Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

دهن بلير التجارب مع بليرس فقاعة الاتصال للتصحيح--كلامبيرس

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لتشكيل بليرس الدهن باستخدام أسلوب بلير اتصال فقاعي. هو مهب فقاعة مياه في المذيبات عضوية، حيث تتشكل من أحادي الطبقة على الواجهة المائية للنفط. يتم التلاعب بها الماصات اثنين لإرساء فقاعات لتشكيل من بلير.

Abstract

دهن بليرس توفير منصة تجريبية فريدة من نوعها للدراسات الفنية من قنوات أيون، مما يتيح دراسة التفاعلات غشاء القناة تحت غشاء مختلف التراكيب الدهن. فيما بينها، وقد اكتسب bilayer واجهة الحبرية شعبية؛ ومع ذلك، حجم كبير الغشاء يعوق تسجيل منخفضة الضوضاء الكهربائية. وقد أنشأنا أسلوب بلير (مصرف البحرين المركزي) فقاعة اتصال الذي يجمع بين فوائد الدهن مستو بلير وأساليب التصحيح-المشبك، مثل القدرة على تكوين الدهن وتختلف والتلاعب الميكانيكا بلير، على التوالي. استخدام برنامج الإعداد لتجارب المشبك التصحيح التقليدية، التجارب المستندة إلى مصرف البحرين المركزي يمكن سهولة إجراء. باختصار، هو حلاً المنحل بالكهرباء في ماصة زجاجية في مهب إلى مرحلة المذيبات عضوية (هيكساديكان)، وهو الإبقاء على الضغط ماصة للحصول على حجم فقاعة مستقرة. الفقاعة عفويا تصطف دهن أحادي الطبقة (الدهون نقية أو الدهون المختلطة)، التي يتم توفيرها من الدهنية في الفقاعات. بعد ذلك، يتم إرساء (~ 50 ميكرومتر في القطر) مبطنة أحادي الطبقة فقاعتين في غيض الماصات الزجاجية لتشكيل بيلايير. إدخال تشكيل القناة الدهنية في الفقاعة يؤدي إلى دمج القنوات في بيلايير، مما يسمح لتسجيل قناة واحدة الحالية مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء يمكن مقارنته بتسجيلات المشبك التصحيح. يتم تشكيل كبس مع تكوين دهن غير متماثل سهولة. مصرف البحرين المركزي يتجدد مرارا وتكرارا بتطاير الفقاعات السابقة وتشكيل شراكات جديدة. اضطرابات كيميائية وفيزيائية مختلفة (مثلوغشاء نضح والتوتر bilayer) يمكن أن تفرض على كبس. هيرين، نقدم الإجراء الأساسي لإنشاء مصرف البحرين المركزي.

Introduction

للقنوات الأيونية، غشاء الخلية ليست مجرد مادة داعمة بل شريكا لتوليد تدفق أيون. وظيفيا، الغشاء عازل كهربائي أيون التي يتضمنها القنوات، وجميع أغشية الخلايا المهلة مع غشاء يستريح محتملة. تقليديا، كان تفرض غشاء تعسفية محتملة من دائرة خارجية التي تم قياس التيار الكهربائي عن طريق القنوات. وكشف هذا التقييم الكمي للجريان أيون في إمكانات غشاء مختلف الخصائص الجزيئية لهذه القنوات، مثل ما تخلل الأيوني الانتقائي والنابضة وظائف1،2. هو منهاج الدراسات الفنية لقنوات أيون الغشاء غشاء الخلية أو الغشاء بلير الدهن. تاريخيا، التسجيلات الحالية الكهربائية قناة واحدة أجريت أولاً في دهن بليرس3،4، وقد وضعت التقنيات ذات الصلة لأغشية الخلية، مثل أسلوب التصحيح-المشبك (الشكل 1أ )5،6. ومنذ ذلك الحين، تطورت هذه التقنيات اثنين بشكل منفصل لأغراض مختلفة (الشكل 1)7،8.

غشاء الدهون والأغشية بلير حاليا تركيز البحوث لأدوارها في دعم هيكل ووظيفة البروتينات القناة. ولذلك، توفر أساليب تختلف تركيبة المادة الدهنية في بليرس في ارتفاع الطلب. دهن bilayer تشكيل أساليب مثل الدهن مستو bilayer (الإرشاد)8،9،،من1011وقطرات الماء في النفط bilayer12الحبرية واجهة بيلايير (DIB)13، 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , تقنيات 19 (الشكل 1) هي الخيارات الشائعة، مما أتاح فرصة لدراسة وظيفة القناة تحت متفاوتة الدهن التراكيب20. على الرغم من بنك دبي الإسلامي أسهل بكثير من الناحية الفنية لإنتاج من الإرشاد التقليدية، حجم كبير من DIB أوجد عاملاً مثبطا للتصحيح--كلامبيرس لتطبيقه لدراسة التسجيلات الحالية قناة واحدة مع الحجم المعتاد الموصلية (< ملاحظة: 100).

للالتفاف على ضجيج الخلفية، يجب التقليل من منطقة بلير. وتذكر هذه المسألة تكراراً للتاريخ في تطوير التقنيات الكهربية للدهن بليرس (الشكل 1). في الأيام الأولى، شكلت bilayer صغيرة الحجم (1-30 ميكرومتر في القطر) في تلميح ماصة (تلميح--تراجع الأسلوب؛ الشكل 1 ج) 21 , 22 , 23، بدلاً من استخدام بلير بذاتها (~ 100 ميكرومتر في القطر) على حاجز مسعور في دائرة (الشكل 1ب). تلميح--تراجع الأسلوب يسمح للقياسات الكهربائية مع الكثير من الضوضاء الخلفية أقل24. أن تجاربنا مع25،26حزب البوابة المفتوحة وتلميح--تراجع22،،من2327، والتصحيح-المشبك28،،من2930، أساليب 31 أدت بنا إلى فكرة جديدة لتشكيل بليرس الدهن باستخدام مبادئ بلير الماء في النفط. أننا أشرنا إلى ذلك كفقاعة الاتصال بلير (مصرف البحرين المركزي) الأسلوب20،32. في هذا الأسلوب، بدلاً من أن تتدلى قطرات الماء في مرحلة نفط (الشكل 1د)، فقاعة مياه هو في مهب من ماصة زجاجية (مع تلميح قطرها حوالي 30 ميكرومتر) إلى مرحلة النفط (الشكل 1ه و 2)، حيث يتم الحفاظ على فقاعة بتطبيق ضغط ثابت. أشكال أحادي الطبقة تلقائياً على الواجهة المائية للنفط على سطح الفقاعة. ثم، يتم إرساء فقاعتين من خلال التلاعب باثنين الزجاج الماصات، وبلير هو تشكيل نقترب من مونولاييرس اثنين بعضها البعض، مما أسفر عن منطقة بلير توازن. يتم التحكم في حجم الفقاعة بالضغط داخل فقاعة (عقد الضغط)، وكذلك حجم بلير. كثيرا ما يستخدم متوسط قطرها 50 ميكرومتر. على الرغم من أن حجم الفقاعة الصغيرة (< 100 رر)، أنه متصل بحجم أكبر من الحل الماصة موجودة في نطاق ميكروليتير، التي تشكل المرحلة اﻻلكتروﻻيت السائبة.

هناك العديد من الفوائد لاستخدام أسلوب مصرف البحرين المركزي (الجدول 1). كأسلوب تشكيل bilayer دهني، يمكن إنتاج الأغشية المختلفة الدهن المؤلفات، والأغشية غير المتناظر هي المشكلة أكثر سهولة32 من تلك ب طريقة قابلة للطي التقليدية33. يمكن ميكانيكيا التلاعب في بيلايير، بخلاف حزب البوابة المفتوحة التقليدية التي يمكن أن تكون عازمة فقط مع ضغط الهيدروستاتي فرق34،35. عن طريق تغيير الضغط القابضة، الفقاعات أما توسيع أو تقليص, مما أدى إلى توتر الغشاء زيادة أو نقصان32. بلير انفصال ميكانيكيا في مونولاييرس، مشابهة لتقنية التجميد--كسر36،37 من الأغشية في الدراسات المورفولوجية، ولكن مع مصرف البحرين المركزي، يسمح بمناورة لتكرار فصل وإرفاق دورات32 . صغر حجم الحل المنحل بالكهرباء داخل الفقاعة يسمح الانصهار الفعال لتشكيل القناة الدهنية إلى بيلايير، واحتمال الحصول على تسجيلات قناة أعلى بكثير من تقنية الإرشاد التقليدية. حجم الفقاعة الصغيرة كما يسمح نضح السريع (داخل ~ 20 مللي ثانية) الحقن مرة أخرى ماصة يتم إدراجها في أي من الفقاعات. خلافا لأسلوب التصحيح-المشبك، مرة واحدة مكسورة، إعادة تشكيل غشاء مصرف البحرين المركزي فورا ومرارا وتكرارا، ويمكن استخدام الماصات عدة مرات في يوم. بدمج فوائد التصحيح-المشبك وأساليب الإرشاد، مصرف البحرين المركزي منبرا تنوعاً تختلف الظروف الفيزيائية للغشاء، مما يسمح لدراسات لم يسبق لها مثيل من التفاعلات غشاء القناة.

قبل عرض بروتوكول مفصل لعملية تشكيل مصرف البحرين المركزي، يقدم الخلفية الفيزيائية لتشكيل بلير الأولى والتي سوف تكون مفيدة للتصحيح--كلامبيرس لحل الصعوبات التجريبية المتصلة بتكوين غشاء التي تصادف.

مصرف البحرين المركزي تجارب نقل الدروس المستفادة من علوم الكيمياء السطحية38. مصرف البحرين المركزي يشبه فقاعة صابون مهب من القش في الهواء، حيث المثل، فجرت فقاعة الماء في مذيب عضوي. واحد ستلاحظ أن فقاعة الماء يكاد مبالغا فيها عندما الدهون غشاء غير مضمنة في فقاعة الماء أو المذيبات العضوية. نظراً لغياب الدهون أمفيباثيك، التوتر السطحي في واجهة مياه-نفط عالية، وسوف يكون الضغط داخل فقاعة تهب فقاعة عالية. هذا تحقيق معادلة لابلاس (ΔP = 2 γ/R، ΔP هو الضغط داخل الفقاعة، γ هو التوتر السطحي، حيث R هو نصف قطر الفقاعة). عندما يكون تركيز الدهون في مرحلة العضوية أو الحل اﻻلكتروﻻيت عالية، كثافة الدهون في أحادي الطبقة يزيد، وفق ما تمليه الايسوثرم الامتزاز جيبس (-dγ = Γوأنا dµأنا، حيث Γأنا هو الفائض في السطح للمجمع، و μأنا هو الكيميائية المحتملة للمكون أنا)39، مما أدى إلى انخفاض التوتر السطحي وسهولة تشكيل فقاعة. في مصرف البحرين المركزي، يمكن ملاحظة بلير من زاوية عرضية (الشكل 2)، ومن زاوية الاتصال بين بلير وأحادي الطبقة قابلة للقياس. هذه الزاوية يمثل توازناً بين surface tensions من أحادي الطبقة وبيلايير (معادلة الشباب: γbi = γمو cos(θ)، γثنائية هو التوتر بيلايير، γمو هو التوتر أحادي الطبقة، حيث θ هي الزاوية الاتصال). التغيرات في زاوية الاتصال تشير إلى تغييرات في التوتر بيلايير، نظراً لأن التوتر أحادي الطبقة يتم تقييم التغيرات في زاوية الاتصال كوظيفة من وظائف الغشاء المحتملة (معادلة يونغ-ليبمان: γمو = جم الخامس2 /4 (cos (θ0)-cos (θالخامس))، جم هو السعة غشاء، الخامس هو الغشاء المحتملة، حيث θ0 و θالخامس هي زوايا الاتصال 0 وأم الخامس، على التوالي)40،41 ،42. عند إغلاق كافية فقاعتين، أنها نهج بعضها البعض تلقائياً. وهذا سبب قوة فإن دير فالس، ويمكن أن نلاحظ بصريا هذه العملية الحيوية في تشكيل مصرف البحرين المركزي.

نظام مصرف البحرين المركزي يتكون من مراحل متميزة: إلا وهي مرحلة نفط السائبة، الماء فقاعات مغطاة بطبقة من أحادي الطبقة، وبلير اتصال (الشكل 3). وهذه تذكرنا بمراحل متعددة في حزب البوابة المفتوحة، مثل الحيد المحتوية على المذيب حولها في مرحلة بلير ومرحلة عضوية رقيقة تقع باثنين مونولاييرس43،44. في مصرف البحرين المركزي، المستمر مع النشرة بلير المرحلة أحادي الطبقة، وجزيئات الدهن سهولة منتشر بين أحادي الطبقة والنشرة. المرحلة أحادي الطبقة يغطي معظم سطح الفقاعة، التي تشكل المرحلة الرئيسية التي تعمل كمستودع للدهون. لأن ذيل مسعور الدهون في أحادي الطبقة يمتد إلى الخارج إلى مرحلة النفط السائبة، يفتح الداخلية بيلايير أو لب مسعور إلى مرحلة النفط الجزء الأكبر. وهكذا، مادة مسعور حقنه في مرحلة النفط القريبة من بيلايير غير قادرة على سهولة الوصول إلى المناطق الداخلية بيلايير. هذا هو أسلوب نضح غشاء أننا قد وضعت مؤخرا45، الذي يتم تغيير تكوين الدهن في بيلايير سرعة (في غضون ثانية) أثناء التسجيلات الحالية قناة واحدة. ووجدنا أن محتوى الكولسترول في بيلايير يمكن التحكم في شكل قابل للعكس بتبديل نضح الكولسترول وإيقاف45. في حالة ما إذا يختلف تركيز المواد ذات الصلة في أحادي الطبقة، وبلير، الانحدار تركيز المواد ذات الصلة فورا حل من خلال نشرها، الذي يعرف باسم تأثير Marangoni46، 47-من ناحية أخرى، هي المتأرجح عبر مونولاييرس بطء48،،من4950.

استخدام الأسلوب مصرف البحرين المركزي، يتشكل في بيلايير تحت الظروف الفيزيائية تنوعاً، مثل درجة حموضة اﻻلكتروﻻيت منخفضة تصل إلى 1 51وتركيز ملح (ك+، نا+، إلخ.) ما يصل إلى 3 متر وإمكانات غشاء مرتفعا كما ±400 mV ونظام درجة حرارة تصل إلى 60 درجة مئوية.

هناك عدة خيارات لتشكيل مصرف البحرين المركزي والتأسيس لجزيئات قناة فيه. لتشكيل المونولاير على الواجهة المائية للنفط، تضاف الدهون أما في مذيب عضوي (الأسلوب من الدهن؛ الشكل 4 أ، ج 4) أو في فقاعة الدهنية (الدهون في الأسلوب؛ الشكل 4 و ب، 4 د). جدير بالذكر أن المادة الدهنية في الأسلوب يسمح لتشكيل الأغشية غير المتناظر15،32. قناة جزيئات قابلة للذوبان في المحلول (مثلاً، تشكل قناة الببتيدات) مباشرة تضاف إلى52،فقاعة (الشكل 4أ، ب)53، بينما البروتينات قناة يتم تشكيلها في الدهنية، ثم تضاف إلى الفقاعة (الشكل 4ج، د). وهنا، تشكيل كبس بطريقة الدهن في أما ببتيد قناة (بوليثيوناميدي ب (pTB)؛ الشكل 4 A) أو يظهر بروتين (ككسا البوتاسيوم القناة، الشكل 4ج).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الدهنية

  1. تفريق فوسفوليبيدات (مثلاً، 10 ملغ مسحوق) في كلوروفورم بتركيز المطلوب (مثلاً، 10 ملغ/مل).
  2. تتبخر كلوروفورم.
    1. مكان الحل فسفوليبيد في قارورة مستديرة القاع ومجموعة فعلى مبخر دوراني (انظر الجدول للمواد) متصل باسطوانة غاز2 ن. قم بتدوير قارورة تحت تدفق2 ن في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر فيلم فسفوليبيد رقيقة (بعد ~ 30 دقيقة).
    2. ضع قارورة مفتوحة إلى مجفف متصل بمضخة فراغ. استخدام مضخة فراغ، نضح داخل مجففة لعدة ساعات لإزالة كلوروفورم دقة.
  3. إضافة وحدة تخزين مناسبة لحل المنحل بالكهرباء إلى قارورة وتعليق فسفوليبيد للحصول على 2 مغ/مل تعليق فسفوليبيد.
  4. Sonicate التعليق لعدة عشرات من ثوان باستخدام سونيكاتور حمام (انظر الجدول للمواد) للحصول على تعليق حويصلة متعدد الطبقات (ملف).
  5. لإعداد بروتيوليبوسوميس التي تحتوي على أيون قناة البروتينات، إضافة إلى حل بروتين (مع البروتينات سولوبيليزيد باستخدام المنظفات المناسبة؛ هو 2% حجم الحد الأقصى) إلى تعليق ملف و sonicate لعدة ثوان باستخدام سونيكاتور حمام.

2-إعداد كبيرة تحمل الزجاج الماصات

  1. تعيين زجاج الشعرية ساحبة ماصة واختلاق ميكروبيبيتيس مع طرف مدبب غرامة من خلال سحب خطوتين.
  2. تعيين ميكروبيبيتي على ميكروفورجي واتصل غيض ميكروبيبيتي إلى خيوط البلاتين في الجزء مدبب يبلغ قطرها من 30 إلى 50 ميكرومتر.
  3. الحرارة الشعيرة بإيجاز (5 ق) وإيقافها فورا.
    ملاحظة: هذا أشكال التلاعب نقطة وجود صدع في التدفئة، والذي بموجبه قطع غيض من ميكروبيبيتي، تاركاً تتحمل واسعة يبلغ قطرها من 30 إلى 50 ميكرومتر.

3-معالجة سطح الشريحة الزجاجية مع بئر ضحلة مقعرة (سيليكونيزيشن لإنهاء طارد المياه)

  1. تنظيف سطح الشريحة الزجاجية مع بئر ضحلة مع الماء المقطر والايثانول.
  2. تطبيق حجم مناسب (مثلاً، 100 ميليلتر) لكاشف سيليكونيزينج (طارد المياه) على الزجاج الشريحة ثقب.
  3. الكاشف تماما في الهواء الجاف.
  4. ضع الشريحة الزجاجية في مرحلة المجهر المقلوب.

4-تشكيل مصرف البحرين المركزي وإجراء القياس الكهربية

  1. إضافة 100 ميليلتر من هيكساديكان في البئر ضحلة من الزجاج الشريحة ثقب سيليكونيزيد.
    ملاحظة: لتحديد أسلوب من الدهن، فوسفوليبيدات متناثرة في هيكساديكان (20 ملغ/مل) مسبقاً.
  2. تملأ الحل المنحل بالكهرباء إلى نصف طول ميكروبيبيتي، استخدام حقنه السلين.
  3. تعيين ميكروبيبيتي إلى حامل ميكروبيبيتي مع منفذ ضغط، السماح لمسرى سلك Ag/AgCl نقع في الحل اﻻلكتروﻻيت ماصة.
  4. قم بتوصيل أحد أصحاب ميكروبيبيتي إلى مرحلة الرأس مكبر للصوت في تصحيح-المشبك والآخر على الأرض الكهربائية.
  5. الاتصال ميكروينجيكتور إلى منفذ الضغط حامل ميكروبيبيتي.
  6. تعيين ميكروبيبيتي إلى موقف مناسب فوق المرحلة المجهر المقلوب بالتلاعب في ميكرومانيبولاتور.
  7. ضبط الإزاحة الكهربائي المحتملة.
    1. 1 مكان ميليلتر لنفس الحل المنحل بالكهرباء المستخدمة لملء ميكروبيبيتي على سطح مستو حول بئر ضحلة الزجاج الشريحة هول، خلق قبة المنحل بالكهرباء.
    2. نقع غيض من كلا ميكروبيبيتيس في قبة المنحل بالكهرباء عن طريق التلاعب في ميكرومانيبولاتور.
    3. ضبط القطب المقابل إمكانات التصحيح-المشبك مكبر للصوت.
    4. تأكيد الإزاحة الصحيح في نهاية التجارب عن طريق كسر مصرف البحرين المركزي عن طريق تطبيق غشاء عالية المحتملة (توزيع الكهرباء؛ واستخدام انطلق في مكبر للصوت)، مما تسبب في الاثنين فقاعات إلى أن تنصهر فيها إلى واحد (فقاعة الانصهار).
    5. تصحيح تقاطع السائل المحتملة54 في الحالات التي تستخدم فيها حلول الكهرباء غير متماثلة، مثل أن يتم إضافة القيمة المحسوبة للغشاء التطبيقية المحتملة للغشاء الحقيقي المحتملة.
      ملاحظة: يحسب تقاطع السائل المحتملة باستخدام برنامج جبكالك55.
  8. رسم الحل الحويصلية من الحافة.
    ملاحظة: عندما يتم فحص القنوات للذوبان في الماء باستخدام الأسلوب من الدهن، المص الحل الحويصلية غير ضروري.
    1. ضع 1 ميليلتر من حل الحويصلية على سطح مستو حول بئر ضحلة ثقب الزجاج الشريحة (قبة المحتوية على الحويصلية).
    2. التلاعب في ميكرومانيبولاتور وإدراج غيض من ميكروبيبيتي في القبة التي تحتوي على الحويصلية.
    3. نضح الحل الذي يحتوي على الحويصلية بتخفيض الضغط داخل حامل ميكروبيبيتي ميكروينجيكتور باستخدام.
    4. كرر هذا الإجراء ماصة أخرى.
  9. التلاعب في ميكرومانيبولاتور وتراجع غيض من ميكروبيبيتي إلى هيكساديكان في بئر ضحلة.
  10. ضربة فقاعة الماء ببطء عن طريق زيادة الضغط حتى تصل الفقاعة إلى الحجم المطلوب (مثلاً، 50 ميكرومتر في القطر) والحفاظ على ضغط نفسه بعد ذلك.
  11. تجاهل الفقاعات بتمرير التلميح عن طريق واجهة الهواء النفط إذا كان من الصعب إبقاء حجم الفقاعات مستقرة.
  12. كرر الخطوات من 4.8 إلى 4.9 حتى تتشكل فقاعات مستقرة.
  13. التعامل مع الفقاعات للسماح بالاتصال بين (الشكل 5).
    ملاحظة: في بعض الأحيان، الفقاعات نهج بعضها البعض تلقائياً لتشكل مصرف البحرين المركزي. وفي حالات أخرى، الفقاعات متقاربة لكن عدم الاتصال ببعضها البعض. وفي هذه الحالة، دفع الفقاعات بعضها ميكانيكيا.
  14. ضبط الضغط للحفاظ على حجم الفقاعة، نظراً للحجم قد تغير تدريجيا حتى عند ضغط ثابت داخل فقاعة.
  15. تعيين الغشاء المحتملة إلى القيمة المناسبة باستخدام مكبر للصوت المشبك التصحيح والانتظار للقناة الحالية للخروج (الشكل 6).

5-قياس السعة بلير

  1. قياس السعة الكهربائية بلير (جش) عن طريق تطبيق منحدر محتملة.
    ملاحظة: عند معدل تغير الجهد في الأمر منحدر ms mV 10/10 (أو 1 V/s) تليها-10 mV/10 مللي ثانية، يقابل السعة للطفرة الحالية عند إجراء تغييرات في المنحدر لقراءة قيمة membrane'scapacitance (مثلاً ، السلطة الفلسطينية 100 100 ← pF).
  2. تقييم مجال bilayer اثنين فقاعات مكدسة واحدة على الأخرى، وتركيز المجهر على المستوى بيلايير لعرض حافة بيلايير (الشكل 6).
    ملاحظة: الشكل بيلايير الغالب دائرية، ويتم حساب المجال من دائرة نصف قطرها.
  3. حساب السعة الغشاء محددة (جس) بتقسيم السعة الكهربائية بمنطقة بيلايير (جس = جش&/A).
  4. حساب سمك بيلايير (سمك مسعور الأساسية) باستخدام دج = (اليورو اليوروr0)/جس (حيثr من اليورو واليورو0 تمثل سماحية لمنطقة مسعور بيلايير وسماحيه من فراغ، على التوالي).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نموذجي مصرف البحرين المركزي قد يبلغ قطرها 50 ميكرومتر (الشكل 5، 6) والسعة الغشاء محددة في هيكساديكان 0.65 µF/سم2. ويسيطر حجم الفقاعة تعسفاً من الضغط داخل فقاعة. عندما فقاعات صغيرة ضرورية لتسجيلات منخفضة الضوضاء، ينبغي أن تكون قطر تلميح صغيرة في المقابل. على سبيل المثال، ينبغي أن يكون قطر تلميح لحجم فقاعة 50 ميكرومتر في القطر، 30 ميكرومتر.

متى شكلت مصرف البحرين المركزي، أدرجت قناة الجزيئات في محلول مائي أو في الحويصلية عفوية في بلير في غضون فترة قليلة إلى عشرات الدقائق. وأكد إدراج القنوات زيادة تدريجية من السعة الحالية (الشكل 7) تحت الغشاء التطبيقية المحتملة. منطقة الغشاء أصغر (< 1,000 ميكرومتر2) بالنسبة إلى أن الإرشاد التقليدية وبنك دبي الإسلامي في تحسين نظم إلى حد كبير نسبة الإشارة إلى الضوضاء الكهربائية.

التسجيلات الحالية يمكن أن تستمر حتى تعطلت الغشاء ودمجها فقاعتين. تم تفجير فقاعات جديدة ومصرف البحرين المركزي شكلت فورا ومرارا وتكرارا. يمكن استخدامها الماصة مرارا وتكرارا خلال يوم واحد.

واجب دورة من إرفاق وفصل. يمكن تفككت bilayer تشكيلها بواسطة الأسلوب مصرف البحرين المركزي في مونولاييرس اثنين. إرفاق فصل من مصرف البحرين المركزي يمكن أن تتكرر بالتلاعب بفقاعتين (دورة العمل من ديتاتشاتاتش). تم رصد هذه العملية بظهور القناة الحالية من pTB، قناة ببتيد من الأسفنج البحري، كما كان يسهل إدراجه في بلير الدهن بتشكيل52،الفموي الأحادي التكافؤ مسام الموجبة انتقائية56. ظهرت قناة pTB الحالية فورا بعد إرفاق مونولاييرس اثنين، والحالي أصبح أكبر كمجال الاتصال زيادة (الشكل 8). السعة الحالية كانت متزامنة مع فصل-إرفاق التلاعب مصرف البحرين المركزي.

قياسات قناة واحدة للقناة ككسا. قناة البوتاسيوم ككسا هو الأس الهيدروجيني الحساسة، يجري تنشيطه بواسطة pH داخل الخلايا الحمضية57. وهكذا، تم تعيين الحل اﻻلكتروﻻيت إلى غير متماثل58،،من5960. في الخطوة 4، 2 من تشكيل مصرف البحرين المركزي، تم حل ماصة من الجانب الأيسر في الرقم الهيدروجيني 4، بينما تم تعيين من الجانب الأيمن في درجة الحموضة 7.525. في خطوة 4.7.1، بروتيوليبوسومي تعليق، بدلاً من وقف الحويصلية، كان توضع على الزجاج الشريحة للتطلع إلى ماصة الأيسر. تبعاً لذلك، كان المنحى قناة ككسا في الغشاء مع المجال هيولى تواجه فقاعة الأيسر. الدهنية بنسبة وزن البروتين: دهن 1:2000 مناسبة للتسجيل الحالي في قناة واحدة، والذين يعانون 01:10، نسبة للتسجيل الحالي العيانية.

غشاء غير متماثل. يمكن أن تشكل بلير دهن غير متماثلة استخدام تعليق الحويصلية مختلفة لكل15،فقاعة (المادة الدهنية في)32. التوجه لقناة ككسا في الغشاء ينظم وضع الأس الهيدروجيني حل غير المتناظر (الأس الهيدروجيني 4في/pH 7الخروج)، مما يؤدي إلى كونها الجانب هيولى تجاه الجانب الأيسر. تبعاً لذلك، تم تعيين الجانب الأيسر كما "في"، بينما تم تعيين الجانب الأيمن ك "في الخارج". النظر في اعتماد المادة الدهنية على النابضة القناة ككسا، استخدمت أربعة أنواع من مصرف البحرين المركزي (بما في ذلك مصرف البحرين المركزي غير المتناظر)؛ هي PGفي/PGخارجPGفي/PCخارجوالكمبيوترفي/PGخارج، والكمبيوترفي/PCخارج (PG: فوسفاتيديلجليسيرول) (الشكل 9). عرضت قناة ككسا الاحتمال مفتوحاً (> 90%) فقط في PGفي/PGبها والتعبئةفي/PCخارج الأغشية. قناة ككسا يتطلب وجود فوسفوليبيدات أنيونى في النشرة الداخلية للغشاء احتمال فتح26.

Figure 1
الشكل 1 : أساليب بلير والتصحيح-المشبك الدهن. وقد وضعت أساليب مختلفة لتشكيل بلير الدهن. (أ) تصحيح المشبك الأسلوب. (ب) أسلوب bilayer الدهن مستو التقليدية، والذي يوفر بيلايير بذاتها، ومعظمها العمودي، في حفرة صغيرة. (ج) تراجع نصيحة الأسلوب. يتم وضع أحادي الطبقة في واجهة الهواء والماء في تلميح القطب الزجاج. وقد وضعت مختلف التعديلات. (د) معالجة تجميعية لأسلوب واجهة بلير. (ه) الاتصال بأسلوب bilayer فقاعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 2
الشكل 2 : الاتصال بتشكيل بلير فقاعة. كما هو في مهب فقاعة في مرحلة نفط، نقل جزيئات الدهن عفويا على الواجهة المائية للنفط. أنواع مختلفة من الدهون كما الدهنية التي يتضمنها كل فقاعة (المادة الدهنية في)، ويتم تشكيل مونولاييرس حصرا بالدهون ذات الصلة. مونولاييرس اثنين لرسو السفن يولد غشاء بلير غير متماثل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 3
الشكل 3 : مراحل متميزة في bilayer فقاعة الاتصال، وديناميات الدهون فيه. تشكل الدهون بطانة الفقاعة مرحلة حيث أنهم ينتمون إلى أحادي الطبقة أو من بلير. التقلب المفاجىء الدهون عبر بيلايير نادرة، والغشاء غير المتناظر يتم الاحتفاظ لفترة طويلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 4
الشكل 4 : تقديم الدهون مع الأسلوب من الدهن أو الدهن في. تتم إضافة الدهون أما في مذيب عضوي (الدهن التدريجي؛ ألف وجيم) أو في محلول مائي الدهنية (الدهون في؛ ب ود). في الأسلوب في الدهن، تتشكل غشاء غير متماثل. المواد المكونة للقناة التي قابلة للذوبان في المحلول (الأزرق)، مثل الببتيدات، إضافة إلى واحدة من الفقاعات وإدراجها تلقائياً في بلير. في أسلوب المادة الدهنية في إدراج جزء من القنوات الدهنية، التي تنصهر فيها ثم إلى بيلايير. قناة البروتينات (أحمر) يتم تشكيلها في الدهنية في أي من الطريقتين من الدهن أو الدهن في، ثم أضيف إلى واحدة من الفقاعات وتنصهر تلقائياً إلى بلير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 5
الشكل 5 : صورة مجهرية لجهة الاتصال وتشكيل فقاعة بلير- ولوحظ بلير من اتجاه عرضية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 6
الرقم 6 : المراقبة لبلير لقياس منطقة بلير- فقاعتين مكدسة واحدة أخرى من خلال التلاعب ماصة، والمجهر وتركز على مستوى بلير الاتصال الفقاعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 7
الشكل 7 : الإدراج التدرجي لقناة ككسا في الغشاء بلير فقاعة الاتصال- واستخدمت المسخ E71A على قناة ككسا لإظهار الكشف الفوري عن القنوات المدرجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 8
الشكل 8 : إرفاق فصل مونولاييرس والردود من القنوات- قناة ببتيد، بوليثيوناميدي ب، أضيفت إلى إحدى الفقاعات، الذي ثم أدمج عفويا في الغشاء. عند فصل، قنوات في الغشاء انسحب لكن تم الإبقاء على النشرة غشاء الجانب إضافة قناة. عند الإلحاق، تم إدراج القنوات في الغشاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

Figure 9
الرقم 9 : تشكيل نشاط الغشاء وقناة غير المتناظر اعتماداً على تكوين النشرة. قناة ككسا ينظم الدهون الحمضية، مثل التعبئة، في النشرة الداخلية للغشاء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم- 

الإرشاد التقليدية تصحيح الحويصلية بنك دبي الإسلامي مصرف البحرين المركزي
معدل النجاح1 عالية منخفضة عالية جداً عالية جداً
ريفورمابيليتي الفورية2 نعم لا متوسطة نعم
غشاء غير متماثل نعم لا نعم نعم
تبادل الحلول بطيئة سريع جداً بطيئة سريع
نسبة S/N3 منخفضة عالية منخفضة عالية
تشوه الغشاء لا لا لا نعم4
معالجة ميكانيكية لا نعم5 نعم نعم
نضح الغشاء لا لا نعم نعم
التراكيب الدهن متنوعة محدودة6 متنوعة متنوعة
1 معدل نجاح تشكيل بلير الدهن مستقرة كل محاكمة.
2 تكوين غشاء جديد بسرعة بعد كسر من الغشاء. أيضا، يتم تشكيل غشاء مرارا وتكرارا.
3 نسبة الإشارة إلى الضوضاء (S/N) يمثل المرحلة الابتدائية الضوضاء الخلفية الكهربائية المتولدة من السعة الغشاء.
4 يمكن أن تشكل غشاء مقعر أو محدب بتطبيق مختلف الضغوط الداخلية بين فقاعتين.
5 سوى زيادة التوتر الغشاء.
6 فوسفوليبيدات التي يمكن أن تشكل حويصلات أونيلاميلار العملاقة قابلة للتطبيق، ولكن قد لا تتحقق جيجا-الختم.

الجدول 1: الخصائص المختلفة الدهن بيلايير الأغشية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة الدهن بلير تشكيل مصرف البحرين المركزي يستند على مبدأ معالجة المياه في النفط تجميعية مبطنة ب أحادي الطبقة20. من الناحية التقنية، إجراءات تشكيل كبس سهلة، خاصة بالنسبة للتصحيح-المشبك الباحثين، الذين يجيدون التلاعب ميكروبيبيتيس الزجاج. سهولة يستخدم الإعداد الكهربية المشبك التصحيح في مصرف البحرين المركزي عندما تتوفر المتلاعبين ماصة اثنين مع ميكروينجيكتورس. من ناحية أخرى، نظراً لمصرف البحرين المركزي خلفا للإرشاد التقليدية، لكان قدر كبير من المعارف الفيزيائية الكيميائية المتراكمة8، هذا من الخلفية، فضلا عن المعرفة بالكيمياء السطحية38 مفيد للتشغيل و التلاعب كبس. مصرف البحرين المركزي يقدم منصة متعددة لدراسة إينتيربلايس غشاء القناة مع قدرته على تعديل التركيب الكيميائي والحالة البدنية61. في مصرف البحرين المركزي، يمكن نشر الدهون بطانة الفقاعة بحرية عبر الحدود المرحلة أحادي الطبقة، والنشرة من بلير، ولدينا التقنيات المتقدمة مثل بلير إرفاق-فصل و أساليب نضح غشاء45. قدمنا كبس في المختبر قناة تخليق البروتين، حيث أنجز توليف القناة في الفقاعة، والبروتينات القناة المركبة حديثا تعرضوا لنقل العفوية لبلير إطار تطبيق غشاء المحتملة حيث كانت تتبع وظائف القناة الوليدة من قناة ككسا من وقت بدء النسخ/ترجمة "الحمض النووي ككسا"62.

ومن بين الخطوات للبروتوكول، الحفاظ على حجم الفقاعة أمر بالغ الأهمية. الفقاعات تضخم ببطء أو تتقلص تلقائياً لأنه بطيء نقل الدهون إلى الواجهة والتوتر أحادي الطبقة معرضة للتغيير. على وجه الخصوص، الفقاعة الأولى تضخم فقط بعد الشفط الحل الحويصلية (الخطوات 4.8.3 و 4.10) من الصعب الاحتفاظ لأنه هو خفض التوتر أحادي الطبقة الدهنية تراكمت في تلميح الماصة. نبذ فقاعات الأولية واللاحقة تشكيل الفقاعات تقديم أرقام مستقرة. التعقب المرئي لحجم الفقاعة وضبط الضغط ضرورية.

توجد قيود التجريبية إلى الأسلوب مصرف البحرين المركزي. على الرغم من أن مصرف البحرين المركزي صمم للقياسات الكهربية، قد لا تكون المقاومة الكهربائية ل bilayer لبعض التراكيب الدهنية عالية كافية (مثلاً، 100 GΩ) لتسجيلات قناة واحدة. على سبيل المثال، فوسفاتيديلتشوليني ديوليويل يستخدم بشكل متكرر الدهنية، ولكن يشكل كبس راشح كهربائياً في63من 25 درجة مئوية. ولا حتى تشكيل كبس مع الأنواع الدهون الذي درجة حرارة التحول المرحلة أعلاه تسجيل درجة الحرارة. في الواقع، يصعب تشكيل مصرف البحرين المركزي مع فوسفاتيديلتشوليني ديبالميتويل في درجة حرارة الغرفة، ولكن رفع درجة الحرارة فوق تيم الالتفاف حول مشكلة64. في هذه التجارب، كان يسيطر درجة الحرارة باستخدام لوحة حرارة شفافة (انظر الجدول للمواد) تحت الشريحة الزجاجية62. درجة حرارة التحول مرحلة phosphatidylcholine ديفيتانويل المادة الدهنية المستخدمة بشكل متكرر دون 0 درجة مئوية 65، وكبس هي سهولة تشكيل32،،من4551 في طائفة واسعة من درجات حرارة.

من أي من الطريقتين الدهن أو الدهن، حيث معدل نقل أبطأ نسبيا في الدهون-الخروج من المحتوى الدهني في الأسلوب63التي تقدمها فوسفوليبيدات الواجهة المائية للنفط. وبالإضافة إلى ذلك، لأسباب غير معروفة، المقاومة الكهربائية للغشاء بلير أصغر نسبيا مع الأسلوب من الدهن من المادة الدهنية في الأسلوب.

في البروتوكول (الخطوة 4، 8)، يتم تحميل حل الدهنية والدهنية التي أعادت تشكيل القناة (1 ميليلتر) من طرف الماصة (الخطوات 4-9 و 4.10)، وبقية الماصة تحتوي على الحل اﻻلكتروﻻيت شغلها سابقا. وهذا لمجرد المحافظة على المواد، مثل الدهون وجزيئات القناة. ونتيجة لذلك، الدهنية منتشر تدريجيا نحو الحل ماصة العلوي، وبعد فترة من الوقت، يصبح تركيز الدهن في التلميح الماصة غير كافية بشكل دهن مونولاييرس. وفي هذه الحالة، يجب أن يستنشق الحل الحويصلية جديدة من الطرف (الخطوة 4، 8). يمكن التحايل عليها هذا التغير الزماني التركيز عندما يتم تعبئة ماصة كاملة مع الحل الذي يحتوي على الدهون وجزيئات القناة، بينما الدهنية يستقر تدريجيا في الفقاعات. وفي هذه الحالة، يتم تجديد الفقاعات.

اليكتروفيسيولوجيكالي، أكبر من المشبك التصحيح، وهكذا الغلة سعة غشاء أكبر حجم مصرف البحرين المركزي. ولكن المقاومة سلسلة (المقاومة الكهربائية في سلسلة من مقاومة الغشاء) هو الكثير (~ 100 kΩ) أو أقل لتصحيح المشبك (ماصة المقاومة > 1 MΩ)، الذي يعجل سرعة المشبك الجهد ويخفف ضجيج الخلفية وسلسلة أخطاء المقاومة في إمكانات غشاء فرضت الجهد66،67،68. ضجيج الخلفية دالة السعة الغشاء والمقاومة سلسلة، حيث يكمل مقاومة سلسلة منخفضة سعة غشاء عالية، أسفر عن خلفية منخفضة الضوضاء9.

كقاعدة للدهن بلير تجارب، ينبغي عدم استخدام المنظفات لغسل الأواني الزجاجية. حتى تتبع كمية المنظفات إزعاجا سلامة بلير. ينبغي استخدام المذيبات العضوية مثل الميثانول/كلوروفورم والايثانول لأغراض التنظيف هذه بدلاً من ذلك.

عموما، مصرف البحرين المركزي يدمج فوائد المشبك التصحيح (مثلاً، التلاعب الميكانيكية للغشاء) والإرشاد (مثلاً، القدرة على تعديل تكوين دهن الغشاء). أنواع مختلفة من المواد المكونة للقناة والقناة البروتينات قد درس52،53،،من6970. من تطوير هذا الأسلوب المناسب نظراً لعدد متزايد من الباحثين تركز على التفاعل بين غشاء القناة، ومصرف البحرين المركزي يوفر منبرا تنوعاً لتجارب مختلفة. ويتوقع كذلك التطورات التجريبية في أسلوب مصرف البحرين المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن يشكر ياماتاكي ماريكو وتاكاشيما ماساكو للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل في جزء من كاكينهي أرقام المنح ح 16 00759 و 17 ح 04017 (هكذا).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

علم الأعصاب، العدد 143، بلير الدهن، المشبك التصحيح، قطرات الماء في النفط، أحادي الطبقة، قناة أيون، الكهربية، والكيمياء السطحية
دهن بلير التجارب مع بليرس فقاعة الاتصال للتصحيح--كلامبيرس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter