Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Липидного бислоя эксперименты с контактной пузырь бислоев для патч фиксаторы

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Здесь мы представляем протокол для формирования липидных бислоев с помощью метода бислой контакт пузырь. Воду пузырь выдувается в среде органического растворителя, whereby монослоя образуется в интерфейсе вода масло. Два пипетки манипулируют для закрепления пузыри, чтобы сформировать бислоя.

Abstract

Липидных бислоев обеспечивают уникальный экспериментальной платформы для функциональных исследований ионных каналов, позволяя изучение взаимодействия канала мембраны под различные мембраны липидной композиции. Среди них капелька интерфейс бислой приобрел популярность; Однако размер большой мембрана препятствует запись низкой электрической фоновый шум. Мы создали контактную пузырь бислой (НБР) метод, который сочетает в себе преимущества планарных липидного бислоя и патч зажим методы, такие как способность варьировать состав липидов и манипулировать бислой механика, соответственно. С помощью установки для обычных патч зажим экспериментов, CBB-основе может быть легко эксперименты. Вкратце раствор электролита в стеклянной пипетки выдувается в органических растворителей фазу (гексадекан), и пипетки давление поддерживается для получения размер стабильным пузырька. Пузыря выстлана спонтанно липидов монослоя (чистый липидов или смешанной липидов), которая предоставляется от липосомы в пузырьки. Далее двух картонных монослоя пузыри (~ 50 мкм в диаметре) на кончике стеклянной пипетки прикрепляются для формирования бислоя. Введение восстановленный канал липосомы в пузырь приводит к включению каналов в бислой, позволяя для текущей записи Одноканальный с соотношением сигнал шум сравнима с патч зажим записей. Легко образуются общеиспользуемые с асимметричной липидный состав. CBB неоднократно обновляется путем выдува предыдущих пузыри и формирования новых. Различные химические и физические возмущения (например, мембраны перфузии и бислой напряженности) может быть наложен на общеиспользуемые. здесь, мы представляем основные процедуры для формирования CBB.

Introduction

Для ионных каналов клеточной мембраны является не просто вспомогательные материалы, но партнером для создания потока ионов. Функционально мембрана является электрических изоляторов, в которых ион внедряются каналы, и установленные с отдыха мембранного потенциала всех клеточных мембран. Условно произвольные мембранного потенциала был введен с внешней цепи, в которой была измерена электрического тока через каналы. Эта количественная оценка ионного потока на различных мембранных потенциалов выявлены молекулярные свойства этих каналов, таких как их ионоселективного проникновение и шлюзовые функций1,2. Мембрана платформа для функциональных исследований ионных каналов является клеточной мембраны или липидного бислоя мембраны. Исторически одноканальный электрические текущей записи были впервые исполнена в липидных бислоев3,4, и соответствующие методы были разработаны для клеточных мембран, например метод патч зажим (рис. 1A )5,6. С тех пор эти две технологии развивались отдельно для разных целей (рис. 1)7,8.

Бислоя мембран и мембранных липидов в настоящее время находятся в центре внимания исследований для их роли в поддержке структуры и функции белков канала. Таким образом доступность методов варьировать состав липидов в бислоев пользуется большим спросом. Липидного бислоя формирования методы, такие как Вселенский липидного бислоя (ПРБ)8,9,10,11, капельки воды в нефти бислой12и капелька интерфейс бислой (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , общий выбор, обеспечивая возможность для изучения каналов при различных липидной композиции20 19 методов (рис. 1). Хотя технически гораздо легче, чем обычные PLB DIB, большой размер DIB создала дестимулирующее воздействие на патч фиксаторы применить его для изучения текущей записи Одноканальный с обычного размера проводимости (< 100 Л.с.).

Чтобы обойти фоновый шум, области бислой должны быть минимизированы. Этот вопрос напоминает повторения истории в разработке электрофизиологических методов липидных бислоев (рис. 1). В первые дни малогабаритные бислой (1-30 мкм в диаметре) был сформирован в наконечник пипетки (Подсказка цинкования метод; Рисунок 1 C) 21 , 22 , 23, а не с помощью свободностоящая бислой (~ 100 мкм в диаметре) на гидрофобной перегородки в камере (рис. 1Б). Подсказка цинкования метод для электрических измерений с гораздо ниже фонового шума24. Наш опыт с25,26ПРБ, подсказка цинкования22,,2327и патч зажим28,29,30, 31 методы привели нас к роман идея формирования липидных бислоев, используя принципы бислой воды в нефти. Мы говорили это как контакт пузырь бислой (НБР) метод20,32. В этом методе, а не висит капли воды в масляной фазы (рис. 1D), воду пузырь выдувается из стеклянной пипетки (с наконечник диаметром около 30 мкм) в масляной фазы (Рисунок 1E и 2), где пузырь поддерживается постоянное давление. Однослойная формы самостоятельно в интерфейсе вода масло на поверхности пузыря. Затем два пузыри закреплены посредством манипулирования две стеклянные пипетки и бислой образуется два монослои приближаемся друг друга, давая площадью бислой равновесия. Размер пузыря контролируется интра пузырь давления (холдинг давления), а также размер бислоя. Часто используется средний диаметр 50 мкм. Хотя объем пузырь мал (< 100 pL), он подключен к больший объем пипетки решения, которое находится в диапазоне микролитр, составляющие основная фаза электролита.

Есть много преимуществ для использования метода CBB (Таблица 1). Как метод формирования бислой липидов мембраны различных липидной композиции могут быть изготовлены, и асимметричной мембраны являются более легко сформированные32 , чем обычные складные метод33. Бислоя могут управляться механически, в отличие от обычных ПРБ, который только может быть изогнут с гидростатического давления разница34,35. Изменяя давление Холдинг, пузырьки расширить или сжать, приводит к увеличению или уменьшению мембраны напряженности32. Бислой механически съемный в монослои, похож на замораживание перелом техника36,37 мембран в морфологических исследований, но с CBB, маневр позволяет для многократного отсоединения и присоединения циклов32 . Небольшой объем раствора электролита внутри пузыря позволяет эффективное слияние в бислой восстановленный канал липосом, и вероятность получения канала записи намного выше, чем с обычными PLB техникой. Объем маленький пузырь также позволяет быстрое перфузии (в ~ 20 мс) раз еще инъекцию пипеткой вставляется в любой из пузырьков. В отличие от метода патча зажим после сломанной, CBB мембрана вновь формируется сразу и неоднократно, и пипетки может использоваться несколько раз в день. Объединяя преимущества патч зажим и ПРБ методов, CBB обеспечивает универсальная платформа для физико-химических условий мембраны, учитывая беспрецедентный исследования взаимодействий канала мембраны.

Прежде чем представить подробный протокол процесса формирования CBB, физико-химический фон бислой формирования представлена первая, которая будет полезна для патч фиксаторы для разрешения экспериментальной трудности, связанные с формирования мембраны которые встречаются.

CBB эксперименты распространять уроки химии поверхности науки38. CBB похож на мыльный пузырь ветром из соломы в воздух, где аналогичным образом, воду пузырь выдувается в органическом растворителе. Один будет заметить, что воду пузырь надувается вряд ли когда липиды мембран не включаются в пузырь воде или органических растворителях. В отсутствие амфифильными липиды поверхностное натяжение в водно нефтяных интерфейс высок, и давление внутри пузырь для дуть пузырь будет высоким. Это реализация уравнения Лапласа (ΔP = 2 γ/R, где ΔP давление внутри пузырь, γ-это поверхностное натяжение, и R-радиус пузырь). При высокой концентрации липидов в органические фазы или раствор электролита плотность липидов в монослое увеличивается, как продиктовано изотермы адсорбции Гиббс (-dγ = Γя dµя, где это Γ,я поверхности избыток соединения и µ,я это химический потенциал компонента i)39, ведущего к нижней поверхностное натяжение и легкость формирования пузыря. CBB бислоя могут наблюдаться от тангенциальный угол (рис. 2), в угол контакта между монослоя и бислой поддается измерению. Этот угол представляет равновесие между surface tensions монослоя и бислой (молодые уравнение: γbi = γ cos(θ)МО , где γБи бислой напряженность, γМО -это однослойная напряженность, и θ угол контакта). Изменения в угол контакта указывают изменения в бислой напряженности, учитывая, что напряженность монослоя оценивается от изменений в угол контакта как функция мембранного потенциала (молодые-Lippmann уравнение: γmo = Cm V2 /4 (cos (0θ) - cos (θv)), где Cm является емкость мембраны, V мембранного потенциала, и θ0 и θv — контактные углы на 0 и В МВ, соответственно)40,41 ,42. Когда два пузырьки являются достаточно близко, они подходят друг другу спонтанно. Это объясняется ван дер Ваальса силы, и мы можем визуально наблюдать этот динамичный процесс в формировании CBB.

CBB система состоит из отдельных этапов: а именно, массовых масляной фазы, вода пузыри, покрытые монослоя и контактирующих бислой (рис. 3). Они напоминают несколько фаз, наблюдаемые в Ипр, например вокруг этапа бислоя и тонких органических фазы, зажатая двумя монослои43,44Тора, содержащих растворители. В CBB фазы монослоя непрерывный с бислой листовку, и липидные молекулы легко распространять между монослоя и листовки. Фазы монослоя охватывает большую часть поверхности пузыря, составляющих важный этап, который служит водохранилище липидов. Потому что гидрофобные хвост липидов в монослое распространяется наружу масляной фазы массового, бислой интерьер или гидрофобные core открывает масляной фазы массового. Таким образом гидрофобное вещество вводят в масляной фазы рядом бислой возможность легко получить доступ к бислой интерьер. Это техника перфузии мембраны, мы разработали недавно45, в которой состав липидов в бислой меняется быстро (в секунду) в один канал текущей записи. Мы обнаружили, что содержание холестерина в бислой может контролироваться обратимо путем переключения холестерина перфузии и выключать45. В том случае, если концентрации соответствующего вещества в монослое и бислой отличается, градиент концентрации соответствующего вещества немедленно расторгается путем диффузии, который известен как эффект Марангони46, 47. с другой стороны, Вьетнамки через монослои являются медленными48,,4950.

С помощью метода CBB, бислой формируется под универсальный физико-химических условий, таких как электролит рН, как низко как 1 51, концентрация соли (+K, Na+, и т.д.) до 3 М, мембранный потенциал как высокий как ±400 МВ и системы температуре до 60 ° C.

Есть несколько вариантов для формирования CBB и включения канала молекул нем. Для формирования монослоя на интерфейсе вода масло липиды добавляются либо в среде органического растворителя (липидов out метода; Рисунок 4 A, 4 C) или в пузырь как липосомы (липидов в метод; Рисунок 4 B, 4 D). В частности липидов в метод позволяет для формирования асимметричной мембраны15,32. Канал молекул растворим в растворе (например, канал формирование пептиды) напрямую добавляются в пузырь (рис. 4A, B)52,53, тогда как источник белков воссоздана в липосомы, которые затем добавляются в пузырь (рис. 4C, D). Здесь формирование общеиспользуемые методом липидов в для любой канал пептида (polytheonamide B (ПТБ); Рисунок 4 A) или показано белок (КГГА калия канал, рис. 4C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовьте липосом

  1. Разогнать фосфолипидов (например, 10 мг в порошок) в хлороформе в нужной концентрации (например, 10 мг/мл).
  2. Испарится хлороформ.
    1. Место решение фосфолипидов в раунд нижней колбе и установить его на роторный испаритель (см. Таблицу материалы) подключены к N2 баллона. Вращайте колбу под N2 потока при комнатной температуре до тех пор, пока фильм тонкие фосфолипидного появляется (после ~ 30 мин).
    2. Поместите открыть колбу в эксикатор, который подключен к вакуумного насоса. С помощью вакуумного насоса, аспирационная внутри эксикатора на несколько часов тщательно удалить хлороформ.
  3. Добавить соответствующий объем раствора электролита в колбу и приостановить фосфолипидов для получения фосфолипидов подвеска 2 мг/мл.
  4. Sonicate подвеска для нескольких десятков секунд, с использованием sonicator ванна (см. Таблицу материалы), для получения многослойных везикул (МЛВ) подвеска.
  5. Для приготовления proteoliposomes, которые содержат ионного канала белки, добавить раствор белка (с белками, солюбилизирован, с использованием соответствующих моющих средств; 2% по объему-это максимум) к MLV подвеска и sonicate на несколько секунд, с использованием sonicator ванна.

2. подготовить большой диаметр стеклянной пипетки

  1. Установите стакан капиллярные пипетки съемник и изготовить micropipettes с тонкой конических отзыв через двухступенчатый потянув.
  2. Установите микропипеткой на microforge и контакт кончика микропипеткой в платиновой нити на конической части с диаметром от 30 до 50 мкм.
  3. Тепло накаливания кратко (5 s) и немедленно выключите его.
    Примечание: Эта манипуляция формы трещины на нагрев точка, которой является отрезать кончик микропипеткой, оставляя широкие отверстия с диаметром от 30 до 50 мкм.

3. Обработайте поверхность стекла слайд с мелкой вогнутый колодец (Siliconization для водоотталкивающей отделкой)

  1. Очистите поверхность стекла слайда с мелкой хорошо с дистиллированной воды и этанола.
  2. Применить соответствующий объем (например, 100 мкл) siliconizing реагента (водоотталкивающим) на стекло слайд отверстие.
  3. Сухого реагента полностью в воздухе.
  4. Место стеклянное скольжение на сцене инвертированным микроскопом.

4. форма CBB и электрофизиологические измерения

  1. 100 мкл гексадекан, в мелкой хорошо стекла слайд силицированного отверстие.
    Примечание: Для метода липидов из фосфолипидов разметаны в гексадекан (20 мг/мл) заранее.
  2. Заполните половину длины микропипеткой, используя шприц туберкулиновые раствор электролита.
  3. Установите микропипеткой на микропипеткой держатель с портом давления, позволяя Ag/AgCl проволока электрода для Замочите в растворе электролита пипеткой.
  4. Подключите один из владельцев микропипеткой главный этап патч зажим усилителя и другое одно к электросети местах.
  5. Подключите microinjector к порту давления микропипеткой держателя.
  6. Установите микропипеткой для соответствующей позиции над сценой инвертированным микроскопом, манипулируя микроманипулятор.
  7. Отрегулируйте смещение электрода потенциал.
    1. Место 1 мкл же раствор электролита используется для заполнения микропипеткой на плоской поверхности вокруг мелкой хорошо отверстие слайд стекла, создавая куполом электролита.
    2. Замочите кончик обоих micropipettes в электролит купол, манипулируя микроманипулятор.
    3. Отрегулируйте смещение потенциал электрода патч зажим усилителя.
    4. Подтверждение правильного смещения в конце экспериментов, нарушая CBB через применение высоких мембранного потенциала (электрического пробоя; использование зап на усилитель), вызывая два пузырьки будут слиты в один (пузырь фьюжн).
    5. Исправьте жидкого соединения потенциальных54 в тех случаях, когда используются асимметричные электролит решения, таким образом, что вычисленное значение добавляется к прикладной потенциал для истинный потенциал мембраны мембраны.
      Примечание: Перекрестка жидкого потенциальных рассчитывается с помощью программы JPCalc55.
  8. Нарисуйте липосом решение от кончика.
    Примечание: Когда водорастворимый каналы рассматриваются с помощью метода липидов out, отсасывание липосом решения не является необходимым.
    1. Место 1 мкл раствора липосом на плоской поверхности вокруг неглубокие скважины отверстие слайд стекла (липосомы содержащих купол).
    2. Манипулировать микроманипулятор и вставьте наконечник микропипеткой в липосомы содержащих купол.
    3. Аспирационная липосомы содержащих решения путем снижения давления внутри держателя микропипеткой, используя microinjector.
    4. Повторите эту процедуру для других пипеткой.
  9. Манипулировать микроманипулятор и погрузите кончик микропипеткой в гексадекан в неглубокие скважины.
  10. Удар пузырь вода медленно увеличивая давление до тех пор, пока пузырь достигает нужного размера (например, 50 мкм в диаметре) и в дальнейшем поддерживать такое же давление.
  11. Отбросить пузыри, передав кончик через интерфейс масло воздух, если это трудно держать конюшню размер пузырьков.
  12. Повторите шаги 4,8-4,9 стабильной пузырьки образуются.
  13. Манипулировать пузыри, чтобы позволить контакта между ними (рис. 5).
    Примечание: Иногда, пузырьки подход друг друга самостоятельно сформировать CBB. В других случаях пузырьки близки, но не связаться друг с другом. В этом случае нажмите пузыри друг к другу механически.
  14. Отрегулировать давление, чтобы сохранить размер пузырьков, потому что размер может постепенно меняться даже при давлении постоянной интра пузырь.
  15. Установите мембрану потенциальных соответствующее значение с использованием патч зажим усилителя и ждать для канала текущего появляться (рис. 6).

5. измерить емкость бислоя

  1. Измерьте бислой электрической емкости (elC), применяя рамп потенциал.
    Примечание: Когда скорость изменения напряжения в команде рамп 10 мВ/10 мс (или 1 V/s), следуют-10 мВ/10 мс, амплитуда текущего перехода после изменения на склоне соответствует чтения membrane'scapacitance значения (например 100 Па → 100 ПФ).
  2. Оценить области бислой двух пузыри накладываются один на другой и сосредоточиться Микроскоп на уровне бислой для просмотра края бислой (рис. 6).
    Примечание: Бислой имеет главным образом круглую форму, и площадь вычисляется от радиуса.
  3. Рассчитать емкость конкретных мембраны (Csp) путем деления электрической емкости по области бислой (Csp =ЭльC/a).
  4. Рассчитать толщину бислой (толщина гидрофобного ядра) с помощьюc D = (εrε0) / csp (где εr и ε0 представляют диэлектрической проницаемости гидрофобные региона бислоя и диэлектрическая проницаемость вакуума, соответственно).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Типичная CBB диаметром 50 микрон (рис. 56) и конкретные мембраны емкость в гексадекан 0,65 МКФ/см2. Размер пузырька произвольно контролируется давление внутри пузырь. Когда маленькие пузырьки необходимы для записи низким уровнем шума, диаметра кончика должен быть соответственно небольшим. Например для пузырь размером 50 микрон в диаметре, диаметра кончика должно быть 30 мкм.

После того, как сформирован CBB, канал молекул в водном растворе или в липосомы спонтанно были вставлены в бислой в течение нескольких десятков минут. Включение каналов была подтверждена поэтапное увеличение амплитуда тока (рис. 7) под прикладной мембранного потенциала. Меньшую площадь мембраны (< 1000 мкм2) по сравнению с обычными PLB и DIB систем значительно улучшены электрические соотношение сигнал шум.

Текущие записи может быть продолжена до тех пор, пока был сорван мембраны и объединены два пузыри. Новые пузыри были взорваны и CBB формируется сразу и неоднократно. Дозатор может использоваться многократно в течение дня.

Долг цикл присоединения и отсоединения. Бислой, сформированные методом CBB может распался на два монослои. Отсоединить прикрепить CBB может повторяться, манипулируя два пузыри (нагрузка detach-attach). Этот процесс контролируется внешнего вида текущего канала ПТБ, пептид канала от морской губкой, как оно было легко вставляется в липидный бислой сформировать моновалентной катион селективный поры52,56. Текущий канал ПТБ появились сразу после присоединения двух монослои, и текущий стало больше, как площадь контакта увеличено (рис. 8). Амплитуда тока был синхронизирован с отсоединения-приложите манипуляции CBB.

Один канал измерения КГГА канала. КГГА канала калия — pH чувствительных, активируемая кислой внутриклеточной рН57. Таким образом чтобы быть асимметричной58,,5960был установлен раствор электролита. В шаге 4.2 CBB формирования пипеткой раствора левой стороны был установлен при pH 4, тогда как, с правой стороны был установлен на уровне pH 7.525. В шаге 4.7.1 proteoliposome подвеска, вместо суспензии липосом, была помещена на слайд стекло для аспирации в левой пипеткой. Соответственно КГГА канал был ориентирован в мембрану с его цитоплазматических доменов, стоящих перед левой пузырь. Липосомы с белка: липидного веса соотношение 1: 2000 подходят для одноканальных текущей записи и те, с 1:10 соотношение для макроскопической текущей записи.

Асимметричная мембраны. Асимметричная липидного бислоя могут быть сформированы с помощью различных липосом суспензий для каждого пузыря (липид в)15,32. Ориентация в КГГА канал мембраны регулируется, установив асимметричной раствор pH (pH 4вгипертермальная 7вне), приводит к их цитоплазматических сторона к левой стороне. Соответственно левой стороне был назначен в качестве «в», тогда как с правой стороны был назначен в качестве «вне.» Для изучения зависимости липидов стробирования КГГА канала, были использованы четыре типа CBB (в том числе асимметричной CBB); а именно, PGв/PGиз, PGвнастройкииз, PCв/PGи PCвнастройки, (PG: фосфатидилглицерина) (Рисунок 9). КГГА канал выставлены вероятность открытой (> 90%) только в PGв/PG и PGвнастройкииз мембраны. КГГА канал требует наличия анионные фосфолипидов на талоне внутренней мембраны для открытых вероятность26.

Figure 1
Рисунок 1 : Методы липидного бислоя и патч зажим. Различные методы были разработаны для формирования липидного бислоя. (A) патч зажим метод. (B) обычной планарной липидного бислоя метод, который обеспечивает свободностоящая, основном вертикальные, бислой на небольшое отверстие. (C) Tip-методом. Однослойная на воздух вода интерфейс позиционируется на кончике Стеклянный электрод. Были разработаны различные модификации. (D) капли интерфейса бислой метод. (E) контакт пузырь бислой метод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 2
Рисунок 2 : Контакт формирования пузыря бислой. Как пузырь выдувается в масляной фазы, молекул липидов передачи спонтанно к интерфейсу вода масло. Различные типы липидов, липосомы, включены в каждый пузырь (липидов в), и монослои исключительно формируются соответствующие липиды. Стыковка двух монослои создает асимметричный бислоя мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 3
Рисунок 3 : Ключевое слово Distinct фаз в бислой контакт пузырь и динамика липидов нем. Липиды, вагонка пузырь составляют этап, где они принадлежат к монослоя или бислоя. Flip-Flop через бислой липидов нечасто, и асимметричной мембраны сохраняется на долгое время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 4
Рисунок 4 : Доставку липидов с методом липидов out или липидов в. Липиды добавляются либо в среде органического растворителя (липид out; A и C) или в водном растворе как липосомы (липид в; B и D). В методе липидов в формируется асимметричной мембраны. Канал формирование вещества, которые растворяются в водном растворе (синий), такие как пептиды, добавляются в одну из пузырьков и спонтанно вставляется в бислой. В методе липидов в часть каналов вставляется в липосомах, которые затем сливаются в бислой. Восстановленный канал белков (красный) в липосомы в липидов out или липидов в методе, который затем добавлены в один из пузырьков и спонтанно сливается с бислоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 5
Рисунок 5 : Формирования и микроскопических изображений контакта пузырь бислой. Бислой наблюдается с тангенциальным направления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 6
Рисунок 6 : Наблюдения бислоя для измерения области бислой. Два пузыри укладываются один на другой через пипетку манипуляции, и Микроскоп ориентирован на уровне контактов пузырь бислоя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 7
Рисунок 7 : Ступенчатой вставки КГГА канала в контакт пузырь бислоя мембраны. E71A мутант КГГА канала был использован для Показать немедленного обнаружения вставленной каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 8
Рисунок 8 : Отсоединения присоединения монослои и ответы каналов. Канал с пептида, polytheonamide B, была добавлена в одну из пузырьков, которые затем спонтанно частью мембрана. При отсоединении каналы в мембране снял, но были сохранены на мембраны буклет со стороны канала Добавлено. После вложения каналы были вставлены в мембрану. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 9
Рисунок 9 : Формирование асимметричного мембраны и канала активности зависит от состава листовки. КГГА канал регулируется кислой липиды, таких как PG, в листовке внутренней мембраны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Обычные ПРБ Липосомы патч ДИБ CBB
Успех ставка1 высокая низкая очень высокая очень высокая
Немедленно reformability2 Да Нет промежуточные Да
Асимметричные мембраны Да Нет Да Да
Решение обмен медленно очень быстро медленно быстрый
Соотношение сигнал/шум3 низкая высокая низкая высокая
Деформации мембраны Нет Нет Нет Да4
Механическая манипуляция Нет Да5 Да Да
Мембрана перфузии Нет Нет Да Да
Липидной композиции разнообразные ограниченные6 разнообразные разнообразные
1 Коэффициент успеха формирования стабильной липидного бислоя за судебного разбирательства.
2 Формирование новой мембраны быстро после сломать мембраны. Кроме того неоднократно формируется мембраны.
3 Соотношение сигнал шум (S/N) представляет начальных шум электрические фон, созданный из емкости мембраны.
4 Вогнутые или выпуклые мембраны могут быть созданы путем применения различных внутриглазное давление между двумя пузыри.
5 Только повышение напряженности мембраны.
6 Фосфолипиды, которые могут образовываться гигантские однослойных везикул применимы, но гига печать не может быть достигнуто.

Таблица 1: Характеристики различных липидного бислоя мембран.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CBB метод формирования липидного бислоя основан на принципе капельку воды в нефти, облицованная монослоя20. Технически процедуры для формирования общеиспользуемые легко, особенно для фиксации исследователей, которые владеют в манипулировании стекла micropipettes. Электрофизиологические установки для фиксации легко используется в CBB, когда два манипулятора пипетку с microinjectors доступны. С другой стороны, потому что CBB является преемником обычных ПРБ, который был большой объем физико-химических знаний, накопленных8, этот фона, а также знание химии поверхности38 полезно для эксплуатации и манипулируя общеиспользуемые. CBB служит универсальная платформа для изучения взаимодействия канала мембраны с возможностью изменения химического состава и физического состояния61. В CBB, липиды, вагонка пузырь может свободно диффузного через границу фазы монослоя и листовка бислоя, и у нас есть разработанные методики, такие как бислой прикрепить отделить и мембраны перфузии методы45. Мы продлили общеиспользуемые в vitro канал синтеза белка, где синтез канала была исполнена в пузырь, и недавно синтезированных канал белки были подвергнуты спонтанное передаче бислой под применение мембранного потенциала где функции зарождающейся каналов КГГА канала была прослежена с момента инициирования транскрипция/перевод КГГА ДНК62.

Среди шагов, протокола поддержание размер пузырька имеет решающее значение. Пузыри могут медленно набухают или сжать спонтанно потому что липидов передача интерфейса является медленным и напряженность монослоя подвержен изменения. В частности первый пузырь, завышенные сразу после всасывания липосом раствора (шаги 4.8.3 и 4.10) трудно поддерживать, потому что напряжение монослоя снижен липосомы накопленных на кончике пипеткой. Отбрасывая первоначальный пузыри и последующее формирование пузырьков обеспечивают стабильное CBB. Визуального отслеживания размер пузырьков и тонкой настройки давления являются необходимыми.

Есть экспериментальные ограничения метода CBB. Хотя CBB предназначен для электрофизиологические измерения, электрическое сопротивление бислоя для некоторых липидной композиции не может быть достаточно высоко (например, 100 GΩ) для одноканальной записи. К примеру dioleoyl фосфатидилхолина часто используется для липосомы, но она образует электрически Дырявый общеиспользуемые при 25 ° C63. Общеиспользуемые даже не могут быть сформированы с липидов видов которых температура стеклования фазы находится выше запись температуры. Действительно CBB формирования было трудно с dipalmitoyl фосфатидилхолинов при комнатной температуре, но повышение температуры выше Tm обойти проблемы64. В этих экспериментах, температура контролировалась с помощью прозрачной калильная пластина (см. Таблицу материалы) под слайдом стекла62. Температура стеклования фаза часто используемых липидов diphytanoyl фосфатидилхолина ниже 0 ° C 65, и общеиспользуемые легко сформированные32,45,51 в широком диапазоне температур.

Фосфолипиды водно нефтяных интерфейса предоставляются либо липидов или липидов out метода, где скорость передачи сравнительно медленнее в липидов out чем в метод липидов в63. Кроме того по неизвестным причинам, электрическое сопротивление бислоя мембраны относительно меньше с методом липидов out чем с методом липидов.

В протоколе (шаг 4,8), раствор липосомы и восстановленный канал липосомы (1 мкл) загружается из кончика пипетки (шаги 4.9 и 4.10), и остальная часть пипетки содержит решение ранее заполненные электролитом. Это просто для сохранения материалов, таких как липиды и канал молекул. Следовательно липосомы диффузного постепенно к верхней пипеткой раствор, и через некоторое время, концентрации липидов на кончике пипеткой становится недостаточным для формы липидного монослои. В этом случае свежие липосом решение должно быть придыхательным от кончика (шаг 4.8). Это изменение временной концентрации можно обойти, когда весь пипеткой заполняется с раствор, содержащий липиды и канал молекул, тогда как липосомы постепенно поселиться в пузырьки. В этом случае возобновляются пузыри.

Electrophysiologically CBB размер больше, чем патч зажима, таким образом давая больше емкость мембраны. Однако, серия сопротивление (электрическое сопротивление в серии мембраны сопротивления) намного ниже (~ 100 kΩ), чем для фиксации (Пипетка сопротивление > 1 MΩ), который ускоряет скорость мембраной и ослабляет фоновый шум и серия сопротивление ошибки в зажат напряжение мембраны потенциалов66,67,68. Фоновый шум является функцией емкости мембраны и сопротивления серии, где сопротивление низким серия дополняет емкость высокий мембраны, что приводит к низкой фоновой шум9.

Как правило липидного бислоя экспериментов моющие средства не должны использоваться для мытья посуды. Еще следовые количества моющего средства возмущает целостность бислоя. Органические растворители, такие как хлороформ/метанол и этанол следует использовать для таких целей очистки вместо.

В целом CBB объединяет преимущества фиксации (например, механические манипуляции мембраны) и ПРБ (например, возможность изменять состав липидной мембраны). Различные типы веществ, образуя канал и канал белки были изучены52,53,69,70. Развитие этого метода является своевременным, поскольку все больше и больше исследователей сосредоточены на канал мембраны взаимодействие и CBB обеспечивает универсальная платформа для различных экспериментов. Далее ожидается экспериментальных разработок в методе CBB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Марико Yamatake и Масако Такасима для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана в части, KAKENHI Грант насчитывает 16H, 00759 и 17 H 04017 (так).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Нейробиология выпуск 143 липидный бислой фиксации капельки воды в нефти однослойная ионного канала электрофизиологии химии поверхности
Липидного бислоя эксперименты с контактной пузырь бислоев для патч фиксаторы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter