Summary
Este protocolo pretende demostrar cómo combinar arreglos de microelectrodos en vitro con dispositivos microfluídicos para estudiar la transmisión del potencial de acción en cultivos neuronales. Análisis de los datos, es decir, la detección y caracterización de propagar potenciales de acción, es realizada con un nuevo avanzado, pero fácil de usar y libremente disponible, herramienta computacional.
Abstract
Arreglos de microelectrodos (MEAs) son ampliamente utilizados para el estudio de la función neuronal en vitro. Estos dispositivos permiten concurrente no invasivo grabación/estimulación de la actividad electrofisiológica durante largos períodos. Sin embargo, la característica de detección de señales de todas las fuentes alrededor de cada microelectrodo puede convertirse en desfavorable al tratar de entender la comunicación y propagación en circuitos neuronales de la señal. En una red neuronal, las neuronas varios pueden activarse simultáneamente y pueden generar potenciales de acción superpuestos, lo que hace difícil discriminar y propagación de las señales de pista. Teniendo en cuenta esta limitación, hemos establecido una configuración en vitro se centró en la evaluación electrofisiológica de comunicación, que es capaz de aislar y amplificar señales axonales con alta resolución espacial y temporal. Por interfaces dispositivos microfluídicos y MEAs, somos capaces de compartimentar las culturas neuronales con una alineación bien controlada de los axones y de microelectrodos. Esta configuración permite grabaciones de propagación de la espiga con un alto cociente signal-to-noise en el transcurso de varias semanas. En combinación con algoritmos de análisis de datos especializados, proporciona la cuantificación detallada de comunicación varias relacionadas con características tales como velocidad de propagación, falta de conducción, velocidad de disparo, picos anterógrada, codificación y mecanismos.
Este protocolo muestra cómo crear una configuración de cultura neuronal compartimentado sobre sustrato integrado MEAs, cómo las neuronas en esta configuración de la cultura y cómo con éxito registrar, analizar e interpretar los resultados de dichos experimentos. A continuación, os mostramos cómo la configuración establecida simplifica la comprensión de la comunicación neuronal y axonal señal propagación. Estas plataformas de allanan el camino para nuevos modelos en vitro con topografías ingeniería y controlable de la red neuronal. Pueden ser utilizados en el contexto de culturas neuronales homogéneas o con configuraciones de la cultura donde, por ejemplo, comunicación entre las neuronas sensoriales y otros tipos de células es monitoreada y evaluada. Esta configuración proporciona condiciones muy interesantes para estudiar, por ejemplo, neurodesarrollo, circuitos neuronales, información de codificación, métodos de neurodegeneración y Neurorregeneración.
Introduction
Entender la comunicación eléctrica en circuitos neuronales es un paso fundamental para revelar la función normal y diseñar estrategias terapéuticas para tratar la disfunción. Las neuronas integran, computan y transmitir potenciales de acción (APs) que se propagan a lo largo de sus axones delgados. Tradicionales técnicas electrofisiológicas (p. ej., abrazadera del remiendo) son técnicas poderosas para el estudio de la actividad neuronal, pero a menudo se limitan a las estructuras celulares más grandes, como el soma o las dendritas. Técnicas de imagen ofrecen una alternativa para estudiar señales axonales con alta resolución espacial, pero son técnicamente difíciles de realizar y no permita que las medidas a largo plazo1. En este contexto, la combinación de arreglos de microelectrodos (AMUMA) y microfluídica puede hacer una contribución de gran alcance en divulgar las propiedades fundamentales de transmisión de señal y actividad neuron´s dentro de las redes neuronales in vitro2 , 3.
Tecnología MEA se basa en grabaciones extracelulares de cultivos neuronales. Las principales ventajas de esta metodología electrofisiológica son su capacidad para apoyar la estimulación a largo plazo, simultánea y grabación en múltiples sitios y en una forma no invasiva3. Medidas se hacen de biocompatibles, de altas microelectrodos conductivos y resistente a la corrosión encajados un sustrato de oblea de vidrio. Son compatibles con celulares convencionales cultura bio-recubrimientos, que mediante la promoción de adhesión celular significativamente aumentar la resistencia de sellado entre el sustrato y células3,4. Además, son versátiles en el diseño y pueden variar en densidad, geometría y tamaño de microelectrodos. En general, MEAs trabajan como recipientes de cultivo celular convencional con la ventaja de permitir concurrentes en vivo-proyección de imagen y electrofisiológica grabaciones/estimulación.
El uso de la tecnología MEA ha contribuido al estudio de las características importantes de las redes neuronales5. Sin embargo, hay características inherentes que limitan el rendimiento de los AMUMA para estudiar comunicación y propagación de la APs en un circuito neuronal. MEAs permiten grabaciones de las células y estructuras subcelulares incluso como axones, pero en comparación con las señales de somal, axonales señales tienen una muy baja relación de señal a ruido (SNR)6. Por otra parte, la característica de detección de potenciales de campo extracelular de todas las fuentes alrededor de cada microelectrodo dificulta el seguimiento de la propagación de las señales en un circuito neuronal.
Sin embargo, estudios recientes han demostrado que se pueden conseguir mejores condiciones de grabación por tener los microelectrodos alineados dentro de microcanales estrecho en el cual pueden crecer los axones. Esta configuración proporciona un aumento significativo en el SNR que propagar señales axonales puede ser fácilmente detectado7,8,9,10,11,12, 13. La estrategia de aliarse dispositivos microfluídicos con tecnología MEA crea un microambiente aislado eléctricamente adecuado para amplificar señales axonal11. Por otra parte, la presencia de microelectrodos múltiples sensores a lo largo de un microsurco es fundamental para la detección y caracterización de propagación de las señales axonal.
Plataformas en vitro con topografías altamente controlable red neuronal pueden ser adaptadas a muchas preguntas de investigación14. Estas plataformas son adecuadas para usarse en el contexto de culturas neuronales pero se pueden ampliar para diseñar configuraciones de la cultura, donde se puede supervisar y evaluar la comunicación entre las neuronas y otros tipos de células. Así, esta configuración proporciona condiciones muy interesantes para explorar una serie de nervios-estudios relacionados con el neurodesarrollo, circuitos neuronales, codificación de la información, neurodegeneración y Neurorregeneración. Además, su combinación con los modelos emergentes de de15,de las células madre pluripotentes inducidas humanas16 puede abrir nuevos caminos en el desarrollo de terapias potenciales para enfermedades humanas que afectan el sistema nervioso.
Nuestro laboratorio está utilizando esta plataforma con microelectrodos de microfluídica (µEF) para comprender procesos neuronales a nivel celular y de red y su implicación en la fisio - y patológica del sistema nervioso. Dado el valor de dicha plataforma en el campo de la neurociencia, el propósito de este protocolo es demostrar cómo crear una cultura neuronal compartimentada sobre sustrato integrado MEAs, cómo las neuronas de la cultura en esta plataforma y cómo registrar con éxito, analizar e interpretar los resultados de dichos experimentos. Este protocolo sin duda enriquecerá la caja de herramientas experimental de cultivos neuronales en el estudio de la comunicación neuronal.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran animales fueron realizados según la Unión Europea (UE) Directiva 2010/63/CE (transpuesta a la legislación portuguesa por Decreto-ley 113/2013). El protocolo experimental (0421/000/000/2017) fue aprobado por el Comité de ética de ambos la autoridad oficial del portugués en el bienestar de los animales y la experimentación (Direção Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) y de la institución de acogida.
1. preparación de medios de cultivo y otras soluciones
Nota: Recién preparar las soluciones de recubrimiento en el día de su uso. La capa sin usar soluciones y medios de cultivo pueden ser almacenadas a-20 ° C o 4 ° C como se detalla a continuación.
- Preparar 10 mL de un 0,05% (v/v) solución de trabajo de Poly(ethylene imine) (PEI).
- Preparar 20 mL de solución madre de PEI de 0.25% (p/v) disolviendo PEI purificado (véase Tabla de materiales) en agua estéril.
- Diluir 2 mL de solución madre de PEI de 0.25% (p/v) en 8 mL de agua destilada estéril. Mezclar bien y utilizar. Solución puede ser almacenado a 4 ° C.
- Preparar 1 mL de una solución de laminina 5 μg/mL.
- Diluir 5 μl de la solución madre de 1 mg/mL laminina en 995 μl de medio basal (véase Tabla de materiales). Mezclar bien y utilizar. Solución no utilizada puede guardarse congelada a-20 ° C durante 1-2 semanas.
- Preparar 1 L de solución salina equilibrada de Hank tamponado con HEPES (H-HBSS).
- Preparar solución HEPES de 1 M disolviendo 11,9 g de polvo HEPES en 50 mL de agua ultrapura. Ajustar el pH a 7.2.
- Preparar la solución de H-HBSS (sin calcio y magnesio) disolviendo 5,33 mM cloruro de potasio, 0,44 mM potasio fosfato monobásico, cloruro de sodio de 138 mM, 0,3 mM fosfato de sodio dibásico y 5,6 mM de glucosa en 800 mL de agua ultrapura.
- Añadir 15 mL de solución HEPES de 1 M (concentración final de 15 mM).
- Ajustar pH a 0.2-0.3 unidades por debajo de la deseada pH 7,4 con 1 N HCl o NaOH N 1. Añadir agua ultrapura para compensar el volumen de solución final.
Nota pH tiende a aumentar durante la filtración. - Esterilice por filtración utilizando una membrana de poly(ether sulfone) (PES) 0.22 μm porosidad.
- Preparar 10 mL de H-HBSS conteniendo 10% inactivado con calor suero bovino Fetal (hiFBS).
- Diluir 1 mL de hiFBS en 9 mL de H-HBSS. Mezclar bien y utilizar. Solución no utilizado puede almacenarse a 4 ° C durante 3-4 semanas.
- Preparar 5 mL de 1,5 mg/mL solución de tripsina.
- Inmediatamente antes del uso, disolver 7,5 mg de tripsina en 5 mL de H-HBSS. Esterilice por filtración utilizando una membrana de 0,22 μm porosidad PES.
- Preparar 50 mL de medio suplementado.
- En un tubo cónico de 50 mL, mezclar 48,5 mL de medio basal (véase Tabla de materiales), 2% (v/v) suplemento B-27, 0,5 mM L-glutamina y 1% pluma/Strep (10.000 U/mL de penicilina y estreptomicina 10.000 de μg/mL). Medio suplementado puede almacenarse a 4 ° C durante 3-4 semanas.
2. microfluídicos y MEA preparación de dispositivos
Nota: Realice los pasos 2.1-2.11 el día antes de sembrar células.
- Limpie los dispositivos microfluídicos para eliminar la fabricación y otros desechos con cinta de vinilo. Presione suavemente la cinta contra el dispositivo para llegar a todas las áreas del dispositivo.
- Aire limpio de plasma el MEA durante 3 minutos (0,3 mbar) para limpiar la superficie y hacer más hidrofílico.
- Brevemente sumerja los dispositivos microfluídicos en etanol al 70% y deje secar al aire dentro de una campana de flujo laminar.
- Coloque cada MEA en un plato de Petri estériles de 90 mm y esterilizar por 15 min de exposición a luz ultravioleta (UV).
- Cubrir la superficie central de MEA por incubación con 500 μl de solución al 0,05% (v/v) PEI durante al menos 1 h a 37 ° C.
Nota: Según lo descrito por otros17, capa de PEI de AMMA da como resultado menos clustering que poly(lysine) la capa de la célula. - Aspirar la solución de recubrimiento del PEI de la superficie del MEA y lavar los MEAs 4 x con 1 mL de estéril agua destilada. Tenga cuidado de no tocar la superficie MEA durante pasos de lavado ya que esto puede dañar los electrodos.
- Guiados por un estereomicroscopio dentro de una campana de flujo laminar, centro de la viruta MEA y añadir 1 mL de agua estéril a la zona central de MEA.
- Coloque el dispositivo de microfluidos encima de la superficie MEA.
- Cuidadosamente Alinee las micro-ranuras de dispositivo de microfluidos con la red de microelectrodos de la MEA.
- Cuando alineados, Aspire cuidadosamente el exceso de agua sin tocar el MEA o el dispositivo de microfluidos.
- Incubar el µEFs durante la noche a 37 ° C en seco y accesorio completo. Para facilitar el accesorio, oprima suavemente el dispositivo microfluídico contra el MEA.
Nota: Realice paso 2.12 en el día de siembra de la célula. - Una vez que el µEFs se han secado completamente, los pozos de microfluidos con 150 μL de solución de recubrimiento de laminina de 5 μg/mL de carga e incubar a 37 ° C durante al menos 2 h antes de sembrar células.
Nota: Al cargar el µEF con solución de laminina, asegúrese de que la solución llena las micro-ranuras. Use una aspiradora para quitar cualquier burbuja de aire que puede estar presente dentro de las micro-ranuras.
3. prefrontal corteza disección
- Prepare la zona de disección para la eliminación de embriones.
- Desinfectar la superficie de trabajo y los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%.
Nota: Aunque esta disección no es un procedimiento estéril, desinfección ayuda a reducir las posibilidades de contaminación. - Use un pañal desechable limpio para limitar el área de disección y diseñar los instrumentos quirúrgicos para la eliminación de embriones.
- Preparar 4 platos de Petri de 90 mm con frío H-HBSS y colocarlos en una bandeja con hielo cerca de la zona de disección.
- Desinfectar la superficie de trabajo y los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%.
- Eutanasia a una rata de Wistar tiempo embarazada E-18 por inhalación de dióxido de carbono (CO2).
- Al finalizar el procedimiento, retirar el animal de la cámara de CO2 y confirmar la muerte por un método secundario de la eutanasia, como exsanguination.
- Coloque el lado ventral del animal arriba sobre el pañal desechable, rocíe la parte inferior del abdomen con etanol al 70% y, con la ayuda de pinzas y tijeras, hacer una forma de U corte a través de la piel para exponer el útero.
- Cuidadosamente retire los embriones del útero cortando los tejidos conectivos y colocarlos en uno de los platos de Petri con frío H-HBSS.
- Quite su saco embrionario de cada embrión y, con la ayuda de pinzas y tijeras, decapitar el embrión.
- Transferencia de la cabeza de embryo´s a un segundo plato de Petri con frío H-HBSS.
- Repita los pasos 3.6-3.7 de cada embrión.
- Diseccionar la corteza prefrontal.
- Transferencia de una cabeza de embryo´s a un tercer plato de Petri.
- Utilizar un par de pinzas para exponer el cerebro.
- Quitar el cerebro de su cavidad y cubrirla con frío H-HBSS.
- Si está presente, retire y deseche los bulbos olfativos. Diseccionar la corteza prefrontal y quitar meninges.
- Transferencia de los fragmentos de la corteza prefrontal a una cuarta placa Petri con frío H-HBSS.
- Repita los pasos 3.9.1 - 3.9.5 para cada embrión.
4. cortical neuronas disociación y cultura en µEF
Nota: Los siguientes procedimientos se realizaron en campana de flujo laminar después de 15 minutos del ciclo de esterilización ultravioleta. Superficie así como todos los materiales colocados dentro de la campana debe ser previamente desinfectado con etanol al 70%.
- Como se describe en el paso 1.5, disolver la tripsina previamente ponderado en 5 mL de H-HBSS y filtrar la solución.
- Recoger los pedazos de corteza previamente disecados en un total de 5 mL de H-HBSS. Transferirlos a un tubo cónico de 15 mL estéril.
- Añadir 2,3 mL de solución de tripsina recién preparado 1,5 mg/mL al tubo que contiene los fragmentos de la corteza.
- Mezclar la suspensión e incubar a 37 ° C durante 15 min (agite brevemente cada 5 min).
- Detener la digestión de tejido y lavar tripsina.
- Deseche el sobrenadante que contiene la tripsina. Añadir 5 mL de H-HBSS conteniendo 10% hiFBS para inactivar la tripsina restantes; Frote suavemente.
- Dejar fragmentos de corteza asentarse y entonces descarte el sobrenadante.
- Añadir 5 mL de H-HBSS para quitar los residuos de hiFBS. Dejar fragmentos de corteza colocar abajo y descarte el sobrenadante.
- Lavar nuevamente los fragmentos de corteza con 5 mL de H-HBSS.
- Dejar fragmentos de corteza colocar abajo y descarte el sobrenadante. Añadir 5 mL de medio suplementado de neuronal.
- Disocian mecánicamente fragmentos de corteza con una pipeta serológica de 5 mL transfiriendo lentamente arriba y abajo por 10 - 15 veces. Si es necesario, repita el procedimiento utilizando una pipeta de calibre pequeño hasta que la suspensión celular homogénea.
- Deseche los restantes tejidos undissociated filtrando el un colador de célula 40 μm a través de suspensión celular.
- Contar las células viables y determinar la densidad celular.
- En un microtubo, añadir 20 μl del 0,4% (p/v) azul de tripano a una suspensión 20 μl. Mezclar bien al homogeneizado de la solución y 10 μl de transferencia a una cuenta cámara de Neubauer.
- Contar las células viables y determinar la densidad celular de células viables.
- Ajustar la densidad celular a 3.6 x 107 células/mL (si es necesario, Centrifugue la suspensión de la célula).
- Inmediatamente antes de la siembra de la célula, retire el recubrimiento de laminina de todos los pozos de la µEF. Pipetee 50 μl de medio suplementado a cada pozo del compartimiento axonal µEF.
- 5 μl de suspensión de células en el compartimiento de somal de µEF de la semilla. Incubar a 37 ° C durante 1 h, para permitir la fijación de las células al sustrato.
- Cuidadosamente Llene cada uno bien de µEF con medio suplementado precalentado. Transferencia de la µEF a una incubadora a 37 ° C suministrado con 5% CO2de humidificador.
Nota: Para evitar la evaporación rápida de medio de cultivo, colocar un microtubo abierto llenado de agua dentro de la caja Petri con el µEF. - Mantener las culturas durante el periodo necesario sustituir 50% de medio de cultivo cada segundo a tercer día de la cultura.
Nota: Después de los experimentos, la microfluídica puede separarse MEAs sumergiendo el µEF en el agua durante la noche. Si es necesario, pele suavemente la microfluídica con la ayuda de fórceps. AMUMA pueden limpiarse por la incubación durante la noche con un detergente enzimático comercial 1% (v/v) (véase Tabla de materiales).
5. registrar la actividad Neuronal espontánea
Nota: Las culturas embrionarias neurona cortical en MEAs típicamente exhiben actividad espontánea como 7 días de in vitro (DIV), pero 2-3 semanas (14-21 DIV) para madurar y exhiben estable actividad. Es el experimentador para decidir cuándo iniciar las mediciones electrofisiológicas basadas en los objetivos del estudio. En el presente Protocolo, el registro de la actividad neuronal de µEF se demuestra mediante un sistema de grabación comercial (véase Tabla de materiales para detalles de hardware), con un módulo de calefacción incorporado. Para realizar grabaciones, se utilizó un software disponible gratuitamente (véase Tabla de materiales para detalles de software).
- Encienda el MEA registro de sistema y el controlador de temperatura y permita que la placa base heated del preamplificador para llegar a 37 ° C.
Nota: para grabaciones de larga duración (> 30 min al mismo tiempo) uno también debe tener un sistema que mantiene una atmósfera de CO2 . - Lugar la µEF del preamplificador (headstage).
Nota: Asegúrese de que el chip MEA está correctamente alineado con el número de referencia en la izquierda el borde superior. El chip MEA que utilizamos es rotationally simétrico, pero esta alineación coincide con la orientación correcta de la esquema de los terminales de los electrodos y el hardware ID. - Cierre y cierre la tapa del preamplificador.
- Para grabar, abrir el software de grabación y definir los parámetros de grabación y la trayectoria de las corrientes de datos registrados (véase el manual del software para obtener más información sobre cómo configurar un esquema de grabación).
Nota: Una adquisición con una frecuencia de muestreo de 20 kHz es generalmente suficiente para la mayoría de las aplicaciones. Una mayor frecuencia de muestreo es recomendable si se requiere más precisión en horarios pico. Si uno se propone sólo picos récords, establecer un filtro de paso alto a 300 Hz, que atenuará los componentes de frecuencia más baja de la señal. Si cruda y filtrada se registren simultáneamente, esto incrementará significativamente el tamaño del archivo de datos. Siempre es posible hacerlo fuera de línea de filtración de los datos en bruto. Para reducir los datos tamaño del archivo uno puede limitar microelectrodos que grabar (por ejemplo, sólo microelectrodos en micro-ranuras). - Haga clic en Iniciar DAQ para iniciar la adquisición de datos. Compruebe si la pantalla muestra corrientes rastros de actividad y comienzo de grabación.
Nota: El nivel de ruido suele ser ligeramente superior en los microelectrodos correspondiente a las micro-ranuras. Si el nivel de ruido es demasiado alto (amplitud de pico a pico > 50 μV) o inestable en varios microelectrodos, podría ser debido a suciedad, lo que dificulta un buen contacto de pin-pad. Este problema generalmente se resuelve limpiando con suavidad las almohadillas de contacto de MEA y los pernos de preamplificador utilizando un hisopo de algodón humedecido con etanol al 70%. - Abrir el archivo grabado en el software de análisis (véase Tabla de materiales) para explorar rápidamente los datos.
6. Análisis de datos
Nota: Los pasos siguientes muestran cómo utilizar el software de µSpikeHunter, una herramienta computacional desarrollado en el laboratorio de Aguiar (gratuitamente previa solicitud por correo electrónico a pauloaguiar@ineb.up.pt), para analizar los datos registrados con µEF. Una interfaz gráfica de usuario (figura 2) se utiliza para cargar los datos, identificar la propagación de las ondas de espiga, determinar su dirección (anterógrada o retrógrada) y estimar las velocidades de propagación. µSpikeHunter es compatible con archivos HDF5 generados a partir de grabaciones obtenidas mediante sistemas de MEA2100-familia, que pueden ser utilizados en conjunto con 60, 120 y 256 electrodos MEAs. Las grabaciones obtenidas usando el experimentador multicanal se pueden convertir fácilmente archivos HDF5 utilizando el software de libre disposición (véase Tabla de materiales).
- Haga clic en examinar para seleccionar el archivo de grabación. Luego, haga clic en el botón de información de archivo para el muestreo, la duración de la grabación, así como una lista de las secuencias de datos registrados (por ejemplo, datos en bruto, datos filtrados).
Nota: Para las estimaciones de velocidad real de propagación, es aconsejable seleccionar la secuencia de datos para análisis. - Seleccione microelectrodos (una sola fila o columna asociada con microsurco) para el análisis y establecer el valor de umbral de detección de pico (fase positiva o negativa) en 6 veces la desviación estándar (SD) de la señal de ruido. Haga clic en Leer datos para aplicar el detector de eventos y obtener las secuencias identificados propagación.
Nota: Si se cumplen los criterios, una lista de secuencias de propagación detectado poblarán el panel de análisis. El usuario puede entonces ver e interactuar con varias herramientas de análisis de la secuencia de propagación, incluyendo rastros de tensión, Cruz del microelectrodo inter-correlaciones, velocidades de propagación de la solo-secuencia, un kymograph y una herramienta de reproducción de audio. Aunque la estimación de la velocidad de propagación se puede obtener para cualquier par de microelectrodos o como el promedio de las estimaciones para todos los pares, esta estimación es más fiable si se selecciona la pareja alejada. - Repita el paso anterior para los conjuntos de microelectrodo de interés. Cada vez que haga clic en Guardar todos los eventos para ahorrar el tiempo y la amplitud de los picos (en cada uno de los microelectrodos) para propagación identificadas todas las secuencias a un archivo CSV.
- Importar los archivos CSV a entornos de análisis de datos para su posterior análisis de los patrones de actividad de la cultura (p. ej., disparo ritmo, intervalos entre spike).
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Representative Results
Utilizando el protocolo descrito aquí, neuronas corticales de rata de E-18 sembradas en µEF son capaces de desarrollar y mantenerse saludable en estas condiciones de cultivo para más de un mes. Tan pronto como 3 a 5 días en cultivo, las neuronas corticales crecen sus axones a través de micro-ranuras hacia el compartimiento axonal de µEF (figura 1). Después de 15 días en la cultura, las neuronas corticales cultivadas en µEF se esperan exhibir niveles constantes de actividad y se espera que la propagación de potenciales de acción a lo largo de las micro-ranuras. Más viejas culturas (> 14 DIV) tienden a ser dominados por la explosión de actividad como en convencionales MEA grabaciones18,19.
Grabaciones y análisis de datos
Análisis de datos crudos con µSpikeHunter (figura 2) permite la detección y extracción de propagación de ondas de espiga a lo largo de conjuntos de 4 microelectrodos (dentro de micro-ranuras). Figura 3 se muestra uno de estos eventos. µSpikeHunter para la estimación de las velocidades de propagación, basado en las correlaciones cruzadas entre las formas de onda de voltaje de las pares de microelectrodos (proporcionando una demora de tiempo) y la distancia de electrodos entre conocida asociada.
Los datos extraídos más se analizan mediante código personalizado diseñado en MATLAB. Una parcela de representación raster de la multiplicación del punto ondas a lo largo de 11 (de 16) micro-ranuras se muestran en la figura 4a. En la Figura 4bse muestra la tasa de disparo instantáneo para un alta y una baja actividad microsurco.
Grabaciones de µEF exhiben diferentes niveles de actividad por el microelectrodo. Con frecuencia, varios microelectrodos en el compartimiento de somal son "silenciosos". Sin embargo, la mayoría microelectrodos en micro-ranuras tienden a ser activos (figura 5a). Está bien descrito que las micro-ranuras funcionan como amplificadores de señal8. La amplitud de una señal registrada depende no sólo del tamaño de las corrientes de la fuente, sino también en la resistencia de los medios circundantes. La resistencia a lo largo de un microsurco es particularmente alta, que aumenta considerablemente la amplitud de las señales medidas en comparación con los de los microelectrodos en el compartimiento de somal (figura 5b).
Figura 1 . Neuronas corticales de rata embrionarias cultivadas en µEF. (a) fotografía de µEF. Barra de escala: 1 cm. (b) imagen representativa de las neuronas corticales cultivadas en el µEF por 5 días, mostrando varios axones atravesando las micro-ranuras y alcanzar el compartimiento axonal (flechas). Barra de escala: 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Pantalla de captura de la interfaz gráfica de usuario principal de µSpikeHunter. El usuario puede cargar los datos registrados con µEF, identificar la propagación de las ondas de espiga, determinar su dirección (anterógrada o retrógrada) y estimar las velocidades de propagación. Una herramienta kymograph permite al usuario calcular manualmente la velocidad de propagación basada en una línea trazada en la kymograph. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Anterógrada propagación onda del punto detectada por 4 microelectrodos (E8-E11) dentro de un microsurco. Cada rastro representa grabación raw de un microelectrodo Sra. 3 análisis con µSpikeHunter, la correlación cruzada entre las más lejanas microelectrodos (E8 y E11) permite el cálculo de una velocidad de propagación de 0,52 m/s. por favor haga clic aquí para Vea una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Aluvión de información a través de las micro-ranuras. (a) registrado representante trama trama de 2 minutos de la actividad espontánea a lo largo de 11 micro-ranuras. Cada punto representa una propagación onda del punto (unidad) captada por 4 microelectrodos e identificado a través del análisis con µSpikeHunter. Una alta y una baja actividad microsurco son remarcados en amarillo y rojo, respectivamente. (b) evolución de la tasa de disparo instantáneo (como en la tasa de codificación) para los dos micro-ranuras resaltados a lo largo de 10 minutos. Sólo unidades de multiplicación eran considerados para el cálculo de la tasa de disparo. Nota la sincronización de la actividad, a pesar de los diferentes niveles de tasa de disparo. Se calculó la tasa de disparo instantáneo de convolución de los eventos de la espiga con un kernel Gaussiano con una desviación estándar de 100 ms. de tamaño por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Calidad de los registros extracelulares en µEF. (a) ventana de tiempo (1 segundo) de una grabación de µEF (neuronas corticales de rata en 15 días en vitro) con una frecuencia de muestreo de 20 kHz y un filtro de paso alto a 300 Hz. filas de electrodo 1-7 corresponden al compartimiento somal y filas 8-11 a las micro-ranuras. (b) diagrama caja y bigotes de toda la gama de amplitudes pico extrae (picos detectados con un método de umbral, de fase negativa, en la desviación de estándar de 6 x) de las filas especificadas (tiempo de grabación total de 10 minutos). Las amplitudes de los picos son significativamente más grandes en los microelectrodos en micro-ranuras (filas 8-11; 16 micro-ranuras), comparado con microelectrodos del compartimiento del somal (filas 1-7; 16 microelectrodos activadas). ANOVA unidireccional, Dunn de pruebas múltiples de comparación, ***p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo que presentamos muestra cómo montar un µEF, compuesto por un dispositivo de microfluidos y una MEA con diseños estándar disponibles comercialmente y cómo analizar los datos registrados.
Al diseñar un experimento, los investigadores deben tener en cuenta que el modelo de vitro está limitado por la rejilla fija de MEA, que restringe el microsurco arreglos. El uso de un particular microfluidos o MEA diseño dependerá de las necesidades experimentales pero, en general, los mismos pasos del procedimiento deben aplicar configuraciones de diferentes µEF.
Los experimentos de una importante decisión a realizar antes de que µEF es si el usuario tiene la intención de reutilizar el µEF montado en el futuro. Tratamiento con plasma de oxígeno en ambas superficies se puede hacer para enlace covalente dispositivos microfluídicos para MEAs20. Sin embargo, esta sellado a menudo hace las virutas MEA inutilizable para otros experimentos, como separar el dispositivo de microfluidos irreversible daña la capa de pasivación. Para evitar este problema, grupos de investigación tienden a reutilizar el µEF montado, a pesar de los posibles inconvenientes (por ejemplo, restos de experimentos anteriores). Con cuidado, siguiendo los pasos descritos en este protocolo, desde el experimento a experimento, uno puede con seguridad adjuntarán y separar dispositivos microfluídicos sin dañar el MEA.
El uso de µEF permite el aislamiento de un conjunto de axones dentro de las micro-ranuras. El tiempo requerido para un número razonable de axones para cruzar las micro-ranuras dependerá grandemente la célula procedimiento, es decir, la densidad celular semillas de siembra. Utilizando la densidad especificada en el presente Protocolo, las neuronas utilizan para cruzar el microsurco todo dentro de 3 a 5 DIV.
Dependiendo del entorno de la cultura (es decir, la incubadora y nivel de humedad), se requiera para reemplazar a los medios de comunicación cada 2 a 3 días de la cultura. Cuando renovar los medios de comunicación, retirar los medios de comunicación de pozos µEF los medios de comunicación dentro de los canales principales. Luego, suavemente añadir medios a los pozos µEF permitiendo fluir lentamente a través de los canales principales antes de llenar los pozos con el volumen de los medios de comunicación final. Siguiendo estas recomendaciones, somos capaces de mantener estas culturas en condiciones saludables para al menos un mes.
Una ventaja clave de esta plataforma es la capacidad de aislar, medir y controlar señales axonales. Aunque la grabación de µEF es simple, la gran cantidad de datos que se pueden generar es engorrosa para manejar y requiere buenos conocimientos de análisis de datos. El software de análisis utilizado aquí, µSpikeHunter21, es un avanzado sin embargo intuitiva herramienta computacional, que permite la cuantificación detallada de varias relacionadas con las medidas (por ejemplo, eventos de propagación, velocidad de propagación etc.) en a pocos pasos. Aunque el análisis de datos no es el objetivo del presente Protocolo, la información aquí proporcionada ya permite la extracción de datos significativos de una grabación de µEF. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el aislamiento fiable de un solo axón por microsurco sigue siendo imposible. Así, formas de onda de pico muy complejo (debido a múltiples axones atravesando el microsurco) surjan y afectar los tiempos de spike y cálculos de velocidad de propagación. Esta limitación se puede atenuar mediante el uso de micro-ranuras muy estrecha (por debajo de 5 μm)13 o a través de spike clasificación técnicas21, que ayudan a distinguir diferentes fuentes de señal.
A pesar de que en vitro culturas no recapitulan la complejidad completo en vivo , su combinación con µEF permite enfoques de investigación bien controlada de abajo hacia arriba. Esperamos que este protocolo ayudará a los principiantes y los usuarios MEA competentes establecer modelos nuevos y confiables para el estudio electrofisiológica Comunicación en circuitos neuronales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional fondos hasta el 2020 compiten - Operacional programa de competitividad e internacionalización (POCI), 2020 de Portugal y por portugueses fondos a través de la FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus fue apoyada por la FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar fue apoyado por el Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - promoción del empleo científico, FSE y MCTES y programa Investigador FCT, POPH Fundo Social Europeu. Los dispositivos microfluídicos fueron fabricados en INESC - microsistemas y nanotecnologías, Portugal, bajo la supervisión de João Pedro Conde y Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
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