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Neuroscience

लिपिड Bilayer प्रयोगों के साथ संपर्क बुलबुला Bilayers के लिए पैच-clampers

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

यहां, हम एक संपर्क बुलबुला bilayer विधि का उपयोग लिपिड bilayers के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक पानी का बुलबुला एक कार्बनिक विलायक, जिससे एक monolayer पानी के तेल अंतरफलक पर गठन किया है में उड़ा दिया है । दो पिपेट बुलबुले गोदी करने के लिए एक bilayer फार्म में हेरफेर कर रहे हैं ।

Abstract

लिपिड bilayers आयन चैनलों के कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक अनूठा प्रयोगात्मक मंच प्रदान करते हैं, विभिन्न झिल्ली लिपिड रचनाओं के तहत चैनल झिल्ली बातचीत की परीक्षा की अनुमति । उनमें से, छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer लोकप्रियता प्राप्त की है; हालांकि, बड़ी झिल्ली आकार कम विद्युत पृष्ठभूमि शोर की रिकॉर्डिंग में बाधा । हम एक संपर्क बुलबुला bilayer (CBB) विधि है कि planar लिपिड bilayer और पैच के लाभों को जोड़ती है की स्थापना की है, जैसे लिपिड संरचना को अलग करने की क्षमता और bilayer यांत्रिकी में हेरफेर करने के लिए-क्लैंप तरीकों, क्रमशः । पारंपरिक पैच-दबाना प्रयोगों के लिए सेटअप का उपयोग करना, CBB-आधारित प्रयोगों आसानी से किया जा सकता है. संक्षेप में, एक गिलास पिपेट में एक इलेक्ट्रोलाइट समाधान एक कार्बनिक विलायक चरण (hexadecane) में उड़ा दिया है, और पिपेट दबाव एक स्थिर बुलबुला आकार प्राप्त करने के लिए बनाए रखा है । बुलबुला अनायास एक लिपिड monolayer (शुद्ध लिपिड या मिश्रित लिपिड) है, जो liposomes से बुलबुले में प्रदान की जाती है के साथ लाइन में खड़ा है । अगले, दो monolayer के बुलबुले (~ ५० व्यास में µm) ग्लास पिपेट की नोक पर bilayer गठन के लिए डॉक कर रहे हैं । चैनल का परिचय-liposomes बुलबुला में चैनल का गठन bilayer में चैनलों के शामिल करने की ओर जाता है, एकल के लिए अनुमति देता है-शोर अनुपात पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के लिए तुलनीय के साथ एक चैनल वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए । एक असममित लिपिड संरचना के साथ CBBs आसानी से गठित कर रहे हैं. CBB बार बाहर पिछले बुलबुले उड़ाने और नए बनाने के द्वारा नवीनीकृत है । विभिन्न रासायनिक और शारीरिक perturbations (जैसे, झिल्ली छिड़काव और bilayer तनाव) CBBs पर लगाया जा सकता है । इस के साथ साथ, हम CBB गठन के लिए बुनियादी प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं ।

Introduction

आयन चैनलों के लिए, कोशिका झिल्ली बस एक समर्थन सामग्री लेकिन आयन प्रवाह पैदा करने के लिए एक भागीदार नहीं है । कार्यात्मक, झिल्ली एक विद्युत इंसुलेटर जिसमें आयन चैनल एंबेडेड रहे हैं, और सभी कोशिका झिल्ली एक आराम झिल्ली की क्षमता के साथ प्रस्थान कर रहे हैं । पारंपरिक, एक मनमाना झिल्ली क्षमता एक बाहरी सर्किट जिसके द्वारा चैनलों के माध्यम से विद्युत वर्तमान मापा गया था से लगाया गया था । विभिंन झिल्ली क्षमता पर आयन प्रवाह का यह मात्रात्मक मूल्यांकन ऐसे अपने आयन के रूप में इन चैनलों के आणविक गुणों, चयनात्मक permeation और गेटिंग1,2कार्यों से पता चला । आयन चैनलों के कार्यात्मक अध्ययन के लिए झिल्ली मंच या तो कोशिका झिल्ली या लिपिड bilayer झिल्ली है । ऐतिहासिक, एकल चैनल विद्युत वर्तमान रिकॉर्डिंग पहले लिपिड bilayers3,4में प्रदर्शन किया गया था, और प्रासंगिक तकनीक सेल झिल्ली के लिए विकसित किए गए थे, जैसे पैच-क्लैंप विधि (चित्रा 1एक )5,6. तब से, इन दो तकनीकों अलग प्रयोजनों के लिए अलग से विकसित किया है (चित्रा 1)7,8।

झिल्ली लिपिड और bilayer झिल्ली वर्तमान में संरचना और चैनल प्रोटीन के समारोह के समर्थन में अपनी भूमिकाओं के लिए अनुसंधान का ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । इसलिए, bilayers में लिपिड संरचना भिन्न करने के लिए विधियों की तैयार उपलब्धता उच्च मांग में है । लिपिड bilayer गठन के तरीकों जैसे planar लिपिड bilayer (पीएलबी)8,9,10,11, पानी में तेल छोटी बूंद bilayer12, और छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer (DIB)13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 तकनीक (चित्रा 1) आम पसंद कर रहे हैं, लिपिड20रचनाओं अलग के तहत चैनल समारोह की जांच के लिए एक अवसर प्रदान. हालांकि DIB तकनीकी रूप से बहुत पारंपरिक पीएलबी से उत्पादन करने के लिए आसान है, DIB के बड़े आकार के लिए एक प्रोत्साहन बनाया है पैच के लिए इसे लागू करने के लिए एक गैर-चैनल वर्तमान रिकॉर्डिंग का अध्ययन करने के लिए हमेशा की तरह कंडक्टर आकार (< 100 pS) ।

पृष्ठभूमि शोर को दरकिनार करने के लिए, bilayer क्षेत्र छोटा होना चाहिए । यह मुद्दा लिपिड bilayers (चित्रा 1) के लिए electrophysiological तकनीक विकसित करने में इतिहास की पुनरावृत्तियों को याद करते हैं । प्रारंभिक दिनों में, एक छोटे आकार bilayer (व्यास में 1-30 µm) एक पिपेट (टिप डुबकी विधि की नोक पर गठन किया गया था; चित्रा 1 ग) 21 , 22 , 23, बजाय एक मुक्त खड़े bilayer (~ व्यास में १०० µm) एक चैंबर में एक hydrophobic पट पर (चित्रा 1बी) का उपयोग कर । टिप-डुबकी विधि बहुत कम पृष्ठभूमि शोर24के साथ बिजली के माप के लिए अनुमति दी । पीएलबी के साथ हमारे अनुभवों25,26, टिप-डुबकी22,23,27, और पैच-क्लैंप28,29,30, 31 तरीकों हमें पानी में तेल bilayer के सिद्धांतों का उपयोग करके लिपिड bilayers बनाने के एक उपंयास विचार करने के लिए नेतृत्व किया । हम इस के लिए संपर्क बुलबुला bilayer (CBB) विधि20,३२के रूप में संदर्भित किया है । इस विधि में, बजाय एक तेल चरण में पानी की बूंदों फांसी (चित्रा 1डी), एक पानी का बुलबुला एक गिलास पिपेट से उड़ा दिया है (लगभग 30 µm के टिप व्यास के साथ) तेल चरण में (चित्रा 1ई और 2), जहां बुलबुला एक स्थिर दबाव लागू करने के द्वारा बनाए रखा है । बुलबुला की सतह पर पानी के तेल इंटरफेस में अनायास एक monolayer रूपों । फिर, दो बुलबुले दो ग्लास पिपेट के हेरफेर के माध्यम से डॉक कर रहे हैं, और bilayer दो monolayers दृष्टिकोण एक दूसरे के रूप में गठन किया है, एक संतुलन bilayer क्षेत्र उपज. बुलबुला का आकार इंट्रा-बुलबुला दबाव (पकड़े दबाव), और इसी तरह bilayer आकार द्वारा नियंत्रित किया जाता है । ५० µm का एक औसत व्यास अक्सर प्रयोग किया जाता है । हालांकि बबल का वॉल्यूम छोटा है (< 100 pL), यह पिपेट समाधान की बड़ी मात्रा से कनेक्टेड है जो कि बल्क इलेक्ट्रोलाइट चरण का गठन करते हुए microliter श्रेणी में है ।

CBB विधि (Table 1) का उपयोग करने के लिए कई लाभ हैं । एक लिपिड bilayer गठन तकनीक के रूप में, विभिन्न लिपिड रचनाओं की झिल्ली का उत्पादन किया जा सकता है, और असममित झिल्ली अधिक आसानी से गठन कर रहे हैं३२ की तुलना में पारंपरिक तह विधि३३द्वारा उन हैं. bilayer यांत्रिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है, पारंपरिक पीएलबी कि केवल एक हीड्रास्टाटिक दबाव अंतर३४,३५के साथ तुला हो सकता है के विपरीत । पकड़ दबाव बदलने से, बुलबुले या तो विस्तार या सिकुड़ते, वृद्धि हुई है या कम झिल्ली तनाव३२के लिए अग्रणी । bilayer monolayers में यांत्रिक रूप से detachable है, फ्रीज के समान-फ्रैक्चर तकनीक३६,रूपात्मक अध्ययन में झिल्ली के३७ , लेकिन CBB के साथ, एक पैंतरेबाज़ी दोहराया अलग के लिए अनुमति देता है और चक्र संलग्न३२ . बुलबुले के भीतर इलेक्ट्रोलाइट समाधान की छोटी मात्रा bilayer में चैनल पुनर्गठन liposomes के कुशल संलयन की अनुमति देता है, और चैनल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने की संभावना बहुत पारंपरिक पीएलबी तकनीक के साथ तुलना में अधिक है । छोटे बुलबुले की मात्रा भी एक बार एक और इंजेक्शन पिपेट बुलबुले के या तो में डाला जाता है (~ 20 एमएस के भीतर) तेजी से छिड़काव की अनुमति देता है । विपरीत पैच-क्लैंप विधि, एक बार टूट गया, एक CBB झिल्ली फिर से बनते है तुरंत और बार, और पिपेट एक दिन में कई बार इस्तेमाल किया जा सकता है । पैच-क्लैंप और पीएलबी तरीकों के लाभों को एकीकृत करके, CBB एक बहुमुखी मंच प्रदान करता है झिल्ली की भौतिक स्थितियों, चैनल झिल्ली बातचीत के अभूतपूर्व अध्ययन के लिए अनुमति बदलती हैं ।

CBB गठन की प्रक्रिया का एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने से पहले, bilayer गठन की भौतिक पृष्ठभूमि पहले प्रस्तुत किया गया है, जो पैच-clampers झिल्ली गठन से संबंधित प्रयोगात्मक कठिनाइयों का समाधान करने के लिए उपयोगी हो जाएगा जो पडा हो ।

CBB प्रयोगों भूतल रसायन विज्ञान३८के सबक प्रदान करते हैं । CBB एक साबुन बुलबुला हवा में एक भूसे से उड़ा के समान है, जहां इसी तरह, एक पानी का बुलबुला एक कार्बनिक विलायक में उड़ा दिया है । एक पानी के बुलबुले शायद ही फुलाया है जब झिल्ली लिपिड या तो पानी बुलबुला या कार्बनिक विलायक में शामिल नहीं हैं कि नोटिस जाएगा । amphipathic लिपिड के अभाव में, एक पानी के तेल अंतरफलक पर सतह तनाव अधिक है, और एक बुलबुला उड़ाने के लिए इंट्रा बुलबुला दबाव उच्च हो जाएगा । इस लाप्लास समीकरण का एक बोध है (ΔP = 2 γ/आर, जहां ΔP अंतर बुलबुला दबाव है, γ सतह तनाव है, और आर बुलबुला त्रिज्या है) । जब या तो कार्बनिक चरण या इलेक्ट्रोलाइट समाधान में लिपिड की एकाग्रता अधिक है, monolayer में लिपिड के घनत्व बढ़ जाती है, के रूप में गिब्स सोखना isotherm द्वारा तय (-dγ = Γमैं डी µमैं, जहां Γमैं सतह अतिरिक्त है मैं यौगिक के, और µमैं घटक की रासायनिक क्षमता है मैं)३९, एक कम सतह तनाव और बुलबुला गठन में आसानी के लिए अग्रणी । CBB में, bilayer एक स्पर्श कोण से देखा जा सकता है (चित्रा 2), और monolayer और bilayer के बीच संपर्क कोण मध्यम श्रेणी का है । इस कोण monolayer और bilayer की सतह तनाव के बीच एक संतुलन का प्रतिनिधित्व करता है (युवा समीकरण: γद्वि = γमो क्योंकि (θ), जहां γद्वि bilayer तनाव है, γमो monolayer तनाव है, और θ संपर्क कोण है) । संपर्क कोण में परिवर्तन bilayer तनाव में परिवर्तन का संकेत देते हैं, यह देखते हुए कि monolayer तनाव को संपर्क कोण में झिल्ली क्षमता के एक समारोह के रूप में परिवर्तन से मूल्यांकन किया जाता है (युवा-Lippmann समीकरण: γमो = Cm V2 /4 (क्योंकि (θ0)-क्योंकि (θवी)), जहां सीएम झिल्ली समाई है, v झिल्ली क्षमता है, और θ0 और θवी 0 और वी एमवी पर संपर्क कोण हैं, क्रमशः)४०,४१ ,४२. जब दो बुलबुले काफी करीब हैं, वे एक दूसरे को सहज दृष्टिकोण । इस वान डेर Waals बल के कारण है, और हम नेत्रहीन CBB गठन में इस गतिशील प्रक्रिया का पालन कर सकते हैं ।

एक CBB प्रणाली अलग चरणों के होते हैं: अर्थात्, एक थोक तेल चरण, पानी एक monolayer के साथ लेपित बुलबुले, और एक संपर्क bilayer (चित्रा 3) । ये कई चरणों की याद ताजा कर रहे है एक पीएलबी में मनाया, जैसे एक विलायक युक्त टोरस्र्स के रूप में bilayer चरण और एक पतली कार्बनिक दो monolayers४३,४४द्वारा पाटों चरण । CBB में, monolayer चरण bilayer पुस्तिका के साथ निरंतर है, और लिपिड अणुओं को आसानी से monolayer और पत्रक के बीच फैलाना । monolayer चरण बुलबुला सतह के सबसे शामिल है, प्रमुख चरण है कि एक लिपिड जलाशय के रूप में कार्य करता है का गठन । क्योंकि monolayer में लिपिड की hydrophobic पूंछ थोक तेल चरण के लिए जावक फैली हुई है, bilayer इंटीरियर या hydrophobic कोर थोक तेल चरण के लिए खुलता है । इस प्रकार, एक hydrophobic पदार्थ bilayer के लिए करीब तेल चरण में इंजेक्शन के लिए आसानी से bilayer इंटीरियर का उपयोग करने में सक्षम है । यह झिल्ली छिड़काव तकनीक हम हाल ही में विकसित किया था४५, जिसके द्वारा bilayer में लिपिड संरचना तेजी से (एक दूसरे के भीतर) एक चैनल वर्तमान रिकॉर्डिंग के दौरान बदल जाता है । हमने पाया है कि bilayer में कोलेस्ट्रॉल सामग्री पर और४५बंद कोलेस्ट्रॉल छिड़काव स्विचन द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है reversibly । monolayer और bilayer में प्रासंगिक पदार्थ की एकाग्रता अलग है कि घटना में, प्रासंगिक पदार्थ की एकाग्रता ढाल तुरंत प्रसार के माध्यम से भंग कर दिया है, जो Marangoni प्रभाव४६ के रूप में जाना जाता है, ४७. दूसरी ओर, monolayers के पार फ्लिप-फ्लॉप४८,४९,५०धीमी हैं ।

CBB विधि का उपयोग करना, bilayer बहुमुखी भौतिक शर्तों के तहत, जैसे एक इलेक्ट्रोलाइट पीएच के रूप में कम के रूप में 1 ५१, एक नमक (K+, Na+, आदि) 3 मीटर तक एकाग्रता, एक झिल्ली क्षमता के रूप में उच्च के रूप में ± ४०० एमवी, और एक प्रणाली के रूप में गठन किया है ६० डिग्री सेल्सियस तक का तापमान ।

वहां चैनल अणुओं के CBB और निगमन के गठन के लिए कई विकल्प हैं । जल-तेल अंतरफलक पर monolayer के गठन के लिए, लिपिड एक कार्बनिक विलायक (लिपिड बाहर विधि में या तो जोड़ रहे हैं; चित्र 4 A, 4c) या liposomes के रूप में एक बुलबुले में (लिपिड विधि में; चित्र 4 बी, 4d) । विशेष रूप से, लिपिड में विधि असममित झिल्ली15,३२के गठन के लिए अनुमति देता है । चैनल जलीय समाधान में घुलनशील अणुओं (जैसे, चैनल बनाने पेप्टाइड्स) सीधे बुलबुले में जोड़ रहे हैं (चित्रा 4ए, बी)५२,५३, जबकि चैनल प्रोटीन में पुनर्गठन किया जाता है liposomes, जो तो बुलबुला (चित्रा 4सी, डी) में जोड़ रहे हैं । इस के साथ साथ, या तो एक चैनल पेप्टाइड (polytheonamide बी (pTB) के लिए लिपिड में विधि द्वारा CBBs के गठन; चित्र 4 a) या एक प्रोटीन (KcsA नॉनवेज चैनल, फिगर 4सी) दिखाया गया है ।

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Protocol

1. तैयार Liposomes

  1. फॉस्फोलिपिड फैलाने (जैसे, पाउडर में 10 मिलीग्राम) एक वांछित एकाग्रता पर क्लोरोफॉर्म में (जैसे, 10 मिलीग्राम/एमएल) ।
  2. लुप्त क्लोरोफॉर्म.
    1. एक गोल-नीचे कुप्पी में फॉस्फोलिपिड समाधान रखें और एक एन2 गैस सिलेंडर से जुड़े एक रोटरी वाष्पक ( सामग्री की तालिकादेखें) पर सेट करें. एक पतली फॉस्फोलिपिड फिल्म जब तक कमरे के तापमान पर N2 प्रवाह के तहत कुप्पी घुमाएं (के बाद ~ 30 मिनट) प्रकट होता है ।
    2. एक desiccator है कि एक वैक्यूम पंप से जुड़ा है में खुली कुप्पी प्लेस । वैक्यूम पम्प का प्रयोग करते हुए, महाप्राण को desiccator के अंदर कई घंटों तक क्लोरोफॉर्म को अच्छी तरह से निकाल लें ।
  3. कुप्पी के लिए एक इलेक्ट्रोलाइट समाधान का एक उचित मात्रा में जोड़ें और एक 2 मिलीग्राम/एमएल फॉस्फोलिपिड निलंबन प्राप्त करने के लिए फॉस्फोलिपिड निलंबित ।
  4. Sonicate एक स्नान sonicator का उपयोग कर सेकंड के कई दसियों के लिए निलंबन ( सामग्री की तालिकादेखें) एक multilayered पुटिका (MLV) निलंबन प्राप्त करने के लिए ।
  5. proteoliposomes कि आयन चैनल प्रोटीन शामिल की तैयारी के लिए, एक प्रोटीन समाधान (उपयुक्त डिटर्जेंट का उपयोग solubilized प्रोटीन के साथ जोड़ने के लिए; 2% मात्रा) MLV निलंबन और कई सेकंड के लिए sonicate स्नान sonicator का उपयोग करने के लिए अधिकतम है ।

2. बड़े बोर वाले ग् पिपेट तैयार करें

  1. एक पिपेट खींचने के लिए एक गिलास केशिका सेट और दो कदम खींच के माध्यम से एक ठीक पतला टिप के साथ micropipettes बनाना ।
  2. एक microforge पर micropipette सेट करें और 30 से ५० µm के व्यास के साथ पतला भाग पर एक प्लैटिनम रेशा करने के लिए micropipette की नोक से संपर्क करें ।
  3. रेशा संक्षेप में (5 एस) गर्म करें और तुरंत इसे बंद कर दें ।
    नोट: इस हेरफेर रूपों हीटिंग बिंदु पर एक दरार, जिससे micropipette की नोक काट रहा है, 30 के एक व्यास के साथ एक व्यापक बोर छोड़ने के लिए ५० µm ।

3. एक उथले गुफा के साथ कांच स्लाइड की सतह का इलाज अच्छी तरह से (Siliconization एक पानी से बचाने वाली क्रीम के लिए खत्म)

  1. आसुत पानी और इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से एक उथले साथ कांच स्लाइड की सतह को साफ ।
  2. एक उपयुक्त मात्रा (उदा, १०० µ एल) एक siliconizing रिएजेंट (पानी से बचाने वाली क्रीम) के छेद स्लाइड ग्लास पर लागू करें ।
  3. हवा में पूरी तरह से एजेंट सूखी ।
  4. एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर कांच स्लाइड रखें ।

4. CBB फार्म और Electrophysiological माप प्रदर्शन

  1. सिलिकॉन होल स्लाइड ग्लास के उथले कुआं में hexadecane के १०० µ एल जोड़ें ।
    नोट: लिपिड बाहर विधि के लिए, फॉस्फोलिपिड hexadecane में फैलाया जाता है (20 मिलीग्राम/एमएल) पहले से ।
  2. micropipette की लंबाई आधा करने के लिए इलेक्ट्रोलाइट समाधान भरें, एक ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग कर ।
  3. एक दबाव बंदरगाह के साथ micropipette धारक पर micropipette सेट, एजी/AgCl तार इलेक्ट्रोड पिपेट इलेक्ट्रोलाइट समाधान में भिगोने के लिए अनुमति देता है ।
  4. micropipette धारकों में से एक एक पैच-क्लैंप एम्पलीफायर के सिर मंच और बिजली के जमीन के लिए एक दूसरे से कनेक्ट करें ।
  5. micropipette धारक के दबाव बंदरगाह के लिए एक microinjector कनेक्ट ।
  6. micromanipulator जोड़ तोड़ द्वारा एक औंधा माइक्रोस्कोप की अवस्था के ऊपर एक उपयुक्त स्थिति के लिए micropipette सेट करें ।
  7. इलेक्ट्रोड ऑफसेट क्षमता समायोजित करें ।
    1. एक ही इलेक्ट्रोलाइट समाधान के 1 µ l प्लेस छेद स्लाइड ग्लास के उथले अच्छी तरह से चारों ओर सपाट सतह पर micropipette भरने के लिए इस्तेमाल किया, एक इलेक्ट्रोलाइट डोम बनाने ।
    2. micromanipulator से छेड़छाड़ करके दोनों micropipettes की नोक को इलेक्ट्रोलाइट डोम में भिगो दें ।
    3. पैच-दबाना एम्पलीफायर की इलेक्ट्रोड ऑफसेट क्षमता को समायोजित करें ।
    4. एक उच्च झिल्ली क्षमता (बिजली टूटने के आवेदन के माध्यम से CBB तोड़कर प्रयोगों के अंत में सही ऑफसेट की पुष्टि करें, एम्पलीफायर पर जैप का उपयोग), दो बुलबुले एक (बुलबुला संलयन) में आपस में जुड़े होने के कारण.
    5. सही तरल जंक्शन के मामलों में संभावित५४ जहां असममित इलेक्ट्रोलाइट समाधान का उपयोग किया जाता है, ऐसी है कि परिकलित मान सही झिल्ली क्षमता के लिए लागू झिल्ली क्षमता के लिए जोड़ा गया है ।
      नोट: तरल जंक्शन संभावित कार्यक्रम JPCalc५५का उपयोग कर की गणना की है ।
  8. टिप से liposome समाधान ड्रा ।
    नोट: जब पानी में घुलनशील चैनल लिपिड-आउट विधि का उपयोग कर जांच की जाती है, liposome समाधान की चूषण करना आवश्यक नहीं है ।
    1. होल स्लाइड ग्लास (liposome-युक्त गुंबद) के उथले कुआं के चारों ओर समतल सतह पर liposome समाधान के 1 µ l प्लेस ।
    2. micromanipulator में हेरफेर करें और micropipette की नोक को liposome-युक्त गुंबद में डालें ।
    3. महाप्राण का उपयोग कर micropipette धारक के अंदर दबाव कम करके liposome-युक्त समाधान को microinjector ।
    4. अंय पिपेट के लिए प्रक्रिया को दोहराएं ।
  9. micromanipulator हेरफेर और उथले अच्छी तरह से hexadecane में micropipette की नोक डुबकी ।
  10. जब तक बुलबुला वांछित आकार (जैसे, व्यास में ५० µm) तक पहुँच जाता है और एक ही दबाव के बाद बनाए रखने के दबाव को बढ़ाने के द्वारा एक पानी बुलबुला धीरे झटका ।
  11. तेल हवा अंतरफलक के माध्यम से टिप गुजर अगर यह बुलबुले के आकार स्थिर रखने के लिए मुश्किल है द्वारा बुलबुले त्यागें ।
  12. दोहराएँ चरण ४.८ करने के लिए ४.९ जब तक स्थिर बुलबुले बनते हैं.
  13. उन दोनों के बीच संपर्क की अनुमति के लिए बुलबुले में हेरफेर (चित्रा 5) ।
    नोट: कई बार, बुलबुले CBB बनाने के लिए सहज रूप से एक दूसरे से संपर्क करते हैं । अन्य मामलों में, बुलबुले करीब हैं, लेकिन एक दूसरे से संपर्क नहीं है । इस मामले में, एक दूसरे बुलबुले धक्का यांत्रिक ।
  14. ठीक-धुन बुलबुला आकार को बनाए रखने के लिए दबाव है, क्योंकि आकार धीरे से लगातार अंतर बुलबुला दबाव में भी बदल सकते हैं ।
  15. पैच-क्लैंप एम्पलीफायर का उपयोग कर उचित मूल्य के लिए झिल्ली की क्षमता सेट और (चित्रा 6) उभरने के लिए चैनल चालू करने के लिए प्रतीक्षा करें ।

5. माप Bilayer समाई

  1. एक रैंप की क्षमता लागू करने से bilayer विद्युत समाई (सीएल) को मापने.
    नोट: जब रैंप आदेश में वोल्टेज परिवर्तन की दर 10 एमवी/10 ms (या 1 V/s) द्वारा पीछा किया-10 एमवी/10 ms, ढलान में परिवर्तन पर वर्तमान कूद के आयाम से मेल खाती है membrane'scapacitance मूल्य के पढ़ने के लिए (उदा , १०० पीए → १०० पीएफ).
  2. दूसरे पर एक खड़ी दो बुलबुले के bilayer क्षेत्र का मूल्यांकन और bilayer (चित्रा 6) के किनारे देखने के लिए bilayer स्तर पर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित.
    नोट: bilayer आकार ज्यादातर परिपत्र है, और क्षेत्र की त्रिज्या से गणना की है ।
  3. विशिष्ट झिल्ली समाई (सी सपा) bilayerक्षेत्र (सीसपा = सीएलए) द्वारा विद्युत समाई विभाजित करके गणना ।
  4. bilayer मोटाई (hydrophobic कोर की मोटाई) का परिकलन करना Dc = (εrε0) का उपयोग करना (जहां εr और ε0 permittivity के hydrophobic क्षेत्र के bilayer और permittivity का प्रतिनिधित्व करते हैं एक वैक्यूम की, क्रमशः) ।

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Representative Results

एक ठेठ CBB ५० µm (चित्रा 5, 6) और hexadecane में विशिष्ट झिल्ली समाई के एक व्यास था ०.६५ µF/ बुलबुला का आकार अंतर बुलबुला दबाव द्वारा मनमाने ढंग से नियंत्रित किया गया था । जब छोटे बुलबुले कम शोर रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक हैं, टिप व्यास तदनुसार छोटा होना चाहिए । उदाहरण के लिए, व्यास में ५० µm का एक बुलबुला आकार के लिए, टिप व्यास 30 µm होना चाहिए ।

एक बार CBB का गठन किया था, चैनल अणु या तो जलीय समाधान या liposome में सहज bilayer में कुछ मिनट के दर्जनों की अवधि के भीतर डाला गया । चैनल के सम्मिलन वर्तमान आयाम (चित्रा 7) के stepwise वृद्धि लागू झिल्ली क्षमता के तहत की पुष्टि की थी. छोटे झिल्ली क्षेत्र (< 1000 µm2) कि पारंपरिक पीएलबी और DIB प्रणालियों में काफी हद तक बिजली के संकेत-शोर अनुपात में सुधार के सापेक्ष ।

वर्तमान रिकॉर्डिंग जब तक झिल्ली बाधित और दो बुलबुले विलय जारी रखा जा सकता है । नए बुलबुले उड़ा रहे थे और CBB तुरंत और बार का गठन किया । पिपेट को एक दिन के भीतर बार का प्रयोग किया जा सकता है ।

संलग्न और अलग की ड्यूटी चक्र। CBB विधि द्वारा गठित bilayer को दो monolayers में विघटित किया जा सकता है । अलग-CBB के संलग्न दो बुलबुले (अलग के कर्तव्य चक्र-संलग्न) जोड़ तोड़ द्वारा दोहराया जा सकता है । यह प्रक्रिया pTB, एक समुद्री स्पंज से एक पेप्टाइड चैनल के चैनल वर्तमान की उपस्थिति से नजर रखी थी, के रूप में यह लिपिड bilayer में आसानी से डाला गया था एक monovalent कटियन-चयनात्मक ताकना५२,५६फार्म । pTB चैनल वर्तमान दो monolayers संलग्न के बाद तुरंत उभरा, और मौजूदा संपर्क के क्षेत्र के रूप में बड़ा हो गया (8 चित्रा) वृद्धि हुई । वर्तमान के आयाम अलग-CBB के हेरफेर संलग्न के साथ सिंक्रनाइज़ किया गया था ।

KcsA चैनल के एकल चैनल माप। KcsA पोटेशियम चैनल पीएच संवेदनशील है, अंलीय intracellular पीएच५७द्वारा सक्रिय किया जा रहा है । इस प्रकार, इलेक्ट्रोलाइट समाधान असममित५८,५९,६०होना करने के लिए सेट किया गया था । CBB गठन के चरण ४.२ में, बाईं ओर के पिपेट समाधान पीएच 4 पर सेट किया गया था, जबकि दाईं ओर की है कि पीएच ७.५25पर स्थापित किया गया था । कदम 4.7.1 में, एक proteoliposome निलंबन, बजाय liposome निलंबन, आकांक्षा के लिए स्लाइड ग्लास पर बाईं पिपेट में रखा गया था । तदनुसार, KcsA चैनल अपनी cytoplasmic बाईं बुलबुले का सामना करना पड़ डोमेन के साथ झिल्ली में उंमुख था । प्रोटीन के साथ Liposomes: 1:2000 के लिपिड वजन अनुपात एकल चैनल वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए उपयुक्त हैं, और एक 1:10 अनुपात के साथ उन macroscopic वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए कर रहे हैं ।

असममित झिल्ली. एक असममित लिपिड bilayer प्रत्येक बुलबुला के लिए अलग liposome निलंबन का उपयोग कर गठित किया जा सकता है (लिपिड में)15,३२. झिल्ली में KcsA चैनल के उंमुखीकरण एक असममित समाधान पीएच की स्थापना के द्वारा विनियमित किया गया था (पीएच 4/pHमेंबाहर7), अपनी बाईं ओर की ओर जा रहा है cytoplasmic पक्ष के लिए अग्रणी । तदनुसार, बाईं ओर के रूप में सौंपा गया था "में," जबकि दाईं ओर के रूप में सौंपा गया था "बाहर." KcsA चैनल के गेटिंग पर लिपिड निर्भरता की जांच करने के लिए, CBB के चार प्रकार (एक असममित CBB सहित) इस्तेमाल किया गया; अर्थात्, बाहर/PG मेंस्नातकोत्तर, बाहर/PCमेंस्नातकोत्तर, बाहर/PGमेंपीसी, और/PCमेंपीसी (स्नातकोत्तर: phosphatidylglycerol) (9 अंक) । KcsA चैनल उच्च खुली संभावना प्रदर्शित (> 90%) केवल/PGमेंस्नातकोत्तर मेंबाहर और/PCबाहर झिल्ली मेंस्नातकोत्तर । KcsA चैनल एक उच्च खुला संभावना26के लिए झिल्ली की भीतरी पत्रक में anionic फॉस्फोलिपिड के अस्तित्व की आवश्यकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : लिपिड bilayer और पैच-क्लैंप तरीके । लिपिड bilayer के गठन के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है । (क) पैच-क्लैंप विधि । (ख) परम्परागत planar लिपिड bilayer विधि है, जो एक छोटे से छेद पर एक मुक्त खड़े, ज्यादातर ऊर्ध्वाधर, bilayer प्रदान करता है । (ग) टिप-डुबकी विधि । हवा में एक monolayer-पानी अंतरफलक एक गिलास इलेक्ट्रोड की नोक पर तैनात है । विभिन्न संशोधनों को विकसित किया गया है. (D) छोटी बूंद अंतरफलक bilayer विधि । (ङ) संपर्क बबल bilayer विधि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : संपर्क बुलबुला bilayer गठन । के रूप में एक बुलबुला एक तेल चरण में उड़ा दिया है, लिपिड अणुओं अनायास हस्तांतरण पानी के लिए तेल इंटरफेस । liposomes के रूप में लिपिड के विभिन्न प्रकार के प्रत्येक बुलबुला (लिपिड में) में शामिल हैं, और monolayers प्रासंगिक लिपिड द्वारा विशेष रूप से गठित कर रहे हैं । डॉकिंग दो monolayers एक असममित bilayer झिल्ली उत्पन्न करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 3
चित्रा 3 : संपर्क बुलबुला bilayer में अलग चरणों, और उसमें लिपिड की गतिशीलता। लिपिड अस्तर बुलबुला एक चरण का गठन जहां वे या तो एक monolayer या एक bilayer के हैं । bilayer भर में लिपिड के फ्लिप फ्लॉप निराला है, और असममित झिल्ली एक लंबे समय के लिए रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 4
चित्र 4 : लिपिड -बाहर लिपिड या लिपिड के साथ देने में विधि । लिपिड एक कार्बनिक विलायक में या तो जोड़ रहे है (लिपिड बाहर; ए और सी) या liposomes के रूप में जलीय समाधान में (लिपिड में; बी और डी) । लिपिड में विधि में, एक असममित झिल्ली का गठन किया है । चैनल बनाने पदार्थ है कि जलीय समाधान में घुलनशील हैं (नीला), पेप्टाइड्स जैसे, बुलबुले में से एक में जोड़ रहे हैं और सहज bilayer में डाला. लिपिड में विधि, चैनलों का एक हिस्सा liposomes में डाला जाता है, जो तो bilayer से जुड़े हुए हैं. चैनल प्रोटीन (लाल) या तो लिपिड बाहर या लिपिड में liposomes में गठित कर रहे हैं, जो तो बुलबुले में से एक में जोड़ रहे हैं और अनायास bilayer करने के लिए जुड़े हुए. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 5
चित्रा 5 : गठन और संपर्क बुलबुला bilayer की सूक्ष्म छवि । bilayer एक स्पर्श दिशा से मनाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 6
चित्रा 6 : bilayer क्षेत्र को मापने के लिए bilayer का अवलोकन । दो बुलबुले पिपेट हेरफेर के माध्यम से दूसरे पर एक खड़ी कर रहे हैं, और माइक्रोस्कोप संपर्क बुलबुला bilayer के स्तर पर ध्यान केंद्रित किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 7
चित्र 7 : संपर्क बुलबुला bilayer झिल्ली में KcsA चैनल के Stepwise प्रविष्टि । KcsA चैनल के E71A उत्परिवर्ती डाला चैनलों का तत्काल पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 8
चित्र 8 : अलग-monolayers और चैनलों की प्रतिक्रियाओं की अटैच । एक पेप्टाइड चैनल, polytheonamide बी, बुलबुले में से एक है, जो तब सहज झिल्ली में शामिल किया गया था में जोड़ा गया था । जब अलग, झिल्ली में चैनलों को वापस ले लिया लेकिन चैनल की झिल्ली पुस्तिका में रखा पक्ष जोड़ा गया । आसक्ति पर, चैनलों की झिल्ली में डाला गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 9
चित्र 9 : एक असममित झिल्ली और चैनल गतिविधि पत्रक की संरचना पर निर्भर का गठन । KcsA चैनल अम्लीय लिपिड द्वारा विनियमित है, इस तरह के रूप में स्नातकोत्तर, झिल्ली की भीतरी पत्रक में. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

परम्परागत पीएलबी Liposome पैच Dib Cbb
सफलता दर1 उच्च कम बहुत अधिक बहुत अधिक
तत्काल सुधार2 हाँ नहीं मध्यवर्ती हाँ
असममित झिल्ली हाँ नहीं हाँ हाँ
समाधान एक्सचेंज धीमी बहुत तेज धीमी तेज
S/एन अनुपात3 कम उच्च कम उच्च
झिल्ली विकृति नहीं नहीं नहीं हाँ4
यांत्रिक हेरफेर नहीं हाँ5 हाँ हाँ
झिल्ली छिड़काव नहीं नहीं हाँ हाँ
लिपिड रचनाएं विविध सीमित6 विविध विविध
1 परीक्षण प्रति स्थिर लिपिड bilayer बनाने की सफलता दर ।
2 एक नई झिल्ली का गठन जल्दी से एक झिल्ली के टूटने के बाद । इसके अलावा, झिल्ली बार गठन किया है ।
3 संकेत करने वाली शोर (S/N) अनुपात विद्युत पृष्ठभूमि शोर प्राथमिक झिल्ली समाई से उत्पंन का प्रतिनिधित्व करता है ।
4 दो बुलबुले के बीच अलग आंतरिक दबाव लागू करके गुफा या उत्तल झिल्ली का गठन किया जा सकता है ।
5 केवल झिल्ली तनाव बढ़ रही है ।
6 फॉस्फोलिपिड कि विशाल unilamellar बुलबुले के रूप में लागू कर सकते हैं, लेकिन गीगा सील प्राप्त नहीं किया जा सकता है ।

तालिका 1: विभिन्न लिपिड bilayer झिल्ली के लक्षण ।

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Discussion

लिपिड bilayer गठन के CBB विधि एक monolayer20द्वारा लाइन में खड़ा पानी में तेल की छोटी बूंद के सिद्धांत पर आधारित है । तकनीकी तौर पर, CBBs बनाने के लिए प्रक्रिया आसान कर रहे हैं, विशेष रूप से पैच के लिए, शोधकर्ताओं, जो कांच micropipettes हेर-फेर में कुशल हैं दबाना. पैच दबाना के लिए electrophysiological सेटअप CBB में आसानी से इस्तेमाल किया जाता है जब microinjectors के साथ दो पिपेट जोड़तोड़ उपलब्ध हैं । दूसरी ओर, क्योंकि CBB पारंपरिक पीएलबी के उत्तराधिकारी है, जिसके लिए भौतिक ज्ञान की एक बड़ी राशि8जमा किया गया है, इस पृष्ठभूमि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सतह रसायन विज्ञान३८ के ज्ञान के संचालन के लिए उपयोगी है और हेर CBBs. CBB रासायनिक संरचना और शारीरिक स्थिति६१को संशोधित करने की अपनी क्षमता के साथ चैनल-झिल्ली रिप्ले का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी मंच का कार्य करता है । CBB में, लिपिड बुलबुले अस्तर monolayer चरण और bilayer की पुस्तिका की सीमा के पार स्वतंत्र रूप से फैलाना कर सकते हैं, और हम इस तरह के bilayer के रूप में तकनीक विकसित की है-अलग और झिल्ली छिड़काव४५तरीके । हम में इन विट्रो चैनल प्रोटीन संश्लेषण के लिए CBBs बढ़ाया है, जहां चैनल संश्लेषण बुलबुला में प्रदर्शन किया गया था, और नव संश्लेषित चैनल प्रोटीन एक झिल्ली की क्षमता के आवेदन के तहत bilayer को सहज हस्तांतरण के अधीन थे जहां KcsA चैनल के नवजात चैनल कार्यों प्रतिलिपि प्रारंभ करने के समय से पता लगाया गया था/KcsA डीएनए६२के अनुवाद/

प्रोटोकॉल के चरणों के बीच, बबल का आकार बनाए रखना महत्वपूर्ण है । बुलबुले धीरे से प्रफुल्लित हो सकता है या अनायास हटना क्योंकि इंटरफ़ेस करने के लिए लिपिड हस्तांतरण धीमी है और monolayer तनाव को बदलने के लिए प्रवण है । विशेष रूप से, पहले सिर्फ liposome समाधान के चूषण के बाद फुलाया बुलबुला (कदम 4.8.3 और ४.१०) मुश्किल है क्योंकि monolayer तनाव पिपेट की नोक पर संचित liposomes द्वारा कम है बनाए रखने के लिए । प्रारंभिक बुलबुले और बुलबुले के बाद गठन को छोड़ स्थिर CBB प्रदान करते हैं । बुलबुला आकार और दबाव के ठीक ट्यूनिंग के दृश्य अनुरेखण आवश्यक हैं ।

CBB पद्धति के लिए प्रयोगात्मक सीमाएं हैं । हालांकि CBB electrophysiological माप के लिए बनाया गया है, कुछ लिपिड रचनाओं के लिए bilayer के विद्युत प्रतिरोध पर्याप्त उच्च नहीं हो सकता है (जैसे, १०० GΩ) एकल चैनल रिकॉर्डिंग के लिए. उदाहरण के लिए, dioleoyl phosphatidylcholine अक्सर liposomes के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह 25 डिग्री सेल्सियस६३पर बिजली के नलों CBBs रूपों । CBBs भी लिपिड प्रजातियों जिसका चरण संक्रमण तापमान रिकॉर्डिंग तापमान के ऊपर है के साथ नहीं बनाया जा सकता है । दरअसल, CBB गठन कमरे के तापमान पर dipalmitoyl phosphatidylcholine के साथ मुश्किल था, लेकिन टीएम ऊपर तापमान स्थापना६४समस्या को दरकिनार कर दिया । इन प्रयोगों में, तापमान स्लाइड ग्लास६२के नीचे एक पारदर्शी गर्मी थाली ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके नियंत्रित किया गया था । अक्सर इस्तेमाल लिपिड diphytanoyl phosphatidylcholine के चरण संक्रमण तापमान 0 डिग्री सेल्सियस ६५के नीचे है, और CBBs आसानी से एक व्यापक तापमान रेंज में३२,४५,५१ का गठन कर रहे हैं ।

जल-तेल इंटरफ़ेस के फॉस्फोलिपिड लिपिड-इन या लिपिड-आउट विधि से प्रदान की जाती हैं, जहां हस्तांतरण दर लिपिड-में६३की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक धीमी है । इसके अलावा, अज्ञात कारणों के लिए, bilayer झिल्ली के विद्युत प्रतिरोध अपेक्षाकृत लिपिड बाहर विधि से लिपिड में विधि के साथ छोटा है ।

प्रोटोकॉल (चरण ४.८) में, liposomes और चैनल-पुनर्गठन liposomes (1 µ l) का समाधान पिपेट (चरण ४.९ और ४.१०) की नोक से लोड किया गया है, और शेष पिपेट पहले से भरा इलेक्ट्रोलाइट समाधान शामिल हैं । यह केवल इस तरह के लिपिड और चैनल अणुओं के रूप में सामग्री के संरक्षण के लिए है । नतीजतन, liposomes के ऊपरी पिपेट समाधान की ओर धीरे से फैलाना, और कुछ समय के बाद, लिपिड एकाग्रता पिपेट की नोक पर लिपिड monolayers फार्म करने के लिए अपर्याप्त हो जाता है । इस स्थिति में, ताजा liposome समाधान aspirated से टिप (चरण ४.८) होना चाहिए । इस लौकिक एकाग्रता परिवर्तन दरकिनार किया जा सकता है जब पूरे पिपेट लिपिड और चैनल अणुओं से युक्त समाधान से भर जाता है, जबकि liposomes धीरे से बुलबुले में नीचे बसा । इस मामले में, बुलबुले नए सिरे से कर रहे हैं ।

Electrophysiologically, CBB आकार पैच दबाना की तुलना में बड़ा है, इस प्रकार एक बड़ा झिल्ली समाई उपज । हालांकि, श्रृंखला प्रतिरोध (झिल्ली प्रतिरोध की एक श्रृंखला में विद्युत प्रतिरोध) बहुत कम है (~ १०० kΩ) कि पैच क्लैंप के लिए (पिपेट प्रतिरोध > 1 MΩ), जो वोल्टेज दबाना की गति में बढ़ौतरी और पृष्ठभूमि शोर क्षीणन और श्रृंखला प्रतिरोध त्रुटियों में वोल्टेज-clamped झिल्ली क्षमता६६,६७,६८। पृष्ठभूमि शोर झिल्ली समाई और श्रृंखला प्रतिरोध, जहां एक कम श्रृंखला प्रतिरोध एक उच्च झिल्ली समाई पूरक, कम पृष्ठभूमि शोर9में जिसके परिणामस्वरूप का एक समारोह है ।

लिपिड bilayer प्रयोगों के एक नियम के रूप में, डिटर्जेंट कांच के बनने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । यहां तक कि डिटर्जेंट की एक ट्रेस मात्रा bilayer की अखंडता perturbs । ऐसे क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल और इथेनॉल के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स के बजाय इस तरह की सफाई प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

कुल मिलाकर, CBB दोनों पैच दबाना (जैसे, झिल्ली के यांत्रिक हेरफेर) और पीएलबी (जैसे, झिल्ली की लिपिड संरचना को संशोधित करने की क्षमता) के लाभों को एकीकृत करता है । चैनल बनाने के विभिन्न प्रकार के पदार्थ और चैनल प्रोटीन५२,५३,६९,७०अध्ययन किया गया है । इस विधि के विकास के बाद से तेजी से अधिक शोधकर्ताओं चैनल पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं-झिल्ली पुनरावृत्ति, और CBB विभिन्न प्रयोगों के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करता है. CBB विधि में आगे प्रयोगात्मक विकास की उंमीद कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

लेखक तकनीकी सहायता के लिए मारिको Yamatake और मासको Takashima का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह काम KAKENHI अनुदान संख्या 16H00759 और 17H04017 (सू) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १४३ लिपिड Bilayer पैच दबाना पानी में तेल छोटी बूंद Monolayer आयन चैनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी भूतल रसायन विज्ञान
लिपिड Bilayer प्रयोगों के साथ संपर्क बुलबुला Bilayers के लिए पैच-clampers
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Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

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