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Neuroscience

用于补丁夹紧器的接触气泡层的脂质双层实验

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

在这里, 我们提出了一个协议, 形成脂质双层使用接触气泡双层法。水泡被吹入有机溶剂, 藉以单层被形成在水油接口。两个移液器纵 , 以停靠气泡 , 形成一个双层。

Abstract

脂质双层为离子通道的功能研究提供了一个独特的实验平台, 可以检查不同膜脂组成下的通道膜相互作用。其中, 液滴界面双层得到了普及;然而, 大的膜尺寸阻碍了低电气背景噪声的记录。我们建立了一种接触气泡双层 (cbb) 方法, 该方法结合了平面脂质双层和膜片钳方法的优点, 如分别改变脂质成分和操纵双层力学的能力。利用该设置进行常规的膜片钳实验, 可以很容易地进行基于 cbb 的实验。简而言之, 玻璃移液器中的电解质溶液被吹入有机溶剂相 (十六烷), 并保持移液器压力以获得稳定的气泡尺寸。气泡是自发内衬的脂质单层 (纯脂质或混合脂质), 这是由泡泡中的脂质体提供。接下来, 玻璃移液器顶端的两个单衬气泡 (直径约 50μm) 被对接, 以形成双层。将通道重组脂质体引入气泡, 可将通道插入双层机中, 从而允许单通道电流记录, 其信噪比与膜片钳记录的信噪比相当。脂质成分不对称的 cbb 很容易形成。cbb 通过吹灭之前的泡沫并形成新的泡沫, 反复更新。各种化学和物理扰动 (如膜灌注和双层张力) 可对 cbb 施加, 本文介绍了 cbb 形成的基本步骤。

Introduction

对于离子通道, 细胞膜不仅仅是一种支撑材料, 而是产生离子通量的伙伴。在功能上, 膜是一种电绝缘体, 其中嵌入离子通道, 所有细胞膜都具有静止膜的潜力。通常情况下, 从外部电路施加任意膜电位, 通过外部电路测量通过通道的电流。这种对不同膜电位离子通量的定量评价揭示了这些通道的分子性质, 如离子选择性渗透和门控功能1,2。用于离子通道功能研究的膜平台是细胞膜或脂质双层膜。从历史上看, 单通道电流记录首先是在脂质双层3、4中进行的, 并为细胞膜开发了相关技术, 如膜片钳法 (图1 a))5,6。此后, 这两种技术分别为不同的目的而发展 (图 1)7、8.

膜脂质和双层膜因其在支持通道蛋白结构和功能方面的作用而成为目前研究的热点。因此, 对改变双层脂质成分的方法的现成性要求很高。脂质双层形成方法, 如平面脂质双层 (plb)8,9, 10, 11, 水油液滴双层 12, 液滴界面双层 (dib)13,14,15,16,17,18,19种技术 (图 1) 是常见的选择, 为检查不同脂质成分下的通道功能提供了机会20。虽然 dib 在技术上比传统的 plb 更容易生产, 但 dib 的大尺寸已经阻碍了补丁夹持器将其应用于研究具有通常大小电导 (& lt;100 ps) 的单通道电流记录。

为了避开背景噪音, 必须将双层区域降至最低。这个问题让人想起了在发展脂质双层电生理技术的过程中的重复历史 (图 1)。在早期, 在移液器的尖端形成了一个小尺寸的双层 (直径 1-30μm) (倾角法;图 1c)21,22,23, 而不是在室内疏水间隔上使用独立的双层 (直径约 100μm) (图 1b)。该方法允许在背景噪声更低的情况下进行电气测量24。我们在公共小巴25、26、尖浸 22、23、27和膜片夹具 28、29、30方面的经验,31 种方法使我们提出了一种利用油中水双层的原理形成脂质双层的新思想。我们把这个称为接触气泡双层 (cbb) 方法20,32。在这种方法中, 水泡不是挂在油相中的水滴 (图 1d), 而是从玻璃移液器 (尖端直径约为 30μm) 吹到油相 (图 1e 和 2) 中, 其中气泡是通过施加稳定的压力来维持的。在气泡表面的水油界面上自发形成单层。然后, 通过两个玻璃移液器的操作对接两个气泡, 当两个单层相互接近时, 形成了双层, 产生了一个平衡的双层面积。气泡的大小由气泡内压力 (保持压力) 控制, 同样由双层尺寸控制。平均直径为50微米, 经常使用。虽然气泡的体积很小 (和 lt;100 的 pl), 但它与在微升范围内的移液器溶液的较大体积相连, 构成了体积电解质相。

使用 cbb 方法有许多好处 (表 1)。作为一种脂质双层形成技术, 可以产生各种脂质成分的膜, 而非对称膜比传统的折叠方法33更容易形成 32种.双层可以机械操作, 不像传统的 plb, 只能弯曲与静水压差34,35。通过改变保持压力, 气泡要么膨胀, 要么缩小, 从而增加或降低膜张力32。双层是机械可拆卸成单层的, 类似于形态研究中的冻裂技术 36,37膜, 但有了 cbb, 一个机动允许重复分离和附加周期32.小体积的电解质溶液在气泡内允许有效地融合通道重组脂质体到双层, 并获得通道记录的概率远远高于与传统的 plb 技术。小气泡体积还允许快速灌注 (在 ~ 20 毫秒内), 一旦另一个注入移液器插入到任何一个气泡。与膜片钳方法不同的是, cbb 膜一旦破裂, 立即反复重组, 移液器每天可以使用几次。通过整合膜片钳和 plb 方法的优势, cbb 提供了一个多功能的平台来改变膜的物理化学条件, 从而能够对通道膜相互作用进行前所未有的研究。

在介绍 cbb 形成过程的详细协议之前, 首先介绍了双层形成的物理化学背景, 这将有助于滤光片解决与膜形成有关的实验困难。遇到的情况。

cbb 实验提供了表面化学科学的课程38。cbb 类似于从秸秆吹到空气中的肥皂泡, 同样, 水泡也被吹到有机溶剂中。人们会注意到, 当膜脂质不包括在水泡或有机溶剂中时, 水泡几乎不会膨胀。在没有两栖脂质的情况下, 水油界面的表面张力较高, 吹泡泡的气泡内压力较高。这是拉普拉斯方程的实现 (p = 2γ/r, 其中 p 是气泡内压力, γ是表面张力, r 是气泡半径)。当有机相或电解质溶液中的脂类浓度较高时, 单层中的脂质密度会增加, 这取决于吉布斯吸附等温线 (-γ = i dμ i, 其中i是表面多余的化合物 i, 和μ i是组分 i)39的化学势, 导致表面张力降低和气泡形成的容易性。在 cbb 中, 可以从切向角度观察到双层, 单层和双层之间的接触角是可测量的。这个角度代表平衡在单层和双层的表面紧张之间 (年轻等式: γ比 = γ mocos ( ), γbi 是双层张力, γ mo 是单层紧张, 并且是接触角)。接触角的变化表明双层张力的变化, 因为单层张力是根据接触角的变化作为膜电位的函数来评估的 (Young-Lippmann 方程: γ mo = cm v 2) /4 (cos (0)-cos (v)), 其中 cm是膜电容, v 是膜电位, 0 和 v分别是0和 v mv 的接触角)40,41 ,42。当两个气泡足够接近时, 它们会自发地相互接近。这是由于范德瓦尔斯的力量, 我们可以直观地观察到 cbb 形成的这一动态过程。

cbb 系统由不同的阶段组成: 即散装油相、涂有单层的水泡和接触式双层 (图 3)。这些让人想起在公共小巴中观察到的多个相, 例如在双层相周围的含溶剂圆环和由两个单层 43, 44 夹在一起的薄有机相.在 cbb 中, 单层相是连续的, 双层传单, 脂质分子很容易在单层和传单之间扩散。单层相覆盖了泡沫表面的大部分, 构成了作为脂质储层的主要相。由于单层中脂质的疏水尾向外延伸到散装油相, 双层内部或疏水岩心向散装油相打开。因此, 注入靠近双层的油相中的疏水物质能够很容易地进入双层的内部。这是我们最近开发的膜灌注技术 45, 通过这种技术, 在单通道电流记录过程中, 双层层中的脂质成分发生了快速变化 (在一秒钟内)。我们发现, 通过打开和关闭45的胆固醇灌注, 可以可逆地控制双层中的胆固醇含量.如果有关物质在单层和双层中的浓度不同, 相关物质的浓度梯度通过扩散立即溶解, 这就是所谓的马兰戈尼效应46,47. 另一方面, 单层的人字拖速度缓慢48、49、50.

采用 cbb 方法, 在多种物理化学条件下形成双层, 如电解质 ph 值低至 1 51, 盐 (k+, na+等) 浓度高达 3 m, 膜电位高达±400 mv, 以及一个系统。温度高达60°c。

有几个选项的形成 cbb 和通道分子在其中的加入。对于水油界面单层的形成, 在有机溶剂中加入脂质 (脂质法;图 4a, 4c)或在泡沫中作为脂质体 (脂质入法;图 4b, 4d)。值得注意的是, 脂质法允许形成15,32的非对称膜。溶于水溶液的通道分子 (例如, 通道形成肽) 直接添加到气泡中 (图 4a、b)52、53, 而通道蛋白被重组为然后将其添加到气泡中 (图 4c, d)。在此, 用脂联法形成 cbb, 以获得通道肽 (多聚己酰胺 b (ptb);图 4a) 或蛋白质 (kca 钾通道,图 4c)。

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Protocol

1. 制备脂质体

  1. 以所需浓度 (如10 mg/ml) 在氯仿中分散磷脂 (例如粉末中的10毫克)。
  2. 蒸发氯仿。
    1. 将磷脂溶液放入圆底烧瓶中, 并将其安装在连接到n2气瓶的旋转蒸发器 (见材料表) 上。在室温下在 n2 流动下旋转烧瓶, 直到出现薄薄的磷脂膜 (~ 30分钟后)。
    2. 将打开的烧瓶放入连接到真空泵的干燥器中。使用真空泵, 吸气干燥器内部几个小时, 以彻底取出氯仿。
  3. 在烧瓶中加入适当体积的电解质溶液, 并悬浮磷脂以获得 2 mgml 磷脂悬浮液。
  4. 使用浴缸超声器 (见材料表) 将悬浮液涂成几十秒, 以获得多层囊泡 (mlv) 悬架。
  5. 对于含有离子通道蛋白的蛋白质脂质体的制备, 在 mlv 悬浮液中加入蛋白质溶液 (蛋白质使用适当的洗涤剂溶解; 2% 的体积是最大的), 并使用浴超声器进行几秒钟的超声分。

2. 准备大孔玻璃移液器

  1. 将玻璃毛细管设置在移液器拉拔器上, 并通过两步拉制用细锥形尖端制造微移液器。
  2. 将微移液器放在微炉上, 并将微移液器的尖端接触到直径为30至50μm 的锥形部分的白金长丝上。
  3. 将灯丝短暂加热 (5秒), 然后立即将其关闭。
    注: 这种操作在加热点形成裂纹, 从而切断微型移液器的尖端, 留下直径为30至50μm 的宽孔。

3. 用浅层凹井处理玻璃滑块表面 (防水表面的硅化处理)

  1. 用蒸馏水和乙醇在浅井清洁玻璃滑梯表面。
  2. 在孔滑玻璃上涂抹适当体积 (例如 100μl) 的硅化试剂 (防水剂)。
  3. 将试剂完全擦干空气中。
  4. 将玻璃滑块放在倒置显微镜的舞台上。

4. 形成 cbb 并进行电生理测量

  1. 在硅化孔滑动玻璃的浅井中加入100μl 的十六烷。
    注: 对于脂质方法, 磷脂事先分散在十六烷 (20 mg/ml) 中。
  2. 使用结核菌素注射器, 将电解质溶液的长度增加到微型移液器长度的一半。
  3. 将微型移液器设置在带有压力端口的微移液器支架上, 使 ag/agcl 电线电极浸入移液器电解液中。
  4. 将其中一个微移液器支架连接到膜片钳放大器的头部, 另一个连接到电气接地。
  5. 将微喷射器连接到微型移液器支架的压力端口。
  6. 通过操作微机械手, 将微型移液器设置到倒置显微镜舞台上方的适当位置。
  7. 调整电极偏移电位。
    1. 将用于填充微型移液器的相同电解质溶液的1μl 放在孔滑玻璃的浅井周围的平面上, 形成一个电解质圆顶。
    2. 通过操作微机械手将两个微移液器的尖端浸泡到电解质圆顶中。
    3. 调整膜片钳放大器的电极偏移电位。
    4. 通过应用高膜电位 (电击穿; 在放大器上使用 zap) 来在实验结束时确认正确的偏移量, 从而使两个气泡融合成一个 (气泡融合)。
    5. 在使用非对称电解质溶液的情况下, 纠正液体结电位54 , 以便将计算值添加到实际膜电位的应用膜电位中。
      注: 液体结电位是使用 jpcalc55程序计算的。
  8. 从尖端绘制脂质体溶液。
    注: 当使用脂质方法检测水溶性通道时, 不需要吸入脂质体溶液。
    1. 将脂质体溶液在孔滑动玻璃 (含脂质体圆顶) 的浅井周围的平面上放置1μl。
    2. 操作微机械手, 并将微型移液器的尖端插入含有脂质体的圆顶。
    3. 使用微喷射器降低微移液器支架内的压力, 从而吸引含有脂质体的溶液。
    4. 对其他移液器重复此过程。
  9. 操作微机械手, 并将微移液器的尖端浸入浅井中的十六烷。
  10. 通过增加压力慢慢地吹出水泡, 直到气泡达到所需的大小 (例如直径50微米), 并在此后保持相同的压力。
  11. 如果难以保持气泡大小的稳定, 则通过油空气界面传递气泡, 从而丢弃气泡。
  12. 重复步骤4.8 至 4.9, 直到形成稳定的气泡。
  13. 操纵气泡以允许它们之间的接触 (图 5)。
    注: 有时, 气泡会自发地相互接近, 形成 cbb。在其他情况下, 气泡是接近的, 但不相互联系。在这种情况下, 机械地互相推泡。
  14. 微调压力, 以保持气泡大小, 因为即使在恒定的气泡内压力下, 气泡大小也可能逐渐改变。
  15. 使用膜片钳放大器将膜电位设置为适当的值, 并等待通道电流出现 (图 6)。

5. 测量双层电容

  1. 通过施加坡道电位测量双层电容 (cel)。
    注: 当坡道命令中的电压变化速率为 10 mv/10 毫秒 (或 1 v/), 然后是-10 mv/10 毫秒时, 坡度变化时的电流跃迁振幅对应于读取膜的电容值 (例如:, 100 pa→100 pA)。
  2. 评估两个气泡的双层面积, 将一个气泡堆叠在另一个气泡上, 并将显微镜聚焦在双层水平上, 以查看双层的边缘 (图 6)。
    注: 双层形状大部分为圆形, 面积是根据半径计算的。
  3. 通过将电容除以双层面积 (c sp = cel/a)来计算特定的膜电容 (csp )。
  4. 用 dc计算双层厚度 (疏水岩心厚度)(其中 r 和0表示双层疏水区的介电常数和介电常数真空)。

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Representative Results

典型的 cbb 直径为 50μm (图 5, 6), 十六进制膜电容为 0.65μfcm2。气泡尺寸受气泡内压力任意控制。当低噪声记录需要小气泡时, 尖端直径应相应较小。例如, 对于直径为50微米的气泡尺寸, 尖端直径应为30μm。

一旦 cbb 形成, 在水溶液或脂质体中的通道分子在几到几分钟的时间内自发地插入到双层体内。在应用膜电位下, 电流振幅的逐步增加 (图 7) 证实了通道的插入。与传统的 plb 和 dib 系统相比, 较小的膜面积 (& lt;1,000 μm 2) 大大提高了电气信噪比。

目前的录音可以继续, 直到膜被破坏, 两个气泡合并。新的泡沫被吹散, cbb 立即和反复形成。移液器可以在一天内反复使用。

附加和分离的占空比.由 cbb 方法形成的双层可以分解成两个单层。cbb 的分离可以通过操纵两个气泡 (分离连接的占空比) 来重复。这一过程是由 ptb 的通道电流的外观监测, 一个肽通道从海洋海绵, 因为它很容易插入到脂质双层, 形成一个单价阳离子选择性孔 52,56。在连接两个单层后, ptb 通道电流立即出现, 随着接触面积的增加, 电流变得更大 (图 8)。电流的振幅与 cbb 的分离附加操作同步。

kca 通道的单通道测量。kcsa 钾通道对 ph 敏感, 由酸性细胞内 ph 57天被激活。因此, 电解质溶液被设置为不对称58,59,60。在 cbb 形成的步骤4.2 中, 左侧的移液器溶液设置为 ph 值 4, 而右侧的移液器溶液设置为 ph 值 7.525.在4.7.1 步骤中, 将蛋白质脂质体悬浮液而不是脂质体悬浮液放置在滑玻璃上, 用于抽吸到左移液器中。因此, kca 通道被定向在膜, 其细胞质域面对左气泡。蛋白质: 脂重比为1:2000 的脂质体适用于单通道电流记录, 而 1:10 比例的脂质体适用于宏观电流记录。

膜不对称.对于每个气泡 (脂质进入) 15,32, 可以使用不同的脂质体悬浮液形成不对称脂质双层。kca 通道在膜中的方向通过设置一个不对称的溶液 ph 值 (ph 值 4(ph 值在/ph 7)来调节, 导致其细胞质侧向左侧。因此, 左侧被指定为 "在", 而右侧被分配为 "输出"。为研究 kca 通道门控的脂质依赖性, 采用了四种类型的 cbb (包括非对称 cbb);即 pg在/pg 出, pg在/pc出, pc在/pg出, 和 pc在/pc出(pg:aps:磷脂甘油) (图 9)。kcsa 通道仅在 pg中的 pg 和 pg 的/pc输出膜中表现出较高的开度 (& gt;90%)。kcsa 通道要求存在阴离子磷脂在膜的内传单为高开放可能性26。

Figure 1
图 1: 脂质双层和膜片钳的方法.开发了多种脂质双层的形成方法。(a) 膜片钳法。(b) 传统的平面脂质双层法, 它在一个小孔上提供了一个独立的, 主要是垂直的双层。(c) 倾斜浸渍法。空气-水界面上的单层位于玻璃电极的尖端。已经进行了各种修改。(d) 液滴接口双层法。(e) 接触气泡双层法。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 接触气泡双层形成.当气泡被吹到油相时, 脂质分子会自发地转移到水油界面。不同类型的脂质体作为脂质体包含在每个气泡 (脂质输入) 中, 单层完全由相关脂质形成。对接两个单层会产生一个不对称的双层膜。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 接触气泡双层的不同阶段, 以及其中脂质的动态。气泡内衬的脂质构成了一个阶段, 它们属于单层或双层。双层上的脂质触发器很少, 不对称膜被保留很长时间。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 用脂质或脂质入法输送脂质.脂质要么添加在有机溶剂中 (脂质;a 和 c) 或在水溶液中作为脂质体 (脂质;b 和 d)。在脂质法中, 形成了非对称膜。可溶于水溶液 (蓝色) 的通道形成物质, 如肽, 被添加到其中一个气泡中, 并自发地插入到双层。在脂质入法中 , 部分通道入脂质体中 , 然后与双层体融合。通道蛋白 (红色) 以脂质或脂质法重组为脂质体, 然后添加到其中一个气泡中, 并自发地融合到双层体中。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 接触气泡双层的形成和显微图像.从切向方向观察双层。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 测量双层的测量双层的观测.两个气泡通过移液器操作将一个堆叠在一起, 显微镜聚焦在接触气泡双层的水平上。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 逐步将 kca 通道插入接触气泡双层膜.kca 通道的 e71a 突变体被用来显示插入通道的即时检测。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 8
图 8: 单层的分离和通道的响应.一个多肽通道, 多氯胺 b, 被添加到其中一个气泡, 然后自发地加入到膜。分离时, 膜中的通道退出, 但保留在通道添加侧的膜传单上。在连接时 , 通道入膜中。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 9
图 9: 不对称膜的形成和通道活性取决于小叶的组成.kcs 通道由膜内的酸性脂质 (如 pg) 调节。请点击这里查看此图的较大版本.

传统小巴 脂质体贴片 dib cbb
成功率1 高 低 非常高 非常高
即时改造2 是的 不 中间 是的
不对称膜 是的 不 是的 是的
解决方案交换 慢 非常快 慢 快速
sn 比 3 低 高 低 高
膜变形 不 不 不 是4
机械操作 不 是5 是的 是的
膜灌注 不 不 是的 是的
脂质成分 不同 有限的 6 不同 不同
1每次试验形成稳定脂质双层的成功率。
2膜破裂后迅速形成新的膜。此外, 膜是反复形成的。
3 个信噪比 (sn) 表示由膜电容产生的电气背景噪声。
4 个在两个气泡之间施加不同的内压, 可以形成凹凸膜。
5只会增加膜的张力。
6磷脂, 可以形成巨大的单侧囊泡是适用的, 但千兆密封可能无法达到。

表 1: 各种脂质双层膜的特性。

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Discussion

cbb 法的脂质双层形成是基于水油液滴内衬单层20的原理.从技术上讲, 形成 cbb 的程序很容易, 特别是对补丁夹具研究人员来说, 他们擅长操作玻璃微管。当两个带有微喷射器的移液器机械手可用时, 膜片就很容易使用膜片钳的电生理设置。另一方面, 由于 cbb 是传统的 plb 的接班人, 为此积累了大量的物理化学知识, 因此这一背景以及对表面化学的知识38对操作和操纵 cbb。cbb 为研究通道膜间膜的多功能平台提供了一个具有改变化学成分和物理状态61的能力.在 cbb 中, 气泡内壁的脂质可以自由地扩散到双层的单层相和传单的边界上, 我们开发了双层装置分离和膜灌注方法45等技术.我们扩大了用于体外通道蛋白合成的 cbb, 在气泡中进行通道合成, 新合成的通道蛋白在膜电位下被自发转移到双层从启动 ccsa dna 62 的转录翻译的时间, 就可以追溯到 kca通道的新生通道功能。

在协议的步骤中, 保持气泡大小至关重要。气泡可能会缓慢膨胀或自发收缩, 因为脂质转移到界面是缓慢的, 单层张力是容易改变。特别是, 在吸脂质体溶液 (步骤4.8.3 和 4.10) 后, 第一个气泡就膨胀了, 因为在移液器尖端积累的脂质体降低了单层张力。丢弃初始气泡并随后形成气泡提供了稳定的 cbb。有必要对气泡尺寸进行可视化跟踪, 并对压力进行微调。

cbb 方法存在实验局限性。尽管 cbb 是为电生理测量而设计的, 但对于某些脂质成分, 双层的电阻可能不够高 (例如, 100 gω), 无法进行单通道记录。例如, 二烯丙基磷脂酰胆碱经常用于脂质体, 但在 25°c63 时, 它形成电泄漏的 cbb。cbb 甚至不能与相变温度高于记录温度的脂质物种形成。事实上, 在室温下, 双棕榈酰磷脂酰胆碱很难形成 cbb, 但将温度提高到 tm 以上则解决了 64.在这些实验中, 温度是通过使用滑玻璃62下的透明热板 (见材料表) 来控制的。常用的脂质二苯基磷脂酰胆碱的相变温度低于 0°c 65, cbb 在较宽的温度范围内容易形成32,45,51 。

水油界面的磷脂是由脂入法或脂质法提供的, 在这种方法中, 脂质的传递速率相对低于脂入法 63。此外, 由于不明原因, 与脂质法相比, 脂质法的双层膜电阻相对较小。

在协议 (步骤 4.8) 中, 从移液器的尖端 (步骤4.9 和 4.10) 加载脂质体和通道重组脂质体 (1μl) 的溶液, 其余的移液器包含先前填充的电解质溶液。这仅仅是为了保存材料, 如脂质和通道分子。因此, 脂质体逐渐向上移液器溶液扩散, 一段时间后, 移液器顶端的脂质浓度不足以形成脂质单层。在这种情况下, 应从尖端 (步骤 4.8) 中吸入新鲜的脂质体溶液。当整个移液器充满含有脂质和通道分子的溶液时, 这种时间浓度的变化可以被规避, 而脂质体则逐渐沉淀成气泡。在这种情况下, 泡沫会更新。

从化学生理上看, cbb 的尺寸大于膜片钳, 从而产生较大的膜电容。然而, 串联电阻 (一系列膜电阻中的电阻) 比膜片钳 (移液器电阻 > 1 mω) 要低得多 (~ 100 kω), 从而加快了电压夹具的速度, 减轻了背景噪声。电压夹紧膜电位的串联电阻误差 66、67、68.背景噪声是膜电容和串联电阻的函数, 其中低串联电阻与高膜电容相结合, 从而产生低背景噪声9。

作为脂质双层实验的一项规则, 洗涤剂不应用于清洗玻璃器皿。即使是微量的洗涤剂也会扰乱双层的完整性。有机溶剂, 如氯甲酸甲醇和乙醇, 应用于此类清洁目的。

总体而言, cbb 集成了膜片钳 (例如, 膜的机械操作) 和 plb (例如, 修改膜脂质成分的能力) 的优势。对各种类型的通道形成物质和通道蛋白进行了 52、53、69、70只研究。这种方法的发展是合适的, 因为越来越多的研究人员关注通道膜相互作用, cbb 为各种实验提供了一个多功能的平台。预计 cbb 方法将有进一步的实验发展。

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Disclosures

提交人没有利益冲突可以披露。

Acknowledgments

提交人感谢 yamatake mariko 和 takashima masako 提供的技术援助。这项工作得到 kakenhi 赠款编号16h00759 和 17h04017 (so) 的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

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