Summary
פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.
Abstract
מערכים microelectrode (אותי) נמצאים בשימוש נרחב לימודים תפקוד במבחנה. מכשירים אלו מאפשרים בו-זמניות פולשני הקלטה/גירוי של פעילות אלקטרופיזיולוגיות לתקופות ארוכות. עם זאת, המאפיין של חישה אותות מכל המקורות סביב כל microelectrode יכול להיות שלילי כאשר מנסים להבין תקשורת, אות התפשטות מעגלים עצביים. ברשת העצבית, מספר הנוירונים ניתן להפעיל בעת ובעונה אחת, ניתן ליצור פוטנציאל פעולה חופפים, ומקשה להפלות ולעקוב אחר התפשטות אות. בהתחשב מגבלה זו, הקמנו במבחנה התקנה התמקדו הערכת אלקטרופיזיולוגיות תקשורת, אשר מסוגל לבודד ומגבירים אותות עצב עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאת התממשקות והתקנים microfluidic אותי, אנחנו יכולים להפריד תרבויות עצביים עם יישור ומבוקרות היטב של אקסונים ו- microelectrodes. התקנה זו מאפשרת הקלטות של ספייק התפשטות עם יחס אות לרעש גבוה במשך מספר שבועות. בשילוב עם נתונים המתמחה באלגוריתמים לניתוח, הוא מספק נתונים היסטוריים כימות של תקשורת מספר הקשורים מאפיינים כגון הפצת מהירות הולכה כשל, קצב ירי, anterograde קוצים, וקידוד מנגנונים.
פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מלכודת תרבות עצביים ממודר מעל המצע משולב אותי כיצד תרבות נוירונים בתוכנית התקנה זו, כיצד להקליט בהצלחה, לנתח ולפרש את התוצאות של ניסויים אלה. כאן, אנו מראים איך הגדרת הוקמה מפשט את ההבנה של תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב. פלטפורמות אלה לסלול את הדרך עבור במבחנה דגמים חדשים עם topographies הנדסה ורשת עצביים לשליטה. הם יכולים לשמש בהקשר של תרבויות עצביים הומוגנית, או עם תצורות תרבות משותפת איפה, לדוגמה, התקשורת בין נוירונים סנסוריים סוגי תאים אחרים הנמצאים תחת פיקוח, העריך. תוכנית התקנה זו מספקת תנאים מאוד מעניין ללמוד, לדוגמה, neurodevelopment, מעגלים עצביים, מידע קידוד, גישות הקשורים ניוון מוחיים neuroregeneration.
Introduction
הבנת תקשורת חשמלית של מעגלים עצביים היא צעד מהותי כדי לחשוף את התיפקוד הרגיל, לתכנן אסטרטגיות טיפוליות כדי לטפל בתפקוד. נוירונים לשלב, לחשב, להעביר פוטנציאל פעולה (APs) אשר יפיץ לאורך אקסונים דק שלהם. טכניקות מסורתיות אלקטרופזיולוגים (למשל, מלחציים תיקון) טכניקות עוצמתיות ללמוד פעילות. עצבית אך מוגבלים המבנים התאיים גדולים יותר, כמו סומא או של דנדריטים לעיתים קרובות. טכניקות ההדמיה להציע חלופה ללמוד אותות עצב עם רזולוציה מרחבית גבוהה, אך הם קשים מבחינה טכנית לבצע ולא מאפשרים מדידות לטווח ארוך1. בהקשר זה, השילוב של מערכים microelectrode (אותי) מיקרופלואידיקה יכולה לתרום תרומה חזק ב לחשוף את המאפיינים הבסיסיים של neuron´s פעילות של אות שידור בתוך רשתות עצביים במבחנה2 , 3.
טכנולוגיה MEA מסתמכות על הקלטות חוץ-תאי של תרבויות עצביים. היתרונות העיקריים של מתודולוגיה אלקטרופיזיולוגיות זו הם יכולתה לתמוך לטווח ארוך, בו זמנית ורישום באתרים מרובים, לא פולשנית דרך3. אותי עשויים מסתיימים, גבוהה מוליך ועמידים בפני קורוזיה microelectrodes נעוץ מצע וופל זכוכית. הם תואמים תא קונבנציונאלי התרבות ביו-ציפויים, אשר באמצעות קידום תא אדהזיה באופן משמעותי להגביר את ההתנגדות איטום בין המצע והתאים3,4. יתר על כן, הם מגוונים בעיצוב, עשויים להשתנות microelectrodes גודל, גאומטריה, צפיפות. בסך הכל, לי לעבוד ככלים תרבות תא קונבנציונאלי עם היתרון של ומאפשר בו-זמניות הדמיה לחיות, אלקטרופיזיולוגיות הקלטות/גירוי.
השימוש בטכנולוגיה MEA תרם המחקר של תכונות חשובות של רשתות עצביות5. עם זאת, קיימות תכונות הטבועות המגבילות את הביצועים של לי ללמוד תקשורת והתפשטות APs במעגל עצביים. אותי לאפשר הקלטות של תאים בודדים ומבנים אפילו subcellular כמו אקסונים, אבל בהשוואה אותות somal, אותות עצב יש יחס אות לרעש נמוך מאוד (SNR)6. יתר על כן, המאפיין של חישה חוץ-תאית שדה פוטנציאל מכל המקורות סביב microelectrode כל הסלים המעקב של התפשטות אות במעגל עצביים.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו, עם זאת, כי ההקלטה תנאים טובים יותר יכולה להיות מושגת על ידי כך את microelectrodes מיושרת צר microchannels שבו אקסונים יכולים לגדול. תצורה זו מספקת שעלייה משמעותית SNR כזה כי הפצת האותות עצב יכול להיות בקלות זוהה7,8,9,10,11,12, 13. האסטרטגיה של לכרות ברית microfluidic התקנים עם טכנולוגיית MEA יוצר microenvironment מבודד חשמלית מתאימים להגביר אותות עצב11. יתר על כן, הנוכחות של microelectrodes חישה מרובים לאורך microgroove הוא היסוד עבור זיהוי ואפיון של התפשטות אות עצב.
כזה פלטפורמות במבחנה עם הרשת העצבית מאוד לשליטה topographies ניתן להתאים שאלות מחקר רבות14. פלטפורמות אלה מתאימים לשמש בהקשר של תרבויות עצביים, אך ניתן להרחיב מהנדס תצורות תרבות משותפת, התקשורת בין הנוירונים סוגי תאים אחרים יכול להיות במעקב ואיפה העריך. תוכנית התקנה זו ובכך מספק תנאים מאוד מעניין לחקור מספר מחקרים עצביות הקשורות כגון neurodevelopment, מעגלים עצביים, קידוד מידע, הקשורים ניוון מוחיים, neuroregeneration. יתר על כן, השילוב שלו עם מודלים המתעוררים של האדם pluripotent המושרה בתאי גזע15,16 יכול לפתוח אפיקים חדשים בפיתוח של טיפולים פוטנציאליים עבור מחלות אנושיות המשפיעות על מערכת העצבים.
המעבדה שלנו היא באמצעות פלטפורמה זו שילוב microelectrodes עם מיקרופלואידיקה (µEF) כדי להבין תהליכים עצביים ברמת סלולריים ורשת, שההשפעה שלהם פיזיו - ואת מערכת העצבים פיפטות. בהינתן ערך כזה פלטפורמה בתחום של מדעי המוח, המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד ליצור תרבות עצביים ממודר מעל המצע משולב אותי, כיצד תרבות נוירונים ב פלטפורמה זו וכיצד להקליט בהצלחה, לנתח ולפרש את התוצאות של ניסויים אלה. פרוטוקול זה בהחלט יגרום להעשרת ארגז הכלים ניסיוני עבור תרבויות עצביים במחקר של תקשורת עצבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים חיות בוצעו על פי האיחוד האירופי (EU) דירקטיבה 2010/63/האיחוד האירופי (משורבב פורטוגזית חקיקה על-ידי Decreto-Lei 113/2013). פרוטוקול נסיוני (0421/000 000 2017) אושרה על ידי ועדת האתיקה של שני פורטוגזית שהסמכות הרשמית על רווחת בעלי חיים וניסוי (Alimentação de Geral-מחפשת ה Veterinária - DGAV), של המוסד המארח.
1. הכנת תרבות תקשורת, פתרונות אחרים
הערה: להכין טרי פתרונות ציפוי ביום של השימוש בו. ניתן לאחסן את פתרונות ציפוי שאינם בשימוש ומדיה תרבות ב-20 ° C או 4 ° C כמפורט להלן.
- הכינו 10 מיליליטר 0.05% (v/v) הפתרון עובד Poly(ethylene imine) (פיי).
- להכין 20 מ של 0.25% (w/v) פיי מניות פתרון על ידי המסת פיי מטוהר (ראה טבלה של חומרים) במים סטריליים.
- למהול 2 מ של 0.25% (w/v) פיי מניות פתרון 8 מ ל מים מזוקקים סטריליים. מערבבים היטב ולהשתמש. ניתן לאחסן פתרון שאינו בשימוש ב 4 º C.
- להכין 1 מ"ל של פתרון laminin 5 µg/mL.
- לדלל 5 µL של 1 מ"ג/מ"ל laminin מניות פתרון µL 995 בינוני הבזליים (ראה טבלה של חומרים). מערבבים היטב ולהשתמש. פתרון שאינו בשימוש ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C עד 1-2 שבועות.
- להכין 1 ליטר של תמיסת מלח מאוזנת של באגירה HEPES האנק (H-HBSS).
- להכין 1 מ' HEPES פתרון על ידי המסת 11.9 גר' אבקת HEPES 50 מ של מים הנדסה גנטית. להתאים את ה-pH ל- 7.2.
- להכין פתרון H-HBSS (ללא סידן ומגנזיום) על ידי המסת 5.33 מטרים מ מ אשלגן כלורי, מ"מ 0.44 אשלגן פוספט monobasic, מ מ 138 נתרן כלורי, 0.3 מ מ סודיום פוספט dibasic, גלוקוז 5.6 מ מ ב- 800 מ ל מים הנדסה גנטית.
- להוסיף 15 מ"ל של 1 מ' HEPES פתרון (הריכוז הסופי של 15 מ מ).
- להתאים את ה-pH ל 0.2-0.3 יחידות מתחת ה-pH הרצוי 7.4 באמצעות 1 N HCl או 1 N NaOH. מוסיפים מים הנדסה גנטית כדי להפוך את עוצמת הקול של הפתרון הסופי.
הערה pH נוטה לעלות במהלך סינון. - לחטא על-ידי סינון באמצעות מיקרומטר 0.22 נקבוביות קרום poly(ether sulfone) (פסי).
- הכינו 10 מ"ל של H-HBSS המכיל 10% חום-לא פעיל סרום שור עוברית (hiFBS).
- למהול 1 מ"ל של hiFBS ב 9 מ ל H-HBSS. מערבבים היטב ולהשתמש. ניתן לאחסן פתרון שאינו בשימוש ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שבועות.
- להכין 5 מ של 1.5 mg/mL טריפסין פתרון.
- מיד לפני שימוש, להתמוסס 7.5 מ"ג של טריפסין ב 5 מ של H-HBSS. לחטא על-ידי סינון באמצעות מיקרומטר 0.22 נקבוביות PES קרום.
- להכין 50 מ של מדיום שהושלם.
- צינור חרוטי 50 מ ל, לערבב mL 48.5 בינוני הבזליים (ראה טבלה של חומרים), 2% (v/v) תוספת של B-27, 0.5 מ מגלוטמין ו 1% עט/דלקת (10,000 פניצילין U/mL ו- 10,000 סטרפטומיצין µg/mL). ניתן לאחסן בינוני שהושלם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שבועות.
2. Microfluidic והכנת ההתקנים MEA
הערה: בצע את השלבים 2.1-2.11 ביום שלפני תא זריעה.
- התקנים microfluidic נקיים כדי להסיר את ייצור ופסולת אחרת באמצעות הקלטת ויניל. לחץ בעדינות את הקלטת נגד המכשיר כדי להגיע בכל התחומים של המכשיר.
- אוויר נקי-פלזמה כר הדשא במשך 3 דקות (0.3 mbar) כדי לנקות את השטח. ולעשות את זה יותר הידרופילית.
- בקצרה להטביע microfluidic התקנים ב- 70% אתנול, לאפשר להם מילה נהדרת בתוך תא למינארי.
- מניחים כל מאה מ מ 90 עקר פטרי ולחטא אותם באמצעות 15 דקות של חשיפה אור אולטרה סגול (UV).
- מעיל MEA במרכז שטח הפנים על ידי המקננת עם 500 µL של 0.05% (v/v) פיי פתרון לפחות שעה ב 37 º C.
הערה: כפי שתואר על ידי אחרים17, פיי ציפוי של לי תוצאות בתא פחות התקבצות מאשר באמצעות ציפוי poly(lysine). - האחות הפתרון ציפוי פיי מהמשטח MEA. ולשטוף אותי 4 x עם 1 מ"ל של סטרילי מים מזוקקים. יש להיזהר לא לגעת השטח MEA במהלך שטיפת צעדים כמו זו עלולה לגרום נזק האלקטרודות.
- מונחה על ידי stereomicroscope בתוך תא למינארי, מרכז את השבב MEA ולהוסיף 1 מ"ל של מים סטריליים לאזור המרכזי של MEA.
- מניחים את המכשיר microfluidic מעל פני השטח MEA.
- בזהירות ליישר את microgrooves של המכשיר microfluidic עם רשת microelectrode של כר הדשא.
- כאשר מיושרים כהלכה, בזהירות וארוקן את עודף המים בלי לגעת כר הדשא או המכשיר microfluidic.
- דגירה של µEFs בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס יבש ולאפשר המלא מצורף. כדי להקל על הקובץ המצורף, לחץ בעדינות את המכשיר microfluidic נגד כר הדשא.
הערה: בצע את שלב 2.12 ביום של התא זריעה. - ברגע µEFs התייבשו לגמרי, לטעון את הבארות microfluidic עם µL 150 של 5 µg/mL laminin ציפוי פתרון, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לפחות לפני תא זריעה.
הערה: בעת טעינת µEF עם פתרון laminin, ודא כי הפתרון ממלא את microgrooves. השתמש ואקום כדי להסיר את כל בועות האוויר שעשויים להיות מתנה בתוך microgrooves.
3. לגשת לנתיחה
- להכין את האזור ניתוח להסרת העובר.
- לחטא משטח העבודה מכשירי הניתוח עם 70% אתנול.
הערה: למרות הקרע הזה הוא לא הליך סטרילי, חיטוי מסייעת להפחית את הסיכון של זיהום. - השתמש חיתול חד פעמיות נקי כדי להגביל את אזור הקרע ופרוס את מכשירי ניתוח להסרת העובר.
- להכין 4 צלחות פטרי 90 מ מ מלא עם H-HBSS קרים ומניחים על מגש עם קרח ליד אזור הקרע.
- לחטא משטח העבודה מכשירי הניתוח עם 70% אתנול.
- המתת חסד עכברוש Wistar בהריון-זמן E-18 על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2).
- עם סיום ההליך, להסיר את החיה מן החדר2 CO ואשר למוות על ידי שיטה המשני של המתת חסד, כגון דימום למוות.
- במקום הצד הבטני בעלי חיים למעלה על החיתול חד פעמיות, לרסס את הבטן התחתונה עם 70% אתנול ולעשות, בעזרת מלקחיים, מספריים, U-צורה לחתוך דרך העור כדי לחשוף את הרחם.
- בזהירות להסיר את העוברים מן הרחם על ידי חיתוך של כל רקמת ולמקם אותם באחת צלחות פטרי עם H קר-HBSS.
- להסיר את כל העובר השק העוברי שלה, בעזרת מלקחיים, מספריים, לערוף את העובר.
- להעביר את הראש embryo´s צלחת פטרי השני מלא עם H קר-HBSS.
- חזור על הצעדים 3.6-3.7 כל העובר.
- לנתח את קליפת המוח הקדם חזיתית.
- להעביר את הראש embryo´s של שליש צלחת פטרי.
- להשתמש זוג מלקחיים כדי לחשוף את המוח.
- להסיר את המוח שלה חלל, לכסות אותו. עם H קר-HBSS.
- אם היא קיימת, להסיר ולמחוק את הנורות הריח. קליפת המוח הקדם חזיתית לנתח ולהסיר את קרומי המוח.
- להעביר את שברי קליפת המוח הקדם חזיתית צלחת פטרי הרביעי מלא עם H קר-HBSS.
- חזור על השלבים 3.9.1 - 3.9.5 עבור כל העובר.
4. קורטיקלית נוירונים דיסוציאציה ותרבות על µEF
הערה: ההליכים הבאים בוצעו בתוך תא למינארי לאחר 15 דקות במחזוריות של עיקור UV. עובד שטח, כמו גם כל החומרים בתוך המנוע צריך להיות קודם לכן נקיים עם 70% אתנול
- כפי שמתואר בשלב 1.5, לפזר את טריפסין בעבר משוקלל ב 5 מ של H-HBSS ולסנן את הפתרון.
- לאסוף את השברים קליפת בעבר ביתר סך של 5 מ של H-HBSS. להעביר אותם צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל.
- להוסיף 2.3 מ ל שזה עתה הוכנו 1.5 mg/mL טריפסין פתרון הצינור המכיל את שברי קליפת המוח.
- לערבב את המתלים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות (להתסיס בקצרה כל 5 דקות).
- תפסיק עיכול רקמת ולהתנקות טריפסין.
- למחוק את תגובת שיקוע המכיל את טריפסין. הוסף 5 מ של H-HBSS המכיל 10% hiFBS כדי להשבית את טריפסין הנותרים; בעדינות להתסיס.
- תן שברי קליפת להתיישב ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.
- הוסף 5 מ של H-HBSS כדי להסיר את שאריות hiFBS. תן שברי קליפת להתיישב ולמחוק את תגובת שיקוע.
- לשטוף שוב את שברי קליפת עם 5 מ של H-HBSS.
- תן שברי קליפת להתיישב ולמחוק את תגובת שיקוע. הוסף 5 מ של מדיום עצביים שהושלם.
- מכנית מביצועם שברי קליפת עם פיפטה serologic 5 מ"ל מאת לאט pipetting למעלה ולמטה במשך 10 - 15 פעמים. אם יש צורך, חזור על הפעולות באמצעות פיפטה של קוטר קטן עד התליה תא הופכים הומוגנית.
- למחוק את הרקמות undissociated שנותרו על-ידי סינון האבוס התליה תא מסננת תא 40 מיקרומטר.
- לספור התאים קיימא ולקבוע את צפיפות התאים.
- ב- microtube, להוסיף 20 µL של 0.4% (w/v) Trypan Blue כדי השעיה תא µL 20. מערבבים היטב כדי homogenate את הפתרון ולהעביר 10 µL נויבאואר ספירת קאמרית.
- לספור התאים קיימא ולקבוע תא צפיפות התאים קיימא.
- להתאים את צפיפות התאים ל- 3.6 x 107 תאים/מ ל (אם יש צורך, צנטריפוגה תא השעיה).
- מיד לפני תא זריעה, הסר laminin ציפוי כל בארות µEF. פיפטה µL 50 של בינוני שהושלם מכל קידוח של תא עצב µEF.
- זרע µL 5 תא השעיה בתוך התא somal µEF. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לשעה כדי לאפשר תאים המצורף המצע.
- בעדינות למלא כל אחד טוב של µEF בינונית שהושלם ומחוממת. להעביר את µEF חממה מעשיר ב 37 מעלות צלזיוס שסופק עם 5% CO2.
הערה: כדי למנוע אידוי מהיר תרבות בינוני, במקום של microtube נפתח מלא מים בתוך הפטרי נושאת את µEF. - לשמור על תרבויות עבור התקופה הנדרשת על-ידי החלפת 50% של תרבות בינוני בכל יום שני עד שלישי של תרבות.
הערה: לאחר הניסויים, מיקרופלואידיקה יכולה להיות מנותקת אותי במועט את µEF במים למשך הלילה. אם יש צורך, מקלפים בעדינות את מיקרופלואידיקה בעזרת מלקחיים. ניתן לנקות אותי על ידי דגירה לילה עם חומר ניקוי מסחרי אנזימטי 1% (v/v) (ראה טבלה של חומרים).
5. הקלטה ספונטנית פעילות. עצבית
הערה: תא עצב בקליפת המוח העוברי תרבויות על אותי להפגין פעילות ספונטנית בדרך כלל ברגע 7 ימים במבחנה (DIV), אך לוקח 2-3 שבועות (DIV 14-21) ועד מבוגרים שהפגינו יציבה פעילות. זה תלוי הנסיין להחליט מתי להתחיל את מדידות אלקטרופיזיולוגיות בהתבסס על מטרות המחקר. ב פרוטוקול זה, ההקלטה של פעילות. עצבית של µEF מומחש באמצעות מערכת הקלטה מסחרית (ראה טבלה של חומרים לפרטים חומרה), עם מודול חימום משולב. עבור ביצוע הקלטות, השתמשנו תוכנה זמינה בחופשיות (ראה טבלה של חומרים לפרטים תוכנה).
- הפעל את כר הדשא הקלטה המערכת לבין בקר טמפרטורה ולאפשר את צלחת הבסיס מחוממת של מגבר קדם להגיע 37 מעלות צלזיוס.
הערה: עבור הקלטות לטווח ארוך (> 30 דקות בכל פעם) אחד צריך גם מערכת שומר על אווירה2 CO. - מניחים את µEF על מגבר קדם (headstage).
הערה: ודא כי השבב MEA מיושר כראוי עם מספר האסמכתא העליונה לקצה הימני. השבב MEA שנשתמש rotationally סימטריים, אבל יישור זה תואם לתקן את הכיוון של פריסת ה-pin של האלקטרודות והתגובה של מזהי חומרה. - סגור, להיצמד אליו את המכסה מגבר קדם.
- כדי להקליט, לפתוח את תוכנת הצריבה ולהגדיר את הפרמטרים הקלטה והנתיב של הזרמים נתוני ההקלטות (עיין במדריך התוכנה לקבלת פרטים על אופן הגדרת ערכת הקלטה).
הערה: רכישה, בקצב דגימה של-20 קילו-הרץ היא בדרך כלל מספיק עבור מרבית היישומים. תדר דגימה גבוה יותר, מומלץ אם ספייק תזמונים נדרש דיוק רב יותר. אם אחד עומד רק קוצים הרשומה, להגדיר מסנן מעבר גבוה 300 הרץ, אשר להחליש את הרכיבים בתדירות נמוכה יותר של האות. אם נתונים גולמיים ומסוננות נרשמים בו זמנית, זה יהיה להגדיל באופן משמעותי את גודל הקובץ נתונים. . זה תמיד אפשר לעשות סינון מקוון של הנתונים הגולמיים. כדי להפחית את נתוני גודל קובץ אחד יכול גם להגביל microelectrodes שממנו לרשומה (למשל, רק microelectrodes בתוך microgrooves). - לחץ על להתחיל DAQ להתחיל קירור והקפאה. בדוק אם התצוגה מראה עקבות ריצה של פעילות, התחל הקלטה.
הערה: רמת הרעש הוא בדרך כלל מעט גבוה יותר. microelectrodes המתאים microgrooves. אם רמת רעש גבוהה מדי (משרעת השיא אל שיא > 50 µV) או לא יציב, מספר microelectrodes, זה יכול להיות בגלל עפר הפרעה איש קשר טוב pin-pad. בדרך כלל לפתור בעיה זו על-ידי ניקוי בעדינות את רפידות קשר MEA וסיכות מגבר קדם בעזרת ספוגית כותנה לחלח עם 70% אתנול. - פתח את הקובץ המוקלט בתוכנת ניתוח (ראה טבלה של חומרים) כדי לחקור במהירות את הנתונים.
6. ניתוח נתונים
הערה: השלבים הבאים מראים כיצד להשתמש בתוכנה µSpikeHunter, חישובית כלי שפותח במעבדה של הלומדים (זמינה בחופשיות על פי בקשה דוא ל pauloaguiar@ineb.up.pt), כדי לנתח נתונים הקליט עם µEF. ממשק משתמש גרפי (איור 2) משמש כדי לטעון את הנתונים, לזהות גלים דקר כציוד, לקבוע את הכיוון שלהם (anterograde או רטרוגרדית) מעריכים הפצת המהירויות. µSpikeHunter הוא תואם HDF5 קבצים שנוצר מתוך הקלטות שהושג באמצעות מערכות MEA2100-משפחה, אשר יכול לשמש בשילוב עם 60 - 120-, 256-אלקטרודה אותי. ההקלטות תוך שימוש רב ערוצית הנסיין ניתן להמיר בקלות את הקבצים HDF5 באמצעות התוכנה זמינה בחופשיות (ראה טבלה של חומרים).
- לחץ על עיון כדי לבחור את קובץ ההקלטה. לאחר מכן, לחץ על הלחצן ' נתוני קובץ ' כדי לפרט את קצב הדגימה, משך ההקלטה, כמו גם רשימה של הזרמים נתוני ההקלטות (למשל, נתונים גולמיים, נתונים מסוננים).
הערה: עבור הפצת האמת מהירות אומדנים, מומלץ לבחור את זרם הנתונים הגולמיים לניתוח. - בחר microelectrodes (שורה אחת או עמודה המשויך microgroove) לניתוח והגדר את הערך סף גילוי ספייק (שלב חיובי או שלילי) ב 6 x סטיית התקן (SD) של הרעש האות. לחץ על קריאת נתונים כדי להחיל את גלאי האירוע ולקבל את רצפי הפצת שזוהה.
הערה: אם מתקיימים הקריטריונים, רשימת רצפי הפצת שזוהו ימלא את לוח ניתוח. המשתמש יכול ואז להציג ולהידבר עם מספר כלים לניתוח רצף הפצת, כולל מתח עקבות, הבין-microelectrode קרוס-מתאמים, הפצת יחיד-רצף המהירויות, kymograph של כלי השמעת השמע. למרות ההערכה מהירות התפשטות ניתן להשיג לכל זוג של microelectrodes או כממוצע של האומדנים עבור כל הזוגות, הערכה זו הוא אמין יותר אם הזוג הרחוק ביותר נבחרה. - חזור על השלב הקודם עבור ערכות microelectrode עניין. בכל פעם לחץ על לשמור את כל האירועים כדי לחסוך את הזמן ואת משרעת של הקוצים (בכל אחד microelectrodes) על כל רצפי הפצת מזוהה לקובץ CSV.
- לייבא את קבצי ה-CSV סביבות ניתוח נתונים לצורך ניתוח נוסף של דפוסי הפעילות של התרבות (קצב ירי, למשל , מרווחי זמן בין ספייק).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, E-18 החולדה הנוירונים קורטיקלית נזרע על µEF מסוגלים לפתח ולהישאר בריאים בתנאים אלו תרבות עבור מעל חודש. ברגע 3 עד 5 ימים בתרבות, נוירונים בקליפת המוח לגדול אקסונים שלהם דרך microgrooves לכיוון תא עצב של µEF (איור 1). לאחר 15 ימים בתרבות, נוירונים בקליפת המוח תרבותי על µEF צפויים להפגין רמות קבועה של פעילות וצפויה התפשטות של פוטנציאל פעולה לאורך microgrooves. בתרבויות עבר (> 14 DIV) נוטים להיות נשלט על ידי מתפוצץ פעילות כמו קונבנציונאלי MEA הקלטות18,19.
הקלטות וניתוח נתונים
ניתוח נתונים גולמיים עם µSpikeHunter (איור 2) מותר זיהוי, חילוץ הפצת גלים דקר לאורך קבוצות של 4 microelectrodes (בתוך microgrooves). איור 3 מציג את אחד האירועים. µSpikeHunter המותר עבור הערכת של הפצת המהירויות, בהתבסס על הצלב-מתאמים בין את המתח ואת זוגות הנבחר של microelectrodes (המספק השהיית זמן) ואת המרחק בין אלקטרודה ידוע המשויך.
הנתונים שחולצו בהמשך נותחו באמצעות קוד מותאם אישית מעוצבת ב- MATLAB. חלקת רסטר נציג הפצת ספייק גלים לאורך 11 (מתוך 16) microgrooves מוצג באיור 4a. קצב ירי מיידי עבור גבוה - ו microgroove נמוך-פעילות מוצג באיור 4b.
µEF הקלטות להפגין רמות משתנות של פעילות לכל microelectrode. לעתים קרובות, microelectrodes מספר בתא somal הם "שקט". עם זאת, רוב microelectrodes בתוך microgrooves נוטים להיות פעיל (איור 5a). הוא מתואר היטב כי microgrooves מתפקד כמו האות מגברים8. משרעת האות המוקלט תלוי לא רק על גודלו של הזרמים המקור, אלא גם את resistivity של התקשורת שמסביב. ההתנגדות לאורך microgroove הוא גבוה במיוחד, אשר מגדילה מאד את משרעת של האותות נמדד ביחס לאלה של microelectrodes בתא somal (איור 5b).
איור 1 . עובריים החולדה הנוירונים קורטיקלית תרבותי על µEF. (א) צילום של µEF. סרגל קנה מידה: 1 ס מ. (b) נציג תמונה של נוירונים בקליפת המוח תרבותי ב µEF במשך 5 ימים, מציג מספר אקסונים חוצה את microgrooves ופנייה תא עצב (חיצים). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . מסך לכידת של ממשק משתמש גרפי הראשי µSpikeHunter. המשתמש יכול לטעון את הנתונים הקליט עם µEF, לזהות גלים דקר כציוד, לקבוע את הכיוון שלהם (anterograde או רטרוגרדית) מעריכים הפצת המהירויות. כלי kymograph מאפשר למשתמש להעריך באופן ידני את מהירות התפשטות בהתבסס על קו ששורטט על kymograph. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . גל ספייק כציוד Anterograde חש על ידי 4 microelectrodes (E8-E11) בתוך microgroove. כל עקבות מייצג microelectrode גלם הקלטה אחת עבור גברת 3 לאחר ניתוח עם µSpikeHunter, קרוס-הקשר בין microelectrodes הרחוק ביותר (E8 ו E11) מותר חישוב מהירות התפשטות של 0.52 מ'/ס לחץ כאן הצג גרסה גדולה יותר של הדמות הזו.
איור 4 . מידע מטח דרך microgrooves. (א) נציג רסטר מגרש של שתי דקות של פעילות ספונטנית הקליט לאורך 11 microgrooves. כל נקודה מייצגת כציוד ספייק גל (יחידה) חש על ידי 4 microelectrodes ומזוהה דרך הניתוח עם µSpikeHunter. גבוהה - ו microgroove נמוך-פעילות מסומנים בצהוב ואדום, בהתאמה. (b) התפתחות קצב ירי מיידי (כמו קצב-קידוד) microgrooves מסומנים שני לאורך 10 דקות. יחידות כציוד היחידה נחשבו לחישוב קצב ירי. הערה פעילות הסינכרון, למרות השונות ירי קצב רמות. קצב ירי מיידי חושבה convolving האירועים ספייק עם קרנל גאוסיאנית עם סטיית תקן של גב' 100 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . איכות של הקלטות חוץ-תאית ב- µEF. (א) חלון הזמן (1 שנייה) של הקלטה µEF (עכברים, קורטיקלית נוירונים ב 15 ימים במבחנה) עם קצב הדגימה של-20 קילו-הרץ ומסנן מעבר גבוה ב- 300 Hz. אלקטרודה שורות 1-7 להתכתב תא somal, שורות 8-11 כדי microgrooves. (b) עלילה ותיבת משערה של מגוון רחב של ספייק amplitudes מופק (קוצים שאותרו באמצעות שיטה הסף, לשלב שלילי בלבד, שוכן בגובה סטיית תקן x 6) השורות שצוין (זמן ההקלטה סך כ-10 דקות). Amplitudes של הקוצים הם גדולים משמעותית ב microelectrodes בתוך microgrooves (שורות 8-11; 16 microgrooves), בהשוואה ל- microelectrodes של תא somal (שורות 1-7; 16 microelectrodes פעיל). חד-כיווני אנובה, דאן של מבחני השוואה מרובים, * * *p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד להרכיב את µEF, המורכב מכשיר microfluidic, לי עם עיצובים זמין מסחרית רגילה, וכיצד לנתח את הנתונים המוקלט.
בעת תכנון ניסוי, חוקרים יש לקחת בחשבון כי המודל במבחנה הוא מוגבל על ידי הרשת MEA קבוע, אשר מאלץ את הסדרי microgroove. השימוש של microfluidic מסוים או עיצוב MEA תיקבע בהתאם לצרכים הספציפיים ניסיוני אבל, באופן כללי, הפעולות בהליך צריך להחיל על תצורות שונות µEF.
החלטה קריטית להתבצע לפני הרכבה µEF היא בכוונת המשתמש לשימוש חוזר בעתיד את µEF התאספו ניסויים. טיפול עם חמצן פלזמה על שני משטחים יכול להיעשות להתחבר covalently microfluidic להתקני לי20. עם זאת, איטום זה לעיתים קרובות עושה את האסימונים MEA שמיש לניסויים נוספים, כמו ניתוק ההתקן microfluidic בלתי הפיך נזקים את שכבת פסיבציה. כדי לעקוף בעיה זו, קבוצות מחקר נוטים לעשות שימוש חוזר µEF את הנטען, למרות החסרונות אפשרי (למשל, פסולת ניסויים קודמים). על ידי בקפידה ביצוע השלבים המתוארים פרוטוקול זה, מהניסוי להתנסות, אפשר בבטחה לצרף ולנתק התקנים microfluidic ללא פגיעה כר הדשא.
השימוש µEF מאפשר בידודו של ערכה של אקסונים בתוך microgrooves. הזמן הנדרש עבור מספר סביר של אקסונים לחצות את microgrooves תלויות במידה רבה התא זריעה נוהל, כלומר תא הזריעה צפיפות. שימוש צפיפות שצוין בפרוטוקול זה, נוירונים להשתמש לחצות את כל microgroove בתוך 3 עד 5 DIV.
בהתאם לסביבת תרבות (קרי, חממה, רמת הלחות), זה עשוי להידרש כדי להחליף מדיה כל 2-3 ימים של תרבות. בעת חידוש מדיה, הסר את המדיה מבארות µEF תוך שמירה על מדיה בתוך הערוצים העיקריים. ואז, בעדינות להוסיף מדיה הבארות µEF ומאפשרת לאט זורמת דרך הערוצים הראשי לפני שתמלאו את הבארות עם אמצעי המדיה הסופי. בעקבות המלצות אלה, אנו מסוגלים לשמור על תרבויות אלה בתנאים בריא במשך חודש לפחות.
יתרון מפתח של פלטפורמה זו היא היכולת לבודד, למדוד ולעקוב אחר אותות עצב. ההקלטה µEF אמנם פשוטים, כמות גדולה של נתונים זה יכול להיווצר היא מסורבלת לטפל ודורש ידע טוב של ניתוח נתונים. ניתוח תוכנה המשמש כאן, µSpikeHunter21, היא מתקדמת אך אינטואיטיבית כלי חישובית, המאפשר כימות מפורט של כמה קשורים אמצעים (למשל, כציוד אירועים, מהירות הפצה וכד') כמה צעדים. למרות ניתוח נתונים אינה המוקד של פרוטוקול זה, המידע הניתן כאן כבר מאפשר הפקת נתונים משמעותיים של הקלטה µEF. עם זאת, חשוב לציין כי הבידוד אמין של האקסון יחיד לכל microgroove נשאר אכן. לפיכך, ואת ספייק מורכב מאוד (עקב אקסונים מרובות עוברים microgroove) עשויים להיווצר, להשפיע על ספייק תזמונים ועל הפצת מהירות החישובים. מגבלה זו יכולה להיות attenuated באמצעות microgrooves צר מאוד (מתחת 5 מיקרומטר)13 ו/או באמצעות ספייק מיון טכניקות21, אשר לסייע באבחנה איתות אחר מקורות.
אף-על-פי במבחנה תרבויות לא יכול לסכם את המורכבות מלא ויוו , השילוב שלהם עם µEF מאפשר גישות מחקר מלמטה למעלה ומבוקרות היטב. אנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע הן למתחילים והן משתמשים MEA שגורה להקמת מודלים חדשים ואמין ללמוד תקשורת אלקטרופיזיולוגיות של מעגלים עצביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה פדר - פונדו Europeu דה Desenvolvimento האזורית כספים באמצעות 2020 להתחרות - Operacional תוכנית תחרותיות בינאום (POCI), פורטוגל 2020, וכן על ידי הפורטוגזים קרנות דרך FCT - Fundação פארא e Ciência Tecnologia / Ministério דה Ciência, Tecnologia e Ensino מעולה, במסגרת הפרויקט PTDC/CTM-נאן/3146/2014 (POCI-01-0145-פדר-016623). חוסה C מתאוס נתמכה על ידי FCT (PD/BD/135491/2018). פאולו הלומדים נתמכה על ידי פרוגרמה Ciência - פרוגרמה Operacional Potencial Humano (POPH) - קידום של מדעי תעסוקה, ESF, MCTES, תוכנית Investigador FCT, POPH ופונדו Europeu חברתית. המכשירים microfluidic היו מפוברק-INESC - מיקרוסיסטמס, ננוטכנולוגיה, פורטוגל, תחת פיקוחו של ז'ואו פדרו קונדה ו וירג'יניה צ'ו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
