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Neuroscience

Experimentos de bicamada lipídica com contato bolha Bilayers para Patch-Clampers

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação de bilayers do lipid usando um método de BICAMADA contato bolha. Uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico, segundo a qual uma monocamada é constituída na interface água-óleo. Duas pipetas são manipuladas para encaixar as bolhas para formar uma BICAMADA.

Abstract

Bilayers do lipid fornecem uma única plataforma experimental para estudos funcionais de canais iônicos, permitindo que o exame das interações de canal-membrana sob a membrana várias composições de lipídios. Entre eles, a BICAMADA de interface da gota ganhou popularidade; no entanto, o tamanho grande membrana dificulta a gravação do ruído de fundo eléctrica baixa. Nós temos estabelecido um método de BICAMADA (CBB) contato bolha que combina os benefícios da bicamada lipídica planar e remendo-braçadeira métodos, tais como a capacidade de variar a composição de lipídios e manipular a mecânica de BICAMADA, respectivamente. Usando a configuração para experimentos de remendo-braçadeira convencional, CBB-baseado podem ser prontamente realizados experimentos. Em breve, uma solução de eletrólito em uma pipeta de vidro é fundida em uma fase de solvente orgânica (hexadecano) e a pressão da pipeta é mantida para obter um tamanho de bolha estável. A bolha é espontaneamente forrada com uma monocamada de lipídios (lipídios puros ou mistos de lipídios), que é fornecida de lipossomas nas bolhas. Em seguida, as duas bolhas de monocamada-alinhado (~ 50 µm de diâmetro) na ponta da pipeta de vidro são encaixadas para formação da bicamada. Introdução do canal-reconstituído lipossomas dentro da bolha leva à incorporação de canais na BICAMADA, permitindo a gravação atual de canal único com uma relação sinal-ruído comparável de gravações de remendo-braçadeira. CBBs com uma composição assimétrica lipídios formam-se facilmente. A CBB é renovada repetidamente por estourar as bolhas anteriores e formando novos. Várias perturbações físicas e químicas (por exemplo, perfusão de membrana e a BICAMADA tensão) podem ser impostas a CBBs. aquiem, apresentamos o procedimento básico para formação da CBB.

Introduction

Para canais de íon, a membrana celular não é simplesmente um material de apoio, mas um parceiro para gerar o fluxo de íons. Funcionalmente, a membrana é um isolador elétrico, no qual íon canais são incorporados, e todas as membranas celulares são transmitidas com um potencial de membrana de repouso. Convencionalmente, um potencial de membrana arbitrária foi imposta de um circuito externo pelo qual a corrente elétrica através dos canais foi medido. Esta avaliação quantitativa do fluxo de iões em potenciais de membrana diferentes revelou as propriedades moleculares destes canais, tais como sua permeação íon-seletivo e associada funções1,2. Plataforma para estudos funcionais de canais iônicos de membrana é a membrana celular ou membrana de bicamada lipídica. Historicamente, gravações de corrente elétricas monocanal realizaram-se primeiro no lipid bilayers3,4, e as técnicas pertinentes foram desenvolvidas para as membranas celulares, tais como o método de remendo-braçadeira (Figura 1A )5,6. Desde então, estas duas técnicas evoluíram separadamente para fins diferentes (Figura 1)7,8.

Lipídios de membrana e membranas de BICAMADA são atualmente o foco de pesquisa para os seus papéis no apoio a estrutura e função das proteínas de canal. Portanto, a pronta disponibilidade de métodos para variar a composição lipídica em bilayers está em alta demanda. Métodos de formação de bicamada lipídica como a planar lipídios BICAMADA (PLB)8,9,10,11, gotículas de água em óleo BICAMADA12e gota interface BICAMADA (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , técnicas de 19 (Figura 1) são escolhas comuns, fornecendo uma oportunidade para examinar a função canal sob diferentes composições de lipídios20. Embora o DIB é tecnicamente muito mais fácil de produzir do que a convencional PLB, o grande tamanho de DIB criou um desincentivo para remendo-clampers para aplicá-la para o estudo atuais gravações de canal único com tamanho usual de condutância (< 100 picosegundo).

Para contornar o ruído de fundo, a área de BICAMADA deve ser minimizada. Esta questão recorda as repetições da história no desenvolvimento de técnicas eletrofisiológicas para bilayers do lipid (Figura 1). Nos primeiros dias, formou-se uma BICAMADA de pequeno porte (1-30 µm de diâmetro) na ponta de uma pipeta (método de imersão a dica; Figura 1 C) 21 , 22 , 23, em vez de usar uma BICAMADA autônoma (~ 100 µm de diâmetro) em um septo hidrofóbico em uma câmara (Figura 1B). O método de imersão a ponta permitido para medições elétricas com muito de ruído de fundo inferior24. Nossas experiências com o PLB25,26, ponta-mergulho22,23,27e remendo-braçadeira28,29,30, métodos de 31 nos levaram a uma nova ideia de formar bilayers do lipid usando os princípios da bicamada de água em óleo. Referimos a isto como o contato bolha BICAMADA (CBB) método20,32. Neste método, ao invés de pendurar as gotículas de água em uma fase de óleo (Figura 1D), uma bolha de água é levada de uma pipeta de vidro (com diâmetro de ponta de cerca de 30 µm) para a fase de óleo (Figura 1E e 2), onde o bolha é mantida através da aplicação de uma pressão constante. Um forms monocamada espontaneamente na interface água-óleo na superfície da bolha. Em seguida, duas bolhas são encaixadas através da manipulação de duas pipetas de vidro, e a BICAMADA é formada como as duas monocamadas aproximam uns aos outros, com uma área de BICAMADA de equilíbrio. O tamanho da bolha é controlado pela pressão intrabolha (mantendo a pressão) e, da mesma forma, o tamanho da bicamada. Diâmetro médio de 50 µm é frequentemente usado. Embora o volume da bolha é pequeno (< 100 pL), está relacionado com o maior volume da solução de pipeta que é na faixa de microlitros, constituindo a fase de eletrólito em massa.

Há muitos benefícios de usar o método da CBB (tabela 1). Como uma técnica de formação de bicamada lipídica, membranas de várias composições de lipídios podem ser produzidas, e membranas assimétricas são mais prontamente formado32 do que são aqueles pelo convencional método dobrável33. A BICAMADA pode ser manipulada mecanicamente, ao contrário do PLB convencional que só pode ser dobrado com uma diferença de pressão hidrostática34,35. Alterando a pressão de exploração, as bolhas ou expandir ou encolhem, levando ao aumento ou diminuição da membrana de tensão32. A BICAMADA é mecanicamente destacável em monocamadas, semelhantes a congelar-fratura técnica36,37 das membranas em estudos morfológicos, mas com a CBB, uma manobra permite múltiplas desanexar e anexar ciclos32 . O pequeno volume da solução de eletrólito dentro da bolha permite fusão eficiente de lipossomas canal-reconstituído a BICAMADA, e a probabilidade de conseguir as gravações do canal é muito maior do que com a técnica convencional de PLB. O volume de pequena bolha também permite perfusão rápida (dentro de ~ 20 ms) injeção uma vez outra pipeta é inserida em qualquer das bolhas. Ao contrário do método de remendo-braçadeira, uma vez quebrado, uma membrana CBB é re-formada imediatamente e repetidamente, e pipetas podem ser usadas várias vezes ao dia. Integrando os benefícios da remendo-braçadeira e métodos PLB, a CBB fornece uma plataforma versátil para variar as condições físico-químicas da membrana, permitindo estudos sem precedentes de interações de canal-membrana.

Antes de apresentar um protocolo detalhado do processo de formação de CBB, o fundo físico-químico da formação BICAMADA é apresentado primeiro, que será útil para remendo-clampers resolver dificuldades experimentais relacionadas com a formação da membrana que são encontrados.

Experimentos CBB dar aulas de química de superfície ciência38. A CBB é semelhante a uma bolha de sabão soprada de um canudo para o ar, onde da mesma forma, uma bolha de água é explodida em um solvente orgânico. Um vai notar que uma bolha de água dificilmente é inflada quando lipídios de membrana não estão incluídos na bolha de água ou solvente orgânico. Na ausência de lipídios anfifílicos, a tensão de superfície em uma interface água-óleo é elevada, e a pressão intrabolha para explodir uma bolha vai ser alta. Esta é uma realização da equação de Laplace (ΔP = 2 γ/R, onde ΔP é a pressão intrabolha, γ é a tensão de superfície, e R é o raio da bolha). Quando a concentração de lipídios na fase orgânica ou a solução eletrolítica é elevada, aumenta a densidade dos lipídios na monocamada, conforme indicado pela isoterma de adsorção de Gibbs (-dγ = Γeu dµeu, onde Γ é o excesso de superfície do composto i e µeu é o potencial químico do componente eu)39, levando a uma baixa tensão superficial e a facilidade de formação de bolhas. A CBB, a BICAMADA pode ser observada de um ângulo tangencial (Figura 2) e o ângulo de contato entre a monocamada e BICAMADA é mensurável. Este ângulo representa um equilíbrio entre a surface tensions da monocamada e BICAMADA (equação jovem: γbi = γmo cos(θ), onde γbi é a tensão de BICAMADA, γmo é a tensão de monocamadas e θ é o ângulo de contato). As alterações no ângulo contato indicam mudanças na tensão BICAMADA, dado que a tensão de monocamada é avaliada de alterações no ângulo de contato em função do potencial de membrana (equação de Young-Lippmann: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), onde Cm é a capacitância de membrana, V é o potencial de membrana e θ0 e θv são os ângulos de contacto em 0 e V mV, respectivamente)40,41 ,,42. Quando duas bolhas estão perto o suficiente, eles se aproximam um do outro espontaneamente. Isto é devido a força van der Waals, e podemos observar visualmente este processo dinâmico na formação da CBB.

Um sistema CBB é composto por fases distintas: ou seja, uma fase de óleo em massa, revestidas com uma monocamada e uma contato BICAMADA (Figura 3) de bolhas de água. Estas são uma reminiscência das várias fases observadas em um PLB, tais como um toro que contenham solventes em torno da fase de BICAMADA e uma fase orgânica fina imprensado por duas monocamadas43,44. A CBB, fase monocamada é contínua com o folheto do BICAMADA e moléculas lipídicas prontamente difundem entre a monocamada e o folheto. A fase de monocamada cobre a maior parte da superfície da bolha, constituindo a fase principal que serve como um reservatório de lipídios. Porque a cauda hidrofóbica de lipídios na monocamada se estende para fora para a fase de óleo em massa, o interior da bicamada ou o núcleo hidrofóbico abre a fase de óleo a granel. Assim, uma substância hidrofóbica injectada a fase de óleo perto da bicamada é capaz de acessar facilmente o interior da bicamada. Esta é a técnica de perfusão de membrana que tínhamos desenvolvido recentemente45, pelo qual a composição de lipídios na BICAMADA mudou rapidamente (dentro de um segundo) durante gravações atuais de canal único. Nós achamos que o teor de colesterol na BICAMADA poderia ser reversível controlado por ligar a perfusão de colesterol e desligar45. No caso em que a concentração da substância relevante na monocamada e bicapa difere, o gradiente de concentração da substância relevante é imediatamente dissolvido através da difusão, que é conhecido como o efeito de Marangoni46, 47. por outro lado, flip-flops através de monocamadas são lento48,,49,50.

Usando o método da CBB, a BICAMADA é formada sob condições físico-químicas versáteis, como um pH de eletrólito tão baixo quanto 1 51, uma concentração de sal (K+, Na+, etc.) até 3 M, um potencial de membrana tão alto quanto ±400 mV e um sistema de temperatura até 60 ° c.

Existem várias opções para a formação da CBB e a incorporação de moléculas de canal nele. Para a formação da monocamada na interface água-óleo, lipídios são adicionados em um solvente orgânico (método de lipídios-out; Figura 4 A, 4 C) ou em uma bolha como lipossomas (lipid-no método; Figura 4 B, 4 D). Notavelmente, o lipid-em método permite a formação de membranas assimétricas15,32. Moléculas de canal solúveis em solução aquosa (por exemplo, canal-formando peptídeos) são adicionadas diretamente na bolha (Figura 4A, B)52,53, Considerando que as proteínas de canal são reconstituídas em lipossomas, que são adicionados dentro da bolha (Figura 4C, D). Neste documento, a formação da CBBs pelo método lipid-para um peptide de canal (polytheonamide B (pTB); Figura 4 A) ou de uma proteína (canal de potássio KcsA, Figura 4C) é mostrada.

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Protocol

1. prepare os lipossomas

  1. Disperse os fosfolípidos (por exemplo, 10 mg em pó) em clorofórmio em uma concentração desejada (por exemplo, 10 mg/mL).
  2. Evapore o clorofórmio.
    1. Lugar a solução de fosfolípidos em um balão de fundo redondo e o conjunto em um evaporador rotativo (ver Tabela de materiais) conectado a um cilindro de gás de2 N. Gire o frasco sob fluxo de2 N à temperatura ambiente até um filme fino fosfolipídeo aparece (depois de ~ 30 min).
    2. Coloque o frasco aberto em um dessecador que está conectado a uma bomba de vácuo. Usando a bomba de vácuo, Aspire dentro do exsicador durante várias horas para remover completamente o clorofórmio.
  3. Adicionar um volume adequado de uma solução de eletrólito no balão e suspender o fosfolípido para obter um 2 mg/mL suspensão de fosfolípidos.
  4. Proceda à sonicação a suspensão para várias dezenas de segundos usando um sonicador de banho (consulte a Tabela de materiais) para obter uma suspensão de vesículas em várias camadas (MLV).
  5. Para a preparação de proteoliposomes que contêm proteínas de canal de íon, adicionar uma solução de proteína (com as proteínas solubilizadas com detergentes adequados; volume de 2% é o máximo) para a suspensão MLV e proceda à sonicação durante vários segundos usando o sonicador de banho.

2. prepare pipetas de vidro de grande diâmetro

  1. Definir um vidro capilar para um puxador de pipeta e fabricar micropipetas com uma fina ponta afunilada através de duas etapas puxando.
  2. Definir a micropipeta em um microforge e entre em contato com a ponta da micropipeta de um filamento de platina na porção afilada, com um diâmetro de 30 a 50 µm.
  3. Aquecer o filamento brevemente (5 s) e desligá-lo imediatamente.
    Nota: Esta manipulação formas apontar um crack para o aquecimento, segundo a qual a ponta da micropipeta é cortada, deixando um grande furo com um diâmetro de 30 a 50 µm.

3. tratar a superfície da lâmina de vidro com um poço raso côncavo (siliconização para um acabamento repelente de água)

  1. Limpe a superfície do vidro slide com um poço raso com água destilada e álcool etílico.
  2. Aplica um volume adequado (por exemplo, 100 µ l) de um reagente siliconizing (Water-repellent) ao vidro de slide no buraco.
  3. Seque o reagente completamente no ar.
  4. Coloque a lâmina de vidro no palco de um microscópio invertido.

4. formam a CBB e executar medição eletrofisiológica

  1. Adicione 100 µ l de hexadecano para o poço raso de vidro siliconizado buraco slide.
    Nota: Para o método lipídios, fosfolipídios são dispersos no hexadecano (20 mg/mL) previamente.
  2. Encha a solução eletrolítica até metade do comprimento da micropipeta, utilizando uma seringa de tuberculina.
  3. Defina a micropipeta no suporte micropipeta com uma porta de pressão, permitindo que o eletrodo de fio de Ag/AgCl mergulhar a solução eletrolítica de pipeta.
  4. Conecte um dos suportes de micropipeta para o palco principal de um amplificador de remendo-braçadeira e o outro para o aterramento elétrico.
  5. Conecte um microinjector à porta do titular micropipeta de pressão.
  6. Defina a micropipeta para uma posição apropriada acima do palco de um microscópio invertido, manipulando o micromanipulador.
  7. Ajuste o deslocamento do eletrodo potencial.
    1. Coloque 1 µ l da solução eletrolítica mesmo usada para preencher a micropipeta sobre a superfície plana em torno do poço raso de vidro slide do buraco, criando uma cúpula de eletrólito.
    2. Mergulhe a ponta de ambas as micropipetas para a cúpula de eletrólito manipulando o micromanipulador.
    3. Ajuste o potencial de deslocamento do eletrodo do amplificador remendo-braçadeira.
    4. Confirmar o deslocamento correto no final dos experimentos, quebrando a CBB através da aplicação de um elevado potencial de membrana (avaria elétrica; usando o Zap do amplificador), fazendo com que as duas bolhas para ser fundidos em um (fusão da bolha).
    5. Corrigi o potencial de junção líquida54 nos casos onde as soluções de eletrólitos assimétrica são usadas, tal que o valor calculado é adicionado para o potencial para o verdadeiro potencial de membrana de membrana aplicada.
      Nota: A potencial de junção líquida é calculada usando o programa JPCalc55.
  8. Desenhe a solução lipossoma da ponta.
    Nota: Quando canais Water-soluble são examinadas usando o método lipid-out, a aspiração da solução lipossoma não é necessária.
    1. Coloque 1 µ l da solução de lipossoma sobre a superfície plana em torno do poço raso do vidro slide buraco (lipossomas contendo cúpula).
    2. Manipular o micromanipulador e insira a ponta da micropipeta a cúpula de lipossomas contendo.
    3. Aspire a solução contendo lipossomas, reduzindo a pressão no interior do titular micropipeta usando o microinjector.
    4. Repita o procedimento para a outra pipeta.
  9. Manipular o micromanipulador e mergulhe a ponta da micropipeta ao hexadecano no poço raso.
  10. Explodir uma bolha de água lentamente, aumentando a pressão até que a bolha atinja o tamanho desejado (por exemplo, 50 µm de diâmetro) e manter a mesma pressão posteriormente.
  11. Elimine as bolhas passando a ponta através da interface óleo-ar, se é difícil manter o tamanho das bolhas estáveis.
  12. Repita as etapas de 4,8 para 4,9 até formam-se bolhas estáveis.
  13. Manipule as bolhas para permitir o contato entre eles (Figura 5).
    Nota: Às vezes, as bolhas abordagem outro espontaneamente para formar a CBB. Em outros casos, as bolhas estão perto, mas não entre em contato com os outros. Neste caso, empurre as bolhas outro mecanicamente.
  14. Ajuste a pressão para manter o tamanho da bolha, pois o tamanho pode ser alterado gradualmente até à pressão constante intrabolha.
  15. A membrana potencial para o valor apropriado usando o amplificador de remendo-braçadeira e esperamos para o canal atual a emergir (Figura 6).

5. medir capacitância bicapa

  1. Medir a capacitância elétrica BICAMADA (Cel) aplicando uma rampa de potencial.
    Nota: Quando a taxa da mudança da tensão do comando de rampa é ms 10 mV/10 (ou 1 V/s) seguido de ms de mV/10-10, a amplitude do salto atual sobre as mudanças na inclinação corresponde a leitura do valor (por exemplo, membrane'scapacitance 100 pA → 100 pF).
  2. Avaliar a área de BICAMADA de duas bolhas empilhados um sobre o outro e focar o microscópio a nível da bicamada para exibir a borda da bicamada (Figura 6).
    Nota: A forma de BICAMADA principalmente é circular, e a área é calculada a partir do raio.
  3. Calcular a capacitância de membrana específicos (Csp) dividindo a capacitância elétrica pela área de BICAMADA (Csp = Cel/A).
  4. Calcular a espessura de BICAMADA (espessura do núcleo hidrofóbico) usando Dc = (εrε0) /Csp (onde εr e ε0 representam a permissividade da região hidrofóbica da bicamada e a permissividade de um vácuo, respectivamente).

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Representative Results

Um típico CBB tinha um diâmetro de 50 µm (Figura 56), sendo a capacitância de membrana específicas em hexadecano 0.65 µF/cm2. O tamanho da bolha arbitrariamente era controlado pela pressão intrabolha. Quando pequenas bolhas são necessárias para as gravações de baixo ruído, o diâmetro da ponta deve ser correspondentemente pequeno. Por exemplo, para um tamanho de bolha de 50 µm de diâmetro, o diâmetro da ponta deve ser de 30 µm.

Uma vez que a CBB tinha formado, as moléculas de canal em solução aquosa ou no lipossoma espontaneamente foram inseridas a BICAMADA dentro de uma extensão de algumas dezenas de minutos. Inserção dos canais foi confirmada pelo aumento gradual da atual amplitude (Figura 7) sob o potencial de membrana aplicada. A menor área de membrana (< 1.000 µm2) em relação ao que na PLB convencional e DIB sistemas melhoraram substancialmente a relação sinal-ruído elétrica.

Gravações atuais poderiam ser continuadas até a membrana foi interrompida e fundiu as duas bolhas. Novas bolhas foram explodidas e a CBB formado imediatamente e repetidamente. A pipeta pode ser usada repetidamente dentro de um dia.

Dever ciclo de anexar e desanexar. Uma BICAMADA formada pelo método CBB pode ser desintegrou-se em duas monocamadas. Desanexar-anexar da CBB pode ser repetido, manipulando as duas bolhas (ciclo de trabalho de detach-attach). Este processo foi monitorado pelo aparecimento do canal atual do pTB, um canal de peptídeo de uma esponja marinha, como ele prontamente foi inserido com a bicamada lipídica para formar um poro seletivo cátion monovalente52,56. O canal do pTB atual surgiu imediatamente depois de anexar as duas monocamadas, e a corrente tornou-se maior que a área de contato aumentada (Figura 8). A amplitude da corrente foi sincronizada com o desanexar-anexar a manipulação da CBB.

Medições de canal único do canal KcsA. O canal de potássio KcsA é pH sensível, sendo ativada pelo pH ácido intracelular57. Assim, a solução eletrolítica foi definida para ser assimétrica58,59,60. Passo 4.2 de formação da CBB, a solução da pipeta do lado esquerdo foi fixada em pH 4, enquanto que do lado direito foi fixado em pH 7,525. Na etapa 4.7.1, uma suspensão de proteoliposome, ao invés de suspensão de lipossomas, foi colocado ao vidro para aspiração na esquerda pipeta no slide. Nesse sentido, o canal KcsA foi orientado na membrana com seu domínio citoplasmático virado para a esquerda da bolha. Lipossomas com a relação de peso de proteína: lipídios de 1: 2000 são adequados para gravação atual de canal único e aqueles com um 01:10 proporção são para gravação de corrente macroscópica.

Membrana assimétrica. Uma bicamada lipídica assimétrica pode ser formada usando suspensões lipossoma diferentes para cada bolha (lipid-no)15,32. A orientação do canal KcsA na membrana foi regulamentada, definindo um pH de solução assimétrica (pH 4em/pH 7para fora), levando a seu lado citoplasmático sendo voltada para o lado esquerdo. Nesse sentido, o lado esquerdo foi designado como "em", Considerando que o lado direito foi designado como "out". Para examinar a dependência de lipídios a retenção do canal KcsA, foram utilizados quatro tipos de CBB (incluindo uma CBB assimétrica); ou seja, PGem/PGfora, PGem/PCpara fora, PCem/PGforae PCem/PCpara fora (PG: fosfatidilglicerol) (Figura 9). O canal KcsA exibiu alta probabilidade aberta (> 90%) só na PGem/PGfora e PGem/PCpor membranas. O canal de KcsA requer a existência de fosfolípidos aniónicos no folheto interno da membrana para uma alta probabilidade de aberto26.

Figure 1
Figura 1 : Métodos de lipídios BICAMADA e patch-clamp. Vários métodos foram desenvolvidos para formar a bicamada lipídica. (A) método de Patch-clamp. (B) método de bicamada lipídica planar convencional, que fornece uma BICAMADA autônoma, principalmente vertical, em um pequeno buraco. Método c ponta-mergulho. Uma monocamada na interface ar-água é posicionada na ponta de um eletrodo de vidro. Desenvolveram-se várias modificações. (D) método de BICAMADA de interface da gota. (E) entre em contato com a método de BICAMADA de bolha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 2
Figura 2 : Entre em contato com a formação de bolhas BICAMADA. Como uma bolha é fundida em uma fase de óleo, as moléculas de lipídios transferem espontaneamente para a interface água-óleo. Diferentes tipos de lipídeos como lipossomas são incluídos em cada bolha (lipid-em), e monocamadas são formadas exclusivamente por lipídeos relevantes. Encaixe as duas monocamadas gera uma membrana de BICAMADA assimétrica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 3
Figura 3 : Distinct fases na BICAMADA de contato bolha e a dinâmica de lipídeos nele. Forro da bolha de lipídios constituem uma fase onde eles pertencem a uma monocamada ou uma BICAMADA. Flip-flop de lipídios através da bicamada é pouco frequente, e a membrana assimétrica é mantida por um longo tempo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 4
Figura 4 : Entrega de lipídios com o método de lipid-out ou lipídios-no. Lipídios são adicionados em um solvente orgânico (saída de lipídios; A e C) ou em solução aquosa como lipossomas (lipid-no; B e D). No método de lipídios-no, é formada uma membrana assimétrica. Substâncias formadoras de canais que são solúveis em solução aquosa (azul), tais como peptídeos, são adicionadas em uma das bolhas e espontaneamente inseridas a BICAMADA. No método de lipídios-em, uma parte dos canais é inserida em lipossomas, que são então fundidos para a BICAMADA. Proteínas de canal (vermelho) são reconstituídas em lipossomas no método lipid-out ou lipídios-no, que são então adicionados em uma das bolhas e espontaneamente fundidos para a BICAMADA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 5
Figura 5 : Formação e imagem microscópica do contato bolha BICAMADA. A BICAMADA é observada de uma direção tangencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 6
Figura 6 : Observação da bicamada para medir a área de BICAMADA. Duas bolhas são empilhadas um sobre o outro através da manipulação de pipeta e o microscópio é focado no nível da bicamada de contato bolha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 7
Figura 7 : Inserção gradual do canal KcsA na membrana de BICAMADA contato bolha. O mutante E71A do canal KcsA foi usado para mostrar a detecção imediata dos canais inseridos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 8
Figura 8 : Desanexar-anexar de monocamadas e respostas de canais. Um canal de peptídeo, polytheonamide B, foi adicionado em uma das bolhas, que depois foi incorporada espontaneamente a membrana. Quando separada, canais na membrana retiraram, mas foram retidos no folheto da membrana do lado do canal-adicionado. Em anexo, os canais foram inseridos na membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figure 9
Figura 9 : Formação de uma atividade assimétrica de membrana e canal dependente da composição do folheto. O canal KcsA é regulado por lipídios ácidos, tais como PG, no folheto interno da membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

PLB convencional Remendo do lipossoma DIB CBB
Taxa de sucesso1 alta baixa muito alta muito alta
Reformability imediata2 Sim Não intermediário Sim
Membrana assimétrica Sim Não Sim Sim
Troca de solução devagar muito rápido devagar rápido
Relação S/N3 baixa alta baixa alta
Deformação da membrana Não Não Não Sim4
Manipulação mecânica Não Sim5 Sim Sim
Perfusão de membrana Não Não Sim Sim
Composições de lipídios diversos limitada6 diversos diversos
1 A taxa de sucesso de formação lipídica estável por julgamento.
2 Formação de uma nova membrana rapidamente após a quebra de uma membrana. Além disso, a membrana é formada repetidamente.
3 A relação de sinal-ruído (S/N) representa o principal de ruído elétrico fundo gerado a partir a capacitância de membrana.
4 Membrana côncava ou convexa pode ser formada através da aplicação de pressão interna diferente entre duas bolhas.
5 Só aumentando a tensão de membrana.
6 Fosfolipídios que podem formar vesículas unilamellar gigante são aplicáveis, mas o giga-selo não pode ser atingido.

Tabela 1: Características de várias membranas de bicamada lipídica.

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Discussion

O método CBB de formação de bicamada lipídica é baseado no princípio de uma gota de água em óleo, revestida por uma monocamada de20. Tecnicamente, os procedimentos para a formação de CBBs são fáceis, especialmente para os pesquisadores da remendo-braçadeira, que são proficientes em manipular Micropipetas de vidro. A configuração eletrofisiológica para a braçadeira do remendo prontamente é usada na CBB quando dois manipuladores de pipeta com microinjectors estão disponíveis. Por outro lado, porque a CBB é um sucessor da PLB convencional, para que uma grande quantidade de conhecimento físico-químico tem sido acumulada8, este fundo bem como conhecimento de química de superfície38 é útil para o funcionamento e manipulando a CBBs. A CBB serve uma plataforma versátil para estudar o canal-membrana interacções com a sua capacidade de modificar a composição química e estado físico61. Na CBB, lipídios forro da bolha podem difundir livremente através da fronteira da fase monocamada e folheto da bicamada, e temos desenvolvidas técnicas tais como a BICAMADA anexação desanexação e a perfusão de membrana métodos45. Nós estendemos CBBs para em vitro canal síntese proteica, onde síntese do canal foi realizada na bolha e canal recentemente sintetizadas proteínas foram sujeitos a transferência espontânea para a BICAMADA sob a aplicação de um potencial de membrana onde funções canal nascente do canal KcsA foi traçado desde o momento de iniciar a transcrição/tradução de DNA KcsA62.

Entre as etapas do protocolo, manter o tamanho da bolha é fundamental. As bolhas lentamente podem inchar ou encolher espontaneamente porque transferência de lipídios para a interface é lenta e a tensão de monocamada é propensa a mudar. Em particular, a primeira bolha inflada logo após a aspiração da solução em lipossomas (etapas 4.8.3 e 4.10) é difícil de manter porque a tensão monocamada é abaixada pelos lipossomas acumulados na ponta da pipeta. Descartando as bolhas iniciais e subsequente formação de bolhas fornecem a CBB estável. Rastreio visual do tamanho da bolha e ajuste fino da pressão são necessárias.

Existem limitações experimentais para o método da CBB. Embora a CBB é projetado para medições eletrofisiológicas, a resistência elétrica da bicamada para certas composições de lipídios pode não ser alto o suficiente (por exemplo, GΩ 100) para gravações de canal único. Por exemplo, dioleoyl fosfatidilcolina é frequentemente utilizada para lipossomas, mas forma eletricamente gotejantes CBBs em 25 ° C63. CBBs mesmo não podem ser formadas com espécies de lipídios, cuja temperatura de transição de fase é acima da temperatura de gravação. Com efeito, formação de CBB foi difícil com fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina em temperatura ambiente, mas elevando a temperatura acima de Tm contornado o problema,64. Nesses experimentos, a temperatura era controlada por meio de uma placa transparente calor (veja a Tabela de materiais) abaixo do slide de vidro62. A temperatura de transição de fase de fosfatidilcolina de diphytanoyl os lipídios usados com frequência é abaixo de 0 ° C 65, e CBBs são prontamente formado32,,45,51 em uma escala de temperatura larga.

Fosfolipídios da interface água-óleo são fornecidos de lipídeos ou lipídios, onde a taxa de transferência é relativamente mais lenta no lipid-fora do que no lipid-no método63o método. Além disso, por razões desconhecidas, a resistência elétrica da membrana de BICAMADA é relativamente menor com o método de lipídios-out do que com o método de lipídios-no.

No protocolo (etapa 4.8), uma solução de lipossomas e canal-reconstituído lipossomas (1 µ l) é carregada da ponta da pipeta (medidas 4.9 e 4.10), e o resto da pipeta contém a solução de eletrólito previamente preenchido. Isto é apenas para a conservação de materiais, tais como lipídios e moléculas de canal. Consequentemente, os lipossomas difundem gradualmente em direção a solução superior da pipeta, e depois de um tempo, a concentração de lipídios na ponta da pipeta torna-se insuficiente para monocamadas de lipídios do formulário. Neste caso, solução de lipossoma fresco deve ser aspirada da ponta (etapa 4.8). Esta mudança de concentração temporal pode ser contornada quando toda pipeta é preenchida com a solução que contém lipídios e moléculas de canal, Considerando que os lipossomas gradualmente assentar em bolhas. Neste caso, as bolhas são renovadas.

Electrophysiologically, o tamanho da CBB é maior do que a braçadeira do remendo, gerando assim uma maior capacitância de membrana. No entanto, a resistência série (a resistência elétrica de uma série de resistência de membrana) é muito inferior (~ 100 kΩ) para a braçadeira do remendo (pipeta resistência > 1 MΩ), que acelera a velocidade da mordaça tensão e atenua o ruído de fundo e os erros de resistência série da membrana de tensão-fixada potenciais66,67,68. O ruído de fundo é uma função da capacitância de membrana e a resistência série, onde uma resistência baixa série complementa uma capacitância de membrana de alta, resultando em baixo fundo ruído9.

Como uma regra de experimentos de bicamada lipídica, detergentes não devem ser usados para lavar copos. Mesmo uma pequena quantidade de detergente perturba a integridade da bicamada. Solventes orgânicos como clorofórmio/metanol e etanol devem ser usados para tais fins de limpeza.

Em geral, a CBB integra os benefícios de ambos a braçadeira do remendo (por exemplo, a manipulação mecânica da membrana) e a PLB (por exemplo, a capacidade de modificar a composição lipídica da membrana). Vários tipos de substâncias formadoras de canal e canal proteínas foram estudados52,53,69,70. O desenvolvimento deste método é oportuno, já que cada vez mais pesquisadores estão se concentrando em interação canal-membrana, e a CBB fornece uma plataforma versátil para várias experiências. Esperam-se mais desenvolvimentos experimentais no método CBB.

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Disclosures

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer Mariko Yamatake e Masako Takashima para assistência técnica. Este trabalho foi financiado em parte por KAKENHI concessão números 16H 00759 e 17 H 04017 (SO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

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Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

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