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Neuroscience

Bicouche lipidique expérimente le Contact bulle bicouches pour Patch-colliers

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Nous présentons ici un protocole pour la formation des bicouches lipidiques en utilisant une méthode de bicouche contacter bulle. Une bulle d’eau est soufflée dans un solvant organique, par laquelle il se forme une monocouche à l’interface eau-huile. Deux pipettes sont manipulés pour ancrer les bulles pour former une bicouche.

Abstract

Bicouches lipidiques fournissent une plate-forme expérimentale unique pour l’étude fonctionnelle des canaux ioniques, permettant l’examen des interactions canal-membrane sous membrane diverses compositions lipidiques. Parmi eux, la double couche interface de gouttelettes a gagné en popularité ; Toutefois, la taille de la membrane large fait obstacle à l’enregistrement du bruit de fond électrique faible. Nous avons établi une méthode de bicouche (CBB) contacter bulle qui combine les avantages des bicouches lipidiques planes et méthodes de patch clamp, telles que la possibilité de varier la composition lipidique et de manipuler la mécanique de la bicouche, respectivement. En utilisant le programme d’installation pour les expériences classiques patch clamp, expériences CBB peuvent être facilement réalisées. En bref, une solution électrolytique d’une pipette de verre est soufflée dans une phase solvant organique (hexadécane), et la pression de la pipette est maintenue pour obtenir une taille de bulle stable. La bulle est spontanément bordée d’une monocouche de lipides (lipides pures ou mixtes lipides), qui est fournie à partir de liposomes dans les bulles. Ensuite, les deux bulles bordées de monocouche (~ 50 µm de diamètre) à la pointe des pipettes en verre sont amarrés pour la formation de la bicouche. Introduction de liposomes canal-reconstituée dans la bulle mène à l’intégration des canaux dans la bicouche, permettant à canal unique enregistrement actuel avec un rapport signal-bruit comparable à celle des enregistrements de patch clamp. CBBs avec une composition lipidique asymétrique sont forment facilement. Le CBB est renouvelé à plusieurs reprises de souffler les bulles précédentes et former de nouveaux. Diverses perturbations chimiques et physiques (p. ex., perfusion de membrane et la tension de la bicouche) peuvent être imposées sur le CBBs. Herein, nous présentons la procédure de base pour la formation de CBB.

Introduction

Pour les canaux ioniques, la membrane cellulaire est pas simplement un appui matériel, mais un partenaire pour générer le flux ionique. D’un point de vue fonctionnel, la membrane est un isolant électrique dans lequel ion canaux est incorporées, et toutes les membranes cellulaires sont conférés avec un potentiel de repos membranaire. Classiquement, un potentiel de membrane arbitraire a été imposé depuis un circuit externe, par lequel le courant électrique à travers les canaux a été mesuré. Cette évaluation quantitative du flux ionique à des potentiels de membrane différents a révélé les propriétés moléculaires de ces canaux, tels que leur perméabilité sélective des ions et blocage des fonctions1,2. La plate-forme de membrane pour l’étude fonctionnelle des canaux ioniques est la membrane de la cellule ou la membrane lipidique bi-couche. Historiquement, monocanal enregistrements de courants électriques ont été créés en lipides bicouches3,4, et les techniques pertinents ont été élaborés pour les membranes cellulaires, telles que la méthode de patch clamp (Figure 1A )5,6. Depuis lors, ces deux techniques ont évolué séparément pour différentes fins (Figure 1)7,8.

Lipides membranaires et membranes bicouches sont actuellement au centre de recherche pour leur rôle dans le soutien de la structure et la fonction des protéines de canal. Par conséquent, la facilité avec laquelle des méthodes pour faire varier la composition des lipides dans les bicouches est en forte demande. Lipidique bi-couche formation méthodes comme le lipidiques planes bicouche (PLB)8,9,10,11, goutte d’eau dans l’huile bicouche12et gouttelettes d’une interface bicouche (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 techniques (Figure 1) sont des choix communs, fournissant l’occasion d’examiner la fonction canal sous diverses compositions de lipides20. Bien que le fichier DIB est techniquement plus facile à produire que la PLB conventionnelle, la grande taille du fichier DIB a créé un effet dissuasif pour les patch-colliers pour l’appliquer pour étudier les enregistrements actuels monocanal avec conductance taille habituelle (< 100 pS).

Pour contourner le bruit de fond, le domaine de la bicouche doit être minimisé. Cette question rappelle les répétitions de l’histoire dans le développement des techniques électrophysiologiques des bicouches lipidiques (Figure 1). Dans les premiers jours, une bicouche de petite taille (1 à 30 µm de diamètre) a été formée à l’extrémité de la pipette (méthode de l’immersion à bout ; Figure 1 C) 21 , 22 , 23, plutôt que d’utiliser une bicouche autoportantes (~ 100 µm de diamètre) sur une cloison hydrophobe dans une chambre (Figure 1B). La méthode d’immersion à pointe autorisée pour mesures électriques avec beaucoup moins de bruit fond24. Nos expériences avec le patch clamp28,29,30, , pointe-dip22,23,27et25,26PLB méthodes 31 nous a conduit à une idée originale de former des bicouches lipidiques en utilisant les principes de la bicouche de l’eau dans l’huile. Nous avons appelé cela la bulle contact bicouche (CBB) méthode20,32. Dans cette méthode, au lieu d’accrocher les gouttelettes d’eau dans une phase huileuse (Figure 1D), une bulle d’eau est soufflée par une pipette de verre (avec diamètre d’environ 30 µm) dans la phase huileuse (Figure 1E et 2), où le bulle est maintenue par une pression constante. Une monocouche se forme spontanément à l’interface eau-huile à la surface de la bulle. Ensuite, deux bulles sont ancrés par la manipulation de deux pipettes de verre et la bicouche est formée comme les deux monocouches approchent mutuellement, ce qui donne une superficie de bicouche d’équilibre. La taille de la bulle est contrôlée par la pression intra-bulle (maintien) et même la taille de la bicouche. Un diamètre moyen de 50 µm est fréquemment utilisé. Bien que le volume de la bulle est faible (< 100 pL), il est relié au grand volume de la solution de la pipette qui est de l’ordre du microlitre, constituant la phase électrolytique en vrac.

Il y a beaucoup d’avantages à utiliser la méthode du CBB (tableau 1). Comme une technique de formation de bicouche lipidique, membranes de diverses compositions de lipides peuvent être produites, et les membranes asymétriques sont plus facilement formé32 que ceux par les classiques de méthode pliage33. La bicouche peut être manipulée mécaniquement, contrairement à la PLB conventionnelle qui peut seulement être pliée avec une pression hydrostatique différence34,35. En changeant la pression d’exploitation, les bulles, soit élargir ou rétrécissement, conduisant à une augmentation ou une diminution de membrane tension32. La bicouche est mécaniquement détachable en monocouches, semblables à la cryofracture technique36,37 des membranes dans les études morphologiques, mais avec du CBB, une manoeuvre permettant des recherches répétées détacher et attacher les cycles32 . Le faible volume de la solution d’électrolyte dans la bulle permet une fusion efficace des liposomes canal-reconstituée dans la bicouche, et la probabilité d’obtenir des enregistrements de canaux est beaucoup plus élevée avec la technique classique de PLB. Le volume de la petite bulle permet également une perfusion rapide (dans environ 20 ms) une fois une autre injection pipette est insérée dans une des bulles. Contrairement à la méthode de patch-clamp, une fois brisé, une membrane CBB est re-formée immédiatement et de manière répétée et pipettes peuvent être utilisés plusieurs fois par jour. En intégrant les avantages des méthodes PLB et patch clamp, CBB fournit une plateforme polyvalente pour faire varier les conditions physico-chimiques de la membrane, permettant des études sans précédent des interactions canal-membrane.

Avant de présenter un protocole détaillé du processus de formation CBB, l’arrière-plan physicochimique de la formation de la bicouche est présenté première, qui sera très utile pour le patch-colliers résoudre les difficultés expérimentales relatives à la formation de la membrane qui se rencontrent.

CBB expériences donnent des leçons de chimie de surface science38. Le CBB est semblable à une bulle de savon, soufflée par une paille dans les airs, où même, une bulle d’eau est soufflée dans un solvant organique. On remarquera qu’une bulle d’eau est gonflée peine lorsque les lipides membranaires ne figurent pas dans la bulle d’eau ou solvant organique. En l’absence d’amphipathic lipides, la tension superficielle à une interface eau-huile est élevée, et la pression intra-bulle pour le soufflage une bulle sera élevée. Il s’agit d’une réalisation de l’équation de Laplace (ΔP = γ 2/R, où ΔP est la pression intra-bulle, γ est la tension superficielle et R est le rayon de la bulle). Lorsque la concentration de lipides dans la phase organique ou la solution d’électrolyte est élevée, augmente la densité des lipides dans la monocouche, dicté par l’isotherme d’adsorption de Gibbs (-dγ = Γj’ai dµje, où Γj’ai est l’excès de surface du composé i et µj’ai est le potentiel chimique du composant i)39, conduisant à une plus faible tension superficielle et la facilité de formation de bulles. Dans le Canadian Black Book, la bicouche peut être observée sous un angle tangentiel (Figure 2), et l’angle de contact entre la monocouche et bicouche est mesurable. Cet angle représente un équilibre entre les surface tensions de la monocouche et bicouche (équation jeune : γbi = cos(θ)mo γ, où γbi est la tension de la bicouche, γmo est la tension de la monocouche et θ est l’angle de contact). Les changements dans l’angle de contact indiquent des changements dans la tension de la bicouche, étant donné que la tension de la monocouche est évaluée à partir des changements dans l’angle de contact en fonction du potentiel membranaire (équation de Young-Lippmann : γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), où C,m est la capacité de la membrane, V est le potentiel de membrane et θ0 et θv sont les angles de contact à 0 et V mV, respectivement)40,41 ,,42. Quand deux bulles sont assez proches, ils s’approchent de l’autre spontanément. Cela est dû à la force de van der Waals, et nous pouvons observer visuellement ce processus dynamique en formation de CBB.

Un système CBB se compose de phases distinctes : à savoir, une phase d’huile en vrac, l’eau bulles recouvertes d’une monocouche et une bicouche contact (Figure 3). Elles rappellent les multiples phases observées dans une PLB, comme un tore contenant des solvants dans la phase de la bicouche et une phase organique mince en sandwich par deux monocouches43,44. Dans le Canadian Black Book, la phase monocouche est en continuité avec le dépliant de la bicouche et molécules lipidiques diffusent facilement entre la monocouche et de la notice. La phase de monocouche couvre la majeure partie de la surface de la bulle, qui constitue la phase majeure qui sert comme un réservoir de lipides. Parce que la queue hydrophobe des lipides dans la monocouche s’étend vers l’extérieur à la phase huileuse en vrac, l’intérieur de la bicouche ou le noyau hydrophobe s’ouvre à la phase huileuse en vrac. Ainsi, une substance hydrophobe injectée dans la phase huileuse à proximité de la bicouche est en mesure d’accéder facilement à l’intérieur de la bicouche. Il s’agit de la technique de perfusion de membrane que nous avions récemment développé45, par lequel la composition lipidique dans la bicouche est changée rapidement (moins d’une seconde) pendant monocanal enregistrements actuels. Nous avons constaté que la teneur en cholestérol dans la bicouche pourrait être réversible contrôlée par allumage et extinction45de la perfusion de cholestérol. Dans le cas où la concentration de la substance concernée dans la monocouche et bicouche diffère, le gradient de concentration de la substance concernée est immédiatement dissous par diffusion, qui est connue comme le Marangoni effet46, 47. en revanche, tongs à travers les monocouches sont lents48,49,50.

À l’aide de la méthode CBB, la bicouche est formée dans des conditions physico-chimiques polyvalentes, comme un pH de l’électrolyte aussi bas que 1 51, une concentration de sel (K+, Na+, etc.) jusqu'à 3 M, un potentiel de membrane atteint ±400 mV et un système température jusqu'à 60 ° c.

Il y a plusieurs options pour la formation du CBB et incorporation des molécules de canal qui y sont. Pour la formation de la monocouche à l’interface eau-huile, lipides sont ajoutés dans un solvant organique (méthode de lipide-out ; Figure 4 A, 4C) ou dans une bulle comme liposomes (méthode lipidique ; Figure 4 « B, 4D). La méthode lipides permet notamment, pour la formation des membranes asymétriques15,32. Molécules de canal solubles en solution aqueuse (p. ex., peptides formant le chenal) sont ajoutés directement dans la bulle (Figure 4A, B)52,53, alors que les protéines de canal sont reconstitués en liposomes, qui sont ensuite ajoutés dans la bulle (Figure 4C, D). Dans les présentes, la formation du CBBs par la méthode lipidique composant logiciel enfichable pour un peptide de canal (polytheonamide B (pTB) ; Figure 4 A) ou une protéine (canal de potassium KcsA, Figure 4C) s’affiche.

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Protocol

1. préparer les Liposomes

  1. Disperser les phospholipides (p. ex., 10 mg en poudre) dans le chloroforme à une concentration souhaitée (par exemple, 10 mg/mL).
  2. Évaporer le chloroforme.
    1. Place de la solution de phospholipides dans un ballon à fond rond et la fixer sur un évaporateur rotatif (voir Table des matières) relié à une bouteille de gaz N2 . Tourner le flacon sous flux2 N à la température ambiante jusqu'à ce qu’un film mince de phospholipides s’affiche (après environ 30 min).
    2. Placez le flacon ouvert dans un dessiccateur qui est relié à une pompe à vide. À l’aide de la pompe à vide, aspirer l’intérieur du dessiccateur pendant plusieurs heures pour enlever le chloroforme soigneusement.
  3. Ajouter un volume approprié d’une solution d’électrolyte dans le ballon et suspendre les phospholipides pour obtenir un 2 mg/mL suspension de phospholipides.
  4. Ultrasons la suspension pendant plusieurs dizaines de secondes en utilisant un sonicateur bath (voir la Table des matières) pour obtenir une suspension de vésicule multicouches (VCP).
  5. Pour la préparation des protéoliposomes qui contiennent des protéines de canal d’ion, ajouter une solution protéique (avec les protéines solubilisées en utilisant des détergents appropriés ; volume 2 % est le maximum) à la suspension MLV et laisser agir pendant plusieurs secondes en utilisant le sonicateur bain.

2. préparer les Pipettes de verre de gros calibre

  1. Mettre un verre capillaire à un extracteur de pipette et fabriquer les micropipettes avec une pointe fine conique à travers deux étapes en tirant.
  2. Définir la micropipette sur une microforge et communiquer avec la pointe de la micropipette à un filament de platine à la partie conique avec un diamètre de 30 à 50 µm.
  3. Chauffer le filament brièvement (5 s) et arrête immédiatement.
    Remarque : Cette manipulation se forme une fissure au chauffage point, auquel cas la pointe de la micropipette est coupée, laissant un trou large de 30 à 50 µm de diamètre.

3. traiter la Surface de la lame de verre avec un puits peu profond Concave (siliconage pour une finition hydrofuge)

  1. Nettoyer la surface de la lame de verre avec un puits peu profond avec l’eau distillée et l’éthanol.
  2. Appliquer un volume approprié (par exemple, 100 µL) d’un réactif siliconizing (hydrofuge) sur le verre de glissière de trou.
  3. Sécher le réactif complètement dans l’air.
  4. Placez la lame de verre sur la scène d’un microscope inversé.

4. forme du CBB et effectuer des mesures électrophysiologiques

  1. Ajouter 100 µL d’hexadécane dans le puits peu profond du verre siliconé trou diapositive.
    Remarque : Pour la méthode de lipide-out, phospholipides sont dispersent dans l’hexadécane (20 mg/mL) au préalable.
  2. Remplir à moitié de la longueur de la micropipette, à l’aide d’une seringue à tuberculine de la solution d’électrolyte.
  3. Définissez la micropipette sur le support de micropipette un orifice de pression, ce qui permet du fil-électrode Ag/AgCl à tremper dans la solution d’électrolyte de pipette.
  4. Connecter un des porte-micropipette à la scène en tête d’un amplificateur de patch clamp et l’autre à la masse.
  5. Connecter un microinjector à l’orifice de pression du titulaire une micropipette.
  6. Affectez une micropipette un poste approprié au-dessus de la scène d’un microscope inversé en manipulant le micromanipulateur.
  7. Régler le décalage de l’électrode potentiels.
    1. Placez 1 µL de solution d’électrolyte même utilisée pour remplir la micropipette sur une surface plane autour du puits peu profond du verre trou diapositive, création d’un dôme d’électrolyte.
    2. Faire tremper le bout de ces deux micropipettes dans le dôme de l’électrolyte en manipulant le micromanipulateur.
    3. Ajuster le potentiel décalage électrode de l’amplificateur de patch clamp.
    4. Confirmer le décalage exact à la fin des expériences en brisant la CBB via l’application d’un haut potentiel de membrane (claquage électrique ; utiliser Zap sur l’ampli), entraînant les deux bulles pour être fondus en un seul (fusion de bulle).
    5. Corriger le potentiel de jonction liquide54 dans les cas où les solutions d’électrolytes asymétriques sont utilisées, tels que la valeur calculée est ajoutée à la membrane appliquée potentielle pour le vrai potentiel de membrane.
      Remarque : Le potentiel de jonction liquid est calculé en utilisant le programme JPCalc55.
  8. Tirer la solution aux liposomes de la pointe.
    Remarque : Lorsque les canaux soluble dans l’eau est examinés en utilisant la méthode de lipide-out, aspiration de la solution de liposome n’est pas nécessaire.
    1. Placez 1 µL de solution de liposome sur une surface plane autour du puits peu profond du verre trou diapositive (liposome contenant le dôme).
    2. Manipuler le micromanipulateur et introduire l’embout de la micropipette dans le dôme de liposome contenant.
    3. Aspirer la solution de liposome contenant en abaissant la pression à l’intérieur de la titulaire de la micropipette à l’aide de la microinjector.
    4. Répétez l’opération pour les autre la pipette.
  9. Manipuler le micromanipulateur et plonger l’extrémité de la micropipette dans l’hexadécane dans le puits peu profond.
  10. Souffler une bulle d’eau lentement en augmentant la pression jusqu'à ce que la bulle atteint la taille désirée (par exemple, 50 µm de diamètre) et de maintenir la même pression par la suite.
  11. Jeter les bulles en passant la pointe par le biais de l’interface air-huile, s’il est difficile de maintenir la stabilité de la taille des bulles.
  12. Répétez les étapes de 4,8 à 4,9 jusqu'à ce que sont forment les bulles stables.
  13. Manipuler les bulles afin de permettre le contact entre eux (Figure 5).
    Remarque : Parfois, les bulles d’approchent l’autre spontanément pour former du CBB. Dans d’autres cas, les bulles sont proches mais ne contactent pas les uns les autres. Dans ce cas, appuyez sur les bulles entre eux mécaniquement.
  14. Ajuster la pression pour maintenir la taille de la bulle, car la taille peut changer progressivement même à la pression constante intra-bulle.
  15. Définir la membrane potentiel sur la valeur appropriée à l’aide de l’amplificateur de patch clamp et attendre pour le canal actuel à émerger (Figure 6).

5. Mesurez la Capacitance bicouche

  1. Mesurer la capacité électrique bicouche (Cel) en appliquant une rampe de potentielle.
    Remarque : Lorsque le taux de la variation de tension de la commande de rampe est 10 mV/10 ms (ou 1 V/s) suivie de-10 mV/10 ms, l’amplitude du saut actuel sur les changements dans la pente correspond à la lecture de la valeur de membrane'scapacitance (p. ex. 100 pA → 100 pF).
  2. Évaluer l’espace bicouche de deux bulles empilés les uns sur les autres et se concentrent au microscope au niveau de la bicouche pour visualiser le bord de la bicouche (Figure 6).
    NOTE : La forme de la bicouche est le plus souvent circulaire, et la zone est calculée à partir du rayon.
  3. Calculer la capacité de la membrane spécifique C (sp) en divisant la capacité électrique de la région de bicouche (Csp = Cel/A).
  4. Calculer l’épaisseur de la bicouche (épaisseur du noyau hydrophobe) à l’aide de Dc = (εrε0) /Csp (où εr et ε0 représentent la permittivité de la région hydrophobe de la bicouche et la permittivité d’un vide, respectivement).

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Representative Results

Un typique CBB avait un diamètre de 50 µm (Figure 56) et la capacité de la membrane spécifique en hexadécane était 0,65 µF/cm2. Taille de la bulle a été arbitrairement contrôlée par la pression intra-bulle. Lorsque les petites bulles sont nécessaires pour des enregistrements de faible bruit, le diamètre de la pointe doit être proportionnellement faible. Par exemple, pour une taille de bulle de 50 µm de diamètre, le diamètre de pointe devrait être de 30 µm.

Une fois le CBB avait formé, les molécules de canal soit en solution aqueuse, soit dans les liposomes ont été spontanément insérés dans la bicouche en l’espace de quelques dizaines de minutes. Insertion des canaux a été confirmée par l’augmentation progressive de l’amplitude du courant (Figure 7) sous le potentiel de membrane appliqué. La plus petite zone de la membrane (< 1 000 µm2) par rapport à celle dans les classique PLB et DIB systèmes a considérablement amélioré le ratio signal-bruit électrique.

Enregistrements actuels pourraient se poursuivre jusqu'à ce que la membrane a été perturbée et a fusionné les deux bulles. Nouvelles bulles ont été soufflées et le CBB formé immédiatement et de manière répétée. La pipette peut être utilisée à plusieurs reprises dans une journée.

Duty cycle d’attacher et détacher. Une bicouche formée par la méthode CBB peut être désintégrée en deux monocouches. Attachement-détachement du CBB peut être répété en manipulant les deux bulles (facteur de marche de detach-attach). Ce processus a été suivi par l’apparition de l’actuel canal du pTB, un canal de peptide d’une éponge marine, tel qu’il était facilement inséré dans la bicouche lipidique pour former un pore sélective des cations monovalents52,56. Le canal de pTB actuel est apparu immédiatement après y attacher les deux monocouches, et le courant s’est agrandi sous la surface de contact augmenté (Figure 8). L’amplitude du courant a été synchronisé avec le détacher-fixer la manipulation du CBB.

Monocanal mensurations du canal KcsA. Le canal potassique KcsA est activé par un pH intracellulaire acide57sensible, au pH. Ainsi, la solution d’électrolyte a été fixée à asymétrique58,,du5960. À l’étape 4.2 de formation CBB, la solution de la pipette du côté gauche a été fixée à pH 4, alors que celle de droite a été fixé à pH 7.5,25. À l’étape 4.7.1, une suspension protéoliposomes, plutôt qu’une suspension de liposomes, a été placée sur le verre de diapositive pour aspiration dans la pipette de gauche. Par conséquent, le canal de KcsA était orienté dans la membrane avec son domaine cytoplasmique face à la bulle gauche. Liposomes avec la protéine : poids de lipides 1 : 2000 conviennent à canal unique enregistrement actuel et ceux avec un 01:10 ratio sont pour l’enregistrement courant macroscopique.

Membrane asymétrique. Une bicouche lipidique asymétrique peut être formé à l’aide des suspensions de liposome différent pour chaque bulle (lipides-en)15,32. L’orientation du chenal KcsA dans la membrane a été réglementée en définissant un pH de la solution asymétrique (pH 4à/pH 7dehors), conduisant à son côté cytoplasmique étant vers le côté gauche. Par conséquent, le côté gauche a été affecté comme « in », alors que la droite a été affectée comme « out ». Pour examiner la dépendance de lipides sur le blocage du canal KcsA, quatre types de CBB (y compris une CBB asymétrique) ont été utilisées ; nommément, PGdans/PGdehors, PGdans/PCsur, PCdans/PGàet PCen/PCsur (PG : phosphatidylglycérol) (Figure 9). Le canal KcsA exposées haute probabilité d’ouverture (> 90 %) que dans le PGen/PGdehors et PGdans/PCdes membranes. Le canal KcsA nécessite l’existence des phospholipides anioniques dans le feuillet interne de la membrane pour une haute probabilité d’ouverture26.

Figure 1
Figure 1 : Méthodes de bicouche et patch-clamp de lipides. Diverses méthodes ont été développées pour former la bicouche lipidique. (A) méthode de Patch clamp. (B) méthode bicouches lipidiques planes classiques qui fournit une bicouche autoportantes, principalement verticale, sur un petit trou. Méthode de pointe creux (C). Une monocouche à l’interface air-eau est placée à l’extrémité d’une électrode de verre. Diverses modifications ont été développées. D méthode de gouttelettes interface bicouche. (E) méthode de bulle contact de bicouche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 2
Figure 2 : Communiquer avec formation de bulles bicouche. Comme une bulle est soufflée dans une phase huileuse, les molécules lipidiques transfert spontanément à l’interface eau-huile. Différents types de lipides comme les liposomes sont inclus dans chaque bulle (lipides-en), et monocouches sont formés exclusivement par les lipides pertinents. Station d’accueil deux monocouches génère une membrane asymétrique bicouche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 3
Figure 3 : Distinct des phases dans la bicouche de contacter bulle et la dynamique des lipides qui y sont. Bordant la bulle de lipides constituent une phase où ils appartiennent à une monocouche ou une bicouche. Flip-flop des lipides à travers la bicouche est rare, et la membrane asymétrique est conservée pendant une longue période. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 4
Figure 4 : Fournir des lipides avec la méthode de lipides ou de lipides-en. Les lipides sont ajoutés dans un solvant organique (lipides-sort ; A et C) ou en solution aqueuse comme liposomes (lipides-en ; B et D). Dans la méthode lipidique, une membrane asymétrique est formée. Substances formant des canaux qui sont solubles en solution aqueuse (bleue), tels que des peptides, sont ajoutés dans l’une des bulles et spontanément insérées dans la bicouche. Dans la méthode lipidique, une partie des canaux est insérée dans des liposomes, qui sont ensuite fusionnées à la bicouche. Les protéines de canal (rouge) sont reconstituées dans des liposomes dans la méthode lipide-out ou en lipides, qui sont ensuite ajoutés dans l’une des bulles et spontanément fusionnée à la bicouche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 5
Figure 5 : Formation et image microscopique du contact bubble bicouche. On observe la bicouche venant d’une direction tangentielle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 6
Figure 6 : Observation de la bicouche pour mesurer les superficies bicouche. Deux bulles sont empilés les uns sur les autres par le biais de manipulation de la pipette, et le microscope se concentre au niveau de la bicouche de contacter bulle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 7
Figure 7 : Insertion progressive du canal KcsA dans la membrane bi-couche contacter bulle. Le mutant E71A du canal KcsA permettait d’afficher la détection immédiate des canaux insérés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 8
Figure 8 : Détachement d’attachement des monocouches et des réponses des canaux. Un canal de peptide, polytheonamide B, a été ajouté dans l’une des bulles, qui était alors spontanément incorporé dans la membrane. Lorsque détachée, canaux dans la membrane se sont retirés mais ont été retenus à la brochure de la membrane du côté canal-ajouté. Après fixation, les canaux ont été insérés dans la membrane. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 9
Figure 9 : La formation d’une activité asymétrique de membrane et canal dépend de la composition de la brochure. Le canal KcsA est réglementé par les lipides acides, tels que PG, dans le feuillet interne de la membrane. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

PLB classique Patch de liposome DIB CBB
Taux de réussite1 haute faible très haute très haute
Réadaptabilité immédiate2 Oui aucune intermédiaire Oui
Membrane asymétrique Oui aucune Oui Oui
Échange de solution lente très rapide lente rapide
Rapport S/B3 faible haute faible haute
Déformation de la membrane aucune aucune aucune Oui4
Manipulation mécanique aucune Oui5 Oui Oui
Perfusion de membrane aucune aucune Oui Oui
Compositions lipidiques divers limitée6 divers divers
1 Le taux de réussite de formation stable lipidique par procès.
2 Formation d’une nouvelle membrane rapidement après la pause d’une membrane. En outre, membrane est formée à plusieurs reprises.
3 Le rapport de signal-bruit (S/N) représente le primaire de bruit de fond électrique produit de la capacité de la membrane.
4 Membrane concave ou convexe peut être formé en appliquant une pression intérieure différente entre deux bulles.
5 Qu’augmenter la tension de la membrane.
6 Les phospholipides qui forment des vésicules unilamellaires géant sont applicables, mais le sceau de giga puisse ne pas être réalisée.

Tableau 1 : Caractéristiques des diverses membranes de bicouche lipidique.

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Discussion

La méthode CBB de formation de bicouche lipidique est basée sur le principe d’une goutte d’eau dans l’huile bordée par une monocouche20. Techniquement, les procédures de formation CBBs sont faciles, surtout pour les chercheurs de patch clamp, qui sont compétents dans la manipulation des micropipettes de verre. La configuration électrophysiologique pour le patch clamp d’est facilement utilisée du CBB lors de deux manipulateurs de pipette avec microinjectors sont disponibles. D’autre part, parce que CBB est un successeur de la PLB classique, pour lesquelles une grande quantité de connaissances physico-chimiques a été accumulé8, cet arrière-plan ainsi que connaissance de la chimie de surface38 est utile pour le fonctionnement et manipulant la VEB. Le CBB sert une plate-forme polyvalente pour étudiant les interactions canal-membrane grâce à sa capacité de modifier la composition chimique et physique statut61. Dans le Canadian Black Book, lipides tapissant la bulle peuvent se diffuser librement à travers la frontière de la phase de monocouche et du feuillet de la bicouche, et nous avons développé des techniques tels que la bicouche attachement-détachement et la membrane perfusion méthodes45. Nous avons étendu CBBs pour la synthèse protéique in vitro canal, où canal synthèse a été réalisée dans la bulle, et protéines nouvellement synthétisées de canal ont été soumis à un transfert spontané à la bicouche sous l’application d’un potentiel membranaire où les fonctions de chaîne naissante du canal KcsA a été retracée depuis le moment de faire la transcription/traduire d’ADN KcsA62.

Parmi les étapes du protocole, il est essentiel de maintenir la taille des bulles. Les bulles peuvent lentement gonfler ou rétrécir spontanément parce que le transfert des lipides à l’interface est lente et la tension de la monocouche est sujette à changement. En particulier, la première bulle gonflée juste après que l’aspiration de la solution de liposome (étapes 4.8.3 et 4.10) est difficile à maintenir car la tension de la monocouche est abaissée par les liposomes accumulée à l’extrémité de la pipette. Jeter les bulles initiales et la formation subséquente des bulles fournir du CBB stable. Le suivi visuel de la taille des bulles et un réglage de la pression sont nécessaires.

Il y a des limitations expérimentales à la méthode CBB. Bien que le CBB est conçu pour des mesures électrophysiologiques, la résistance électrique de la bicouche pour certaines compositions lipidiques ne peut-être pas assez élevé (p. ex., GΩ 100) pour les enregistrements monocanal. Par exemple, dioléoyl phosphatidylcholine est fréquemment utilisée pour les liposomes, mais il forme CBBs électriquement qui fuites à 25 ° C,63. CBBs ne peut pas même se former avec des espèces de lipides dont température de transition de phase est supérieure à la température de l’enregistrement. En effet, CBB formation était difficile avec dipalmitoylphosphatidylcholine à température ambiante, mais augmentant la température au-dessus de Tm contourné le problème64. Dans ces expériences, la température était contrôlée à l’aide d’une plaque transparente de chaleur (voir la Table des matières) sous la lame de verre62. La température de transition de phase de la phosphatidylcholine diphytanoyl de lipides fréquemment utilisée est inférieure à 0 ° C, 65et CBBs sont facilement formé32,45,51 à une gamme de température large.

Phospholipides de l’interface eau-huile sont fournis de la méthode de lipides ou de lipides, où le taux de transfert est relativement plus lent dans le lipide-out que dans la méthode lipide-in63. En outre, pour des raisons inconnues, la résistance électrique de la membrane bicouche est relativement plus petite avec la méthode de lipide-out qu’avec la méthode lipidique.

Dans le protocole (étape 4.8), une solution de liposomes et canal-reconstituée liposomes (1 µL) est chargée à partir de l’extrémité de la pipette (étapes 4.9 et 4.10), et le reste de la pipette contient la solution d’électrolyte préalablement rempli. Il s’agit simplement de la conservation de matériaux, tels que les lipides et les molécules de canal. En conséquence, les liposomes diffusent progressivement vers la solution de la pipette supérieur, et après un certain temps, la concentration de lipides à l’extrémité de la pipette devient insuffisante pour les monocouches de lipides de forme. Dans ce cas, solution de liposome frais devrait être aspirée de la pointe (étape 4.8). Ce changement de concentration temporelle peut être contourné quand la pipette entier est remplie de la solution contenant des lipides et des molécules de canal, tandis que les liposomes s’installent progressivement dans les bulles. Dans ce cas, les bulles sont renouvelés.

Électrophysiologique, la taille CBB est supérieure à celle de la pince de patch, donnant ainsi une plus grande capacité de membrane. Cependant, la résistance en série (la résistance électrique d’une série de résistance de la membrane) est beaucoup moins que pour le patch clamp (pipette résistance > 1 MΩ), de qui accélère la vitesse de la pince de tension et atténue le bruit de fond (~ 100 kΩ) et erreurs de résistance série dans la membrane de voltage clamp potentiels66,67,68. Le bruit de fond est fonction de la capacité de la membrane et la résistance série, où une résistance faible série vient compléter une capacité élevée membrane, résultant en bruit de fond faible9.

En règle générale d’expériences de bicouche lipidique, détergents ne devraient pas servir à laver la verrerie. Même une quantité trace de détergent perturbe l’intégrité de la bicouche. Solvants organiques tels que le chloroforme/méthanol et l’éthanol doivent servir à des fins de nettoyage à la place.

Dans l’ensemble, la CBB intègre les avantages de la pince de patch (par exemple, la manipulation mécanique de la membrane) et de la BLP (p. ex., la capacité de modifier la composition lipidique de la membrane). Divers types de substances formant le chenal et les protéines de canal ont été étudiés52,53,,du6970. Le développement de cette méthode est opportun car plus en plus de chercheurs mettent l’accent sur l’interaction de canal-membrane et CBB fournit une plateforme polyvalente pour diverses expériences. Outre les développements expérimentaux dans la méthode CBB sont attendus.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiens à remercier Mariko Yamatake et Masako Takashima pour l’assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par KAKENHI subvention numéros 16H 00759 et 17 H 04017 (SO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

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Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

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