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Neuroscience

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58840
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Fukui Faculty of Medical Sciences

Summary

ここでは、連絡先バブル膜法を用いた脂質膜の形成のためのプロトコルを提案する.有機溶媒、油水界面単分子層を形成するという水のバブルが吹かれます。2 つのピペットは、層を形成する泡のドック操作されます。

Abstract

脂質二重膜脂質組成の様々 な膜の下でチャネル膜相互作用の検査を許可する、イオン チャネルの機能研究のユニークな実験的プラットフォームを提供します。中でも、液滴インターフェイス層の人気を得ていますただし、大型膜面サイズは、低電気ノイズの記録を妨げています。平面脂質二分子膜の利点を組み合わせた連絡先気泡膜 (CBB) 法と脂質組成を変化させると二分子膜の力学をそれぞれ操作する能力などのパッチ ・ クランプ方法を設けています。従来のパッチ ・ クランプの実験のセットアップを使用して、CBB 試験が容易に行えます。簡単に言えば、有機溶媒 (ヘキサデカン)、ガラス ピペットで電解質溶液が吹かれると、ピペット圧力が安定気泡サイズを取得維持されます。泡が泡でリポソームから提供される脂質膜 (純粋な脂質または混合脂質) 自発的に並んでいます。次に、2 つ単分子膜並んで泡 (~ 50 μ m 径) ガラス ピペットの先端には、二重膜形成のためドッキングされます。チャンネル再構成リポソームのバブルへの導入は、ホールセル記録に匹敵する単一チャネル信号対雑音比と現在の録音を可能にする、膜チャネルの設立に します。非対称の脂質組成の CBBs 容易に形成されています。CBB が以前泡を吹き、新しいものの形成によって繰り返し更新されます。CBBs。 ここに様々 な化学的および物理的な摂動 (例えば膜灌流と二分子膜緊張) を課すことができる、CBB の形成のための基本的な手順を提案します。

Introduction

イオン チャネルの細胞膜は単にサポート材料パートナー イオン流束を生成するためです。機能的には、膜はイオン チャンネルが埋め込まれて、電気絶縁体、すべての細胞膜が静止膜電位を別れて。従来、任意の膜電位は、チャネルを介して電圧電流の測定、外部回路から課されました。別の膜電位でのイオン流束のこの定量的評価では、これらのチャネルのイオン選択性透過などゲーティング機能1,2分子の特性を明らかにしました。イオン チャネルの機能解析のための膜プラットフォームは、細胞膜や脂質二分子膜です。歴史的に、シングル チャネル電気現在録音は脂質二重膜3,4で最初に実行された、関連技術をパッチ ・ クランプの方法 (図 1Aなどの細胞膜の開発しました。)5,6。以来、これらの 2 つの手法を個別にさまざまな目的 (図 1)7,8の進化しています。

膜脂質と二分子膜は、現在のチャネル蛋白質の機能と構造を支える役割研究の焦点です。したがって、膜脂質組成を変化させる方法の準備状況は、需要が高いです。平面脂質二分子膜 (PLB)8,9,10,11、油中水滴二層12、液滴インターフェイス層 (DIB)13,などの脂質二分子膜形成方法14,15,16,17,18,19テクニック (図 1) は、一般的な選択肢、20脂質組成の変動を受けるチャネル機能を調べることのための機会を提供することです。DIB は技術的に従来の PLB よりもはるかに簡単ですが、DIB の大きいサイズがシングル チャネル伝導性の通常サイズと現在のレコーディングを勉強のために適用するパッチ取り付けの阻害要因を作成 (< 100 pS)。

バック グラウンド ノイズを回避するために膜面積を最小化する必要があります。この問題は、脂質二重層 (図 1) の電気生理学的な技術の開発の歴史の繰り返しを思い出します。(先端ディップ法; ピペットの先端に形成された小型膜 (直径 1-30 μ m) 初期の頃の図 1C)21,22,商工会議所 (図 1B) の疎水性中隔のフリースタンディング膜 (直径 ~ 100 μ m) を使用してのではなく、 23日。多くの低いバック グラウンド ノイズ24電気計測のヒント ディップ法。PLB25,26, 先端ディップ22,23,27, パッチク ランプ-28,29,30,と私たちの経験31の方法は、水に油の膜の原理を使用して脂質二重層を形成、斬新なアイデアに私たちを導いた。連絡先バブル膜 (CBB) メソッド20,32としてこれを紹介しています。このメソッドで水滴を油相 (図 1D) にぶら下がっているのではなく水のバブルからの吹きガラス ピペット (先端を直径約 30 μ m) と(図 1と 2)、油相にどこ、バブルは、安定した圧力を適用することによって管理されます。バブルの表面で水-油界面における自発的に単分子膜形態。2 つのガラス ピペットの操作によって 2 つの気泡がドッキングしているし、2 つの単分子膜は平衡二分子膜領域を降伏、互いに近づくと、2 層が形成されます。バブルのサイズは、(保持圧力)、内バブル圧と同様に二層サイズによって制御されます。50 μ m の平均粒径がよく使用されます。泡のボリュームは小さい (< 100 pL)、バルク電解質相を構成する 1 マイクロリットルの範囲内にあるピペット ソリューションの大きいボリュームに接続されています。

CBB 法 (表 1) を使用する多くの利点があります。脂質二分子膜形成技術として様々 な組成の脂質膜を作り出すことができると従来の折りたたみ法33によるものよりも、非対称膜がより容易に形成された32 。2 層機械的に操作できます、静水圧差34,35曲げるだけことができる従来の PLB とは異なり。保持圧力を変更すると、泡で拡張または縮小、増加または減少させる膜張力32に 。2 層は、単分子膜、形態学的研究における膜の凍結破壊技術36,37のように機械的に取り外し可能が、CBB、策略により繰り返さデタッチし、アタッチ サイクル32.バブル内の電解液の少量は、二層にチャネル再構成リポソームの効率的な融合でき、チャネルの録音を得ることの確率は従来の PLB 手法でよりはるかに高い。小さな気泡容積も急速な灌流 (~ 20 ms) 内で一度別注入が可能ピペットが泡のいずれかを挿入します。パッチ ・ クランプのメソッドとは異なり、ただちに、壊れた、CBB 膜が再結成し、ピペットは、日に数回を使用できます。パッチ ・ クランプと PLB メソッドの利点を統合することにより、CBB はチャネル膜相互作用の前例のない研究を可能にする膜の物理化学的条件の変化する汎用性の高いプラットフォームを提供します。

CBB 形成過程の詳細なプロトコルを提示する前に膜形成の物理化学的背景膜形成に関する実験の難しさを解決するパッチ取り付けのために有用される最初にされます。それが発生しました。

CBB 実験は、界面化学科学38の教訓を伝えます。CBB のシャボン玉吹きストローから空気中に水のバブルが有機溶剤に吹かれて同様に、どこに似ています。膜脂質、水のバブルや有機溶剤のいずれかに含まれていない場合、水のバブルが膨張ほとんど 1 つに気づくでしょう。両親媒性脂質がない場合は、油水界面での表面張力が高いと泡を吹くためバブル内の圧力が高くなります。これはラプラス方程式の実現 (ΔP = 2 γ/R、どこ ΔP 内バブル圧力、γ は表面張力、R はバブルの半径)。有機相または電解質溶液での脂質の濃度が高い場合、単分子膜の脂質の密度増加、ギブスの吸着等温線によって決定される (-dγ = Γ私dµ私、表面の過剰は私Γ化合物は、μ は私がコンポーネントの化学ポテンシャル私)39、低い表面張力とバブル形成の容易さに 。CBB の接線角度 (図 2) から 2 層を観測できるし、単分子膜と膜の間の接触角を測定可能です。この角度は、単分子膜の surface tensions と二分子膜間の平衡を表します (若い方程式: γbi = γmo cos(θ)、どこ γbiは二分子膜張力 γmo膜張力はある、θ は接触角)。接触角の変化は、単分子膜の張力は接触角の変化から膜電位の関数として評価されることを考える二分子膜緊張の変化を示す (若いリップマン式: γmo = Cm V2/4 (cos (θ0) - cos (θv))、ところ Cm膜容量、V は膜電位を、θ0と θvは、それぞれ 0 と V mV で接触角)40,41 ,42。2 つの泡が十分に近い、彼らは自発的に互いに接近します。これは van der Waals 力によるものと我々 は視覚的に CBB 形成における動的な過程を観察できます。

CBB システムは個別のフェーズで構成されています: バルク石油相、すなわち、水の泡、単層および接触層 (図 3) でコーティングします。これらは、膜相周辺 2 単分子膜43,44に挟まれた薄い有機相溶媒を含むトーラスなど、PLB において複数のフェーズを連想させる。CBB の単分子膜の相は、二層のリーフレットと連続と脂質分子単層とリーフレットの間拡散します。単分子膜の相は、脂質の貯蔵所として機能する主要なフェーズを構成する気泡表面のほとんどをカバーします。単分子膜の脂質の疎水性尾はバルク油相を外側に延長ので、二層内部または疎水性コアはバルク油相に開きます。したがって、2 層に近い油相に注入される疎水性の物質は膜内部に容易にアクセスすることができます。これは我々 が開発した最近45、急速に (秒) 以内、膜脂質組成を変更シングル チャネル現在録音中膜灌流法です。2 層でコレステロール含有量が45の内外でのコレステロール血流を切り替えることにより可逆的に制御できることがわかった。関連する物質の濃度勾配の解消がマランゴニ効果46,として知られている拡散をすぐに単層および二層に関連する物質の濃度が異なる場合に、47。 その一方で、単一層にフリップフ ロップが遅い48,49,50。

CBB メソッドを使用すると、2 層が、電解質の pH 低 1 としてなど、多彩な物理化学的条件の下で形成されるシステム注 mV として高い膜電位、最大 3 M (K+、ナ+)塩濃度5160 ° C までの温度

そこに、CBB の形成のためのいくつかのオプションとチャネル分子の結合があります。油水界面単分子膜の形成に有機溶剤 (脂質アウト メソッドで脂質が追加されます。図 4A、4 C)やリポソーム (脂質の方法; としてバブル図 4B、4 D)特に、脂質のメソッドは非対称膜15,32の形成のためことができます。チャネル蛋白質に再構成されたに対しチャネル分子 (例えば、チャネル形成ペプチド) 水溶液に可溶、バブル (図 4A, B)52,53, に直接追加されます。リポソームは、バブル (図 4C, D) に追加されます。ここで、チャネル ペプチド (巨大 B (pTB); 脂質で法による CBBs の形成図 4A) または蛋白質 (KcsA カリウム チャネル、図 4C) が表示されます。

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Protocol

1. リポソーム

  1. (例えば、10 mg/mL) 望ましい集中にクロロホルムでリン脂質 (例えば粉末で 10 mg) を分散させます。
  2. クロロホルムを蒸発させます。
    1. 場所丸底フラスコ、ロータリーエバポレーターでそれは N2ガス シリンダーに接続 (材料の表を参照してください) のセットでリン脂質液。(30 分程度) 後表示される薄いリン脂質膜まで室温で N2の流れの下でフラスコを回転します。
    2. オープンのフラスコを真空ポンプに接続されているデシケータに配置します。真空ポンプを使用して、徹底的にクロロホルムを削除するいくつかの時間デシケータの中を吸引します。
  3. フラスコに電解液の適切なボリュームを追加し、リン脂質懸濁液 2 mg/mL を取得するリン脂質を中断します。
  4. 数十秒お風呂超音波発生装置を使用してのための懸濁液の超音波 (材料表を参照) を多層小胞 (MLV) 懸濁液を得る。
  5. イオン チャネル蛋白質を含むプロテオリポソーム調製された、タンパク質溶液を追加 (; 適切な洗剤を使用して可溶化蛋白質 2% のボリュームは最大) MLV 懸濁液お風呂超音波発生装置を使用していくつかの秒の超音波と。

2. 準備する大口径ガラス ピペット

  1. ピペットの引き手にガラスの毛細管を設定し、二段引きで罰金テーパ先端マイクロ ピペットを作製します。
  2. マイクロ ピペットを on、マイクロフォージ 30 ~ 50 μ m の直径を持つテーパ部にプラチナ フィラメント マイクロ ピペットの先端を連絡してください。
  3. 簡単にフィラメントを熱する (5 s) し、すぐにオフします。
    注: この操作では加熱でクラック ポイント、マイクロ ピペットの先端が断ち切られる、30 ~ 50 μ m の直径を持つ広い穴を残してというフォーム。

3. 浅い凹状井戸 (撥水加工仕上げのためケイ) スライド グラスの表面を治療します。

  1. 蒸留水やエタノールと浅い井戸でスライド ガラスの表面をきれいにします。
  2. ホール スライド ガラス上に反応試薬 (撥水加工) の適切なボリューム (例えば、100 μ L) を適用します。
  3. 完全に空気で試薬を乾燥させます。
  4. 倒立顕微鏡のステージ上のスライド ガラスを配置します。

4. CBB の形成し、電気生理学的測定を行う

  1. シリル ホール スライド ガラスの浅い井戸にヘキサデカンの 100 μ L を追加します。
    注: 脂質メソッドのリン脂質中に分散させたヘキサデカン (20 mg/mL) 事前。
  2. マイクロ ピペット、ツベルクリンの注射器を使用しての長さの半分に電解質溶液を埋めます。
  3. 電解質溶液をピペットに浸る銀/塩化銀線電極を許可する圧力ポートとマイクロ ピペット ホルダーにマイクロ ピペットを設定します。
  4. パッチ ・ クランプの増幅器と電気地面に他の 1 つのヘッド ステージ ピペット ホルダーのいずれかに接続します。
  5. マイクロをマイクロ ピペット ホルダーの圧力ポートに接続します。
  6. 倒立顕微鏡のステージ上の適切な位置にマイクロ ピペットを設定するには、マニピュレーターを操作します。
  7. 潜在的な電極のオフセットを調整します。
    1. 場所 1 μ 同じ電解質溶液を電解質ドームを作成する、ホール スライド ガラスの浅い井戸の周りの平らな面にマイクロ ピペットを埋めるために使用します。
    2. 電解質のドームにマニピュレーターを操作することによって両方のマイクロ ピペットの先端を浸します。
    3. パッチ ・ クランプ アンプの電位オフセットを調整します。
    4. CBB を壊すことによって実験の終わりの正しいオフセットを確認を介してアプリケーションの高い膜電位 (放電; アンプで Zap を使用して)、1 つ (バブル核融合) に融合される泡 2 つを引き起こしています。
    5. その計算値は対象の潜在的な真の膜の潜在的な応用膜非対称電解質溶液を使用、する場合の液絡部潜在的な54を修正します。
      注: 潜在的な液絡部は JPCalc55プログラムを使用して計算されます。
  8. リポソーム液を先端から描画します。
    注: 脂質アウト法を用いた水溶性チャンネルを調べると、リポソーム液の吸引必要はありません。
    1. リポソーム液 1 μ L をホール スライド ガラス (リポソーム含むドーム) の浅い井戸の周りの平らな面に配置します。
    2. マニピュレーターを操作し、リポソームを含むドームに、マイクロ ピペットの先端を挿入します。
    3. ガラスシリンジを使用してマイクロ ピペット ホルダー内の圧力を下げることによってリポソーム含有溶液を吸引します。
    4. 他のピペットの手順を繰り返します。
  9. マニピュレーターを操作、浅い井戸でヘキサデカンにピペットの先端を浸しなさい。
  10. バブル (例えば、直径 50 μ m)、目的のサイズに達するまで圧力を高めることによってゆっくりと水に泡を吹くし、その後同じ圧力を維持します。
  11. 泡を破棄するには、バブルのサイズを安定に保つは難しい場合、オイル空気インターフェイスを先端を通過します。
  12. 手順 4.8 から 4.9 を繰り返して安定した気泡を形成します。
  13. (図 5) での間の接触を許可するように、泡を操作します。
    注: 場合によっては、泡 CBB を形成するために自発的に互いに接近します。他のケースで泡がありますが、お互いに連絡しないでください。この場合、それぞれのプッシュ泡他機械的に。
  14. サイズが定数内バブル圧力でも徐々 に変わるために、バブルのサイズを維持するために圧力を微調整します。
  15. 潜在的な膜をパッチ ・ クランプのアンプを使用して適切な値に設定し、(図 6) を emerge する現在のチャネルを待ちます。

5. 二重層容量を測定します。

  1. 潜在的なランプを適用することで二分子膜キャパシタンス (Cエル) を測定します。
    注: ランプ コマンドで電圧変化率が-10 mV/10 ミリ秒後 10 mV/10 ms (または 1 V/s) と、斜面の変更時に現在のジャンプの振幅に対応 (例えばmembrane'scapacitance の値の読み取り、100 pA → 100 pF)。
  2. 評価 2 つの膜面積泡は他の 1 つの積み重ねし、二分子膜 (図 6) のエッジを表示する 2 層レベルで顕微鏡の焦点します。
    注: 二重膜形状は円形、主と地域、半径から計算されます。
  3. 二層エリアで電気容量で割って特定膜キャパシタンス (Csp) を計算 (Csp Cエル/A を =)。
  4. 膜厚 (疎水性コアの厚み) を計算 Dcを使用して (、εrと ε0を表す二重膜の疎水性領域の誘電率と比誘電率 (εrε0)/Cspを =真空のそれぞれ)。

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Representative Results

典型的な CBB いた (図 5, 6) 50 μ m の直径、ヘキサデカン特定膜容量 0.65 μ F/cm2であった。バブルの大きさは任意内気泡圧によって制御されます。小さな泡が低ノイズ録音に必要な先端の直径は少ないはずです。たとえば、直径 50 μ m の気泡径、先端径を 30 μ m にする必要があります。

CBB は形作った、水溶液、リポソーム チャネル分子が自発的に数十分にいくつかのスパン内膜に挿入されます。チャンネルの挿入は、現在振幅 (図 7) 応用膜電位下での段階的な増加によって確認されました。膜面積 (< 1,000 μ2) 従来の PLB と DIB を基準にしてシステムが電気の信号対雑音比を大幅に改善します。

膜が中断された、2 つの泡の合併まで、現在のレコーディングを続けることができなかった。新しい泡が吹き飛ばされ、ただちに CBB が形成されました。ピペットは、一日の内で繰り返し使用できます。

義務をアタッチを入れ切り離します。CBB 法により形成した膜は、2 つの単分子膜に崩壊することができます。CBB のデタッチ-アタッチは、(detach-attach のデューティ サイクル) の 2 つの泡を操作して繰り返すことができます。このプロセスは、それは容易に 1 価の陽イオン選択性細孔52,56を形成する脂質二重膜に挿入された、pTB の海洋のスポンジからペプチド チャネルのチャネル電流の出現によって監視されました。2 単分子膜を取り付けた後すぐに pTB チャネル電流が登場し、現在はお問い合わせ増加 (図 8) の領域として大きくなった。電流の振幅は、デタッチと同期だった-CBB の操作をアタッチします。

KcsA チャネルの単一チャネル測定。KcsA カリウム チャネルは pH に敏感、酸性の細胞内 pH57によってアクティブ化されています。したがって、電解質溶液は、非対称58,59,60に設定されました。手順で 4.2 CBB 形成、左サイドのピペット ソリューションは、右側にあるの pH 7.525で設定されていた pH 4 に設定されました。4.7.1 のステップ、左のピペットを穿刺用スライド ガラス上にリポソーム懸濁液よりもむしろプロテオリポソーム懸濁液を入れました。したがって、KcsA チャネルは、左のバブルに直面して細胞質ドメインと膜の指向だった。たんぱく質: 脂質重量比配分のリポソームは、シングル チャネルの現在の録音や、1:10 比率は、巨視的電流記録に適しています。

非対称膜。非対称の脂質は、各バブル (脂質で)15,32の異なるリポソーム懸濁液を使用して形作ることができます。膜の KcsA チャネルの方向は、その細胞質側に向かって左側にあることにつながる (pH 4で/pH 7アウト)、非対称ソリューション pH を設定することによって調整されました。したがって、右側が「アウト」として割り当てられていたに対し、「で、」として左側が配属KcsA チャネルのゲーティング脂質依存性を考察し、CBB (非対称 CBB を含む) の 4 種類が使用されました。すなわち、PGで/PGうちPGで/パソコンをPCで/PGアウト、および PCの/パソコンを(PG: ホスファチジルグリセロール) (図 9)。KcsA チャネル展示オープン確率が高い (> 90%) PGで/PGうちと膜を/パソコンでPG だけで。KcsA チャネルでは、高い確率でオープン26陰イオン性リン脂質膜の内部のリーフレットの存在が必要です。

Figure 1
図 1:脂質二重膜とパッチ ・ クランプ方法。様々 な方法は、脂質二重層を形成するために開発されています。(A) パッチ ・ クランプ法。(B) 従来の平面脂質二分子膜メソッドは、小さな穴に自由に立って、ほとんど垂直二層を提供します。(C) ヒント ディップ法。気水界面単分子膜は、ガラス電極の先端に配置されます。様々 な変更が開発されています。(D) 液滴インターフェイス層メソッドです。(E) バブル膜法にお問い合わせください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 2
図 2:気泡の膜を問い合わせてください。油相に、泡を吹き、脂質分子を自発的に水-油インターフェイスに転送します。(脂質で)、バブルのリポソームがそれぞれに含まれている脂質の種類と関連する脂質によって専ら単分子膜が形成されます。2 単分子膜をドッキング、非対称膜を生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 3
図 3:Distinct 相接触バブル脂質と脂質のダイナミクスそこに。脂質泡のライニングは、彼らは単層または層のいずれかに所属するという段階を構成します。2 層間脂質のフリップフ ロップは頻繁に、および非対称膜が長時間保持されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 4
図 4:脂質アウトまたは脂質による脂質を提供します。脂質は、有機溶剤 (脂質アウト; のいずれかを追加します。A および C) または水溶液としてリポソーム (脂質で;B と D のような)。脂質のメソッドでは、非対称膜が形成されます。ペプチドなど (青)、水溶液に溶けるチャネル形成物質が泡の 1 つに追加され、自発的に 2 層に挿入します。脂質のメソッドでチャンネルの一部は 2 層に融合し、リポソームに挿入されます。再構成されたチャネル蛋白質 (赤) では泡の 1 つに追加されますいて、自発的に、膜融合リポソーム脂質アウトまたは脂質のいずれかの方法で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 5
図 5:形成と連絡先の顕微鏡像バブル膜。2 層は接線方向から観察されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 6
図 6:二層膜領域を測定するための観察します。2 つの気泡に積み上げられているピペット操作による他と顕微鏡は連絡先バブル膜のレベルに注目しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 7
図 7:接触バブル二分子膜に KcsA チャネルの段階的な挿入します。KcsA チャネルの E71A 変異は、挿入されたチャンネルの即時検出を表示する使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 8
図 8:単分子膜およびチャネルの応答のデタッチ-アタッチします。巨大 B ペプチド チャネルは膜に自発的に設立し、泡の 1 つに追加しました。戸建、膜のチャネルを撤回したが、チャンネル追加側のリーフレットには膜で保持されました。添付ファイルにチャネルは膜に挿入されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

Figure 9
図 9:非対称膜およびチャネル活動リーフレットの組成に依存して形成します。KcsA チャネルは膜の内部のリーフレットには、PG などの酸性脂質によって規制されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 

従来の PLB リポソーム パッチ DIB CBB
成功率1 高 低 非常に高い 非常に高い
即時 reformability2 うん 違います 中間 うん
非対称膜 うん 違います うん うん
ソリューション交換 遅い 非常に速い 遅い 高速
S/N 比3 低 高 低 高
膜変形 違います 違います 違います はい4
機械操作 違います はい5 うん うん
膜灌流 違います 違います うん うん
脂質組成 多様です 限定6 多様です 多様です
1試用版につき安定した脂質二重膜を形成の成功率。
2膜の分解後すぐに新しい膜の形成。また、膜を繰り返し形成です。
3信号対雑音 (S/N) 比は膜容量から生成された電気的背景騒音主を表します。
42 つのバブルの間異なる内部圧力を適用することによって、凹面、または凸面の膜を形成できます。
5膜張力を増やすだけ。
6リン脂質の巨大リポソームを形成することができますが該当するが、ギガ シールは得られない可能性があります。

表 1: さまざまな脂質二分子膜の特性。

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Discussion

CBB 脂質二分子膜形成法は、単層20並んで油中水滴の原則に基づいています。技術的には、CBBs を形成するための手順が簡単、特にガラス マイクロ ピペットの操作に精通したパッチ ・ クランプの研究者。インジェクターを持つ 2 つのピペット マニピュレーターがありますパッチ クランプの電気生理学的のセットアップが容易に、CBB で使用されます。一方、CBB は従来の PLB の後継者、累計8、この背景だけでなく、表面の化学の知識を大量の物理化学的知識をされている38便利です営業のため、CBBs を操作します。CBB の化学組成と物理的な状態の61の変更機能にチャネル膜トーキョーの勉強に汎用性の高いプラットフォームを提供しています。CBB でバブルをライニング脂質は単分子膜の相と、二重膜のリーフレットの国境を越えて自由に拡散が、2 層アタッチ デタッチなど先進技術のある我々 と膜灌流方法45。我々 は体外チャネル蛋白質が合成、どこチャンネル合成がバブルで行われ、新たに合成されたチャネル蛋白質は膜電位の適用を受ける二層への自発的な転送を受けた CBBs を拡張しています。どこ KcsA チャネルの初期チャンネル機能は、62KcsA DNA の転写・翻訳の開始の時間からトレースしました。

プロトコルの手順の中で、バブルの大きさを維持することは重要です。泡がゆっくりとうねりまたはインターフェイスに脂質転送が遅い、単分子膜緊張を変更する傾向があるので自然に縮小します。特に、最初のバブルを膨らませた直後 (手順 4.8.3 と 4.10) リポソーム液の吸引はリポソームによる単分子膜の張力を低く維持するためにハードには、ピペットの先端に蓄積。CBB の安定を提供する初期の泡と泡の形成を破棄します。バブル サイズのビジュアル トレースと圧力の微調整が必要です。

CBB 法を実験的制限もあります。特定の脂質組成の二重膜の電気抵抗ができない場合があります、CBB は電気生理学的測定のために設計されていますが、十分に高い (例えば、100 GΩ) シングル チャンネル録音のため。たとえば、dioleoyl ホスファチジルコリンは、リポソームの頻繁に使用されるが、それは 25 ° C63で電気漏れ CBBs を形成します。CBBs もその相転移温度は記録温度以上脂質種を形成することはできません。確かに、CBB の形成は、室温でジパルミトイルホスファチジルコリンリポソームでは困難だったが、問題64を回避 Tm以上温度を上げます。これらの実験で温度は透明熱板を使用して制御 (材料の表を参照してください)、スライドの下にガラス62。頻繁に使用される脂質 diphytanoyl ホスファチジルコリンの相転移温度は 0 の ° C の65、以下 CBBs、広い温度範囲で容易に形成された32,45,51 。

水-油界面のリン脂質は、いずれ脂質または脂質アウト メソッド、転送速度は脂質で法63よりも脂質を比較的遅いから提供されます。また、理由は不明ですが、二分子膜の電気抵抗が脂質でメソッドを持つよりも脂質をメソッドに比較的小さい。

プロトコル (手順 4.8)、リポソームとチャネル再構成リポソーム (1 μ L) 溶液 (4.9 と 4.10 のステップ)、ピペットの先端から読み込みは、ピペットの残りに以前満たされた電解質溶液が含まれています。これは単なる脂質やチャネル分子などの材料を節約するためです。その結果、リポソーム拡散上ピペット解決に向けて徐々 に、しばらくして、ピペットの先端に脂質濃度が不十分フォーム脂質単分子膜となった。この場合、先端 (ステップ 4.8) から新鮮なリポソーム液を吸引する必要があります。リポソームは徐々 に泡に落ち着くに対し、全体のピペットが脂質やチャネル分子を含む溶液でいっぱい、この時間的な濃度変化を回避できます。この場合、泡を更新しました。

生理、CBB サイズはこうして降伏膜容量が大きいパッチ クランプよりも大きいです。ただし、直列抵抗 (電気抵抗膜抵抗のシリーズで)、多くの電圧クランプの速度を加速し、バック グラウンド ノイズを減衰させるパッチ クランプ (ピペット抵抗 > 1 MΩ) のそれより低く、(~ 100 kΩ)電圧クランプ膜電位66,,6768シリーズ耐エラー。バック グラウンド ノイズは、低直列抵抗が高い膜容量、低バック グラウンド ノイズ9の結果を補完する膜容量と直列抵抗の関数です。

脂質二分子膜実験のルールとして洗剤をガラス製品を洗浄する使用しないでください。洗剤量もトレースは、二重膜の整合性を摂動します。クロロホルム ・ メタノールやエタノールなどの有機溶剤は、このような洗浄のための代わりに使用する必要があります。

全体的に、CBB はパッチ クランプ (例えば膜の機械的操作) と (例えば膜の脂質組成を変更できる機能) の PLB の両方のメリットを統合します。さまざまな種類のチャネル形成物質およびチャネル蛋白質研究52,53,69,70をされています。このメソッドの開発はますます多くの研究者がチャネル膜の相互作用に焦点を当て、CBB は様々 な実験のため汎用性の高いプラットフォームを提供します。さらに CBB 法における実験的進歩が期待されています。

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Disclosures

著者はある利益相反を開示します。

Acknowledgments

著者は、テクニカル サポートに真理子山武と雅子高島を感謝したいです。この作品が支持された部分で科研費による補助金番号 16 H 00759 と 17 H 04017 (SO)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) Sigma-Aldrich P3644
A/D Converter Molecular Divices Digidata1550A
Ag/AgCl electrode Warner Instruments 64-1317
Bath Sonicator Branson M1800H-J
Camera Hamamatsu Photonics C11440-10C
Glass Capillary Harvard Apparatus 30-0062
Hepes Dojindo 342-01375
Hole Slideglass Matsunami Glass S339929
Inverted Microscope Olympus IX73
Isolation Table Herz TDI-86LA(Y)2
Micro Injenctor Narishige IM-11-2
Micro Manipulator Narishige EMM
Microforge Narishige MF-830
Micropipette holder
n-Hexadecane Nacalai 07819-32
Patch-Clamp Amplifier HEKA EPC800
Pipette Puller Sutter Instrument Co. P-87
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) Avanti Polar Lipids 850457
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine
)		 Avanti Polar Lipids 850757
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) Avanti Polar Lipids 840457
Potassium Chloride Nacalai 28514-75
Rotary Evapolator Iwaki REN-1000
Succinic Acid Nacalai 32402-05
Vacuum Pump Buchi V-100

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神経科学、問題 143、脂質二重膜、パッチク ランプ、水で油滴、単分子膜、イオン チャネル、電気生理学、界面化学
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Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer… More

Iwamoto, M., Oiki, S. Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers. J. Vis. Exp. (143), e58840, doi:10.3791/58840 (2019).

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