התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב
Summary
פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.
Abstract
מערכים microelectrode (אותי) נמצאים בשימוש נרחב לימודים תפקוד במבחנה. מכשירים אלו מאפשרים בו-זמניות פולשני הקלטה/גירוי של פעילות אלקטרופיזיולוגיות לתקופות ארוכות. עם זאת, המאפיין של חישה אותות מכל המקורות סביב כל microelectrode יכול להיות שלילי כאשר מנסים להבין תקשורת, אות התפשטות מעגלים עצביים. ברשת העצבית, מספר הנוירונים ניתן להפעיל בעת ובעונה אחת, ניתן ליצור פוטנציאל פעולה חופפים, ומקשה להפלות ולעקוב אחר התפשטות אות. בהתחשב מגבלה זו, הקמנו במבחנה התקנה התמקדו הערכת אלקטרופיזיולוגיות תקשורת, אשר מסוגל לבודד ומגבירים אותות עצב עם רזולוציה גבוהה של יכולות. מאת התממשקות והתקנים microfluidic אותי, אנחנו יכולים להפריד תרבויות עצביים עם יישור ומבוקרות היטב של אקסונים ו- microelectrodes. התקנה זו מאפשרת הקלטות של ספייק התפשטות עם יחס אות לרעש גבוה במשך מספר שבועות. בשילוב עם נתונים המתמחה באלגוריתמים לניתוח, הוא מספק נתונים היסטוריים כימות של תקשורת מספר הקשורים מאפיינים כגון הפצת מהירות הולכה כשל, קצב ירי, anterograde קוצים, וקידוד מנגנונים.
פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מלכודת תרבות עצביים ממודר מעל המצע משולב אותי כיצד תרבות נוירונים בתוכנית התקנה זו, כיצד להקליט בהצלחה, לנתח ולפרש את התוצאות של ניסויים אלה. כאן, אנו מראים איך הגדרת הוקמה מפשט את ההבנה של תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב. פלטפורמות אלה לסלול את הדרך עבור במבחנה דגמים חדשים עם topographies הנדסה ורשת עצביים לשליטה. הם יכולים לשמש בהקשר של תרבויות עצביים הומוגנית, או עם תצורות תרבות משותפת איפה, לדוגמה, התקשורת בין נוירונים סנסוריים סוגי תאים אחרים הנמצאים תחת פיקוח, העריך. תוכנית התקנה זו מספקת תנאים מאוד מעניין ללמוד, לדוגמה, neurodevelopment, מעגלים עצביים, מידע קידוד, גישות הקשורים ניוון מוחיים neuroregeneration.
Introduction
הבנת תקשורת חשמלית של מעגלים עצביים היא צעד מהותי כדי לחשוף את התיפקוד הרגיל, לתכנן אסטרטגיות טיפוליות כדי לטפל בתפקוד. נוירונים לשלב, לחשב, להעביר פוטנציאל פעולה (APs) אשר יפיץ לאורך אקסונים דק שלהם. טכניקות מסורתיות אלקטרופזיולוגים (למשל, מלחציים תיקון) טכניקות עוצמתיות ללמוד פעילות. עצבית אך מוגבלים המבנים התאיים גדולים יותר, כמו סומא או של דנדריטים לעיתים קרובות. טכניקות ההדמיה להציע חלופה ללמוד אותות עצב עם רזולוציה מרחבית גבוהה, אך הם קשים מבחינה טכנית לבצע ולא מאפשרים מדידות לטווח ארוך1. בהקשר זה, השילוב של מערכים microelectrode (אותי) מיקרופלואידיקה יכולה לתרום תרומה חזק ב לחשוף את המאפיינים הבסיסיים של neuron´s פעילות של אות שידור בתוך רשתות עצביים במבחנה2 , 3.
טכנולוגיה MEA מסתמכות על הקלטות חוץ-תאי של תרבויות עצביים. היתרונות העיקריים של מתודולוגיה אלקטרופיזיולוגיות זו הם יכולתה לתמוך לטווח ארוך, בו זמנית ורישום באתרים מרובים, לא פולשנית דרך3. אותי עשויים מסתיימים, גבוהה מוליך ועמידים בפני קורוזיה microelectrodes נעוץ מצע וופל זכוכית. הם תואמים תא קונבנציונאלי התרבות ביו-ציפויים, אשר באמצעות קידום תא אדהזיה באופן משמעותי להגביר את ההתנגדות איטום בין המצע והתאים3,4. יתר על כן, הם מגוונים בעיצוב, עשויים להשתנות microelectrodes גודל, גאומטריה, צפיפות. בסך הכל, לי לעבוד ככלים תרבות תא קונבנציונאלי עם היתרון של ומאפשר בו-זמניות הדמיה לחיות, אלקטרופיזיולוגיות הקלטות/גירוי.
השימוש בטכנולוגיה MEA תרם המחקר של תכונות חשובות של רשתות עצביות5. עם זאת, קיימות תכונות הטבועות המגבילות את הביצועים של לי ללמוד תקשורת והתפשטות APs במעגל עצביים. אותי לאפשר הקלטות של תאים בודדים ומבנים אפילו subcellular כמו אקסונים, אבל בהשוואה אותות somal, אותות עצב יש יחס אות לרעש נמוך מאוד (SNR)6. יתר על כן, המאפיין של חישה חוץ-תאית שדה פוטנציאל מכל המקורות סביב microelectrode כל הסלים המעקב של התפשטות אות במעגל עצביים.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו, עם זאת, כי ההקלטה תנאים טובים יותר יכולה להיות מושגת על ידי כך את microelectrodes מיושרת צר microchannels שבו אקסונים יכולים לגדול. תצורה זו מספקת שעלייה משמעותית SNR כזה כי הפצת האותות עצב יכול להיות בקלות זוהה7,8,9,10,11,12, 13. האסטרטגיה של לכרות ברית microfluidic התקנים עם טכנולוגיית MEA יוצר microenvironment מבודד חשמלית מתאימים להגביר אותות עצב11. יתר על כן, הנוכחות של microelectrodes חישה מרובים לאורך microgroove הוא היסוד עבור זיהוי ואפיון של התפשטות אות עצב.
כזה פלטפורמות במבחנה עם הרשת העצבית מאוד לשליטה topographies ניתן להתאים שאלות מחקר רבות14. פלטפורמות אלה מתאימים לשמש בהקשר של תרבויות עצביים, אך ניתן להרחיב מהנדס תצורות תרבות משותפת, התקשורת בין הנוירונים סוגי תאים אחרים יכול להיות במעקב ואיפה העריך. תוכנית התקנה זו ובכך מספק תנאים מאוד מעניין לחקור מספר מחקרים עצביות הקשורות כגון neurodevelopment, מעגלים עצביים, קידוד מידע, הקשורים ניוון מוחיים, neuroregeneration. יתר על כן, השילוב שלו עם מודלים המתעוררים של האדם pluripotent המושרה בתאי גזע15,16 יכול לפתוח אפיקים חדשים בפיתוח של טיפולים פוטנציאליים עבור מחלות אנושיות המשפיעות על מערכת העצבים.
המעבדה שלנו היא באמצעות פלטפורמה זו שילוב microelectrodes עם מיקרופלואידיקה (µEF) כדי להבין תהליכים עצביים ברמת סלולריים ורשת, שההשפעה שלהם פיזיו – ואת מערכת העצבים פיפטות. בהינתן ערך כזה פלטפורמה בתחום של מדעי המוח, המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד ליצור תרבות עצביים ממודר מעל המצע משולב אותי, כיצד תרבות נוירונים ב פלטפורמה זו וכיצד להקליט בהצלחה, לנתח ולפרש את התוצאות של ניסויים אלה. פרוטוקול זה בהחלט יגרום להעשרת ארגז הכלים ניסיוני עבור תרבויות עצביים במחקר של תקשורת עצבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המוצגת כאן מראה כיצד להרכיב את µEF, המורכב מכשיר microfluidic, לי עם עיצובים זמין מסחרית רגילה, וכיצד לנתח את הנתונים המוקלט.
בעת תכנון ניסוי, חוקרים יש לקחת בחשבון כי המודל במבחנה הוא מוגבל על ידי הרשת MEA קבוע, אשר מאלץ את הסדרי microgroove. השימוש של microfluidic מסוים או עיצוב MEA …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה פדר – פונדו Europeu דה Desenvolvimento האזורית כספים באמצעות 2020 להתחרות – Operacional תוכנית תחרותיות בינאום (POCI), פורטוגל 2020, וכן על ידי הפורטוגזים קרנות דרך FCT – Fundação פארא e Ciência Tecnologia / Ministério דה Ciência, Tecnologia e Ensino מעולה, במסגרת הפרויקט PTDC/CTM-נאן/3146/2014 (POCI-01-0145-פדר-016623). חוסה C מתאוס נתמכה על ידי FCT (PD/BD/135491/2018). פאולו הלומדים נתמכה על ידי פרוגרמה Ciência – פרוגרמה Operacional Potencial Humano (POPH) – קידום של מדעי תעסוקה, ESF, MCTES, תוכנית Investigador FCT, POPH ופונדו Europeu חברתית. המכשירים microfluidic היו מפוברק-INESC – מיקרוסיסטמס, ננוטכנולוגיה, פורטוגל, תחת פיקוחו של ז’ואו פדרו קונדה ו וירג’יניה צ’ו.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W. Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 55 (3), 1136-1146 (2008).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. . μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
