Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de vorming van lipide-bilayers met behulp van een contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel, waarbij een monolayer wordt gevormd op het grensvlak water / olie. Twee pipetten zijn gemanipuleerd om het dok van de belletjes vormen een dubbelgelaagde.

Abstract

Lipide-bilayers bieden een unieke experimenteel platform voor functionele studies van ionenkanalen, waardoor het onderzoek van kanaal-membraan interacties onder verschillende membraan lipide composities. Onder hen, steeds de druppel interface dubbelgelaagde populairder; echter belemmert de grootte groot membraan de opname van lage elektrische achtergrondgeluiden. Wij hebben vastgesteld dat een contact zeepbel dubbelgelaagde (CBB) methode die de voordelen van de vlakke lipide dubbelgelaagde combineert en patch-clamp methoden, zoals de mogelijkheid om te variëren van de samenstelling van lipide en te manipuleren de dubbelgelaagde mechanica, respectievelijk. Het gebruik van de instelling voor conventionele patch-clamp experimenten, kunnen CBB gebaseerde experimenten gemakkelijk uitgevoerd worden. In het kort, een elektrolyt oplossing in een glazen pipet is geblazen in een organische oplosmiddelen fase (hexadecaan), en de druk van de pipet wordt gehandhaafd om het verkrijgen van een stabiele belgrootte. De zeepbel is spontaan bekleed met een enkelgelaagde voor lipide (lipiden zuivere of gemengde lipiden), die wordt geleverd door liposomen in de bubbels. Vervolgens zijn de twee enkelgelaagde omzoomde bubbels (~ 50 µm in diameter) op het puntje van het glas pipetten gedokt voor dubbelgelaagde vorming. Binnenbrengen van de zeepbel van kanaal-gereconstitueerd liposomen leidt tot de integratie van kanalen in de dubbelgelaagde, waardoor de huidige opname eenkanalig met een signaal-ruisverhouding vergelijkbaar met die van de patch-clamp opnames. CBBs met de samenstelling van een asymmetrische lipide worden gemakkelijk gevormd. Het CBB is herhaaldelijk vernieuwd door het uitblazen van de eerdere belletjes en de vorming van nieuwe. Verschillende chemische en fysische verstoringen (b.v., membraan perfusie en dubbelgelaagde spanning) kunnen worden opgelegd aan de Herein CBBs., presenteren we de basisprocedure voor het CBB vorming.

Introduction

Ionenkanalen is het celmembraan niet gewoon een ondersteunende materiaal maar een partner voor het genereren van de ion-flux. Functioneel, het membraan is een elektrische isolator welke ion kanalen zijn ingesloten, en alle celmembranen zijn bijgebracht met een rust membraanpotentiaal. Conventioneel, was een willekeurige membraanpotentiaal van een externe schakeling waarop elektrische stroom via de kanalen werd gemeten opgelegd. Deze kwantitatieve evaluatie van de ion-flux op verschillende membraan potentieel bleek de moleculaire eigenschappen van deze kanalen, zoals hun ion-selectieve permeatie en gating functies1,2. Het membraan platform voor functionele studies van ionenkanalen is de celmembraan of het membraan van de dubbelgelaagde lipide. Historisch, eenkanalig elektrische huidige opnames in première gingen lipide bilayers3,4, en de relevante technieken werden ontwikkeld voor celmembranen, zoals de methode van de patch-clamp (Figuur 1A )5,6. Sindsdien hebben deze twee technieken afzonderlijk ontwikkeld voor verschillende doeleinden (Figuur 1)7,8.

Membraan lipiden en dubbelgelaagde membranen zijn momenteel de focus van het onderzoek voor hun rol bij de ondersteuning van de structuur en functie van eiwitten van het kanaal. Daarom is de beschikbaarheid van methoden om te variëren van de samenstelling van lipide in bilayers in hoge vraag. Lipide dubbelgelaagde vorming methoden zoals de vlakke lipide dubbelgelaagde (PLB)8,9,10,11, water-in-olie druppel dubbelgelaagde12en druppel interface dubbelgelaagde (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 technieken (Figuur 1) zijn gemeenschappelijke keuzen, bieden een gelegenheid voor de behandeling van de functie van de kanaal onder variërende lipide composities20. Hoewel de DIB technisch veel gemakkelijker is te produceren dan de conventionele PLB, de grote omvang van de DIB ontmoedigen patch-clampers toe te passen voor het bestuderen van één-kanaals huidige opnames met gebruikelijke middelgrote huidgeleiding heeft gemaakt (< 100 pS).

Om te omzeilen de achtergrondgeluiden, moet het dubbelgelaagde gebied worden geminimaliseerd. Deze kwestie roept de herhalingen van ervaring met het ontwikkelen van elektrofysiologische technieken voor lipide bilayers (Figuur 1). In de vroege dagen, werd een kleine dubbelgelaagde (1-30 µm in diameter) opgericht op het puntje van een pipet (tip-dip methode; Figuur 1 C) 21 , 22 , 23, in plaats van met behulp van een vrijstaande dubbelgelaagde (~ 100 µm in diameter) op een hydrofobe septum in een kamer (Figuur 1B). De tip-dip methode toegestaan voor elektrische metingen met veel lagere achtergrond lawaai24. Onze ervaringen met PLB25,26, tip-dip22,23,27, en patch-clamp28,29,30, 31 methoden leidde ons naar een nieuw idee van het vormen van lipide-bilayers met behulp van de beginselen van de water-in-olie dubbelgelaagde. Wij hebben dit als de contact zeepbel dubbelgelaagde (CBB) methode20,32genoemd. Bij deze methode in plaats van de waterdruppels opknoping in een olie-fase (Figuur 1D), een zeepbel van water is geblazen uit een glazen pipet (met tip diameter van ongeveer 30 µm) in de fase van de olie (Figuur 1E en 2), waar de Bubble wordt onderhouden door een constante druk uit te oefenen. Een enkelgelaagde vormen spontaan op het grensvlak water / olie op het oppervlak van de zeepbel. Vervolgens twee bubbels zijn gekoppeld door middel van de manipulatie van twee pipetten van glas en de dubbelgelaagde wordt gevormd als de twee monolayers aanpak elkaar, een evenwicht dubbelgelaagde gebied oplevert. De grootte van de bel wordt bepaald door de druk van de intra-bubble (holding druk), en eveneens de dubbelgelaagde grootte. Een gemiddelde diameter van 50 µm wordt vaak gebruikt. Hoewel het volume van de zeepbel klein is (< 100 pL), deze is aangesloten op het grotere volume van de pipet-oplossing die in het bereik van microliter, vormen de bulk elektrolyt fase.

Er zijn vele voordelen aan het gebruik van de methode CBB (tabel 1). Als een lipide dubbelgelaagde vorming techniek, membranen van verschillende lipide composities kunnen worden geproduceerd, en asymmetrische membranen zijn gemakkelijker gevormde32 dan die van de conventionele vouwen methode33. De dubbelgelaagde kan mechanisch worden gemanipuleerd, in tegenstelling tot de conventionele PLB die alleen kan worden gebogen met een hydrostatische druk verschil34,35. Door het veranderen van de druk van het bedrijf, de bubbels of vergroten of verkleinen, wat leidt tot verhoogde of verminderde membraan spanning32. De dubbelgelaagde is mechanisch afneembaar in monolayers, vergelijkbaar met de freeze-fractuur techniek36,37 van membranen in de morfologische studies, maar met de CBB, een manoeuvre maakt het mogelijk voor herhaalde loskoppelen en hechten cycli32 . De geringe omvang van de elektrolyt oplossing binnen de zeepbel staat efficiënte fusie van kanaal-gereconstitueerd liposomen in de dubbelgelaagde, en de kans op het krijgen van kanaal opnamen is veel hoger dan bij de conventionele PLB techniek. Het kleine Bel volume kunt snelle perfusie (binnen ~ 20 ms) ook eens een ander injectie Pipet is ingevoegd in een van de bubbels. In tegenstelling tot de methode van de patch-clamp, zodra gebroken, een membraan CBB opnieuw onmiddellijk en herhaaldelijk wordt gevormd en pipetten meerdere malen per dag kunnen worden gebruikt. Voordelen van de patch-clamp en PLB methoden te integreren, biedt de CBB een veelzijdig platform om te variëren van de fysisch-chemische voorwaarden van het membraan, waardoor voor ongekende studies van kanaal-membraan interacties.

Vóór de presentatie van een gedetailleerd protocol van het proces van de vorming van CBB, wordt de fysicochemische achtergrond van de vorming van dubbelgelaagde eerste, die nuttig zijn voor patch-clampers op te lossen van experimentele moeilijkheden met betrekking tot de vorming van het membraan gepresenteerd die worden aangetroffen.

CBB experimenten geven lessen voor Oppervlaktechemie wetenschap38. Het CBB is vergelijkbaar met een zeepbel geblazen uit een rietje in de lucht, waar ook een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel. Men zal merken dat een zeepbel water nauwelijks wordt opgeblazen wanneer membraan lipiden niet in de water-zeepbel of de organisch oplosmiddel opgenomen zijn. Bij gebrek aan amphipathic lipiden, de oppervlaktespanning bij een water-olie-interface is hoog, en de druk van de intra-bubble voor een zeepbel blazen hoog zal zijn. Dit is een realisatie van de Laplace-vergelijking (ΔP = 2 γ/R, waarbij ΔP de druk van de intra-bubble, γ is de oppervlaktespanning en R de straal van de zeepbel is). Wanneer de concentratie van lipiden in de organische fase of de elektrolyt oplossing hoog is, de dichtheid van lipiden in de enkelgelaagde toeneemt, zoals gedicteerd door de adsorptie-isotherm van Gibbs (-dγ = Γik dµik, waar Γik de oppervlakte overmaat is van samengestelde i en µik is de chemische potentiaal van component ik)39, wat leidt tot een lagere oppervlaktespanning en gebruiksgemak luchtbel vorming. In het CBB, de dubbelgelaagde kan worden waargenomen vanuit een tangentiële hoek (Figuur 2) en is de contacthoek tussen de enkelgelaagde en dubbelgelaagde meetbaar. Deze hoek vertegenwoordigt een evenwicht tussen de surface tensions van de enkelgelaagde en dubbelgelaagde (jonge vergelijking: γbi = γma cos(θ), waar γbi is de spanning dubbelgelaagde γma is de enkelgelaagde spanning en θ is de contacthoek). De veranderingen in de contacthoek geven wijzigingen in de dubbelgelaagde spanning, gezien het feit dat de enkelgelaagde spanning uit veranderingen in de contacthoek wordt geëvalueerd als een functie van de membraanpotentiaal (Young-Lippmann vergelijking: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θv)), waar Cm de capaciteit van de membraan is, V de membraanpotentiaal is en θ0 en θv de contacthoeken op 0 en V mV, respectievelijk zijn)40,41 ,42. Wanneer twee bubbels dicht genoeg zijn, benaderen ze elkaar spontaan. Dit is te wijten aan de van der Waals force, en wij kunnen dit dynamisch proces in CBB vorming visueel waarnemen.

Een CBB systeem bestaat uit verschillende fasen: namelijk een bulk olie fase, water van bubbels bekleed met een enkelgelaagde, en een contactmogelijkheden dubbelgelaagde (Figuur 3). Deze doen denken aan de meerdere fasen waargenomen in een PLB, zoals een oplosmiddel-houdende torus rond de dubbelgelaagde fase en een dunne organische fase ingeklemd door twee monolayers43,44. In het CBB, de enkelgelaagde fase is continu met de dubbelgelaagde bijsluiter en lipide moleculen diffuus gemakkelijk tussen de enkelgelaagde en de bijsluiter. De enkelgelaagde fase behandelt de meeste van het oppervlak van de zeepbel, vormen de belangrijke werkfase die als een lipide-reservoir fungeert. Omdat de hydrofobe staart van lipiden in de enkelgelaagde zich naar buiten tot de bulk olie fase uitstrekt, opent de dubbelgelaagde interieur of de hydrofobe kern voor de bulk olie fase. Een hydrofobe stof ingespoten in de olie-fase dichtbij de dubbelgelaagde is dus gemakkelijk toegang krijgen tot het dubbelgelaagde interieur. Dit is het membraan perfusie techniek dat we hadden ontwikkeld onlangs45, waarmee de samenstelling van lipide in de dubbelgelaagde snel (binnen een seconde) wordt gewijzigd tijdens één-kanaals huidige opnames. We vonden dat de cholesterol-gehalte in de dubbelgelaagde omkeerbaar kan worden gecontroleerd door het overschakelen van de cholesterol-perfusie, in- en uitschakelen45. In het geval dat de concentratie van de betrokken stof in de enkelgelaagde en dubbelgelaagde verschilt, wordt het verloop van de concentratie van de betrokken stof onmiddellijk ontbonden door diffusie, die bekend als de Marangoni effect46, staat 47. anderzijds, slippers over de monolayers zijn traag48,49,50.

Met behulp van de methode van het CBB, de dubbelgelaagde wordt gevormd onder veelzijdige fysisch-chemische omstandigheden, zoals een elektrolyt pH zo laag als 1 51, een concentratie zout (K+nb+, enz.) tot 3 M, een zo hoog als ±400 mV membraanpotentiaal en een systeem temperatuur tot 60 ° c.

Er zijn verschillende opties voor de vorming van het CBB en opneming van kanaal moleculen daarin. Voor de vorming van de enkelgelaagde op het grensvlak water / olie, zijn lipiden toegevoegd in een organisch oplosmiddel (lipide-out methode; Figuur 4 A, 4 C) of in een zeepbel als liposomen (lipide-in methode; Figuur 4 B, 4 D). Met name zorgt de lipide-in-methode voor de vorming van asymmetrische membranen15,32. Kanaal moleculen oplosbaar in waterige oplossing (bijvoorbeeld, kanaal-vormende peptiden) worden direct toegevoegd in de zeepbel (Figuur 4A, B)52,53, overwegende dat kanaal eiwitten zijn gereconstitueerd in liposomen, die vervolgens worden toegevoegd in de zeepbel (Figuur 4C, D). Hierin, de vorming van CBBs door de methode lipide-in voor ofwel een kanaal peptide (polytheonamide B (pTB); Figuur 4 A) of een eiwit (KcsA kalium kanaal, Figuur 4C) wordt weergegeven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prepareer liposomen

  1. Dispergeren fosfolipiden (bijv, 10 mg in poedervorm) in chloroform op een gewenste concentratie (bijv, 10 mg/mL).
  2. Verdampen chloroform.
    1. Plaats de fosfolipide oplossing in een rondbodemkolf en reeks het op een rotatieverdamper (Zie Tabel van materialen) op een gasfles van N2 aangesloten . Draai de erlenmeyer onder N2 stroom bij kamertemperatuur totdat een dunne fosfolipide film (na ~ 30 min verschijnt).
    2. Plaats de open kolf in een exsiccator die is verbonden met een vacuümpomp. De binnenkant van de exsiccator gedurende enkele uren tot de chloroform grondig verwijderen met behulp van de vacuümpomp, gecombineerd.
  3. Een passende omvang van een elektrolyt oplossing Voeg aan de maatkolf en de fosfolipide om op te halen een 2 mg/mL fosfolipide schorsing op te schorten.
  4. Bewerk ultrasone trillingen ten de schorsing voor enkele tientallen seconden met behulp van een bad ultrasoonapparaat (Zie Tabel van materialen) te verkrijgen van een schorsing van meerdere lagen Vesikel (MLV).
  5. Voor de bereiding van proteoliposomes die ion kanaal eiwitten bevatten, een eiwit oplossing toevoegt (met de eiwitten ontbindend met behulp van passende detergentia; 2% volume is het maximum) tot de MLV schorsing en bewerk ultrasone trillingen ten voor enkele seconden met behulp van de bad ultrasoonapparaat.

2. voorbereiding van de grote boring glas pipetten

  1. Een glazen capillaire ingesteld op de trekker van een pipet en fabriceren micropipetten met een fijne taps toelopende punt door in twee stappen te trekken.
  2. Stel de micropipet op een microforge en neem contact op met het puntje van de micropipet naar een platina gloeidraad op het tapse gedeelte met een diameter van 30 tot 50 µm.
  3. Verwarm de gloeidraad kort (5 s) en onmiddellijk zwenking op vandoor.
    Opmerking: Deze manipulatie vormen een scheur in de verwarming punt, waarbij het uiteinde van de micropipet wordt afgekapt, waardoor een breed boring met een diameter van 30 tot 50 µm.

3. Behandel het oppervlak van een glasplaatje met een ondiepe concaaf goed (Siliconization voor een waterafstotende afwerking)

  1. Reinig het oppervlak van het glasplaatje met een ondiepe goed met gedestilleerd water en ethanol.
  2. Toepassing van een passende omvang (bijvoorbeeld, 100 µL) van een siliconizing reagens (waterafstotend) op het gat dia glas.
  3. Droog het reagens volledig in de lucht.
  4. Plaats het glasplaatje in het werkgebied van een omgekeerde Microscoop.

4. vorm het CBB en elektrofysiologische meting uitvoeren

  1. Voeg 100 µL van hexadecaan in de ondiepe put van het glas van de dia gesiliconiseerd gat.
    Opmerking: Bij de methode met lipide-out fosfolipiden zijn gedispergeerd in hexadecaan (20 mg/mL) vooraf.
  2. Vullen de elektrolyt oplossing aan de helft van de lengte van de micropipet, met een tuberculine-injectiespuit.
  3. Stel de micropipet op de houder van de micropipet met een druk-poort, waardoor de draad Ag/AgCl-elektrode te genieten in de pipet elektrolyt oplossing.
  4. Een van de houders van de micropipet verbinden met de hoofd fase van een patch-clamp versterker en de andere die de elektrische aarding.
  5. Sluit een microinjector aan de poort van de druk van de micropipet-houder.
  6. Stel de micropipet op een passende plaats boven het werkgebied van een omgekeerde Microscoop door het manipuleren van de micromanipulator.
  7. Pas de verschuiving van de elektrode potentiële.
    1. Plaats 1 µL van dezelfde elektrolyt oplossing gebruikt voor het vullen van de micropipet op het platte vlak naast de ondiepe waterput van het gat dia glas, maken een elektrolyt koepel.
    2. Geniet van het uiteinde van beide micropipetten in de elektrolyt koepel door het manipuleren van de micromanipulator.
    3. Aanpassen van de elektrode offset potentieel van de patch-clamp-versterker.
    4. De juiste offset aan het eind van de experimenten door het breken van het CBB bevestigen via de toepassing van een hoge membraanpotentiaal (elektrische verdeling; met behulp van Zap op de versterker), waardoor de twee bubbels om in een (bubble smelting) worden gesmolten.
    5. Corrigeer de vloeibare junction potentiële54 in de gevallen waar asymmetrische elektrolyt oplossingen worden gebruikt, zodanig dat de berekende waarde wordt toegevoegd aan de toegepaste membraanpotentiaal voor de ware membraanpotentiaal.
      Opmerking: De vloeibare kruising potentiële wordt berekend met behulp van het programma JPCalc55.
  8. De oplossing van liposoom trekken de tip.
    Opmerking: Wanneer in water oplosbare kanalen worden onderzocht met behulp van de methode van lipide-out, suctioning van de liposomen oplossing is niet nodig.
    1. Plaats 1 µL van liposoom oplossing op het platte vlak naast de ondiepe waterput van het gat dia glas (dome liposomen-bevattende).
    2. Manipuleren van de micromanipulator en breng de tip van de micropipet in de liposomen-bevattende koepel.
    3. De liposomen-bevattende oplossing gecombineerd door het verlagen van de druk binnen de micropipet houder met behulp van de microinjector.
    4. Herhaal de procedure voor de andere pipet.
  9. Manipuleren van de micromanipulator en duik het topje van de micropipet in de hexadecaan in de ondiepe put.
  10. Blaas een zeepbel water langzaam door het verhogen van de druk, totdat de zeepbel de gewenste grootte (b.v., 50 µm in diameter tot) en daarna dezelfde druk blijven uitoefenen.
  11. Gooi de belletjes door het uiteinde door de olie-lucht-interface als het is moeilijk de grootte van de bellen om stabiel te houden.
  12. Herhaal de stappen 4.8 tot 4,9 om stabiele belletjes worden gevormd.
  13. Manipuleren van de belletjes zodat contact tussen hen (Figuur 5).
    Opmerking: Soms, de bubbels benaderen elkaar spontaan tot het CBB. In andere gevallen, de bubbels zijn dicht, maar doen geen contact met elkaar opnemen. In dit geval, duw de bellen elkaar mechanisch.
  14. Fine-tunen van de druk om de belgrootte, omdat de grootte geleidelijk zelfs bij de constante intra-bubble druk veranderen kan.
  15. Het membraan potentiële ingesteld op de juiste waarde met behulp van de patch-clamp versterker en wacht op het kanaal huidige naar voren (Figuur 6).

5. meet dubbelgelaagde capaciteit

  1. Meet de elektrische capaciteit van dubbelgelaagde (Cel) door toepassing van een potentiële ramp.
    Opmerking: Als het mutatietempo van de spanning in de oprit-opdracht 10 mV/10 ms (of 1 V/s) gevolgd door-10 mV/10 ms is de amplitude van de huidige sprong op veranderingen in de helling komt overeen met het lezen van de membrane'scapacitance waarde (b.v. 100 pA → 100 pF).
  2. Evalueren van het dubbelgelaagde gebied van twee bubbels gestapeld één op de andere en het concentreren van de Microscoop op het niveau van de dubbelgelaagde te bekijken van de rand van de dubbelgelaagde (Figuur 6).
    Opmerking: De dubbelgelaagde vorm is meestal circulaire, en het gebied is berekend op basis van de straal.
  3. Berekenen van de specifieke membraan capaciteit (Csp) door te delen van de elektrische capaciteit door het dubbelgelaagde gebied (Csp = Cel/A).
  4. De dubbelgelaagde dikte (dikte van de hydrofobe kern) berekenen met behulp van Dc = (εrε0) /Csp (waar εr en ε0 vertegenwoordigen de permittiviteit hydrofobe regio de dubbelgelaagde en de permittiviteit van een vacuüm, respectievelijk).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een typische CBB had een diameter van 50 µm (Figuur 56) en de capaciteit van de specifieke membraan in hexadecaan was 0,65 µF/cm2. De belgrootte werd willekeurig gecontroleerd door de druk van de intra-bubble. Als kleine bellen nodig voor ruisarme opnamen zijn, moet de tip diameter dienovereenkomstig klein. Bijvoorbeeld, voor een belgrootte van 50 µm in diameter moet de tip diameter 30 µm.

Zodra het CBB had gevormd, werden de moleculen van het kanaal in waterige oplossing of in de liposomen spontaan ingevoegd de dubbelgelaagde binnen een spanwijdte van enkele tot tientallen minuten. Inbrengen van de kanalen werd bevestigd door de stapsgewijze verhoging van de huidige amplitude (Figuur 7) onder de toegepaste membraanpotentiaal. De kleinere oppervlakte membraan (< 1.000 µm2) ten opzichte van dat in de conventionele PLB en DIB systemen aanzienlijk verbeterd het elektrische signaal-/ ruisverhouding.

Huidige opnamen kon worden voortgezet totdat het membraan werd verstoord en de twee bubbels samengevoegd. Nieuwe zeepbellen werden geblazen en de CBB gevormd onmiddellijk en herhaaldelijk. De pipet kan herhaaldelijk worden gebruikt binnen een dag.

Plicht cyclus van koppelen en loskoppelen. Een dubbelgelaagde gevormd door de CBB methode kan worden uiteengevallen in twee monolayers. Loskoppelen-hechten van het CBB kunnen worden herhaald door het manipuleren van de twee bubbels (taakcyclus van detach-attach). Dit proces werd gecontroleerd door de verschijning van het huidige kanaal van pTB, een peptide-kanaal van een marine spons, omdat deze gemakkelijk in de lipide dubbelgelaagde vormen een monovalent catie-selectieve porie52,-56werd ingevoegd. Het pTB kanaal huidige ontstond onmiddellijk na de twee monolayers verbonden, en de huidige werd groter is als het gebied van contact toegenomen (Figuur 8). De amplitude van de stroom werd gesynchroniseerd met het loskoppelen-manipulatie van het CBB hechten.

Single-channel metingen van het KcsA-kanaal. De KcsA kalium kanaal is pH gevoelig, wordt geactiveerd door zure intracellulaire pH57. Dus, de elektrolyt oplossing was ingesteld op asymmetrische58,59,60. In stap 4.2 van CBB vorming, werd de oplossing van de Pipet van de linkerzijde vastgesteld op pH 4, terwijl dat van de rechterkant werd vastgesteld op pH 7.525. In stap 4.7.1, werd een proteoliposome schorsing, in plaats van liposoom schorsing, geplaatst op het glas van de dia voor aspiratie in de linker pipet. Dienovereenkomstig, het KcsA kanaal was georiënteerd in het membraan met de cytoplasmatische domein geconfronteerd met de linker zeepbel. Liposomen met de eiwit: lipide-gewichtsverhouding van 1:2000 zijn geschikt voor één-kanaals huidige opname, en die met een 1:10 verhouding zijn voor macroscopische huidige opname.

Asymmetrische membraan. Een asymmetrische lipide dubbelgelaagde kan worden gevormd met behulp van verschillende liposoom schorsingen voor elke zeepbel (lipide-in)15,32. De richting van het KcsA-kanaal in het membraan was geregeld door het instellen van de pH van een asymmetrische oplossing (pH 4in/pH 7uit), wat leidt tot de cytoplasmatische kant wordt naar de linker kant. Dienovereenkomstig, de linkerkant werd toegewezen als "in", terwijl de rechterkant werd toegewezen als "out." Om te onderzoeken lipide afhankelijkheid van het gating van het KcsA kanaal, werden vier soorten CBB (met inbegrip van een asymmetrische CBB) gebruikt; namelijk, PGin/PGuit, PGin/PCuit, PCin/PGuiten PCin/PCuit (PG: phosphatidylglycerol) (Figuur 9). Het KcsA kanaal tentoongesteld grote open kans (> 90%) alleen in de PGin/PGuit en PGin/PCuit membranen. Het KcsA-kanaal vereist het bestaan van anionactieve fosfolipiden in de innerlijke bijsluiter van het membraan voor een grote open kans26.

Figure 1
Figuur 1 : Lipide dubbelgelaagde en patch-clamp methoden. Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor de vorming van het lipide dubbelgelaagde. (A) Patch-clamp methode. (B) de conventionele vlakke lipide dubbelgelaagde methode, die voorziet in een vrijstaande, grotendeels verticaal, dubbelgelaagde over een klein gaatje. (C) Tip-dip methode. Een enkelgelaagde op de lucht-water-interface ligt op het puntje van een glaselektrode. Verschillende wijzigingen hebben ontwikkeld. (D) droplet dubbelgelaagde interfacemethode. (E) contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 2
Figuur 2 : Contact op met bubble dubbelgelaagde vorming. Als een zeepbel is geblazen in een fase van olie, overdracht van lipide moleculen spontaan aan de water-olie-interface. Verschillende soorten lipiden liposomen zijn opgenomen in elk bubble (lipide-in) en monolayers zijn gevormd uitsluitend door de relevante lipiden. Docking twee monolayers genereert een asymmetrische dubbelgelaagde membraan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 3
Figuur 3 : Distinct fasen in de dubbelgelaagde contact zeepbel en de dynamiek van lipiden daarin. Lipiden voering de zeepbel vormen een fase waar ze tot een enkelgelaagde of een dubbelgelaagde behoren. Flip-flop van lipiden in de dubbelgelaagde is zeldzaam en de asymmetrische membraan is behouden voor een lange tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 4
Figuur 4 : Met de methode lipide-out of lipide-in het leveren van lipiden. Lipiden zijn toegevoegd in een organisch oplosmiddel (lipide-out; A en C) of in waterige oplossing als liposomen (lipide-in; B en D). In de methode lipide-in wordt een asymmetrische membraan gevormd. Kanaal-vormende stoffen die oplosbaar zijn in waterige oplossing (blauw), zoals peptiden, zijn toegevoegd in een van de belletjes en spontaan in de dubbelgelaagde ingevoegd. In de methode lipide-in, wordt een deel van de kanalen liposomen, die vervolgens worden gesmolten tot de dubbelgelaagde ingevoegd. Kanaal eiwitten (rood) worden gereconstitueerd in liposomen in ofwel de methode van lipide-out of lipide-in, die vervolgens toegevoegd aan een van de belletjes en spontaan naar het dubbelgelaagde gesmolten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 5
Figuur 5 : Formatie en microscopische opname van de contactpersoon bubble dubbelgelaagde. De dubbelgelaagde wordt uit een tangentiële richting waargenomen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 6
Figuur 6 : Observatie van de dubbelgelaagde voor het meten van het gebied dubbelgelaagde. Twee bubbels zijn gestapeld een anderzijds door manipulatie van de pipet en de Microscoop is gericht op het niveau van de dubbelgelaagde contact zeepbel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 7
Figuur 7 : Stapsgewijze inbrengen van het KcsA-kanaal in het contact zeepbel dubbelgelaagde membraan. De mutant E71A van het KcsA-kanaal werd gebruikt om de onmiddellijke opsporing van de ingevoegde kanalen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 8
Figuur 8 : Loskoppelen-attach monolayers en reacties van kanalen. Een peptide-kanaal, polytheonamide B, werd toegevoegd in een van de belletjes, die was dan spontaan opgenomen in het membraan. Wanneer vrijstaand, kanalen in het membraan trok maar bleven op de bijsluiter van de membraan van de kant kanaal-toegevoegd. Op bijlage, zijn de kanalen in het membraan ingevoegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 9
Figuur 9 : Vorming van een asymmetrische membraan en kanaal activiteit afhankelijk van de samenstelling van de bijsluiter. Het KcsA-kanaal wordt gereguleerd door zure lipiden, zoals PG, in de bijsluiter van het innerlijke van het membraan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Conventionele PLB Liposoom patch DIB CBB
Succes rate1 hoge lage zeer hoog zeer hoog
Onmiddellijke reformability2 Ja geen tussentijdse Ja
Asymmetrische membraan Ja geen Ja Ja
Oplossing uitwisseling vertragen zeer snelle vertragen snel
S/N ratio3 lage hoge lage hoge
Membraan vervorming geen geen geen Ja4
Mechanische manipulatie geen Ja5 Ja Ja
Membraan perfusie geen geen Ja Ja
Lipide composities Divers beperkte6 Divers Divers
1 Het slagingspercentage van het vormen van stabiele lipide dubbelgelaagde per proef.
2 Vorming van een nieuwe membraan snel na afbraak van een membraan. Membraan wordt ook herhaaldelijk gevormd.
3 De signal-to-noise (S/N) verhouding tussen vertegenwoordigt de elektrische achtergrond lawaai primaire gegenereerd op basis van de capaciteit van het membraan.
4 Concave of convexe membraan kan worden gevormd door het toepassen van verschillende innerlijke druk tussen twee bubbels.
5 Alleen het verhogen van de spanning van het membraan.
6 Fosfolipiden die gigantische unilamellar blaasjes kunnen gelden, maar de giga-seal kan niet worden bereikt.

Tabel 1: Kenmerken van verschillende lipide dubbelgelaagde membranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methode van het CBB van lipide dubbelgelaagde formatie is gebaseerd op het beginsel van een water-in-olie-droplet omzoomd door een enkelgelaagde20. Technisch, zijn de procedures voor de vorming van CBBs eenvoudig, vooral voor patch-clamp onderzoekers, die bedreven zijn in het manipuleren van glas micropipetten. Het elektrofysiologische setup voor de patch-clamp is gemakkelijk in het CBB gebruikt wanneer twee Pipetteer manipulators met microinjectors beschikbaar zijn. Aan de andere kant, omdat het CBB een opvolger van de conventionele PLB is, voor die een grote hoeveelheid fysisch-chemische kennis geaccumuleerde8, deze achtergrond evenals kennis van Oppervlaktechemie geweest38 is handig voor de exploitatie en manipuleren van CBBs. Het CBB serveert een veelzijdig platform voor het bestuderen van kanaal-membraan wisselwerkingen met zijn capaciteit van het wijzigen van de chemische samenstelling en fysieke toestand61. In het CBB, lipiden voering de zeepbel kunnen diffuus vrij over de grens van de enkelgelaagde fase en de bijsluiter van de dubbelgelaagde, en we hebben ontwikkelde technieken, zoals de dubbelgelaagde hechten-losmaken en de membraan perfusie methoden45. We hebben uitgebreid CBBs voor in vitro kanaal eiwitsynthese, waar kanaal synthese is uitgevoerd in de zeepbel, en nieuw samengestelde kanaal eiwitten werden onderworpen aan spontane overdracht aan de dubbelgelaagde onder toepassing van een membraanpotentiaal waar was ontluikende kanaal functies van het KcsA-kanaal van de tijd voor het inleiden van de transcriptie/vertaling van KcsA DNA62getraceerd.

Onder de trappen van het protocol is het van cruciaal belang de belgrootte handhaven. De blaasjes kunnen langzaam zwellen of krimpen spontaan omdat lipid transfer naar de interface traag is en de enkelgelaagde spanning gevoelig is voor het wijzigen. In het bijzonder de eerste zeepbel opgeblazen net na de zuiging van de liposomen oplossing (stappen 4.8.3 en 4.10) is moeilijk te handhaven omdat de spanning monolayer wordt verlaagd door de liposomen verzameld op het puntje van de pipet. De stabiele CBB teruggooi de eerste bubbels en de daaropvolgende vorming van de belletjes geven. Visuele tracering van de belgrootte en fine tuning van de druk zijn nodig.

Er zijn experimentele beperkingen aan de CBB methode. Hoewel het CBB is bedoeld voor elektrofysiologische metingen, de elektrische weerstand van de dubbelgelaagde voor bepaalde lipide-composities mogelijk niet hoog genoeg (bv100 GΩ) voor één-kanaals opnames. Bijvoorbeeld, dioleoyl dunlaag wordt vaak gebruikt voor liposomen, maar vormt het elektrisch lekkende CBBs bij 25 ° C63. CBBs kan niet zelfs met lipide soorten waarvan fase overgang temperatuur hoger dan de temperatuur van de opname is worden gevormd. Inderdaad, CBB formatie moeizaam met dipalmitoyl dunlaag bij kamertemperatuur, maar het verhogen van de temperatuur boven Tm omzeild het probleem64. In deze experimenten, was de temperatuur gecontroleerd met behulp van een transparante warmte plaat (Zie Tabel van materialen) onder de dia glas62. De fase overgang temperatuur van de veelgebruikte lipide diphytanoyl dunlaag lager is dan 0 ° C en 65, en CBBs zijn gemakkelijk gevormde32,45,51 bij een breed temperatuurbereik.

Fosfolipiden van de water-olie-interface zijn geleverd door de lipide-in of lipide-out methode, waar de overdrachtssnelheid relatief langzamer in de lipide-out dan in de lipide-in methode63 is. Bovendien, om onbekende redenen is de elektrische weerstand van de dubbelgelaagde membraan relatief kleiner met de methode van de lipide-out dan met de methode lipide-in.

In het protocol (stap 4.8), een oplossing van liposomen en kanaal-gereconstitueerd liposomen (1 µL) wordt geladen vanaf de punt van de Pipet (stappen 4.9 en 4.10) en de rest van de pipet bevat de eerder ingevulde elektrolyt oplossing. Dit is alleen voor het behoud van de materialen, zoals lipiden en kanaal moleculen. Bijgevolg de liposomen diffuse geleidelijk naar de bovenste Pipetteer oplossing, en na een tijdje, de concentratie van de lipide aan het uiteinde van de pipet wordt onvoldoende naar formulier lipide monolayers. In dit geval moet vers liposoom oplossing worden aanzuiging van de tip (stap 4.8). Deze wijziging van de temporele concentratie kan worden omzeild wanneer de hele Pipet is gevuld met de oplossing met lipiden en kanaal moleculen, overwegende dat liposomen geleidelijk in de bubbels settelen. In dit geval worden bubbels vernieuwd.

Electrophysiologically, is de CBB groter dan die van de klem van de patch, dus levert een grotere capaciteit van de membraan. De serie weerstand (de elektrische weerstand in een aantal membraan weerstand) is echter veel lager (~ 100 kΩ) dan die voor de patch klem (Pipetteer weerstand > 1 MΩ), die de snelheid van de klem spanning versnelt en verzwakt de achtergrondgeluiden en serie weerstand fouten in de spanning-geklemd membraan potentieel66,67,68. De achtergrondgeluiden is een functie van de membraan precisiecapaciteit en de weerstand van de serie, waar een lage serie resistentie is een aanvulling op een hoge membraan capaciteit, wat resulteert in lage achtergrond lawaai9.

Als een regel van lipide dubbelgelaagde experimenten, moeten detergentia niet worden gebruikt om te wassen van glaswerk. Zelfs een spoor hoeveelheid wasmiddel ten de integriteit van de dubbelgelaagde. Organische oplosmiddelen zoals chloroform/methanol en ethanol moeten in plaats daarvan voor dergelijke schoonmaak doeleinden worden gebruikt.

Over het geheel genomen integreert het CBB de voordelen van zowel het patch-clamp (bijvoorbeeld, de mechanische manipulatie van het membraan) en de PLB (bijvoorbeeld, de mogelijkheid tot wijziging van de samenstelling van lipide van het membraan). Diverse soorten kanaal-vormende stoffen en kanaal eiwitten geweest bestudeerde52,53,,69,70. De ontwikkeling van deze methode is opportuun aangezien steeds meer onderzoekers zijn gericht op kanaal-membraan samenspel en de CBB een veelzijdig platform voor verschillende experimenten biedt. Verdere worden experimentele ontwikkelingen in de CBB methode verwacht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.

Acknowledgments

De auteurs bedank Mariko Yamatake en Masako Takashima voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund gedeeltelijk door KAKENHI subsidie nummers 16H 00759 en 17 H 04017 (SO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , Sinauer Associates Inc. Sunderland. (2001).
  2. Oiki, S. Channel function reconstitution and re-animation: a single-channel strategy in the postcrystal age. The Journal of Physiology. 593, 2553-2573 (2015).
  3. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194 (4832), 979-980 (1962).
  4. Hladky, S. B., Haydon, D. A. Discreteness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Nature. 225, 451-453 (1970).
  5. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  6. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  7. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. New York. (2009).
  8. Miller, C. Ion Channel Reconstitution. , Springer. New York. (1986).
  9. Wonderlin, W. F., Finkel, A., French, R. J. Optimizing planar lipid bilayer single-channel recordings for high resolution with rapid voltage steps. Biophysical journal. 58 (2), 289-297 (1990).
  10. Oiki, S. Planar Lipid Bilayer Method for Studying Channel Molecules. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. Tokyo. 229-275 (2012).
  11. Kapoor, R., Kim, J. H., Ingolfson, H., Andersen, O. S., O, Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments. Journal of Visualized Experiments. (20), e1033 (2008).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  14. Watanabe, R., Soga, N., Hara, M., Noji, H. Arrayed water-in-oil droplet bilayers for membrane transport analysis. Lab on a Chip. 16 (16), 3043-3048 (2016).
  15. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  16. Tonooka, T., Sato, K., Osaki, T., Kawano, R., Takeuchi, S. Lipid bilayers on a picoliter microdroplet array for rapid fluorescence detection of membrane transport. Small (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 10 (16), 3275-3282 (2014).
  17. Dixit, S. S., Kim, H., Vasilyev, A., Eid, A., Faris, G. W. Light-driven formation and rupture of droplet bilayers. Langmuir. 26 (9), 6193-6200 (2010).
  18. Malmstadt, N., Nash, M. a, Purnell, R. F., Schmidt, J. J. Automated formation of lipid-bilayer membranes in a microfluidic device. Nano letters. 6 (9), 1961-1965 (2006).
  19. Najem, J. S., et al. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  20. Oiki, S., Iwamoto, M. Channel-Membrane Interplay in Lipid Bilayer Membranes Manipulated through Monolayer Technologies. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 41, 303-311 (2018).
  21. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophysical Journal. 41 (2), 119-133 (1983).
  22. Oiki, S., Danho, W., Madison, V., Montal, M. M2 delta, a candidate for the structure lining the ionic channel of the nicotinic cholinergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (22), 8703-8707 (1988).
  23. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Voltage-dependent gating of an asymmetric gramicidin channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (6), 2121-2125 (1995).
  24. Sigworth, F. J., Urry, D. W., Prasad, K. U. Open channel noise. III. High-resolution recordings show rapid current fluctuations in gramicidin A and four chemical analogues. Biophysical Journal. 52 (6), 1055-1064 (1987).
  25. Iwamoto, M., et al. Surface structure and its dynamic rearrangements of the KcsA potassium channel upon gating and tetrabutylammonium blocking. The Journal of Biological Chemistry. 281 (38), 28379-28386 (2006).
  26. Iwamoto, M., Oiki, S. Amphipathic antenna of an inward rectifier K+ channel responds to changes in the inner membrane leaflet. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 749-754 (2013).
  27. Oiki, S., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Asymmetric gramicidin channels: heterodimeric channels with a single F6Val1 residue. Biophysical Journal. 66 (6), 1823-1832 (1994).
  28. Ando, H., Kuno, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. Coupled K+-water flux through the HERG potassium channel measured by an osmotic pulse method. The Journal of General Physiology. 126 (5), 529-538 (2005).
  29. Kuno, M., et al. Temperature dependence of proton permeation through a voltage-gated proton channel. The Journal of General Physiology. 134 (3), 191-205 (2009).
  30. Iwamoto, M., Oiki, S. Counting Ion and Water Molecules in a Streaming File through the Open-Filter Structure of the K Channel. The Journal of Neuroscience. 31 (34), 12180-12188 (2011).
  31. Chang, H. K., Iwamoto, M., Oiki, S., Shieh, R. C. Mechanism for attenuated outward conductance induced by mutations in the cytoplasmic pore of Kir2.1 channels. Scientific Reports. 5, (2015).
  32. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Scientific Reports. 5, 9110 (2015).
  33. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  34. Petelska, A. D. Interfacial tension of bilayer lipid membranes. Central European Journal of Chemistry. 10 (1), 16-26 (2012).
  35. Benz, R., Conti, F. Effects of hydrostatic pressure on lipid bilayer membranes. I. Influence on membrane thickness and activation volumes of lipophilic ion transport. Biophysical Journal. 50 (1), 91-98 (1986).
  36. Meryman, H. T., Kafig, E. The study of frozen specimens, ice crystals and ice crystal growth by electron microscopy. Naval Medical Research Institute, National Naval Medical Center. , (1955).
  37. Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 3 (1), 45-60 (1957).
  38. de Gennes, P. -G., Brochard-Wyart, F., Quére, D. Capillarity and Wetting Phenomena: Drops, Bubbles, Pearls, Waves. , Springer. New York. (2003).
  39. Butt, H. -J., Kappl, M. Surface and Interfacial Forces. , Wiley-VCH. Weinheim. (2018).
  40. Requena, J., Haydon, D. A. The Lippmann equation and the characterization of black lipid films. Journal of Colloid and Interface Science. 51 (2), 315-327 (1975).
  41. Taylor, G. J., et al. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  42. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  43. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 12 (4), 432-445 (1972).
  44. White, S. H. The physical nature of planar bilayer membranes. Ion Channel Reconstitution. Miller, C. , Springer. New York. 3-35 (1986).
  45. Iwamoto, M., Oiki, S. Membrane Perfusion of Hydrophobic Substances Around Channels Embedded in the Contact Bubble Bilayer. Scientific Reports. 7 (1), 6857 (2017).
  46. Velarde, M. G., Zeytounian, R. K., et al. Interfacial phenomena and the Marangoni effect. , Springer. (2002).
  47. Ryazantsev, Y. S., et al. Thermo- and soluto-capillarity: Passive and active drops. Advances in Colloid and Interface Science. 247, 52-80 (2017).
  48. Kornberg, R. D., Mcconnell, H. M. Inside-Outside Transitions of Phospholipids in Vesicle Membranes. Biochemistry. 10 (7), 1111-1120 (1971).
  49. Wimley, W. C., Thompson, T. E. Exchange and Flip-Flop of Dimyristoylphosphatidylcholine in Liquid-Crystalline, Gel, and Two-Component, Two-Phase Large Unilamellar Vesicles. Biochemistry. 29 (5), 1296-1303 (1990).
  50. Nakao, H., et al. pH-dependent promotion of phospholipid flip-flop by the KcsA potassium channel. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1848 (1), 145-150 (2015).
  51. Matsuki, Y., et al. Rectified Proton Grotthuss Conduction Across a Long Water-Wire in the Test Nanotube of the Polytheonamide B Channel. Journal of the American Chemical Society. 138 (12), 4168-4177 (2016).
  52. Iwamoto, M., Shimizu, H., Muramatsu, I., Oiki, S. A cytotoxic peptide from a marine sponge exhibits ion channel activity through vectorial-insertion into the membrane. FEBS letters. 584 (18), 3995-3999 (2010).
  53. Iwamoto, M., et al. Channel Formation and Membrane Deformation via Sterol-Aided Polymorphism of Amphidinol 3. Scientific Reports. 7 (1), 10782 (2017).
  54. Barry, P. H., Lynch, J. W. Liquid junction potentials and small cell effects in patch-clamp analysis. The Journal of Membrane Biology. 121 (2), 101-117 (1991).
  55. Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of Neuroscience Methods. 51 (1), 107-116 (1994).
  56. Oiki, S., Muramatsu, I., Matsunaga, S., Fusetani, N. A channel-forming peptide toxin: polytheonamide from marine sponge (Theonella swinhoei). Nihon Yakurigaku Zasshi. 110, Suppl. 1 195-198 (1997).
  57. Heginbotham, L., LeMasurier, M., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Single streptomyces lividans K(+) channels: functional asymmetries and sidedness of proton activation. The Journal of General Physiology. 114 (4), 551-560 (1999).
  58. Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the Streptomyces lividans K+ channel (SKC1): oligomeric stoichiometry and stability. Biochemistry. 36 (33), 10343-10352 (1997).
  59. MacKinnon, R., Cohen, S. L., Kuo, A., Lee, A., Chait, B. T. Structural Conservation in Prokaryotic and Eukaryotic Potassium Channels. Science. 280 (5360), 106-109 (1998).
  60. LeMasurier, M., Heginbotham, L., Miller, C. KcsA: it's a potassium channel. The Journal of General Physiology. 118 (3), 303-314 (2001).
  61. Iwamoto, M., Oiki, S. Constitutive boost of a K+ channel via inherent bilayer tension and a unique tension-dependent modality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , In Press (2018).
  62. Iwamoto, M., Elfaramawy, M. A., Yamatake, M., Matsuura, T., Oiki, S. Concurrent in Vitro Synthesis and Functional Detection of Nascent Activity of the KcsA Channel under a Membrane Potential. ACS Synthetic Biology. 7 (4), 1004-1011 (2018).
  63. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2016).
  64. Silvius, J. R. Thermotropic phase transitions of pure lipids in model membranes and their modifications by membrane proteins. Lipid-protein Interactions. 2, 239-281 (1982).
  65. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 555 (1), 147-167 (1979).
  66. Moore, J. W., Hines, M., Harris, E. M. Compensation for resistance in series with excitable membranes. Biophysical Journal. 46 (4), 507-514 (1984).
  67. Armstrong, C. M., Chow, R. H. Supercharging: a method for improving patch-clamp performance. Biophysical Journal. 52 (1), 133-136 (1987).
  68. Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
  69. Kojima, S., Iwamoto, M., Oiki, S., Tochigi, S., Takahashi, H. Thylakoid membranes contain a non-selective channel permeable to small organic molecules. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7777-7785 (2018).
  70. Winterstein, L. M., et al. Reconstitution and functional characterization of ion channels from nanodiscs in lipid bilayers. Journal of General Physiology. 150 (4), 637-646 (2018).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 143 lipide dubbelgelaagde Patch-Clamp Water-In-olie druppel enkelgelaagde ionkanaal elektrofysiologie oppervlakte chemie
Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter