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Neuroscience

Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Bildung von Lipid Bilayer mit einer Kontakt-Blase Bilayer Methode. Eine Wasser-Blase wird in einem organischen Lösungsmittel, geblasen, wobei eine Monolage an der Wasser-Öl-Grenzfläche gebildet wird. Zwei Pipetten werden manipuliert, um die Luftblasen zu einem Bilayer anzudocken.

Abstract

Lipid Bilayer bieten eine einzigartige experimentelle Plattform für funktionelle Studien der Ionenkanäle, so dass die Prüfung des Kanal-Membran Interaktionen unter verschiedenen Membran Lipid-Kompositionen. Unter anderem hat die Tröpfchen Schnittstelle Bilayer Popularität gewonnen; die große Membran Größe behindert jedoch die Aufzeichnung der elektrischen geringes Grundrauschen. Wir haben festgestellt, dass ein Kontakt Blase Bilayer (CBB)-Methode, die die Vorteile der planaren Lipid Bilayer verbindet und Patch-Clamp-Methoden, wie die Fähigkeit der Lipidzusammensetzung variieren und die Mechanik Bilayer bzw. zu manipulieren. Mit dem Setup für herkömmlichen Patch-Clamp-Experimenten, können CBB-basierten Experimente leicht durchgeführt werden. Kurz gesagt, eine Elektrolyt-Lösung in einer Glaspipette wird in einem organischen Lösungsmittel-Phase (Hexadecan) geblasen, und die Pipette Druck beibehalten wird, um eine stabile Blasengröße zu erhalten. Die Blase ist spontan eine Lipid-Monolayer (reine Lipide oder gemischte Lipide), gesäumt von Liposomen in den Bläschen vorsah. Als nächstes werden die beiden Monolage gesäumten Bläschen (~ 50 µm im Durchmesser) an der Spitze der Glaspipetten für Bilayer Bildung angedockt. Einführung von Kanal rekonstituiert Liposomen in die Blase führt zu die Einbeziehung der Kanäle in der Bilayer, zulassend Einkanal-aktuelle Aufnahme mit einem Signal-Rausch-Verhältnis des Patch-Clamp-Aufnahmen vergleichbar. CBBs mit einem asymmetrischen Lipidzusammensetzung sind leicht gebildet. Der CBB ist wiederholt durch Ausblasen der früheren Bläschen und bilden neue erneuert. Verschiedene chemische und physikalische Störungen (z.B., Membran-Perfusion und Bilayer Spannung) auf die CBBs. hierin auferlegt werden können, präsentieren wir Ihnen das grundlegende Verfahren für CBB Bildung.

Introduction

Für Ionenkanäle ist die Zellmembran nicht einfach ein unterstützendes Material, sondern als Partner für die Erzeugung des Ionen-Fluss. Funktional, die Membran ist ein elektrischer Isolator, in welche, den Ionen Kanäle eingebettet sind, und aller Zellmembranen sind mit einem ruhenden Membranpotential vermittelt. Konventionell, wurde eine willkürliche Membranpotential aus einem Außenkreis verhängt mit dem elektrischer Strom durch die Kanäle gemessen wurde. Diese quantitative Auswertung der Ionen-Fluss an verschiedenen Membran Potenziale offenbart die molekularen Eigenschaften dieser Kanäle, wie ihre ionenselektive Permeation und gating Funktionen1,2. Die Membran-Plattform für funktionelle Studien von Ionenkanälen ist die Zellmembran oder Bilayer Lipidmembran. Historisch, Einkanal-elektrische aktuelle Aufnahmen wurden uraufgeführt im Lipid Bilayer3,4, und die einschlägigen Techniken wurden entwickelt, um Zelle Membranen, wie der Patch-Clamp-Methode (Abbildung 1A )5,6. Seitdem haben sich diese beiden Techniken separat für verschiedene Zwecke (Abbildung 1)7,8entwickelt.

Membranlipide und Bilayer Membranen stehen derzeit im Mittelpunkt der Forschung für ihre Rolle bei der Unterstützung der Struktur und Funktion von Kanalproteinen. Daher ist die sofortige Verfügbarkeit von Methoden, um die Lipidzusammensetzung in Bilayer variieren stark nachgefragt. Lipid Bilayer Bildung Methoden wie die planare Lipid Bilayer (PLB)8,9,10,11, Wasser-in-Öl Tröpfchen Bilayer12und Tröpfchen Schnittstelle Bilayer (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 Techniken (Abbildung 1) sind allgemeine Wahlen, bietet eine Möglichkeit für die Prüfung unter variierenden Lipid Kompositionen20-Kanal-Funktion. Obwohl die DIB technisch wesentlich einfacher ist zu produzieren als die herkömmlichen PLB, die Größe des DIB schuf ein Abschreckungsmittel für Patch-reckenden anwenden für das Studium Einkanal-aktuelle Aufnahmen mit üblichen mittleren Leitwert (< 100 pS).

Um die Geräuschkulisse zu umgehen, muss der Bilayer Umgebung minimiert werden. Dieses Problem, erinnert sich die Wiederholungen der Geschichte bei der Entwicklung von elektrophysiologischer Techniken für Lipid Bilayer (Abbildung 1). In den frühen Tagen bildete sich eine kleine Bilayer (1-30 µm im Durchmesser) an der Spitze der Pipette (Tipp-Dip-Methode; Abbildung 1 ( C) 21 , 22 , 23, anstatt mit einem freistehenden Bilayer (~ 100 µm im Durchmesser) auf eine hydrophobe Septum in einer Kammer (Abbildung 1B). Die Tipp-Dip-Methode für elektrische Messungen mit viel niedrigeren Hintergrund Lärm24zulässig. Unsere Erfahrungen mit der PLB-25,26, Tipp-Dip22,23,27und Patch-Clamp28,29,30, 31 -Methoden führte uns auf eine neue Idee von Lipid Bilayer mit den Grundsätzen der Wasser-in-Öl-Bilayer bildet. Wir haben dies als Kontakt Blase Bilayer (CBB) Methode20,32bezeichnet. Bei dieser Methode anstatt hängen die Wassertropfen in einer Ölphase (Abbildung 1D), eine Wasser-Blase wird geblasen aus einer Glaspipette (mit Durchmesser von ca. 30 µm) in die Ölphase (Abbildung 1E und 2), wo die Blase wird durch einen stetigen Druck aufrechterhalten. Spontan an der Wasser-Öl-Schnittstelle an der Oberfläche der Blase bildet sich eine Monolage. Dann zwei Seifenblasen durch die Manipulation von zwei Glaspipetten angedockt sind, und die Bilayer bildet sich nähern die beiden Monolagen einander, einen Gleichgewicht Bilayer Bereich nachgeben. Die Größe der Blase wird durch den Intra-Blase Druck (Nachdruck), und ebenso die Bilayer Größe gesteuert. Ein Durchmesser von 50 µm wird häufig verwendet. Obwohl das Volumen der Blase klein ist (< 100 pL), Anschluss an das größere Volumen der Pipette-Lösung, die im Bereich Mikroliter, bilden die Bulk-Elektrolyt-Phase ist.

Es gibt viele Vorteile, die CBB-Methode (Tabelle 1) zu verwenden. Als Lipid Bilayer Bildung Technik Membranen der verschiedenen Lipid-Kompositionen herstellbar und asymmetrische Membranen sind leichter gebildeten32 , als die von herkömmlichen klappbare Methode33sind. Die Bilayer kann mechanisch bearbeitet werden, im Gegensatz zu den herkömmlichen PLB, die nur mit einem hydrostatischen Druck Unterschied34,35gebogen werden kann. Durch die Veränderung der Nachdruck, die Luftblasen erweitern oder verkleinern, was zu erhöhten oder verringerten Membran Spannung32. Die Bilayer ist mechanisch abnehmbar in Monolayer, ähnlich wie die Freeze-Fraktur Technik36,37 der Membranen in den morphologischen Studien, aber mit der CBB ermöglicht eine Manöver wiederholt trennen und anfügen Zyklen32 . Das geringe Volumen der Elektrolyt-Lösung innerhalb der Blase ermöglicht effiziente Mischung aus Kanal rekonstituiert Liposomen in der Bilayer, und die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens Kanal Aufnahmen ist viel höher als bei der konventionellen PLB-Technik. Das kleine Blase Volumen ermöglicht schnelle Perfusion (innerhalb von ~ 20 ms) auch einmal eine weitere Injektion Pipette wird entweder der Bläschen eingelegt. Im Gegensatz zur Patch-Clamp-Methode einmal gebrochen, eine CBB-Membran ist neu formiert, sofort und immer wieder, und Pipetten können mehrmals täglich verwendet werden. Durch die Integration Vorteile der Patch-Clamp und PLB Methoden, bietet der CBB eine vielseitige Plattform um die physikalisch-chemischen Bedingungen der Membran variieren für noch nie dagewesene Studien von Kanal-Membran Interaktionen ermöglicht.

Vor der Präsentation eines detaillierten Protokolls der CBB-Entstehungsprozess, ist physikalisch-chemischen Hintergrund der Bilayer Bildung zunächst dargestellt, die hilfreich für Patch-reckenden experimentelle Schwierigkeiten in Bezug auf die Membran Bildung behoben werden Das sind anzutreffen.

CBB Experimente vermitteln Lektionen der Oberflächenchemie Wissenschaft38. Der CBB ist ähnlich wie eine Seifenblase geblasen aus einem Strohhalm in die Luft, wo ebenfalls, eine Wasser-Blase in einem organischen Lösungsmittel geblasen. Man wird feststellen, dass eine Wasser-Blase kaum aufgeblasen wird, wenn Membranlipide nicht in das Wasser-Blase oder dem organischen Lösungsmittel enthalten sind. Bei fehlender amphipathische Lipide die Oberflächenspannung an einer Wasser-Öl-Schnittstelle ist hoch, und der Intra-Blase Druck für eine Seifenblase wird hoch sein. Dies ist eine Erkenntnis der Laplace-Gleichung (ΔP = 2 γ/R, wo ΔP ist der Druck, Intra-Blase, γ ist Oberflächenspannung und R ist der Blasenradius). Wenn die Konzentration von Lipiden in der organischen Phase oder der Elektrolytlösung hoch ist, erhöht die Dichte der Lipide in der Monolage, wie von Gibbs Adsorption Isotherm diktiert (-Dγ = Γich Dµich, wo Γich die Oberfläche Selbstbeteiligung ist der Verbindung i und µich ist das chemische Potential der Komponente ich)39, führt zu einer niedrigeren Oberflächenspannung und Leichtigkeit der Blasenbildung. In der CBB das Bilayer beobachtet werden, von einem tangentialen Winkel (Abbildung 2), und des Kontaktwinkels zwischen der Monolage und Bilayer messbar. Dieser Winkel stellt ein Gleichgewicht zwischen den Surface tensions der Monolage und Bilayer (junge Gleichung: γBi = γMo cos(θ), wo γBi ist die Bilayer Spannung, γMo ist die Monolayer-Spannung und θ ist der Kontaktwinkel). Die Änderungen in der Kontaktwinkel zeigen Veränderungen in der Bilayer Spannung, angesichts der Tatsache, dass die Monolayer-Spannung als Funktion des Membranpotentials von Änderungen in der Kontaktwinkel ausgewertet wird (Young-Lippmann Gleichung: γMo = Cm V2 /4 (cos (θ0) - cos (θV)), wo Cm die Membran Kapazität ist V das Membranpotential ist und θ0 und θV jeweils der Kontaktwinkel auf 0 und V mV sind)40,41 ,42. Wenn zwei Bläschen nah genug sind, gehen sie einander spontan. Dies ist aufgrund der Van-Der-Waals-Kraft, und wir können visuell beobachten dieser dynamischen Prozess in CBB-Formation.

Ein CBB-System besteht aus verschiedenen Phasen: nämlich ein Großteil Ölphase, Wasser Bläschen mit einem monomolekularen Film und eine Kontaktaufnahme mit Bilayer (Abbildung 3) beschichtet. Diese ähneln der mehrere Phasen in einem PLB, z. B. eine lösemittelhaltige Torus um die Bilayer-Phase und eine dünne organische Phase eingeklemmt durch zwei Monolagen43,44beobachtet. In der CBB Monolayer-Phase ist kontinuierlich mit der Bilayer Broschüre und Lipidmoleküle leicht diffundieren zwischen der Monolage und die Packungsbeilage. Die Monolayer-Phase umfasst einen Großteil der Blase Oberfläche, bilden die Hauptphase, die als ein Lipid-Reservoir dient. Weil das hydrophobe Ende der Lipide in der Monolage erstreckt sich nach außen auf die Masse Ölphase, öffnet Bilayer Interieur oder die hydrophoben Kern der Masse Ölphase. Somit ist eine hydrophobe Substanz injiziert in die Ölphase in der Nähe der Bilayer Bilayer Innenraum leicht zugreifen. Dies ist die Membran Perfusion Technik, die wir kürzlich45, entwickelt hatte, durch die die Lipidzusammensetzung in der Bilayer schnell (innerhalb einer Sekunde) bei Einkanal-aktuelle Aufnahmen geändert. Wir fanden, dass der Cholesteringehalt in der Bilayer reversibel durch die Cholesterin-Durchblutung an und Ausschalten45gesteuert werden konnte. Den Fall, dass die Konzentration des betreffenden Stoffes in der Monolage und Bilayer unterscheidet, ist das Konzentrationsgefälle des betreffenden Stoffes sofort durch Diffusion, aufgelöst bekannt als der Marangoni Effekt46, 47. auf der anderen Seite sind Flip-flops über die Monolagen langsam48,49,50.

Bei der CBB-Methode der Bilayer bildet sich unter vielseitigen physikalisch-chemischen Bedingungen, wie ein Elektrolyt pH-Wert so niedrig wie 1 51, eine Konzentration von Salz (K+, Na+)bis zu 3 M, ein Membran-Potential so hoch wie ±400 mV und ein System bis zu 60 ° c.

Es gibt mehrere Optionen für die Bildung der CBB und Einbeziehung der Kanal Moleküle darin. Für Bildung von der Monolage an der Wasser-Öl-Schnittstelle sind Lipide hinzugefügt, entweder in einem organischen Lösungsmittel (Lipid-Out-Methode; Abbildung 4 A, 4 C) oder in einer Blase als Liposomen (Lipid-Methode; Abbildung 4 " B, 4D). Insbesondere kann die Lipid-Methode für die Bildung von asymmetrischen Membranen15,32. Kanal-Moleküle in wässriger Lösung (z.B. Kanal bilden Peptide) löslich werden direkt in die Blase (Abbildung 4A, B)52,53, hinzugefügt, während Kanalproteinen in wieder hergestellt werden Liposomen, die dann in die Blase (Abbildung 4C, D) hinzugefügt werden. Hierin, die Bildung von CBBs durch das Lipid-in-Verfahren für entweder ein Kanal-Peptid (Polytheonamide B (pTB); Abbildung 4 ( A) oder ein Protein (KcsA Kaliumkanal, Abbildung 4C) angezeigt wird.

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Protocol

1. bereiten Sie Liposomen

  1. Phospholipide (z.B. 10 mg Pulver) im Chloroform bei einer gewünschten Konzentration (z.B. 10 mg/mL) auflösen.
  2. Verdunsten Sie Chloroform.
    1. Ort der Phospholipid-Lösung in ein Rundboden Kolben und es auf einen Drehverdampfer (siehe Tabelle der Materialien) mit einer Gasflasche N2 verbunden. Drehen Sie die Flasche unter N2 fließen bei Raumtemperatur bis ein dünne Phospholipid-Film (nach ~ 30 min) erscheint.
    2. Legen Sie die offene Flasche in den Exsikkator gestellt, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist. Mit der Vakuumpumpe, aspirieren Sie die Innenseite der Exsikkator für mehrere Stunden um die Chloroform gründlich zu entfernen.
  3. Fügen Sie einem entsprechenden Volumen eine Elektrolyt-Lösung in den Kolben und hängen Sie die Phospholipid um 2 mg/mL Phospholipid Aussetzung zu erhalten.
  4. Beschallen Sie die Suspension für einige zehn Sekunden mit einer Bad Sonikator (siehe Tabelle der Materialien), eine vielschichtige Vesikel (MLV) Suspension zu erhalten.
  5. Für die Vorbereitung von Proteoliposomes, die Ionen-Kanalproteine enthalten, fügen Sie eine Proteinlösung (mit den Proteinen solubilisiert mit geeigneten Reinigungsmitteln; 2 % Volumen ist das Maximum) die MLV-Aussetzung und für einige Sekunden mit dem Bad Sonikator beschallen.

2. bereiten Sie große Bohrung Glaspipetten

  1. Ein Glas Kapillare auf eine Pipette Puller und fabrizieren Sie Mikropipetten mit einer feinen konische Spitze durch zweistufige ziehen.
  2. Die Mikropipette auf ein Microforge gesetzt, und wenden Sie sich an die Spitze der Mikropipette zu einem Platin Faden auf den konischen Teil mit einem Durchmesser von 30 bis 50 µm.
  3. Das Filament kurz erhitzen (5 s) und schalten Sie es sofort aus.
    Hinweis: Diese Manipulation Formen ein Riss an der Heizung zeigen, wobei die Spitze der Mikropipette abgeschnitten ist, verlässt eine große Bohrung mit einem Durchmesser von 30 bis 50 µm.

3. behandeln Sie die Oberfläche der Objektträger mit einem flachen konkaven gut (Silikonisierung für eine wasserabweisende Oberfläche)

  1. Reinigen Sie die Oberfläche der Objektträger mit einem seichten Brunnen mit destilliertem Wasser und Ethanol.
  2. Gelten Sie einem entsprechenden Volumen (z.B. 100 µL) ein siliconizing Reagenz (wasserabweisend) auf das Loch Folie Glas.
  3. Trocknen Sie das Reagenz vollständig an der Luft.
  4. Legen Sie die Glas-Folie, auf der Bühne von einem inversen Mikroskop.

(4) bilden Sie die CBB und vornehmen elektrophysiologische Messung

  1. Fügen Sie 100 µL Hexadecan in die flache Mulde des Glases silikonisierte Loch schieben.
    Hinweis: Für die Lipid-Out-Methode werden Phospholipide in Hexadecan (20 mg/mL) im Voraus verteilt.
  2. Füllen Sie der Elektrolyt-Lösung bis zur halb so lang wie die Mikropipette mit einer Tuberkulin-Spritze auf.
  3. Legen Sie die Mikropipette auf den Mikropipette Halter mit einem Druckanschluss, so dass die Ag/AgCl-Draht-Elektrode in die Pipette-Elektrolyt-Lösung einweichen.
  4. Einer der Mikropipette an den Kopf Bühne von einem Patch-Clamp-Verstärker und die andere für die Erdung anschließen.
  5. Schließen Sie ein Microinjector an den Druckanschluß des Inhabers Mikropipette.
  6. Legen Sie die Mikropipette an eine gewünschte Position über der Bühne von einem inversen Mikroskop durch Manipulation der Mikromanipulator.
  7. Potenzielle Elektrode Versatz einstellen.
    1. Platz 1 µL der gleichen Elektrolytlösung verwendet, um die Mikropipette auf die flache Oberfläche um den flachen Brunnen das Loch Folie Glas, erstellen eine Elektrolyt-Kuppel füllen.
    2. Tränken Sie die Spitze der beiden Mikropipetten in die Elektrolyt-Kuppel durch Manipulation der Mikromanipulator.
    3. Passen Sie die Elektrode Offset Potenzial des Patch-Clamp Verstärkers.
    4. Bestätigen Sie die korrekte Offset am Ende der Experimente durch das Brechen der CBB durch Anwendung der hohen Membranpotential (elektrischer Durchschlag; mit Zap am Verstärker), verursachen die beiden Luftblasen, um in einer (Blase Fusion) fixiert werden.
    5. Flüssige Verzweigung potenzielle54 in den Fällen, in denen asymmetrische Elektrolytlösungen verwendet werden, zu korrigieren, so dass angewandte Membranpotentials für wahre Membranpotentials der berechnete Wert hinzugefügt wird.
      Hinweis: Die flüssige Kreuzung potenzielle wird berechnet mit Hilfe des Programms JPCalc55.
  8. Zeichnen Sie die Liposomen-Lösung von der Spitze.
    Hinweis: Bei der Prüfung wasserlöslicher Kanäle mit der Lipid-Out-Methode ist Absaugen der Liposomen-Lösung nicht erforderlich.
    1. Platz 1 µL Liposomen-Lösung auf die flache Oberfläche um den flachen Brunnen das Loch Folie Glas (Liposomen-haltigen Kuppel).
    2. Manipulieren Sie der Mikromanipulator und stecken Sie die Spitze der Mikropipette in Liposomen-haltigen Kuppel.
    3. Aspirieren Sie die Liposomen-haltige Lösung durch Senkung des Drucks in der Mikropipette Halterung mit der Microinjector.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Pipette.
  9. Manipulieren Sie der Mikromanipulator und Tauchen Sie die Spitze der Mikropipette in Hexadecan in die flache Mulde.
  10. Schlag eine Wasser-Blase langsam durch den Druck zu erhöhen, bis die Blase die gewünschte Größe (z.B. 50 µm im Durchmesser erreicht) und danach den gleichen Druck beibehalten.
  11. Verwerfen Sie die Luftblasen durch die Spitze über die Öl-Luft-Schnittstelle zu verabschieden, wenn es schwer ist, die Größe der Bläschen stabil zu halten.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 4.8, 4.9 bis stabile Bläschen gebildet werden.
  13. Manipulieren Sie die Luftblasen um Kontakt zwischen ihnen (Abbildung 5) zu ermöglichen.
    Hinweis: Manchmal, nähern sich die Bläschen spontan zu der CBB. In anderen Fällen die Luftblasen sind in der Nähe aber nicht gegenseitig berühren. In diesem Fall drücken Sie den Bläschen gegenseitig mechanisch.
  14. Optimieren Sie den Druck, die Blasengröße beizubehalten, weil die Größe auch bei konstanter Intra-Blase Druck allmählich ändern kann.
  15. Die Membran mit dem entsprechenden Wert der Patch-Clamp-Verstärker mit potenziellen stellen und warten für den Kanal aktuelle entstehen (Abbildung 6).

5. Messen Sie Bilayer Kapazität

  1. Messen der Bilayer elektrische Kapazität (Cel) durch die Anwendung einer potenziellen Rampe.
    Hinweis: Wenn die Änderungsrate der Spannung in der Rampe Befehl 10 mV/10 ms (oder 1 V/s) gefolgt von-10 mV/10 ms ist, entspricht die Amplitude der aktuellen Sprung auf Änderungen in den Hang zum Lesen des Wertes (z.B. membrane'scapacitance 100 pA → 100 pF).
  2. Bewerten der Bilayer Gegend von zwei Bläschen aufeinander gestapelt und konzentrieren das Mikroskop auf Bilayer Ebene an den Rand des Bilayer (Abbildung 6).
    Hinweis: Die Bilayer Form ist meist kreisförmig, und das Gebiet errechnet sich aus dem Radius.
  3. Die spezielle Membran-Kapazität (Csp) zu berechnen, indem man die elektrische Kapazität von Bereich Bilayer (Csp = Cel/A).
  4. Berechnen Sie die Bilayer Dicke (Dicke der hydrophoben Kern) mit Dc = (εrε0) / csp (wo εR ε0 stehen für die Permittivität der hydrophoben Region der Bilayer und der Permittivität ein Vakuum, beziehungsweise).

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Representative Results

Eine typische CBB hatte einen Durchmesser von 50 µm (Abbildung 56) und die spezielle Membran-Kapazität im Hexadecan war 0,65 µF/cm2. Die Blasengröße wurde willkürlich durch die Intra-Blase Druck gesteuert. Wenn Bläschen für rauscharme Aufnahmen notwendig sind, sollte der Kopfkreis entsprechend klein sein. Beispielsweise sollte der Kopfkreis für eine Blasengröße von 50 µm im Durchmesser, 30 µm.

Sobald die CBB gebildet hatte, wurden die Kanal-Moleküle in wässriger Lösung oder in den Liposomen spontan in der Bilayer innerhalb einer Zeitspanne von wenigen Dutzend Minuten eingefügt. Einfügung der Kanäle wurde durch die schrittweise Erhöhung der aktuellen Amplitude (Abbildung 7) unter den angewandten Membranpotential bestätigt. Die kleinere Membranfläche (< 1.000 µm2) im Verhältnis zu dem in der konventionellen PLB und DIB Systeme wesentlich verbessert das elektrische Signal-Rausch-Verhältnis.

Aktuelle Aufnahmen konnte fortgesetzt werden, bis die Membran kam zum Erliegen und die zwei Bläschen zusammengeführt. Neue Bläschen wurden gesprengt und der CBB gebildet, sofort und immer wieder. Die Pipette konnte mehrmals innerhalb eines Tages verwendet werden.

Pflicht-Zyklus anfügen und trennen. Ein Bilayer gebildet von der CBB-Methode kann in zwei Monolagen zerfiel. Der CBB lösen-anhängen können wiederholt werden, durch die Manipulation der zwei Seifenblasen (Einschaltdauer von Detach-attach). Dieser Prozess wurde durch das Auftreten von der Kanal-Strom der pTB, ein Peptid-Kanal von einem marinen Schwamm überwacht, da es leicht in die Lipid-Bilayer bilden eine monovalente kationen-selektive Pore52,56eingefügt wurde. Die pTB-Kanal aktuelle entstand sofort nach dem Anbringen der beiden Monolagen, und der Strom wurde größer als der Kontaktbereich erhöht (Abbildung 8). Die Amplitude des Stromes wurde synchronisiert mit der trennen-Manipulation der CBB befestigen.

Einkanal - Messungen des KcsA Kanals. Die KcsA Kaliumkanal ist pH empfindlich, durch sauren intrazellulären pH57aktiviert wird. So wurde die Elektrolytlösung eingerichtet, um asymmetrische58,59,60sein. Im Schritt 4.2 CBB Bildung setzte die Pipette-Lösung von der linken Seite bei pH 4, von der rechten Seite bei pH 7,5-25festgelegt wurde. Im Schritt 4.7.1 wurde eine Proteoliposome Federung, anstatt Liposomen Aufhängung auf der Folie Glas für Aspiration in die linke Pipette gelegt. Dementsprechend war die KcsA-Kanal in der Membran mit seiner cytoplasmatischen Domäne mit Blick auf die linke Blase orientiert. Liposomen mit dem Protein: Lipid-Gewichts-Verhältnis von 1: 2000 eignen sich für Einkanal-aktuelle Aufnahme, und solche mit einer 01:10-Verhältnis sind für makroskopische aktuelle Aufnahme.

Asymmetrischer Membran. Eine asymmetrische Lipid Bilayer kann mit verschiedenen Liposomen-Suspensionen für jede Blase (Lipid-in)15,32gebildet werden. Die Ausrichtung der KcsA Kanal in der Membran wurde geregelt durch eine asymmetrische Lösung pH (pH 4in/pH 7heraus), führt zu ihre cytoplasmatischen Seite wird auf der linken Seite einstellen. Dementsprechend wurde die linke Seite als "in" zugewiesen, während die Rechte Seite als "Out." zugewiesen wurde Um Lipid Abhängigkeit die Anspritzung des Kanals KcsA zu untersuchen, wurden vier Arten von CBB (einschließlich einer asymmetrischen CBB) verwendet; nämlich, PGin/PGheraus, PGin/PCheraus, PCin/PGheraus, und PCin/PCheraus (PG: Phosphatidylglycerol) (Abbildung 9). Die KcsA Kanal ausgestellt offen mit hohen Wahrscheinlichkeit (> 90 %) nur in den PGin/PGheraus und PGin/PC, Membranen. Die KcsA Kanal setzt die Existenz von anionischen Phospholipiden im Inneren Merkblatt der Membran für eine offene mit hoher Wahrscheinlichkeit26.

Figure 1
Abbildung 1 : Lipid Bilayer und Patch-Clamp Methoden. Verschiedene Methoden wurden entwickelt für die Bildung der Lipid Bilayer. (A) Patch-Clamp-Methode. (B) die konventionelle planar Lipid Bilayer-Methode, die ein freistehendes, meist vertikal, Bilayer auf ein kleines Loch bietet. (C) Tipp-Dip-Methode. Eine Monolage an der Luft-Wasser-Schnittstelle befindet sich an der Spitze einer Glaselektrode. Verschiedene Modifikationen entstanden sind. (D) Tröpfchen Schnittstellenmethode Bilayer. (E) Kontakt Blase Bilayer Methode. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 2
Abbildung 2 : Kontaktieren Sie Blasenbildung Bilayer. Wie eine Blase in einer Ölphase geblasen wird, übertragen Lipidmoleküle spontan auf die Wasser-Öl-Schnittstelle. Verschiedene Arten von Lipiden wie Liposomen in jedem enthalten sind Blase (Lipid-in) und Monolagen entstehen ausschließlich durch die entsprechenden Lipide. Docking-zwei Monolagen erzeugt eine asymmetrische Bilayer-Membran. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 3
Abbildung 3 : Distinct Phasen in der Kontakt-Blase Bilayer und die Dynamik von Lipiden darin. Lipide, die Auskleidung der Blase bilden eine Phase, wo sie entweder eine Monolage oder einem Bilayer gehören. Flip-Flop von Lipiden in der Bilayer ist selten, und die asymmetrische Membran wird für eine lange Zeit beibehalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 4
Abbildung 4 : Liefern Lipide mit dem Lipid-Out oder Lipid-in Methode. Lipide hinzukommen entweder in einem organischen Lösungsmittel (Lipid-Out; A und C) oder in wässriger Lösung als Liposomen (Lipid-in; B und D). In der Lipid-Methode ist eine asymmetrische Membran gebildet. Kanal-bildenden Substanzen, die in wässriger Lösung (blau), wie Peptide, löslich sind zu einem der Bläschen hinzugefügt und spontan in die Bilayer eingefügt. In der Lipid-Methode ist ein Teil der Kanäle in Liposomen, eingefügt, die dann zu den Bilayer verschmolzen sind. Kanalproteinen (rot) rekonstituiert in Liposomen in der Lipid-Out oder Lipid-in-Methode, die dann zu einem der Bläschen hinzugefügt und spontan mit der Bilayer verschmolzen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 5
Abbildung 5 : Bildung und mikroskopische Bild des Kontakts bubble Bilayer. Die Bilayer wird aus einer tangentialen Richtung beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 6
Abbildung 6 : Beobachtung der Bilayer für Bilayer Messfläche. Zwei Seifenblasen sind übereinander, andererseits durch die Pipette Manipulation und das Mikroskop konzentriert sich auf der Ebene der Kontakt Blase Bilayer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 7
Abbildung 7 : Schrittweise einführen des Kanals KcsA in Kontakt Blase Bilayer Membran. Die E71A Mutante des Kanals KcsA wurde verwendet, um die sofortige Erkennung der eingefügten Kanäle zeigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 8
Abbildung 8 : Trennen von Monolagen und Antworten der Kanäle legen. Ein Peptid-Kanal, Polytheonamide B, wurde zu einem der Blasen, die dann spontan in die Membran integriert wurde hinzugefügt. Wenn getrennt, Kanäle in der Membran wurden an der Membran-Broschüre der Kanal hinzugefügt Seite behielt aber zog sich zurück. Bei der Anlage wurden die Kanäle in der Membran eingefügt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 9
Abbildung 9 : Bildung einer asymmetrischen Membran und Kanal Aktivität abhängig von der Zusammensetzung des Flugblattes. KcsA Kanal wird durch säurehaltige Lipide, wie PG, im Inneren Merkblatt der Membran reguliert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Konventionelle PLB Liposomen-patch DIB CBB
Erfolg-Rate1 hoch niedrige sehr hohe sehr hohe
Sofortige Reformfähigkeit2 Ja Nein Mittelstufe Ja
Asymmetrischer Membran Ja Nein Ja Ja
Lösung-Austausch langsam sehr schnell langsam schnell
Signal/Rausch-Abstand3 niedrige hoch niedrige hoch
Verformung der Membran Nein Nein Nein Ja4
Mechanische Bearbeitung Nein Ja5 Ja Ja
Membran-perfusion keine Nein Ja Ja
Lipid-Kompositionen diverse begrenzte6 diverse diverse
1 Die Erfolgsquote der bilden stabile Lipid Bilayer pro Versuch.
2 Bildung einer neuen Membran schnell nach Abbau einer Membran. Membran wird auch immer wieder gebildet.
3 Das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) steht für die elektrische Hintergrund Lärm primäre generiert aus der Membran-Kapazität.
4 Konkave oder konvexe Membran kann durch verschiedene innere Druck zwischen zwei Bläschen gebildet werden.
5 Die Spannung der Membran nur noch größer.
6 Phospholipide, die giant Unilamellar Bläschen bilden können gelten, aber die Giga-Dichtung kann nicht erreicht werden.

Tabelle 1: Merkmale der verschiedenen Lipid Bilayer Membranen.

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Discussion

Die CBB-Methode von Lipid Bilayer Bildung basiert auf dem Prinzip eines Wasser-in-Öl-Tropfens, gesäumt von einem monomolekularen Film20. Technisch sind die Verfahren zur Bildung von CBBs einfach, vor allem für Patch-Clamp-Forscher, die Manipulation von Glas Mikropipetten beherrschen. Die elektrophysiologische Setup für die Patch-Clamp ist leicht in der CBB verwendet, wenn zwei Pipette Manipulatoren mit Microinjectors verfügbar sind. Auf der anderen Seite, weil der CBB ein Nachfolger der herkömmlichen PLB ist, für die eine große Menge des physikalisch-chemischen Wissens angesammelten8, dieser Hintergrund sowie Kenntnisse der Oberflächenchemie seit38 ist hilfreich für den Betrieb und Bearbeiten von CBBs. Die CBB dient eine vielseitige Plattform für das Studium von Kanal-Membran Zusammenhänge mit seiner Fähigkeit, chemische Zusammensetzung und physischen Zustand61zu verändern. In der CBB Lipide Futter die Blase können frei über die Grenze Monolage Phase und Packungsbeilage von der Bilayer diffundieren, und wir haben entwickelten Techniken, wie z. B. der Bilayer befestigen-abnehmen und die Membran Perfusion Methoden45. Wir haben CBBs für in-vitro- Kanal Proteinsynthese erweitert, wo Kanal Synthese erfolgte in der Blase und neugebildete Kanalproteinen spontane Übertragung auf Bilayer unter Anwendung eines Membranpotentials ausgesetzt waren wo im Entstehen begriffenen Kanalfunktionen des Kanals KcsA wurde ab dem Zeitpunkt der Einleitung der Transkription/Übersetzung von KcsA DNA62zurückgeführt.

Unter den Schritten des Protokolls ist die Erhaltung der Blasengröße entscheidend. Die Bläschen können langsam anschwellen oder schrumpfen spontan, weil Lipid-Transfer an die Schnittstelle langsam ist und die Monolayer-Spannung anfällig ist für ändern. Insbesondere angesammelt die erste Blase aufgeblasen kurz nach Absaugung der Liposomen-Lösung (Schritte 4.8.3 und 4.10) ist schwer zu pflegen, weil die Monolayer-Spannung durch die Liposomen gesenkt wird an der Spitze der Pipette. Verwerfen der ersten Bläschen und anschließende Bildung von Luftblasen bieten die stabilere kmh. Visuelle Rückverfolgung von die Blasengröße und Feinabstimmung des Drucks sind notwendig.

Es gibt experimentelle Einschränkungen der CBB-Methode. Obwohl die CBB Elektrophysiologische Messungen richtet, der elektrische Widerstand des Bilayer für bestimmte Lipid-Zusammensetzungen möglicherweise nicht hoch genug (z.B.100 GΩ) für Einkanal-Aufnahmen. Zum Beispiel Dioleoyl Phosphatidylcholin wird häufig für Liposomen verwendet, aber es bildet elektrisch undichte CBBs bei 25 ° C63. CBBs können nicht sogar mit Lipid Arten gebildet werden, deren Phase Übergangstemperatur oberhalb der Aufnahme-Temperatur ist. In der Tat, CBB Bildung war schwierig mit Dipalmitoyl Phosphatidylcholin bei Raumtemperatur, aber Erhöhung der Temperatur Tm Problem64umgangen. In diesen Experimenten wurde die Temperaturregelung durch die Verwendung eines transparenten Heizplatte (siehe Tabelle der Materialien) unter der Folie Glas62. Die Übergangstemperatur Phase häufig verwendete Lipid Diphytanoyl Phosphatidylcholin ist unter 0 ° C- 65und CBBs sind leicht geformten32,45,51 in einem weiten Temperaturbereich.

Von entweder der Lipid-in oder Lipid-Out-Methode, wo die Übertragungsrate relativ langsamer in der Lipid-Out als in der Lipid-in Methode63 istPhospholipide der Wasser-Öl-Schnittstelle angeboten. Darüber hinaus ist der elektrische Widerstand der Bilayer Membran aus unbekannten Gründen relativ kleiner mit der Lipid-Out-Methode als mit der Lipid-Methode.

Im Protokoll (Schritt 4.8) ist eine Lösung von Liposomen und Kanal rekonstituiert Liposomen (1 µL) von der Spitze der Pipette (Schritte 4.9 und 4.10) geladen, und der Rest der Pipette enthält die zuvor gefüllten Elektrolyt-Lösung. Dies ist nur für den Erhalt der Materialien, wie Lipide und Kanal-Moleküle. Infolgedessen die Liposomen diffundieren allmählich in Richtung der oberen Pipette Lösung, und nach einer Weile wird die Lipidkonzentration an der Spitze der Pipette nicht ausreicht, um Form Lipid Monolagen. In diesem Fall sollten frische Liposomen-Lösung von der Spitze (Schritt 4.8) abgesaugt werden. Diese zeitliche Konzentration Änderung kann umgangen werden, wenn die ganze Pipette mit der Lösung mit Lipiden und Kanal Moleküle gefüllt ist, während Liposomen allmählich in die Bläschen niederzulassen. In diesem Fall werden die Bläschen erneuert.

Elektrophysiologisch, ist die CBB-Größe größer als die der Patch-Clamp, so nachgiebig eine größere Kapazität der Membran. Der Reihenwiderstand (der elektrische Widerstand in einer Reihe von Membran-Widerstand) ist jedoch viel niedriger (~ 100 kΩ) als die für die Patch-Klemme (Pipette Widerstand > 1 MΩ), die beschleunigt der Geschwindigkeit der Spannung Klemme und dämpft die Hintergrundgeräusche und Serie Widerstand Fehler in der Spannung eingespannten Membrane Potentiale66,67,68. Die Geräuschkulisse ist eine Funktion der Membran-Kapazität und der Reihenwiderstand, wo eine niedrige Serienwiderstände ergänzt eine hohe Membran-Kapazität, was zu niedrigen Hintergrund Lärm9.

In der Regel von Lipid Bilayer Experimente sollten Reinigungsmittel nicht verwendet werden, Glaswaren zu waschen. Noch eine Spur Menge an Waschmittel stört die Integrität der Bilayer. Organische Lösungsmitteln wie Chloroform/Methanol und Ethanol sollte stattdessen für solche Reinigung Zwecke verwendet werden.

Insgesamt integriert die CBB die Vorteile der Patch-Clamp (z.B. die mechanische Manipulation der Membran) und der PLB (z.B. die Möglichkeit, die Lipidzusammensetzung der Membran ändern). Verschiedene Arten von Kanal-bildenden Substanzen und Kanalproteinen wurden studierte52,53,69,70. Die Entwicklung dieser Methode ist angebracht, da immer mehr Forscher konzentrieren sich auf Kanal-Membran Zusammenspiel und die CBB eine vielseitige Plattform für verschiedene Experimente bietet. Weitere experimentelle Entwicklungen in der CBB-Methode erwartet.

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Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Mariko Yamatake und Masako Takashima für technische Unterstützung danken. Diese Arbeit unterstützt wurde teilweise durch KAKENHI Zuschuss zahlen 16H 00759 und 17 H 04017 (SO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

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Neurowissenschaften Ausgabe 143 Lipid Bilayer Patch-Clamp Wasser-In-Öl-Tropfen Monolayer Ionenkanal Elektrophysiologie Oberflächenchemie
Lipid Bilayer Experimente mit Kontakt Blase Bilayer für Patch-reckenden
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Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

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