 grader for 30 s.
Merk: Typisk eksperimenter forsterke IgM IgD IgG (IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4), IgA (IgA1 og IgA2), IgE, Igk og Igl immunglobulin klasser å betrakte alle B celle populasjoner (Figur 4).
- For musen immunglobulin, PCR-forsterke cDNA med Hi-Fi-DNA Polymerase universell frem primer og immunglobulin klasse-spesifikke omvendt primere (tabell 1). Angi termisk sykling betingelsene som: 94 grader i 2 minutter, deretter 40 sykluser av 94 grader for 30 s, 59 grader for 30 s og 72 grader for 30 s, etterfulgt av en endelig utvidelse trinn på 72 grader i 5 min.
- Electrophorese produktene PCR som en agarose gel og rense 600-800 bp fragmenter bruker en silica membran spin-kolonne.
- Electrophorese prøven fra 3.2.1 eller 3.2.2 på 2% agarose gel.
- Visualisere DNA band på UV-transilluminator og avgiftsdirektoratet gel-sektoren som inneholder bredbånd mellom 600-800 bp.
- Legge til 10 mL av membran forpliktende løsning per 10 mg gel sektoren. Bland og ruge ved 50-65 ° C før gel stykket er fullstendig oppløst.
- Overføre gel løsningen silica membran spin-kolonnen. Vask en gang med å vaske bufferen og elute DNA med 50 mL av nuclease-fritt vann (Tabell for materiale).
- Kvantifisere det renset amplicons med en fluorometer og basseng amplicons fra hver immunglobulin klasse i like mengder for NGS sekvensering.
Merk: Vanligvis 2-10 mg amplicon DNA ble gjenopprettet for hver immunglobulin klasse. Bland hver eksempel løsning like i DNA beløp å gi opphav 50 mL løsning som inneholder 10-20 ng DNA/mL. - Bestemme størrelsen og konsentrasjonen av biblioteker med en mikro-kapillære basert geleelektroforese DNA størrelse chip (Tabell for materiale). Lagre bibliotekene på - 20 ° C.
4. NGS sekvensering av biblioteker
- Generere en SampleSheet.cvs for sekvenser kjøre angir eksempel navn, informasjon og instruere skaffe .fastq filer bare.
- Tine påreagenskassetten (Tabell for materiale) og bibliotekene.
- Lag 0,2 N NaOH og fortynne biblioteker for å få ønsket molar konsentrasjonen.
- Skyll og tørk flyt cellen. Legge til 600 mL utvannet og denaturert løsning i brønnen påreagenskassetten.
- Starte sekvensering kjøre.
5. kvalitetskontroll NGS data
- Utføre kvalitetskontroll av FASTQ data ved hjelp av "FASTX-Toolkit"16.
Merk: Et grunnleggende eksempel på parameterinnstillingene brukes er som følger:
fastq_quality_trimmer - v -t 20 - l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastq_quality_filter - v - q 20 - p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]
fastx_reverse_complement - v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] - Formatere utdatafiler til "fasta nucleic acid (.fna)" av følgende kommando:
fastq_to_fasta - v - n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna]
6. utvinning og analyse av immunglobulin sekvenser fra .fna Data
Merk: Eksempel programmene ble implementert i et UNIX-miljø. Bruk dem som et eksempel referanser fordi ytelsen kan avhenge av operativsystemet og maskinvare-miljøet. Forfatterne aksepterer ikke noe ansvar for feil eller forsømmelser. Den programmeringsspråk, Perl17, R18og nødvendige moduler må installeres i henhold til instruksjonene på sitert nettsteder. IgBLAST programmet må installeres i henhold til instruksjonene på den riktige nettside19,20.
- Last ned følgende eksempler på interne programmer for repertoar analyser fra https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
03_PipeLine_Mouse.zip; Et sett med eksempel programmer for analyser av musen antistoff sekvenser.
05_PipeLine_Human.zip; Et sett med eksempel programmer for analyser av menneskelig antistoff sekvenser. - Ekstra antistoffer leser i sekvens data: ekstra immunglobulin (Ig) sekvenser av hver Ig-klasse fra data (.fna) av et Perl program som søker signatur sekvenser i hver immunglobulin konstant region (tabell 2).
- For musen immunglobulin tunge kjede (IgH) arvestoffet, Pakk lest av følgende kommando:
$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [Input filnavn] [utdatafilnavn (suffikset)] - For musen immunglobulin lys kjeden ekstra (IgL) gener lest av følgende kommando:
$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [Input filnavn] [utdatafilnavn (suffikset)] - For menneskelige immunglobulin tunge kjede (IgH) arvestoffet, Pakk lest av følgende kommando:
$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [Input filnavn] [utdatafilnavn (suffikset)] - For menneskelige immunglobulin lys kjeden (IgL) arvestoffet, Pakk lest av følgende kommando:
$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [Input filnavn] [utdatafilnavn (suffikset)]
- For musen immunglobulin tunge kjede (IgH) arvestoffet, Pakk lest av følgende kommando:
- Merknader og sjekk produktiviteten til V (D) J genet rekombinasjon:
Merk: Metoden beskrevet nedenfor benytter frittstående IgBLAST19 for merknaden V (D) J genet segmenter i sekvensen. Angi databasen for V (D) J gener og parameterinnstillingene for IgBLAST som beskrevet20.- Kommentere musen immunglobulin tunge kjede (IgH) gener av følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organisme mus - domain_system imgt-spørring. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Kommentere musen immunglobulin lys kjeden (IgL) gener av følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organisme mus - domain_system imgt-spørring. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Kommentere menneskelige immunglobulin tunge kjede (IgH) gener av følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organisme human - domain_system imgt-spørring. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName - Kommentere menneskelige immunglobulin lys kjeden (IgL) gener av følgende kommando:
$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organisme human - domain_system imgt-spørring. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.Aux-show_translation - outfmt 7 >>. / $OutName
- Kommentere musen immunglobulin tunge kjede (IgH) gener av følgende kommando:
- Visualisere den globale funksjonen av et antistoff repertoar.
- Visualisere musen IgH repertoaret av følgende kommando:
$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
Merk: Inndatafilen er filename.fna (sekvens data), fortrinnsvis utdatafilen fra 6.2.1. Denne filen må plasseres i en lavere katalog (mappe) som heter "filnavn". I linje 50 av shell script, tilordne en "filnavn" for Para_4. - Visualisere det menneskelige IgH repertoaret av følgende kommando:
$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
Merk: Inndatafilen er filename.fna sekvens data, fortrinnsvis utdatafilen av 6.2.3. Denne filen må plasseres i nedre katalog (mappe) som heter "filnavn". I linje 46 i shell script, tilordne en "filnavn" for Para_4. - Visualisere musen IgL repertoaret av følgende kommando:
$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
Merk: Med denne rørledningen, Igk og Igl behandles samtidig. Inndatafilen er filename.fna (sekvens data), fortrinnsvis utdatafilen fra 6.2.2. Denne filen må plasseres i nedre-mappen (mappen) "filnavn". I linje 53 av shell script, tilordne en "filnavn" for Para_4. Utgang filnavnet, slutter med "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" gir koordinatene til en todimensjonal stolpediagram (Figur 3, IgL). - Visualisere det menneskelige IgL repertoaret av følgende kommando:
$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
Merk: Med denne rørledningen, Igk og Igl behandles samtidig. Inndatafilen er filename.fna sekvens data, fortrinnsvis utdatafilen av 6.2.4. Denne filen må plasseres i en lavere katalog (mappe) som heter "filnavn". I linje 53 av shell script, tilordne "filnavn" for Para_4. Utdatafilnavn slutter med "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" gir koordinatene til en todimensjonal stolpediagram (Figur 4, IgL).
- Visualisere musen IgH repertoaret av følgende kommando:
Representative Results
Antistoff repertoar av mus
Et perspektiv av et murint antistoff repertoar som helhet kan fås fra eller vev som milt, benmarg, lymfeknute eller blod. Figur 3 viser representant resultatene av IgM, IgG1, IgG2c og immunglobulin lys kjeden (IgL) repertoar fra en naiv musen milten. Sammendrag av Les tallene er vist i tabell 3. For eksempel 166,175/475,144 leser inneholdt IgM-spesifikke signatur sekvens (tabell 2) og 133,371/166,175 leser var VDJ-produktiv utledes ved IgBLAST19.
Figur 3 viser en repertoar profil av VDJ-omorganisering av 3D-VDJ-plot, som representerer størrelsen på hver ball relative antall leser; med andre ord, antall antistoff mRNAs i hele B-celler. 3D mesh består av 110 IGHV, 12 IGHD og 4 IGHJ, som er justert til å gjenspeile rekkefølgen på kromosomet. I tillegg ble genene tvetydig tildelt av IgBLAST samlet seg på siste plassering for hver IGHV, IGHD og IGHJ linje, gir opphav til 7,215 noder i cuboid.
Også vist i Figur 3 et 2D-VJ-plott viser profilen til VJ-omorganisering i IgL repertoar. Lengden på hver stolpe på denne tomten representerer den relative antallet leseoperasjoner. X-aksen representerer 101 IGLVκ og 3 IGLVλ gener, og y-aksen representerer 4 IGLJκ og 3 IGLJλ gener. Unannotated V - og J-genene er representert i høyre grenselandet.
Regionen komplementaritet-bestemme 3 (CDR3) sekvenser av disse produktive leser, som gir opphav til flertallet av antigen bindende spesifisitet, er gitt i IgBLAST utganger. CDR3 sekvenser kan analyseres statistisk, inkludert biologiske eller teknisk gjentak, som beskrevet tidligere8,10.
Menneskelige antistoff repertoar
Et perspektiv av en menneskelig antistoff repertoar som helhet kan analyseres fra ulike vev inkludert perifert blod mononukleære celler (PBMCs) eller patologisk vev. Figur 4 viser representant resultatene av IgM, totale IgG (IgG1, IgG2, IgG3 og IgG4), totalt IgA (IgA1 og IgA2), IgD, IgE og IgL repertoar fra normal PBMCs. Et sammendrag av Les tallene vises i tabell 3. For eksempel 90,238/1,582,754 leser inneholdt IgM-spesifikke signatur sekvens og 67,896/90,238 leser var VDJ-produktiv.
Repertoaret profilen VDJ omorganisering vises på 3D-VDJ-tomten der størrelsen på hver ball representerer den relative antallet leser; med andre ord, antall antistoff mRNAs fra hele PBMCs (Figur 4). 3D mesh består av 56 IGHV og 27 IGHD 6 IGHJ, i rekkefølgen de vises på kromosomet. I tillegg vises gener tvetydig tildelt av IgBLAST separat i den siste plassen for hver IGHV, IGHD og IGHJ linje, gir opphav til 11,172 noder i cuboid.
Profilen til VJ-omorganisering i IgL repertoar er avbildet i et 2D-VJ-plott som lengden på hver stolpe representerer den relative antallet leser (Figur 4). X-aksen representerer 41 IGLVκ og 32 IGLVλ gener, og y-aksen representerer 5 IGLJκ og 5 IGLJλ gener. Un kommenterte V - og J-genene er representert i høyre grenselandet.
Menneskelige CDR3 sekvensene er gitt i IgBLAST utganger og kan analyseres statistisk som beskrevet tidligere8,10.
| Immunglobulin klasse | Følelse | Antisense |
| Musen immunglobulin tunge kjeder (C57BL/6) | ||
| IgM | AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC | GACATTTGGGAAGGACTGACT |
| IgG1 | AAAACGACACCCCCATCTGTC | GACAGATGGGGGTGTCGTTTT |
| (IgG1 variant) | AAAACAACACCCCCATCAGTC | GACTGATGGGGGTGTTGTTTT |
| IgG2c | AAAACAACAGCCCCATCGGTC | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgG3 | GTGATCCCGTGATAATCGGCT | AGCCGATTATCACGGGATCAC |
| IgA | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG | TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG |
| Musen immunglobulin lys kjeder (C57BL/6) | ||
| Igκ | CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC | GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG |
| Igλ1 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG | CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ2 | TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG | CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ3 | TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG | CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA |
| Igλ4 | TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG | CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA |
| Menneskelige immunglobulin tunge kjeder | ||
| IgM | GGGAGTGCATCCGCCCCAAC | GTTGGGGCGGATGCACTCCC |
| IgG | GCTTCCACCAAGGGCCCATC | GATGGGCCCTTGGTGGAAGC |
| IgA | GCATCCCCGACCAGCCCCAA | GACCGATGGGGCTGTTGTTTT |
| IgD | GCACCCACCAAGGCTCCGGA | TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC |
| IgE | GCCTCCACACAGAGCCCATC | GATGGGCTCTGTGTGGAGGC |
| Menneskelige immunglobulin lys kjeder | ||
| Igκ | ACTGTGGCTGCACCATCTGC | GCAGATGGTGCAGCCACAGT |
| Igλ1, 2, 6 | GTCACTCTGTTCCCGCCCTC | GAGGGCGGGAACAGAGTGAC |
| Igλ3, 7 | GTCACTCTGTTCCCACCCTC | GAGGGTGGGAACAGAGTGAC |
Tabell 2: Sammendrag av immunglobulin signatur sekvenser
| Musen IgH | Totalt antall lesninger | IgM | IgG1 | IgG2c | ||
| Inngang | 475,144 | |||||
| IgC inneholder | 166,175 | 229,671 | 36,628 | |||
| VDJ-produktiv | 133,371 | 196,583 | 31,446 | |||
| Musen IgL | Totalt antall lesninger | IgKappa | IgLambda | |||
| Inngang | 527,668 | |||||
| IgC inneholder | 178,948 | 21,446 | ||||
| VJ-produktiv | 160,924 | 16,988 | ||||
| Menneskelige IgH | Totalt antall lesninger | IgM | IgG | IgA | IgD | IgE |
| Inngang | 1,582,754 | |||||
| IgC inneholder | 90,238 | 5,298 | 94,061 | 75,549 | 2,932 | |
| VDJ-produktiv | 67,896 | 2775 | 78,203 | 56,495 | 3 | |
| Menneskets IgL | Totalt antall lesninger | IgKappa | IgLambda | |||
| Inngang | 1,582,754 | |||||
| IgC inneholder | 120,316 | 64,148 | ||||
| VJ-produktiv | 97,169 | 52,324 |
Tabell 3: Sammendrag av Les tallene i eksperimenter
Figur 1: skjematisk fremstilling av sekvensering strategi for å analysere antistoff repertoar i individuelle mus. (A) total RNA fra immunceller eller vev ble omvendt-transkribert og PCR-forsterket bruker universell frem primer immunglobulin klasse-spesifikke reversere primere. Amplicons fra hver immunglobulin klasse var samlet og ytet for neste generasjons sekvensering. (B) biologisk replikerer som spleens fra C57BL/6 mus ble behandlet slik: totalt RNAs var renset fra milt prøver, og cDNAs ble forsterket av 5'-løp med universell primer og antistoff klasse-spesifikke primer. De ble deretter gjengitt for neste generasjons sekvensering med merking primere for individuelle mus. Figuren er tilpasset fra8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk for databehandling flytskjema for å analysere antistoff repertoar i individuelle mus. Amplicon leser innhentet etter neste generasjons sekvensering ble behandlet som følger: (1) Les sekvenser ble sjekket for påvisning av antistoff klasse-spesifikke signatur sekvenser; (2) sekvenser ble undersøkt for V, D, og J genet fragmenter bruker IMGT/HighV-Quest og/eller IgBLAST; (3) sekvenser som inneholder en produktiv VDJ krysset ble samlet; og (4) disse sekvenser ble brukt for analyse av generelle repertoar funksjoner, CDR3, etc. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Global data visualiseringen for musen antistoff repertoar. Generelle repertoar profiler av hver antistoff klasse var visualisert ved 3D-VDJ-handlingen. X-aksen representerer 110 IGHV gener bestilt på kromosomet. Det y - og z - aksen representerer 12 IGHD og 4 IGHJ gener, henholdsvis. Volumet av kuler på hver node representerer antall leseoperasjoner. Rød kuler: un kommenterte V, og gener. IgL lese distribusjoner vises på 2D-VJ-tomten der lengden på hver stolpe representerer den relative antallet leseoperasjoner. X-aksen representerer 101 x IGLVκ og 3 x IGLVλ gener, og y-aksen representerer 4 x IGLJκ og 3 x IGLJλ gener. Un kommenterte V og J genene er representert i høyre grenselandet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Global data visualiseringen for menneskelig antistoff repertoar. Generelle repertoar profiler av hver antistoff klasse var visualisert ved 3D-VDJ-handlingen. X-aksen representerer 56 IGHV gener bestilt på kromosomet. Det y - og z - aksen representerer 27 IGHD og 6 IGHJ gener, henholdsvis. Volumet av kuler på hver node representerer antall leseoperasjoner. Rød kuler: un kommenterte V, og gener. Den IgL lest er plassert på 2D-VJ-tomten der lengden på hver stolpe representerer den relative antallet lest. X-aksen representerer 41 x IGLVκ og 32 x IGLVλ gener, og y-aksen representerer 5 x IGLJκ og 5 x IGLJλ gener. Un kommenterte V - og J-genene er representert i høyre grenselandet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Metoden beskrevet her benytter NGS for antistoff RNA forsterket med metoden 5'-løp. I motsetning til metoder som bruker degenerert 5'-VH genet primere, er mRNAs av hver antistoff klasse forsterket jevnt med universell frem primere. I tillegg kan bruken av antisense primere bestemt for konstant-regionen 1 (CH1) av antistoff genet repertoar profilering av bestemte immunglobulin klasser. Dette er svært gunstig for dissekere klasse-spesifikke antistoffet svaret og sammenligne naiv og vaksineres repertoar8,9.
En passende fallgruve metoden er en paucity forsterket immunglobulin meldinger. Dybden av antistoff repertoar innhentet av denne protokollen vesentlig avhenger PCR forsterkning beskrevet i trinnene 3.1 og 3.2. Hvis repertoar dybden ikke skal oppnås, anbefales det sterkt at du endrer prosenter av malen cDNA og primere i trinn 3.2.1 eller 3.2.2.
Vanligvis er omtrent 20% i antistoff lyder produsert av NGS tvetydig sekvenser21. Selv med etablerte "korreksjonsmetoder", 5-10% være tvetydig3. Vi har derfor analysert sekvensen og filtrert lese rådata som inneholder signatur sekvenser tilsvarer immunglobulin konstant regioner (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, etc.). Dermed må analyse av somatiske hyper-mutasjoner forsiktig eksamen.
En av begrensningene i denne metoden er at immunglobulin tunge og lys kjeden par kan ikke utledes. Derav er visningen repertoar ved denne metoden ikke Holistisk. Det er imidlertid mulig å omtrentlige topp-ranking parene av statistisk analyse av data10. Også rapporterte en ny metode sekvensen immunglobulin parene var nylig3,4.
Immunglobulin sekvenser i .fna utdataene ble hentet basert på tilstedeværelsen av immunglobulin gensekvenser signatur. V, D og J genet segmenter ble deretter kommentert og produktiviteten til V (D) J rearrangements ble vurdert. Regionen komplementaritet-bestemme 3 (CDR3) sekvenser ble også kommentert. Disse systematisk undersøkelser av immunglobulin sekvenser i .fna data ble nyttig levert av IMGT/HighV-QUEST server22,23,24. Bygge en automatisert forløpet har imidlertid de fortjener å analysere store eksperimentelle data. Rørledningen tilpasset formålet er mulig å sette opp ved hjelp av frittstående IgBLAST protokollen19. Denne tilnærmingen må grunnleggende programmering leseferdighet, men er svært nyttig for detaljerte analyser av immunglobulin systemet. Rørledningene beskrevet er eksempler på tilpassede protokollen (figur 2).
Antall antistoff leser er proporsjonal med mengden av antistoff RNAs i utvalget, reflekterer antistoff spesialpreparatets antistoff systemet gitt tid poeng5,8,25. Metoden beskrevet her gir et fugleperspektiv av et antistoff repertoar bruker R programmer8,18,26V (D) J grunnlov.
Globale visningen av IgM antistoffer repertoar av personlige naiv mus avslørte en høyt konservert VDJ-profil i forhold til de IgG1 eller IgG2c8. Det ble rapportert at VDJ kombinasjoner av umodne sebrafisk er svært stereotype9. Derimot er menneskelige VDJ kombinasjoner rapportert å være svært skjev6. Høyt konservert deterministisk VDJ-profilene i naiv B celler er sannsynligvis generert enten av skjev VDJ-rearrangements eller negativ utvalg med auto-antigener presentert i kroppen. For eksempel IGHV11-2 uttrykkes fortrinnsvis de fosterets IgM repertoar27 og dette overvekt er knyttet til autoreactivity av IGHV11-2 mot senescent erytrocytter27. Interessant, var IGHV11-2 også det vanligste store repertoaret i vår tidligere publiserte analyse av naiv IgM8.
Metoden beskrevet her er nyttig for å tyde antigen-responsive antistoff repertoar av inclusively analyse av antistoff-repertoaret plassen generert i individuelle organer, unngå utilsiktet unnlatelse av viktige antistoff repertoar8, 10. Denne metoden tillater også undersøkelse av detaljert antistoff nettverk dynamikk, som vil lette akselerert oppdagelsen av beskyttende antistoffer mot nye patogener.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra AMED under Grant nummer JP18fk0108011 (KO og SI) og JP18fm0208002 (TS, KO og kast), og en Grant-in-Aid fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (15K 15159) til KO. Vi takker Sayuri Yamaguchi og Satoko Sasaki for verdifull teknisk assistanse. Vi vil gjerne takke Editage (www.editage.jp) for engelsk redigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip Tubes | Thermo Fisher Scientific | AB0452 | 120 strips |
| 100 bp DNA Ladder | TOYOBO | DNA-035 | 0.5 mL |
| 2100 Bioanalyzer Systems | Agilent Technologies | G2939BA /2100 | |
| Acetic Acid | Wako | 017-00256 | 500 mL |
| Agarose, NuSieve GTG | Lonza | 50084 | |
| Ammonium Chloride | Wako | 017-02995 | 500 g |
| Chloroform | Wako | 038-02606 | 500 mL |
| Dulbecco's PBS (-)“Nissui” | NISSUI | 08192 | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) | Wako | 345-01865 | 500 g |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | 50/Case |
| ling lock tube 1.7 mL | BM EQUIPMENT | BM-15 | |
| ling lock tube 2.0 mL | BM EQUIPMENT | BM-20 | |
| MiSeq Reagent Kit v2 | illumina | MS-102-2003 | 500 cycles |
| MiSeq System | illumina | SY-410-1003 | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Hydrogen Carbonate | Wako | 166-03275 | 500 g |
| PureLink RNA Mini Kit | life technologies | 12183018A | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | 500 assays |
| SMARTer RACE 5’/3’ Kit | Clontech | 634858 | |
| TaKaRa Ex Taq Hot Start Version | Takara Bio Inc. | RR006A | |
| Trizma base | Sigma | T6066 | 1 kg |
| TRIzol Reagent | AmbionThermo Fisher Scientific | 15596026 | 100 mL |
| Ultra Clear qPCR Caps | Thermo Fisher Scientific | AB0866 | 120 strips |
| UltraPure Ethidium Bromide | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 |
References
- Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
- Tonegawa, S.
- Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
- Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
- Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
- Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).
- Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
- Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
- Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
- Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
- Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
- Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
- Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
- SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
- FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
- Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
- Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
- IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
- Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404 (2011).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
- Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
- IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
- Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
- rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
- Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).
