Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Burada, bir kişi kabarcık bilayer yöntemiyle lipid bilayers oluşumu için bir iletişim kuralı mevcut. Mademki bir monolayer su-yağ arayüzü oluşan organik bir çözücü içine su balonu patladı. İki pipetler bir bilayer oluşturmak için ve baloncuklar sabitlemek için manipüle edilir.

Abstract

Lipid bilayers iyon kanalları, kanal-membran etkileşimleri çeşitli membran altında incelenmesi lipit kompozisyonları sağlayan fonksiyonel çalışmalar için benzersiz bir deneysel platform sağlar. Bunlar arasında damlacık arabirimi bilayer popülerlik kazanmıştır; Ancak, büyük zar boyutu düşük elektrik arka plan gürültü kayıt engeller. Düzlemsel lipid bilayer avantajlarını birleştiren bir iletişim kabarcık bilayer (CBB) yöntemi ve lipid bileşimi değişir ve bilayer mekanik, sırasıyla işlemek olanağı gibi yama-kelepçe yöntemleri kurduk. Kurulumu geleneksel yama-kelepçe deneyler için kullanarak, deneyler CBB tabanlı kolayca gerçekleştirilebilir. Kısaca, bir cam pipet elektrolit çözümde bir organik çözücü faz (hexadecane) attı ve pipet basınç istikrarlı kabarcık boyutu elde etmek için korunur. Kabarcık kendiliğinden lipozomlar kabarcıkları üzerinden sağlanan bir lipid monolayer (saf yağlar veya karışık lipidler) ile kaplı olduğu. Daha sonra iki monolayer kaplı kabarcıklar (~ 50 µm çapında) Cam pipetler ucundaki bilayer oluşumu için yerleştirilmiş. Kanal yeniden düzenlendi lipozomlar giriş kabarcık içine bırakmak için tek kanallı geçerli kaydı bir sinyal-gürültü oranı ile yama-kelepçe kayıtları karşılaştırılabilir bilayer kanallarında birleşme yol açar. CBBs bir asimetrik lipid bileşimi ile kolayca meydana gelir. CBB art arda önceki kabarcıklar üfleme ve yenilerini şekillendirme yenilenir. (Örneğin, membran perfüzyon ve bilayer gerginlik) çeşitli kimyasal ve fiziksel tedirginlikler CBBs. İşbu üzerinde empoze edilebilir, biz temel yordamı CBB oluşumu için mevcut.

Introduction

İyon kanalları, hücre zarının sadece destekleyici bir malzeme ama bir ortak iyon akı üretmek için değildir. İşlevsel olarak, membran hangi iyon kanalları katıştırılmış bir elektrik yalıtkan ve tüm hücre zarlarında istirahat membran potansiyeli ile öğretilir olmasıdır. Geleneksel olarak, rasgele bir membran potansiyel bir dış devre hangi kanallardan elektrik akımı ölçüldü getirilmedi. İyon akı farklı membran potansiyeli, bu kantitatif değerlendirilmesi iyon-seçici nüfuz ve gating işlevleri1,2gibi bu kanallar moleküler özelliklerini ortaya koymuştur. Membran için iyon kanallarının fonksiyonel çalışmalar hücre zarı veya lipid bilayer membran bir platformdur. Tarihsel olarak, tek kanallı elektrik geçerli kayıtları ilk lipid bilayers3,4' te gerçekleştirilen ve ilgili teknikleri (Şekil 1A yama-kelepçe yöntemi gibi hücre zarı için geliştirilmiştir )5,6. O zamandan beri bu iki teknik ayrı ayrı farklı amaçlar (Şekil 1)7,8için evrim geçirmiş.

Membran lipidler ve bilayer membranlar araştırma yapısı ve fonksiyonu kanal proteinlerin desteklemedeki rollerini için odak noktası şu anda vardır. Bu nedenle, hazır bilayers lipid bileşiminde değişir yöntemlerden yüksek talep olduğunu. Lipid bilayer oluşumu yöntemleri düzlemsel lipid bilayer (PLB)8,9,10,11, petrol su damlacığı bilayer12ve damlacık arabirimi bilayer (DIB)13, gibi 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikleri (Şekil 1) altında lipit kompozisyonları20farklı kanal işlevi incelenmesi için bir fırsat sağlayan ortak seçeneklerdir. DIB geleneksel PLB üretmek Teknik olarak çok daha kolay olsa da, DIB büyük boy tek kanallı geçerli kayıtları her zamanki ölçekli gürültülerinden ile çalışmak için uygulamak yama-clampers için bir engel oluşturmuştur (< 100 pS).

Arka plan gürültü sorunu çözecek, bilayer alan indirilmelidir. Bu sorun tekrarlar için lipid bilayers (Şekil 1) elektrofizyolojik teknikleri gelişmekte olan tarihin hatırlıyor. İlk günlerde, bir pipet (İpucu daldırma yöntemi; ucunda bir küçük boyutlu bilayer (çapı 1-30 µm) kuruldu Resim 1 C) 21 , 22 , 23kullanmak yerine, bir müstakil bilayer (çapı ~ 100 µm) (resim 1B) bir odasında bir hidrofobik septum üzerinde. Çok alt arka plan gürültü24ile elektriksel ölçümler için izin ucu daldırma yöntemi. Tecrübelerimizi PLB25,26, ucu daldırma22,23,27ve yama-kelepçe28,29,30, 31 yöntemleri bize petrol su bilayer ilkeleri kullanarak lipid bilayers oluşturan bir fikir yol açtı. Bu kişi kabarcık bilayer (CBB) yöntemi20,32atıfta bulunmuşlardır. Bu yöntemde, petrol aşamasında (Şekil 1D), su damlaları asılı yerine su balonu Cam Pipet (ile uç çapı yaklaşık 30 µm) üzerinden petrol faz (Şekil 1E ve 2), nereye attı kabarcık sabit bir basınç uygulayarak korunur. Kabarcık bir monolayer formları kendiliğinden vasıl yüzey su-yağ arayüzey. Sonra iki kabarcıklar iki Cam pipetler manipülasyonu yerleştirilmiş ve iki monolayers, bir denge bilayer alanı verimli yaklaşım olarak bilayer oluşturulur. Kabarcık boyutu (basınç holding) içi-balon basıncı ve bilayer boyutu tarafından aynı şekilde denetlenir. Bir ortalama çapı 50 µm sık sık kullanılır. Kabarcık hacmi küçük olmasına rağmen (< 100 pL), toplu elektrolit faz oluşturan microliter aralığında pipet çözüm hacmin daha büyük bağlı.

CBB yöntemi (Tablo 1) kullanmak için birçok faydası vardır. Bir lipid bilayer oluşumu Teknik olarak çeşitli lipit kompozisyonları zarı üretilebilir ve daha geleneksel katlama yöntemi33tarafından asimetrik membran daha kolay kurulan32 vardır. Bilayer mekanik olarak, sadece bir hidrostatik basınç farkı34,35ile bükülebilir geleneksel PLB aksine manipüle edilebilir. Holding basıncı değiştirerek, baloncuklar genişletmek ya da daraltmak, artan veya azalan membran gerginlik-32önde gelen. Bilayer içine monolayers, membran morfolojik çalışmalarda, donma-kırık tekniği36,37 benzer mekanik olarak ayrılabilir ama CBB ile ayırma ve iliştirme döngüleri32 tekrarlanan bir manevra sağlar . Ve kanal kayıtları alma ihtimali çok geleneksel PLB tekniği ile daha yüksek kanal yeniden düzenlendi lipozomlar verimli füzyon bilayer içine küçük hacimli balonu içinde elektrolit çözüm sağlar. Küçük kabarcık birim aynı zamanda hızlı perfüzyon (içinde ~ 20 ms) bir kez başka bir enjeksiyon sağlar. pipet ya baloncuklar eklenir. Yama-kelepçe yöntemi, aksine kırık sonra bir CBB membran hemen ve art arda yeniden oluşturulur ve pipetler günde birkaç kez kullanılabilir. Yarar-in belgili tanımlık yama-kelepçe ve PLB yöntemleri entegre ederek, CBB membran, fizikokimyasal şartları değiştirmek için çok yönlü bir platform kanal-membran etkileşimleri benzeri görülmemiş çalışmaları için izin sağlar.

CBB oluşumu işleminin ayrıntılı bir protokol sunmadan önce bilayer oluşumu fizikokimyasal arka plan membran oluşumu ile ilgili deneysel zorlukları gidermek yama-clampers için yardımcı olacaktır ilk sunulur Bu karşılaşılmaktadır.

CBB deneyler yüzey kimyası bilim38dersleri vermek. CBB sabun köpüğü nerede aynı şekilde, bir su balonu organik bir çözücü attı havaya, pipet havaya benzer. Bir membran lipidler su balonu veya organik çözücü dahil değildir zaman su balonu pek şişirilmiş fark edeceksiniz. Amfipatik lipidler yokluğunda bir su-yağ arabirimi, yüzey gerilimi yüksek ve bir balon üfleme için Intra-balon basıncı yüksek olacaktır. Bu bir Laplace denklemi hayata geçirilmesidir (ΔP 2 γ/nerede ΔP içi-balon basıncı, γ olduğunu yüzey gerilimi ise R kabarcık yarıçapı R, =). Lipidler konsantrasyonu Organik faz veya elektrolit çözüm yüksek olduğunda, lipitler monolayer yoğunluğu, Gibbs adsorpsiyon İzoterm tarafından dikte edildiği gibi artar (-dγ = Γben yüzey aşırı nerede Γben dµben, Ben veben µ bileşiktir bileşen kimyasal potansiyel ben)39önde gelen bir alt yüzey gerilimi ve kabarcık oluşumu kolaylığı,. CBB bilayer bir teğet açı (Şekil 2) gözlenebilir ve ölçülebilir monolayer ve bilayer arasında iletişim açıdır. Bu açıyı monolayer surface tensions ve bilayer arasında bir denge ifade eder (genç denklem: γbı γmo cos(θ), nerede γbı var bilayer gerginlik, γmo monolayer gerilim ise θ temas açısı =). Monolayer gerginlik temas açısı değişikliklerden membran potansiyel bir fonksiyonu olarak değerlendirilir verilen bu değişiklikler bilayer gerginlik temas açısı değişimler gösterir (genç-Lippmann denklem: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), nerede Cm şey zar kapasitans, V potansiyel membran ve θ0 ve θv 0 ve V mV, iletişim açılarla sırasıyla)40,41 ,42. İki kabarcıklar yeterince yakın olduğunda, onlar birbirlerini kendiliğinden yaklaşım. Bu van der Waals kuvvetleri nedeniyle ve görsel olarak CBB oluşumu dinamik bu süreçte gözlemleyebilirsiniz.

CBB sistem ayrı aşamadan oluşmaktadır: Yani, bir toplu petrol aşamasında, su kabarcıkları bir monolayer ve ekibine ulaşarak bilayer (Şekil 3) ile kaplı. Birden fazla aşama çözücü içeren simit bilayer faz ve bir ince organik faz tarafından iki monolayers43,44sandviç gibi bir PLB gözlenen anımsatan bunlar. CBB monolayer aşamasıdır bilayer broşür ile sürekli ve lipid molekülleri kolayca monolayer ve broşür arasında yaygın. Monolayer faz lipid su deposu olarak hizmet vermektedir büyük aşama oluşturan kabarcık yüzeyinin en kapsar. Çünkü monolayer lipidler hidrofobik kuyruğunun dışa toplu petrol aşamaya uzanır, bilayer iç veya hidrofobik çekirdeğin toplu petrol aşamaya açar. Böylece, bilayer yakın yağ fazına enjekte bir hidrofobik kolayca bilayer iç erişmeye devam edebilirsiniz bir maddedir. Son zamanlarda hangi bilayer lipid bileşiminde hızla (bir saniye içerisinde) tek kanallı geçerli kayıtları sırasında değiştirilir45, gelişen membran perfüzyon tekniğidir. Bilayer kolesterol içeriği geri dönülebilir olarak kolesterol perfüzyon ve45kapalı geçiş yaparak denetlenebilecek olduğunu bulduk. Monolayer ve bilayer ilgili madde konsantrasyonu farklı olay nedeniyle ilgili maddenin konsantrasyon gradyanı hemen Marangoni etkisi46, bilinen difüzyon tasfiye edilir 47. öte yandan, parmak arası terlik monolayers arasında yavaş48,49,50vardır.

CBB yöntemini kullanarak, bilayer 1 düşük bir elektrolit pH gibi çok yönlü fizikokimyasal koşullarda oluşturulur 51, 3 M kadar tuz (K+, Na+, vb) konsantrasyon, bir membran potansiyeli ±400 mV yüksek ve bir sistem ilâ 60 ° c sıcaklık

Orada CBB oluşumu için çeşitli seçenekler ve kanal moleküllerin birleşme orada. Su-yağ arayüzüne monolayer oluşumu için lipitler ya da organik bir çözücü (lipit-out yöntemi; eklenir Şekil 4 A, 4 C) veya bir kabarcık olarak lipozomlar (lipit-Yöntem; Şekil 4 B, 4 D). Özellikle, lipid Yöntem asimetrik membran15,32oluşumu için sağlar. Oysa kanal proteinlerin içine yeniden kanal molekülleri sulu çözüm (Örneğin, kanal oluşturmayan peptidler) çözünür doğrudan kabarcık (Şekil 4A, B)52,53, eklenir lipozomlar, o zaman (Şekil 4C, D) kabarcık eklenir. Burada, CBBs oluşumu için ya bir kanal peptid (polytheonamide B (pTB); lipid yöntemi ile Şekil 4 A) veya bir protein (KcsA Potasyum kanal, Şekil 4C) gösterilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. lipozomlar hazırlayın

  1. Fosfolipitler (Örneğin, 10 mg toz) (Örneğin, 10 mg/mL) istenen bir konsantrasyon, kloroform dağıtmak.
  2. Kloroform buharlaşır.
    1. Rotary Evaporatör üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek) N2 gaz silindir bağlı bir yuvarlak alt şişesi ve fosfolipid çözümde bir yer. Bir ince fosfolipid film (~ 30 dakika sonra) görünene kadar şişesi N2 akışı oda sıcaklığında altında döndürün.
    2. Bir vakum pompası bağlı bir desiccator içine açık şişeye koyun. Vakum Pompası kullanarak, iyice kloroform kaldırmak için desiccator birkaç saat içine Aspire edin.
  3. Elektrolit çözümünü uygun bir hacmi için balonun ekleyin ve 2 mg/mL fosfolipid süspansiyon elde etmek için fosfolipid askıya alma.
  4. Süspansiyon saniye bir banyo sonicator kullanarak birkaç on için solüsyon içeren temizleyicide (çok katmanlı vezikül (MLV) süspansiyon elde etmek için Malzemeler tablobkz:).
  5. İyon kanal protein içeren proteoliposomes hazırlanması için bir protein çözüm eklemek (uygun deterjanlar; kullanarak çözündürüldükten proteinler ile % 2 maksimum birimdir) MLV süspansiyon için ve banyo sonicator kullanarak birkaç saniye için solüsyon içeren temizleyicide.

2. büyük delik Cam pipetler hazırlayın

  1. Bir cam bir pipet çektirmenin kapiller ayarla ve Mikropipetler iki aşamalı çekerek ile iyi bir konik uç ile imal.
  2. Micropipette bir microforge ayarla ve konik kısmında bir platin filaman için micropipette ucu çapı 30-50 µm ile bağlantı kurun.
  3. Filaman kısaca ısı (5 s) ve hemen kapatmak.
    Not: Bu manipülasyon formlar bir çatlak Isıtma, Gelin, micropipette ucu kesilir, geniş bir delik çapı 30-50 µm ile bırakarak sayede.

3. tedavi cam kaymak ile sığ bir içbükey kuyu (su itici bitirmek için Siliconization) yüzeyine

  1. Distile su ve etanol ile sığ kuyu ile cam slayt yüzeyini temizlemek.
  2. Bir uygun birimi (Örneğin, 100 µL) delik slayt cam üzerine bir siliconizing reaktifi (su itici) uygulanır.
  3. Reaktif havadaki tamamen kuru.
  4. Cam slayt ters bir mikroskop sahnesinde yerini.

4. form CBB ve elektrofizyolojik ölçüm yapmak

  1. Hexadecane 100 µL silikonlu delik slayt cam sığ kuyunun içine ekleyin.
    Not: lipid-out yöntemi için fosfolipitler hexadecane (20 mg/mL) önceden dağılmış.
  2. Elektrolit çözüm tüberkülin şırınga kullanarak micropipette, yarı uzunluk için doldur.
  3. Pipet elektrolit çözüm içine emmek için Ag/AgCl tel elektrot izin micropipette tutucu bir bağlantı noktasıyla basınç, üzerine micropipette ayarlayın.
  4. Micropipette sahipleri birini bir yama-kelepçe amplifikatör ve diğeri elektrik yere baş aşaması bağlayın.
  5. Bir microinjector micropipette sahibi basınç bağlantı noktasına bağlayın.
  6. Micropipette micromanipulator işleyerek ters bir mikroskop sahne alanı üzerinde uygun bir konuma ayarlayın.
  7. Elektrot uzaklığını potansiyel ayarlama.
    1. Yer 1 µL düz yüzeye bir elektrolit kubbe oluşturma delik slayt cam sığ kuyu etrafında micropipette doldurmak için kullanılan aynı elektrolit çözüm.
    2. Her iki Mikropipetler ucu micromanipulator işleyerek elektrolit kubbe emmek.
    3. Yama-kelepçe amplifikatör elektrot mahsup potansiyelini ayarlayın.
    4. Deney sonunda doğru ofset CBB kırarak onaylamak kullanma yüksek membran potansiyel yolu ile (elektriksel delinme; Zap üzerinde amplifikatör kullanarak), bir (kabarcık füzyon) içine erimiş için iki neden kabarcıklar.
    5. Öyle ki potansiyel gerçek membran için potansiyel uygulanan membran hesaplanan değer eklenir asimetrik elektrolit çözümleri kullanıldığı durumlarda sıvı kavşak potansiyel54 düzeltin.
      Not: Sıvı kavşak potansiyel JPCalc55programı kullanılarak hesaplanır.
  8. Lipozom çözüm ucundan çizin.
    Not: suda çözünen kanalları lipid-out yöntemi kullanılarak incelendiğinde, lipozom çözümü emme gerekli değildir.
    1. Lipozom çözüm 1 µL delik slayt cam (kubbe lipozom içeren) sığ kuyu etrafında düz bir yüzeye yerleştirin.
    2. Micromanipulator işlemek ve micropipette ucu lipozom içeren kubbe yerleştirin.
    3. Lipozom içeren çözüm microinjector kullanarak micropipette tutucu içinde basıncı düşürerek Aspire edin.
    4. Diğer pipet için yordamı yineleyin.
  9. Micromanipulator işlemek ve sığ kuyu içinde hexadecane içine micropipette ucu daldırma.
  10. Su balonu yavaşça kabarcık (Örneğin, çapı 50 µm) istediğiniz boyuta ulaşıncaya kadar basıncı artırarak darbe ve bundan sonra aynı basınç korumak.
  11. Baloncuklar baloncuklar boyutunu sabit tutmak zor ise yağ-hava arabirimi aracılığıyla ucu geçirerek atmak.
  12. İstikrarlı kabarcıklar oluşur 4,8-4,9 tamamlayana dek.
  13. Onları (Şekil 5) arasında temas izin için ve baloncuklar işlemek.
    Not: Bazen, baloncuklar birbirlerine kendiliğinden CBB oluşturmak için yaklaşım. Aksi durumda, baloncuklar yakındır ama her diğer iletişim kurabilirim. Bu durumda, baloncuklar birbirlerine mekanik olarak itin.
  14. Boyut yavaş yavaş bile sürekli Intra-balon basınçta değiştirmek için basınç kabarcık boyutu korumak için ince ayar yapın.
  15. Membran potansiyeli yama-kelepçe amplifikatör kullanarak uygun değere ayarlayın ve (Şekil 6) ortaya geçerli kanal için bekleyin.

5. ölçü Bilayer kapasite

  1. Bilayer elektrik kapasite (Cel) bir rampa potansiyel uygulayarak ölçmek.
    Not: rampa Komuttaki gerilim değişim oranı 10 mV/10 ms (veya 1 V/s)-10 mV/10 ms tarafından takip olduğunda, geçerli atlamayı yamaç değişimler üzerine genliğini (Örneğin membrane'scapacitance değer okumak için karşılık gelen 100 pA → 100 pF).
  2. Bilayer alan iki değerlendirmek baloncuklar bir diğer yığılmış ve mikroskop bilayer (Şekil 6) kenarına görüntülemek üzere bilayer düzeyinde odaklanmak.
    Not: Bilayer şekil çoğunlukla yuvarlaktır ve alan RADIUS hesaplanır.
  3. Bilayer alanına göre elektrik kapasite bölerek belirli membran kapasite (Csp) hesaplamak (Csp Cel/A =).
  4. Bilayer kalınlığı (hidrofobik çekirdeğin kalınlığı) hesaplamak Dc kullanarak (nerede εr ve ε0 temsil bilayer hidrofobik bölgesinin geçirgenlik ve geçirgenlik (εrε0) /Csp = bir vakum, sırasıyla).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tipik bir CBB çapı 50 µm (Şekil 56) ve hexadecane belirli membran kapasitans 0.65 µF/cm2. Kabarcık boyutu keyfi içi-balon basıncı tarafından kontrol ediliyordu. Küçük kabarcıklar düşük gürültü kayıtları için gerekli olduğunda, uç çapı buna küçük olmalıdır. Örneğin, çapı 50 µm kabarcık boyutunun için uç çapı 30 µm olması gerekir.

CBB oluşmuş bir kez kanal molekülleri sulu çözüm veya lipozom kendiliğinden bilayer birkaç dakika onlarca yayılımı içinde içine yerleştirildi. Kanal ekleme potansiyel uygulanan membran altında geçerli genlik (Şekil 7) kademeli bir artış tarafından doğrulandı. Daha küçük membran alanı (< 1000 µm2) geleneksel PLB ve DIB göre sistemleri önemli ölçüde Elektrik sinyal-gürültü oranı geliştirilmiş.

Geçerli kayıtları membran kesilmiş ve birleştirilmiş iki kabarcıklar kadar devam. Yeni kabarcıklar üflenir edildi ve CBB hemen ve tekrar tekrar kurdu. Pipet art arda bir gün içinde kullanılabilir.

Görev eklemek döngüsü ve bağlantısını kesin. CBB yöntemi tarafından kurulan bir bilayer iki monolayers parçalanmış. Ayırma-iliştirme CBB, iki kabarcıklar (detach-attach iş hacmi) manipüle ederek tekrar edilebilir. Kolayca monovalent katyon seçici gözenek52,56oluşturmak için lipid bilayer eklendiği şekliyle bu işlem pTB, bir deniz süngeri, peptid kanaldan kanal mevcut görünümünü tarafından izlenen. PTB kanal geçerli hemen iki monolayers ekledikten sonra ortaya çıkan ve mevcut artan iletişim (Şekil 8) alanı olarak daha büyük oldu. Geçerli genliği ile detach eşitlendi-CBB manipülasyon iliştirin.

KcsA kanal tek kanallı ölçümleri. KcsA potasyum kanalıdır pH hassas, asidik hücre içi pH57tarafından aktive ediliyor. Böylece, elektrolit çözüm asimetrik58,59,60olarak ayarlandı. Bu sağ tarafındaki pH 7.525, kuruldu, ancak CBB oluşumu adım 4.2, sol tarafta pipet çözüm pH 4, ayarlandı. 4.7.1. adımda bir proteoliposome süspansiyon yerine, lipozom süspansiyon, sol pipet içine aspirasyon için slayt cam üzerine yerleştirildi. Buna göre KcsA kanal içinde membran sol kabarcık karşı karşıya sitoplazmik etki ile odaklı. 1:2000 protein: lipid ağırlığı oranında lipozomlar tek kanallı geçerli kayıt ve bir 1:10 oranı vardır makroskopik geçerli kayıt için olanlar için uygundur.

Asimetrik membran. Asimetrik lipid bilayer farklı lipozom süspansiyonlar için her kabarcık (lipit-gelen)15,32kullanarak oluşturulabilir. Membran KcsA kanalda yönünü onun sitoplazmik yan Sol tarafa doğru olmak için önde gelen bir asimetrik çözüm pH (pH 4içinde/pH 7dışarı), ayarlayarak düzenlenmiş. Sağ tarafındaki "out" atandı, ancak buna göre sol tarafta "," atanır yapıldı. Lipid bağımlılığı KcsA kanal geçişi üzerinde incelemek için dört tür CBB (asimetrik bir CBB dahil) kullanılmıştır; Yani, PG,/PGdışarı, PGiçinde/adetdışarı, PCiçinde/PGdışarıve PCiçinde/adetdışarı (PG: phosphatidylglycerol) (Şekil 9). KcsA kanal yüksek açık olasılık sergilenen (> % 90) PGiçinde/PGdışarı ve PG/adetiçindedışarı membranlar. KcsA kanal yüksek açık olasılık26için membran iç kitapcıktaki Anyonik fosfolipitler varlığını gerektirir.

Figure 1
Resim 1 : Lipid bilayer ve yama-kelepçe yöntemleri. Lipid bilayer şekillendirme için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. (A) yama-kelepçe yöntemi. (B) müstakil, çoğunlukla dikey bilayer üzerinde küçük bir delik sağlar geleneksel düzlemsel lipid bilayer yöntemi. (C) ucu daldırma yöntemi. Bir monolayer hava-su arayüz cam elektrot ucunu üzerine yerleştirilir. Çeşitli değişiklikler geliştirdik. (D) damlacık arabirim bilayer yöntemi. (E) iletişim kabarcık bilayer yöntemi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 2
Resim 2 : Başvurun kabarcık bilayer oluşumu. Bir kabarcık bir petrol aşamasında içine attı gibi lipid molekülleri su-yağ arabirimine kendiliğinden aktarın. Lipozomlar her içerdiği gibi farklı türde lipidler (lipit-gelen) kabarcık ve monolayers sadece ilgili lipidler tarafından oluşturulur. İki monolayers yerleştirme bir asimetrik bilayer membran oluşturur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 3
Şekil 3 : DISTINCT kişi kabarcık bilayer ve lipidler dinamikleri orada aşama. Kabarcık astar lipidler bir monolayer veya bir bilayer ait oldukları bir dönem oluşturmaktadır. Lipidler bilayer genelinde Flip-flop seyrek ve asimetrik membran uzun süre korunur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 4
Şekil 4 : Lipid-out veya lipid bileşenini yöntemiyle lipidler teslim. Lipitler ya da organik bir çözücü (lipit-out; eklenir A ve C) veya sulu çözüm olarak lipozomlar (lipit-gelen; B ve D). Lipid yönteminde, bir asimetrik membran oluşur. Sulu çözüm (mavi), peptidler gibi çözünebilir kanal oluşturan maddeler baloncuklar birine eklendi ve kendiliğinden bilayer eklenmiş. Lipid yönteminde, kanalları bir parçası için bilayer sonra erimiş lipozomlar eklenir. Kanal proteinler (kırmızı) yeniden lipid-out veya lipid bileşenini yöntemi lipozomlar hangi baloncuklar birine eklenir ve kendiliğinden bilayer için erimiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 5
Şekil 5 : Oluşumu ve ilgili kişinin mikroskobik görüntü kabarcık bilayer. Bilayer teğet bir yönden görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 6
Şekil 6 : Bilayer alan ölçme bilayer gözlenmesi. İki baloncuklar bir pipet manipülasyon yoluyla diğer üzerine dizilir ve mikroskop kişi kabarcık bilayer düzeyinde odaklanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 7
Şekil 7 : Kademeli KcsA kanal ekleme iletişim kabarcık bilayer membran. KcsA kanal E71A mutant eklenen kanalları anında algılanması göstermek için kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 8
Şekil 8 : Monolayers ve kanal yanıtlarının Detach ekleme. Bir peptid kanal, polytheonamide B, sonra kendiliğinden membran dahil oldu baloncuklar birinin içine eklendi. Müstakil zaman kanal zarda çekildi ancak kanal eklendi yan membran broşür korumuştur. Eki kanalları membran yerleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 9
Şekil 9 : Asimetrik membran ve kanal etkinlik broşür kompozisyon üzerinde bağımlı oluşumu. KcsA kanal membran iç kitapcıktaki PG gibi asidik lipidler tarafından düzenlenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Geleneksel PLB Lipozom yama DIB CBB
Başarı oranı1 yüksek düşük çok yüksek çok yüksek
Hemen reformability2 Evet yok ara Evet
Asimetrik membran Evet yok Evet Evet
Çözüm değişimi yavaş çok hızlı yavaş hızlı
S/N oranı3 düşük yüksek düşük yüksek
Membran deformasyon yok yok yok Evet4
Mekanik işleme yok Evet5 Evet Evet
Membran perfüzyon yok yok Evet Evet
Lipit kompozisyonları çeşitli sınırlı6 çeşitli çeşitli
1 İstikrarlı lipid bilayer deneme başına kurma başarı oranı.
2 Yeni bir membran oluşumu bir membran aradan sonra hızlı bir şekilde. Ayrıca, membran tekrar tekrar oluşur.
3 Sinyal-gürültü (S/N) oranı membran kapasitans üretilen elektrik arka plan gürültü İlköğretim temsil eder.
4 İçbükey veya bombeli membran iki kabarcıklar arasında farklı basınç uygulayarak oluşturulması mümkündür.
5 Sadece artan membran gerginlik.
6 Dev unilamellar veziküller oluşabilir fosfolipitler tabidir, ama giga-mühür değil elde edilebilir.

Tablo 1: Özellikleri çeşitli lipid bilayer membranlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CBB yöntemi lipid bilayer oluşumu monolayer20ile kaplı bir petrol su damlacığı prensibi temel alır. Teknik olarak, CBBs şekillendirme için kolay, özellikle yama-kelepçe araştırmacılar, cam Mikropipetler manipüle yetkin olan işlemlerdir. İki pipet manipülatörler microinjectors ile kullanılabilir olduğunda yama kelepçe için elektrofizyolojik Kurulumu kolayca CBB içinde kullanılır. CBB geleneksel PLB halefi olduğundan, öte yandan, fizikokimyasal bilgi büyük miktarda birikmiş8, bu arka plan gibi yüzey kimyası olduğu için38 işletim için yararlıdır ve CBBs manipüle. CBB kanal-membran interplays kimyasal ve fiziksel durumu61değiştirme kabiliyetini ile çalışmak için çok yönlü bir platform sunmaktadır. CBB kabarcık astar lipidler serbestçe monolayer faz ve bilayer broşürü sınırdan diffüz ve bilayer eklemek-ayırmak gibi gelişmiş teknikler vardır ve membran perfüzyon yöntemleri45. Biz CBBs burada kanal sentez içinde balon gerçekleştirildi ve yeni sentezlenmiş kanal proteinler bilayer uygulama potansiyel bir membran altında spontan aktarmak için tabi tutuldu vitro kanal protein sentezi için genişletilmiş var nerede doğmakta olan kanal fonksiyonları KcsA kanalının transkripsiyon/çeviri KcsA DNA62başlatılması zaman takip.

Protokol adımları arasında kabarcık boyutu korumak önemlidir. Baloncuklar yavaşça şişer veya kendiliğinden lipid transfer arabirimine yavaş ve monolayer gerginlik değiştirmek eğilimli olduğu için daraltın. Özellikle, lipozom çözüm (adım 4.8.3 ve 4.10) emme monolayer gerginlik lipozomlar tarafından indirilir çünkü korumak zor sonra şişirilmiş ilk kabarcık pipet ucunda birikmiş. İlk kabarcıklar ve baloncuklar sonraki oluşumunu atarak istikrarlı CBB sağlamak. Kabarcık boyutu görsel izleme ve baskısı ince ayar gerekli.

CBB yöntemine yapılan deneysel sınırlamalar vardır. CBB elektrofizyolojik ölçümleri için tasarlanmış olsa da, bazı lipid besteleri için bilayer elektriksel direnç olmayabilir yeterince yüksek (Örneğin, 100 GΩ) tek kanallı kayıtları için. Örneğin, dioleoyl phosphatidylcholine sık sık lipozomlar için kullanılır, ancak 25 ° C63elektrikle sızan CBBs oluşturur. CBBs bile kimin faz geçiş sıcaklığı kayıt sıcaklığıdır lipid türleri ile oluşmuş olamaz. Nitekim, CBB oluşumu ile dipalmitoyl phosphatidylcholine oda sıcaklığında zordu, ama Tm yukarıda sıcaklık yetiştirme sorunu64atlatılabilirdi. Bu deneylerde bir saydam ısı tabak kullanarak sıcaklık kontrol edildi ( Tablo malzemelerigörmek) altında slayt62cam. Sık kullanılan lipid diphytanoyl phosphatidylcholine faz geçiş sıcaklığı 0 ° C 65, ve CBBs kolayca kurulan32,45,51 , geniş sıcaklık aralığı.

Fosfolipitler su-yağ arabirim aktarım hızı nispeten daha yavaş lipid Yöntem63' te lipid-out nerede ya lipid bileşenini veya lipid-out yönteminden, sağlanır. Buna ek olarak, bilinmeyen nedenlerden dolayı elektrik bilayer membran lipid yöntemiyle daha lipid-out yöntemi ile nispeten daha küçük dirençtir.

Protokolü (adım 4.8), pipet (adım 4,9 ve 4.10) ucundan lipozomlar ve kanal yeniden düzenlendi lipozomlar (1 µL) bir çözüm yüklenir ve pipet geri kalanı daha önce doldurulmuş elektrolit çözüm içerir. Bu sadece malzemeleri, lipidler ve kanal moleküller gibi koruyucu için. Sonuç olarak, lipozomlar yavaş yavaş üst pipet çözüm doğru diffüz ve bir süre sonra pipet ucu, lipid konsantrasyon formu lipid monolayers için yetersiz hale gelir. Bu durumda, taze lipozom çözüm ucundan (adım 4.8) emişli. Lipozomlar kabarcıklar yavaş yavaş sakin ise bütün pipet lipidler ve kanal molekülleri, içeren çözüm ile dolduğunda bu zamansal konsantrasyon değişiklik atlatılabilir. Bu durumda, kabarcıklar yenilendi.

Electrophysiologically, CBB yama kelepçe, böylece daha büyük bir membran kapasitans verimli daha büyük boyutudur. Ancak, seri direnç (membran direnç bir dizi elektriksel direnç) çok (~ 100 kΩ) bunun için gerilim kelepçe hızını hızlandırır ve arka plan gürültü zayıflar yama kelepçe (pipet direnç > 1 MΩ), daha düşük ve seri direnç hataları gerilim klempe membran potansiyeli66,67,68. Arka plan gürültü bir membran kapasitans ve seri direnç nerede düşük serisi direnci düşük arka plan gürültü9' kaynaklanan bir yüksek membran kapasitans tamamlar işlevdir.

Lipid bilayer deneyler bir kural olarak, deterjanlar cam eşya yıkamak için kullanılmamalıdır. Hatta eser miktarda deterjan bilayer bütünlüğünü perturbs. Kloroform/metanol ve etanol gibi organik solventler yerine bu tür temizlik amaçlar için kullanılmalıdır.

Genel olarak, CBB yama kelepçe (Örneğin, membran mekanik manipülasyon) ve (Örneğin, membran lipid bileşimi değiştirme becerisini) PLB bütünleştirir. Kanal oluşturan maddeler ve kanal proteinler çeşitli okudu52,53,69,70olmuştur. Bu yöntem geliştirilmesi elverişli olduğu giderek daha fazla araştırmacılar kanal-membran etkileşimi üzerinde duruluyor ve CBB çeşitli deneyler için çok yönlü bir platform sağlar. Daha fazla deneysel CBB yöntemi gelişmeler bekleniyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Yazarlar Mariko Yamatake ve Masako Takashima teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser desteklenmiştir kısmen KAKENHI tarafından grant 16 H 00759 ve 17 H 04017 (SO) numaraları.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Neuroscience sayı 143 Lipid Bilayer yama kelepçe petrol su damlacığı Monolayer iyon kanal Elektrofizyoloji yüzey kimyası
Lipid Bilayer deneyler ile iletişim balonu Bilayers yama-Clampers için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter