Summary
Этот протокол призван продемонстрировать как совместить в пробирке микроэлектродные массивы с microfluidic приборы для изучения потенциал действия передачи в нейрональных культур. Анализ данных, а именно определение и характеристика размножения потенциалы действия, выполненных с использованием новых передовых, но удобный и свободно доступны, вычислительные средства.
Abstract
Микроэлектродные массивы (МЭС) широко используются для изучения функции нейронов в пробирке. Эти устройства позволяют одновременно неинвазивные записи/стимуляции электрофизиологических деятельности для длительных периодов. Однако свойство зондирования сигналы от всех источников вокруг каждого микроэлектродные может стать неблагоприятным при попытке понять связи и сигнал распространения в нейронных цепей. В нейронной сети несколько нейроны могут быть активированы одновременно и может генерировать перекрывающихся потенциалы действия, что делает его трудно дискриминацию и отслеживать распространение сигнала. С учетом этого ограничения мы создали установку в пробирке , сосредоточена на оценке электрофизиологических коммуникации, которая сможет изолировать и усилить аксональное сигналов с высоким пространственным и временным разрешением. При взаимодействии microfluidic приборы и МЭС, мы способны устроены нейрональных культур с хорошо контролируемых выравнивание аксонов и микроэлектродов. Эта установка позволяет записи Спайк распространения с высоким соотношением сигнал шум в течение нескольких недель. В сочетании с алгоритмами анализа специализированных данных, он предоставляет подробную количественную оценку нескольких связи связанных свойств, таких как скорость распространения, недостаточность проводимости, скорострельность, антероградная шипы и кодирования механизмов.
Этот протокол демонстрируется, как создать настройку разобщенным нейрональных культуры над субстрата интегрированных МЭС, культуры нейронов в этой установки и успешно регистрировать, анализировать и интерпретировать результаты таких экспериментов. Здесь мы покажем, как установленные настройки упрощает понимание нейронные связи и распространения аксональное сигнала. Эти платформы проложить путь для новых моделей в vitro топографии инженерии и controllable нейронной сети. Они могут использоваться в контексте однородных культур нейронов, или с совместного культуры конфигураций, где, например, связь между сенсорных нейронов и другие типы клеток мониторинг и оценку. Эта установка обеспечивает очень интересные условия для изучения, например, нейроразвития, нейронных цепей, информация, кодирование, нейродегенеративные и neuroregeneration подходов.
Introduction
Понимание электрической связи в нейронных цепей является фундаментальным шагом раскрыть нормальной функции, и разработать терапевтические стратегии для решения дисфункции. Нейроны интегрировать, вычислить и реле потенциалы действия (APs), которые распространяются вдоль их тонкой аксоны. Традиционные электрофизиологических методов (например, патч зажим) являются мощные методы для изучения активности нейронов, но часто ограничиваются более клеточных структур, например Сома или дендритов. Методы визуализации предлагают альтернативу для изучения аксональное сигналов с высоким пространственным разрешением, но они являются технически трудно выполнять и не разрешать долгосрочных измерений1. В этом контексте сочетание микроэлектродные массивы (МЭС) и микрофлюидика можно сделать мощный вклад в раскрытие основных свойств neuron´s активности и сигнала передачи в пределах нейронных сетей в пробирке2 , 3.
МПС технология основана на внеклеточные записи нейрональных культур. Основными преимуществами этого электрофизиологических методологии являются ее способность поддерживать долгосрочный, одновременной стимуляции и записи на нескольких сайтах и неинвазивным способом3. МЭС изготовлены из биологически совместимый, высокая проводящих и коррозионно-стойкой микроэлектродов, встроенных в стеклянной подложке пластин. Они совместимы с обычными клетки культуры био покрытий, которые путем поощрения клеточной адгезии значительно увеличить герметизации сопротивления между подложкой и клетки3,4. Кроме того они универсальны в дизайне и может варьироваться по размеру микроэлектродов, геометрии и плотности. В целом МЭС работают как обычные клетки культуры судов с преимуществом, позволяя одновременно жить изображений и электрофизиологические записи/стимуляции.
Использование технологии МПС способствовала изучению важных особенностей нейронных сетей5. Однако есть присущие возможности, которые ограничивают производительность МЭС для изучения коммуникации и распространения APs в нейрональных цепи. МЭС включить записи из одной клетки и даже внутриклеточных структур как аксоны, но по сравнению с somal сигналов, аксональное сигналы имеют очень низкое соотношение сигнал шум (SNR)6. Кроме того характеристика зондирования потенциалов внеклеточного поля из всех источников вокруг каждого микроэлектродные затрудняет отслеживание распространения сигнала в цепи нейронов.
Недавние исследования показали, однако, что лучше записи условий может быть достигнуто путем иметь микроэлектродов выравниваются в пределах узких микроканалов, в которую может расти аксоны. Эта конфигурация обеспечивает значительное увеличение SNR, таким образом, что распространение аксональное сигналы могут быть легко обнаружены7,8,9,10,,11,12 13. Стратегия соединять microfluidic приборы с МПС технологии создает электрически изолированных микроокружения, подходящих для усиления сигналов аксональное11. Кроме того наличие нескольких зондирования микроэлектродов вдоль microgroove имеет основополагающее значение для обнаружения и определения характеристик распространения аксональное сигнала.
Такие в vitro платформ с топографии очень контролируемый нейронной сети может быть адаптирована к многие исследовательские вопросы14. Эти платформы являются подходящими для использования в контексте нейрональных культур, но может быть расширена инженер совместно культуры конфигураций, где связь между нейронами и другие типы клеток могут быть мониторинга и оценки. Таким образом, эта установка обеспечивает очень интересные условия для изучения ряда исследований нейронных связанных нейроразвития нейронных цепей, кодирование информации, нейродегенеративные, neuroregeneration. Кроме того его сочетание с формирующейся модели человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток,1516 может открыть новые возможности в разработке потенциальных терапий для человека заболеваний, которые влияют на нервную систему.
Наша лаборатория понять нейрональные процессы на уровне клеточной и сети и их причастности к физио - и патологии нервной системы с помощью этой платформы, сочетая микроэлектродов с микрофлюидика (µEF). Учитывая важное значение такой платформы в области неврологии, Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации создания разобщенным культуры нейрональных над субстрата интегрированных МЭС, как культуры нейронов в этой платформе и как успешно записать, анализировать и интерпретировать результаты таких экспериментов. Этот протокол, несомненно, обогатят экспериментальный инструментарий для нейронов культур в изучении нейронных коммуникации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
По мнению Европейского союза (ЕС) Директива 2010/63/ЕС (транспонированы в законодательство Португалии Decreto-лей 113/2013) были выполнены все процедуры с участием животных. Экспериментальный протокол (0421/000/000/2017) был одобрен Комитетом по этике обоих Португальский официального органа по вопросам благополучия животных и эксперименты (Direção-Geral де Alimentação e Veterinária - DGAV) и принимающего учреждения.
1. Подготовка культуры средств массовой информации и другие решения
Примечание: Свежие Подготовьте решения покрытие в день ее использования. Неиспользуемые покрытие решения и средства массовой информации культуры могут храниться при-20 ° C или 4 ° C, как описано ниже.
- Подготовка 10 мл 0,05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) рабочим раствором.
- Подготовить 20 мл 0,25% (w/v) PEI Стоковый раствор путем растворения очищенного Пей (см. Таблицу материалы) в стерильной воде.
- Развести 2 мл 0,25% (w/v) PEI Стоковый раствор 8 мл стерильной дистиллированной воды. Хорошо перемешать и использовать. Неиспользованный раствор можно хранить при 4 ° C.
- Готовим 1 мл раствора Ламинин 5 мкг/мл.
- Разбавить 5 мкл 1 мг/мл Ламинин Стоковый раствор в 995 мкл базальной среды (см. Таблицу материалы). Хорошо перемешать и использовать. Неиспользуемые раствор может храниться в замороженном виде при температуре-20 ° C до 1-2 недели.
- Подготовка 1 Л HEPES-амортизированное Хэнк сбалансированного солевого раствора (H-HBSS).
- Готовят раствор 1 М HEPES, растворяя 11,9 гр порошка HEPES в 50 мл сверхчистой воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7.2.
- Готовят раствор H-HBSS (без кальция и магния) путем растворения хлористого калия 5,33 мм, 0.44 мм монокальций фосфат калия, хлорида натрия 138 мм, 0,3 мм натрия фосфат двухосновной и 5,6 мм глюкозы в 800 мл ультрачистая вода.
- Добавьте 15 мл раствора 1 М HEPES (конечная концентрация 15 мм).
- Отрегулируйте пэ-аш до 0,2-0,3 единиц ниже желаемого рН 7,4, используя 1 N HCl или 1 N NaOH. Добавление сверхчистой воды, чтобы сделать громкость окончательного решения.
Обратите внимание, что рН имеет тенденцию к росту во время фильтрации. - Стерилизация фильтрации с использованием мембраной poly(ether sulfone) (ГП) пористость 0,22 мкм.
- Подготовка 10 мл из H-HBSS содержащие 10% тепло инактивированная плода Bovine сыворотки (hiFBS).
- Разбавьте 1 мл hiFBS в 9 мл H-HBSS. Хорошо перемешать и использовать. Неиспользованный раствор может храниться при температуре 4 ° C для 3-4 недели.
- Подготовьте 5 мл 1,5 мг/мл, раствор трипсина.
- Непосредственно перед применением Растворите 7,5 мг трипсина в 5 мл H-HBSS. Стерилизация фильтрации с использованием мембран PES пористость 0,22 мкм.
- Подготовка 50 мл дополнениями среды.
- В 50 мл Конические трубки, микс 48.5 мл базальной среды (см. Таблицу материалы), 2% (v/v) B-27 дополнение, 0.5 мм L-глютамина и 1% перо/стрептококк (10000 ед/мл пенициллина и стрептомицина 10 000 мкг/мл). Дополнено средней может храниться при температуре 4 ° C для 3-4 недели.
2. Microfluidic и MEA подготовка устройства
Примечание: Выполните 2.1-2.11 за день до заполнения ячейки.
- Очистить microfluidic устройства для удаления изготовление и другой мусор, используя виниловые ленты. Аккуратно нажмите ленты против устройство для охвата всех районов устройства.
- Воздух очистки плазмы МПС за 3 мин (0.3 мбар) для очистки поверхности и сделать его более гидрофильные.
- Кратко погружать microfluidic приборы в 70% этанола и позволить им высохнуть внутри Ламинарный шкаф.
- Место каждого МЭС в стерильных 90 мм Петри и их стерилизовать 15 мин ультрафиолетового (УФ) света воздействия.
- Слой центральной площади поверхности МПС по инкубации с 500 мкл раствора PEI 0,05% (v/v) для по крайней мере 1 ч при 37 ° C.
Примечание: Как описано другими17, пей покрытие МЭС приводит к менее клеток, кластеризация, чем при использовании poly(lysine) покрытие. - Аспирационная PEI покрытие решение от поверхности МПС и мыть МЭС 4 x 1 мл стерильной дистиллированной воды. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к поверхности МПС во время стирки шаги, как это может повредить электродов.
- Руководствуясь стереомикроскопом внутри Ламинарный шкаф, центр МПС чип и добавить 1 мл стерильной воды в центральной области МПС.
- Место microfluidic устройство на верхней поверхности МПС.
- Тщательно выровняйте microgrooves microfluidic устройства с сеткой микроэлектродные МПС.
- Когда правильно, тщательно аспирационная избыток воды без касатьться МПС или microfluidic устройства.
- Инкубируйте µEFs на ночь при 37 ° C для сухой и разрешить полный вложений. Чтобы облегчить вложение, аккуратно нажмите microfluidic устройства против МПС.
Примечание: Выполните шаг 2.12 на день заполнения ячейки. - После того, как µEFs полностью высох, загрузить microfluidic скважин с 150 мкл раствора покрытие Ламинин 5 мкг/мл и инкубировать при 37 ° C по меньшей мере 2 h до заполнения ячейки.
Примечание: При загрузке µEF раствором Ламинин, убедитесь, что решение заполняет microgrooves. использование вакуума удалить любой воздушный пузырь, который может присутствовать в пределах microgrooves.
3. префронтальной коры рассечение
- Подготовка области диссекции для удаления эмбриона.
- Продезинфицируйте рабочей поверхности и хирургических инструментов с 70% этиловом спирте.
Примечание: Хотя этот рассечение не стерильных процедуры, лечение помогает уменьшить шансы заражения. - Используйте чистые одноразовые пеленки ограничить области диссекции и выложить хирургических инструментов для удаления эмбриона.
- Подготовка 4 Петри 90 мм, наполненный холодной H-HBSS и разместить их на поднос с льда в районе рассечение.
- Продезинфицируйте рабочей поверхности и хирургических инструментов с 70% этиловом спирте.
- Усыпить E-18 время Беременные крысы Вистар в результате вдыханием двуокиси углерода (CO2).
- По завершении процедуры удалите животное из CO2 камеры и подтвердить смерть методом вторичной эвтаназии, например обескровливания.
- Поместите животных вентральной стороне вверх на одноразовые пеленки, спрей нижней части живота с 70% этанола и, с помощью щипцов и ножницы, чтобы прорваться через кожу, чтобы разоблачить матки U-образной формы.
- Тщательно удалите эмбрионы из полости матки путем убирания любой соединительной ткани и поместите их в одну из чашек Петри с холодной H-HBSS.
- Удаление каждого эмбриона из эмбриональных мешка и, с помощью щипцов и ножниц, обезглавить эмбриона.
- Передача embryo´s глава второй Петри заполнены с холодной H-HBSS.
- Повторите шаги 3.6-3.7 для каждого эмбриона.
- Вскрыть префронтальной коры.
- Передача embryo´s голову в третьем Петри.
- Использование пара щипцы подвергать мозга.
- Удалите из его полости мозга и накрыть холодной H-HBSS.
- Если имеется, снимите и выбросьте обонятельные луковицы. Вскрыть префронтальной коры и удалить мозговых оболочек.
- Передать четвертой Петри, наполненный холодной H-HBSS фрагменты префронтальной коры.
- Повторите шаги 3.9.1 - 3.9.5 для каждого эмбриона.
4. корковых нейронов диссоциации и культура на µEF
Примечание: Следующие процедуры выполнялись внутри Ламинарный шкаф после 15 мин цикл УФ стерилизации. Рабочая площадь поверхности, а также все материалы, размещенные внутри вытяжки следует ранее вылечить с 70% этиловом спирте.
- Как описано в шаге 1.5, распустить ранее взвешенное трипсина в 5 мл H-HBSS и фильтровать решение.
- Соберите кусочки коры, ранее расчлененный в общей сложности 5 мл H-HBSS. Перевести их на стерильную 15 мл Конические трубки.
- Добавьте 2.3 мл раствора трипсина свежеприготовленные 1,5 мг/мл в пробирку, содержащую фрагменты коры.
- Смешать подвеска и инкубировать при 37 ° C 15 мин (кратко агитировать каждые 5 мин).
- Остановить ткани пищеварение и промывают трипсина.
- Выбросите супернатанта, содержащий трипсина. Добавьте 5 мл H-HBSS содержащий 10% hiFBS для инактивации оставшихся трипсина; аккуратно агитируйте.
- Пусть фрагменты коры успокоиться и затем удалить супернатант.
- Добавьте 5 мл H-HBSS для удаления остатков hiFBS. Пусть фрагменты коры успокоиться и удалить супернатант.
- Снова помойте фрагменты коры с 5 мл H-HBSS.
- Пусть фрагменты коры успокоиться и удалить супернатант. Добавьте 5 мл дополняться нейронных среды.
- Механически отделить фрагменты коры с 5 мл Серологические Пипетки, медленно закупорить вверх и вниз на 10 - 15 раз. При необходимости повторите процедуру, с помощью пипетки малого калибра, пока не станет однородной суспензии клеток.
- Отменить оставшиеся undissociated тканей путем фильтрации клеток подвеска через стрейнер клеток 40 мкм.
- Количество жизнеспособных клеток и определить плотность клеток.
- В Микропробирка 20 мкл 0,4% w/v Трипановый синий 20 мкл суспензии клеток. Смесь хорошо огневки решение и передачи 10 мкл Нойбауэр, считая камеры.
- Количество жизнеспособных клеток и определить плотность ячеек жизнеспособных клеток.
- Отрегулируйте плотность клеток до 3.6 x 10-7 кл/мл (при необходимости, центрифуга суспензию клеток).
- Непосредственно перед заполнения ячейки удалите Ламинин покрытие из всех скважин µEF. Пипетка 50 мкл дополнениями среднего для каждой скважины µEF аксональное отсека.
- Семена 5 мкл суспензии клеток в somal отделении µEF. Инкубируйте при 37 ° C за 1 ч, чтобы позволить клетки привязанность к подложке.
- Аккуратно заполните каждый хорошо из µEF с утепленным дополнено средней. Передачи µEF инкубатор увлажнитель при 37 ° C поставляется с 5% CO2.
Примечание: Чтобы избежать испарения быстро питательной среды, место открытые Микропробирка с водой внутри Петри, перевозящих µEF. - Поддержания культур для требуемого периода, заменив 50% средних культуры каждый второй и третий день культуры.
Примечание: После экспериментов, микрофлюидика может быть отделен от МПС, погружая µEF в воде на ночь. При необходимости, аккуратно чистить микрофлюидика с помощью щипцов. МЭС могут быть очищены ночи инкубации с 1% (v/v) коммерческие ферментативного моющего средства (см. Таблицу материалы).
5. Регистрация спонтанной активности нейронов
Примечание: Культурах эмбриональных корковых нейронов на МЭС обычно демонстрируют спонтанной активности, как только 7 дней в пробирке (DIV), но 2-3 недели (14-21 DIV), Зрелые и стабильной деятельности. Это до экспериментатор решить, когда следует начинать электрофизиологические измерения, основанные на цели исследования. В этом протоколе, записи нейронной активности от µEF продемонстрировал с помощью системы коммерческого учета (см. Таблицу материалов для деталей оборудования), с модулем Отопление включены. Для выполнения записи, мы использовали свободно доступного программного обеспечения (см. Таблицу материалы для программного обеспечения детали).
- Включите записи системы и контроллер температуры МПС и позволяют подогревом фундаментной предусилитель до 37 ° C.
Примечание: для записи долгосрочных (> 30 мин в то время) также необходимо иметь систему, которая поддерживает атмосферу CO2 . - Место µEF на предусилитель (headstage).
Примечание: Убедитесь, что МПС чип правильно с номером ссылки в верхней левой края. Диспергирующей чип МПС, которые мы используем, но это выравнивание совпадает с правильной ориентацией ПИН расположение электродов и идентификаторов оборудования. - Закройте и защелки крышки предусилитель.
- Для записи, откройте программное обеспечение для записи и определить параметры записи и путь записанных данных потоков (см. Руководство по программному обеспечению для подробной информации о том, как настроить схему записи).
Примечание: Приобретение с шагом дискретизации 20 кГц — как правило, достаточно для большинства приложений. Более высокой частоте дискретизации рекомендуется если в Спайк тайминги требуется более высокая точность. Если только одно намеревается запись пики, установите фильтр ВЧ-300 Гц, которая будет смягчить нижней частоты компонентов сигнала. Если сырье и отфильтрованных данных записываются одновременно, это значительно увеличит размер файла данных. Это всегда можно делать в автономном режиме фильтрации исходных данных. Чтобы уменьшить данных размер файла, один можно также ограничить микроэлектродов из которого запись (например, только микроэлектродов внутри microgrooves). - Нажмите кнопку Начать DAQ для начала сбора данных. Проверьте, если дисплей показывает запущенные трассировки деятельности и начать запись.
Примечание: Уровень шума обычно немного выше в микроэлектродов, соответствующий microgrooves. Если уровень шума является слишком высокой (пик пик амплитуда > 50 МКВ) или в нескольких микроэлектродов унитазов, это может быть из-за грязи, препятствуя хороший контакт пин падом. Обычно эта проблема решается путем очистки осторожно контактных площадок МПС и предусилитель булавки с помощью ватным тампоном, смоченным 70% этиловом спирте. - Откройте файл записанного в программное обеспечение для анализа (см. Таблицу материалы) для быстрого изучения данных.
6. анализ данных
Примечание: Следующие шаги показывают, как использование µSpikeHunter программного обеспечения, вычислительной инструмент, разработанный в Агиар в лаборатории (свободно доступны по запросу электронная почта к pauloaguiar@ineb.up.pt), для анализа данных, записанных с µEF. Графический интерфейс пользователя (Рисунок 2) используется для загрузки данных, определить распространение всплеск волны, определить их направление (антероградная или ретроградным) и оценки скорости распространения. µSpikeHunter совместим с HDF5 файлы, созданные из записей, полученных с помощью систем MEA2100-семьи, которые могут быть использованы в сочетании с 60 - 120- и 256-электрод МЭС. Записи, полученные с помощью многоканальных экспериментатора может быть легко преобразованы в HDF5 файлов с помощью свободно доступного программного обеспечения (см. Таблицу материалы).
- Нажмите кнопку Обзор для выбора файла записи. Затем нажмите кнопку Сведения о файле список дискретизации, продолжительность записи, а также список записанных данных потоков (например, необработанные данные, отфильтрованные данные).
Примечание: Для распространения истинной скорости оценок, рекомендуется выбрать поток необработанных данных для анализа. - Выберите микроэлектродов (одну строку или столбец, связанный с microgroove) для анализа и задайте значение порога обнаружения Спайк (положительный или отрицательный фаза) в 6 x стандартное отклонение (SD) сигнал шум. Нажмите кнопку Чтение данных применять детектор событий и получить выявленных распространения последовательности.
Примечание: Если критерии удовлетворяются, список обнаруженных распространения последовательностей будет заполнить панель анализа. Пользователь может просмотреть и взаимодействовать с несколькими инструментами анализа для распространения последовательности, включая следы напряжения, кросс корреляции между микроэлектродные, скорости распространения одной последовательности, кимограф и средство воспроизведения аудио. Хотя оценки скорости распространения могут быть получены для любой пары микроэлектродов или как среднее оценок для всех пар, эта оценка является более надежным, если выбран дальней пара. - Повторите предыдущий шаг для наборов микроэлектродные интерес. Каждый раз, нажмите кнопку Сохранить все события , чтобы сэкономить время и амплитуда шипы (на каждом из микроэлектродов) для всех выявленных распространения последовательностей в CSV-файл.
- Импорт CSV-файлов для сред анализ данных для дальнейшего анализа моделей деятельности культуры (например, скорострельность, интервалы между Спайк).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, описанный здесь, E-18 корковых нейронов крысы посеян на µEF имеют возможность развивать и оставаться здоровым в этих условиях культуры для более месяца. Как только 3-5 дней в культуре корковых нейронов растут их аксоны через microgrooves к аксональное отсек µEF (рис. 1). После 15 дней в культуре корковых нейронов, культивируемых на µEF, как ожидается, демонстрируют устойчивый уровень активности и ожидается распространение действий потенциалов вдоль microgrooves. Старые культур (> 14 DIV), как правило, доминируют разрыва деятельности как в обычных МПС записи18,-19.
Записи и анализа данных
Анализ исходных данных с µSpikeHunter (рис. 2) допускается обнаружения и извлечения распространения всплеск волны вдоль наборы 4 микроэлектродов (в microgrooves). Рисунок 3 показывает одно из этих событий. µSpikeHunter допускается для оценки скорости распространения, основанные на кросс корреляции между напряжение сигналов выбранных пар микроэлектродов (предоставление задержки) и связанные известных межэлектродный расстояние.
Извлеченные данные далее были проанализированы с использованием пользовательского кода разработан в MATLAB. Представитель растровых участок размножения всплеск волны вдоль 11 (из 16) microgrooves показано на рисунке 4a. Мгновенная скорострельность для высокой и низкой активности microgroove показан на рисунке 4В.
µEF записи демонстрируют различные уровни активности в микроэлектродные. Часто несколько микроэлектродов в somal отсеке «молчаливых». Однако, большинство микроэлектродов в microgrooves, как правило, быть активными (Рисунок 5a). Это хорошо описано, что microgrooves функции сигнала Усилители8. Амплитуда записываемого сигнала зависит не только от размера исходного токов, но и на сопротивление окружающих сред. Сопротивление вдоль microgroove особенно высока, что значительно увеличивает амплитуду измеренных сигналов по сравнению с микроэлектродов в somal отсеке (Рисунок 5b).
Рисунок 1 . Эмбриональных крыса корковых нейронов, культивируемых на µEF. (a) фотографии µEF. Линейки: 1 cm. (b) представитель изображение корковых нейронов, культивируемых в µEF на 5 дней, показаны несколько аксоны пересечения microgrooves и достижения аксональное отсека (стрелки). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Экран захвата µSpikeHunter основной графический интерфейс пользователя. Пользователь может загрузить данные, записанные с µEF, определить распространение всплеск волны, определить их направление (антероградная или ретроградным) и оценки скорости распространения. Кимограф инструмент позволяет пользователю вручную оценить скорость распространения, основанный на линии, нарисованной на кимограф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Антероградная размножаемый всплеск волны воспринимается 4 микроэлектродов (E8-E11) в пределах microgroove. Каждый след представляет один микроэлектродные сырье для записи 3 г-жа после анализа с µSpikeHunter, кросс корреляции между дальней микроэлектродов (E8 и E11) допускается расчет скорости распространения 0.52 m/s. , пожалуйста, нажмите здесь для Увеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 4 . Плотина информации через microgrooves. (a) представитель растровых участок 2 минуты спонтанной активности записал вдоль 11 microgrooves. Каждая точка представляет распространение всплеск волны (единица) воспринимается 4 микроэлектродов и выявленных в результате анализа с µSpikeHunter. Высоко - и низкой активности microgroove, выделены в желтый и красный, соответственно. (b) эволюция мгновенной скорострельность (как и курс кодирования) для двух выделенных microgrooves вдоль 10 минут. Для расчета скорострельность рассматривались только распространение единиц. Примечание синхронизации активности, несмотря на различные стрельбы ставок. Мгновенная скорострельность была рассчитана convolving Спайк события с гауссова ядра с стандартное отклонение, равное 100 г-жа пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Качество внеклеточного записей в µEF. (a) время окно (1 секунда) µEF записи (корковых нейронов крысы на 15 дней в пробирке) с шагом дискретизации 20 кГц и ВЧ-фильтр на 300 Гц. электрод строк 1-7 соответствуют somal отсека и строки 8-11-microgrooves. (b) Box и нитевидные сюжет полный спектр амплитуд Спайк извлечены (шипы, обнаруженных с помощью метода порог, с отрицательным фазы только, на 6 x стандартное отклонение) от указанных строк (общее время звучания 10 минут). Шипы амплитуд значительно больше в микроэлектродов внутри microgrooves (строки 8-11; 16 microgrooves), когда по сравнению с микроэлектродов somal отсека (строки 1-7; 16 активных микроэлектродов). Односторонний дисперсионный анализ, Данн в множественные сравнения тестов, ***p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокола, представленные здесь показано, как собрать µEF, состоит из устройства microfluidic и МПС с стандартным коммерчески доступные конструкции и как анализировать записанные данные.
При проектировании эксперимент, исследователи должны учитывать, что модель в vitro ограничен МПС фиксированной сетки, которая сдерживает microgroove договоренностей. Использование конкретного microfluidic или МПС дизайн будет зависеть от конкретных потребностей экспериментальный, но, в общем, те же шаги процедуры должны применяться в различных µEF конфигураций.
Критическое решение до того, как Ассамблея µEF является ли пользователь намеревается в будущем повторно собран µEF экспериментов. Лечение с кислородной плазмы на обеих поверхностях может быть сделано для ковалентно bond microfluidic приборы для МЭС20. Однако это уплотнения часто делает чипы МПС непригодным для дальнейших экспериментов, как отсоединение устройства microfluidic необратимо повреждает пассивации слоя. Чтобы обойти эту проблему, научно-исследовательские группы, как правило, повторно использовать навесные µEF, несмотря на возможные недостатки (например, мусор от предыдущих экспериментов). Тщательно следуя шаги, изложенные в настоящем Протоколе, от эксперимента для эксперимента, можно безопасно присоединение и отсоединение microfluidic приборы без повреждения МПС.
Использование µEF позволяет изоляции набора аксоны в пределах microgrooves. Время, необходимое для разумного числа аксоны пересечь microgrooves во многом будет зависеть от посева процедуры, а именно ячейки в сеяный плотность клеток. Плотность, указанные в настоящем Протоколе, нейроны использовать пересечь весь microgroove в течение 3-5 DIV.
В зависимости от культуры окружающей среды (т.е. инкубатор и уровень влажности) может потребоваться заменить СМИ каждые 2-3 дней культуры. При обновлении СМИ, удалите медиафайл из µEF скважин при сохранении СМИ в рамках основных каналов. Затем осторожно добавьте СМИ µEF скважин, позволяя ему медленно течь через основные каналы перед заполнением скважины с объемом окончательный СМИ. После этих рекомендаций мы способны поддерживать этих культур в здоровых условий для по крайней мере месяц.
Основным преимуществом этой платформы является способность изолировать, измерять и отслеживать аксональное сигналов. Хотя запись µEF является простой, большое количество данных, которые могут быть сгенерированы громоздким для обработки и требуется хорошее знание анализа данных. Программное обеспечение анализа, используемое здесь, µSpikeHunter21, является расширенный еще интуитивно вычислительных инструмент, который позволяет для подробного количественного определения нескольких связанных с ним мер (например, пропагандируя мероприятия, скорость распространения и т.д.) в в нескольких шагах. Хотя анализ данных находится не в центре внимания настоящего Протокола, информация здесь уже позволяет извлечения значимых данных из записи µEF. Однако важно отметить, что надежной изоляции один Аксон за microgroove остается практически неосуществимым. Таким образом очень сложные Спайк сигналов (из-за нескольких аксонов, проходя через microgroove) могут возникнуть и влияют на Спайк тайминги и вычисления скорости распространения. Это ограничение можно ослабить с помощью очень узкие microgrooves (менее 5 мкм)13 и/или через Спайк сортировки методы21, которые помогают различать источники различных сигналов.
Даже несмотря на то, что в vitro культур не может резюмировать сложность полной в естественных условиях , их сочетание с µEF позволяет подходы хорошо контролируемых исследований снизу вверх. Мы надеемся, что этот протокол будет способствовать как новичков, так и опытным МПС пользователей, создания новых и надежных моделей для изучения электрофизиологических коммуникации в нейронных цепей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась ФЕДЕРА - Europeu Fundo de Desenvolvimento региональных фондов через КОНКУРИРОВАТЬ 2020 - оперативный программы для конкурентоспособности и интернационализации (ПЗП), Португалия 2020 и португальский средства через FCT - Фонд пункт Ciência e Tecnologia / Министерство da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior в рамках проекта ПТУС/CTM-NAN/3146/2014 (ПЗП-01-0145-ФЕДЕР-016623). Хосе C Mateus был поддержан КГФ (PD/BD/135491/2018). Паулу Агиар был поддержан Programa Ciência - програма оперативный потенциал Humano (POPH) - продвижение научных занятости, ПФ и MCTES и программа Investigador КГФ, POPH и Fundo социальной Europeu. Microfluidic приборы были сфабрикованы на INESC - Microsystems и нанотехнологий, Португалия, под руководством Жоао Педро Conde и Вирджиния Чу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
