Microfluidica di interfacciamento con microelettrodi per studiare comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale
Summary
Questo protocollo mira a dimostrare come combinare in vitro microelettrodi con dispositivi microfluidici per lo studio della trasmissione del potenziale d’azione in colture neuronali. Analisi dei dati, vale a dire l’individuazione e la caratterizzazione dei materiali di moltiplicazione di potenziali di azione, è eseguita utilizzando un nuovo avanzato, ma facile da usare e liberamente disponibile, strumento computazionale.
Abstract
Matrici di microelettrodi (MEA) sono ampiamente usate per studiare la funzione di un neurone in vitro. Questi dispositivi permettono di registrazione/stimolazione non invasiva simultanea di attività elettrofisiologica per lunghi periodi. Tuttavia, la proprietà di rilevamento di segnali provenienti da tutte le fonti intorno ogni microelettrodo può diventare sfavorevole quando si cerca di capire la comunicazione e propagazione nei circuiti neuronali del segnale. In una rete neuronale, diversi neuroni possono essere attivati simultaneamente e possono generare potenziali di azione sovrapposti, rendendo difficile per discriminare e tenere traccia di propagazione del segnale. Tenendo conto di questa limitazione, abbiamo stabilito un’installazione in vitro focalizzata sulla valutazione elettrofisiologica comunicazione, che è in grado di isolare e amplificare i segnali axonal con elevata risoluzione spaziale e temporale. Interfacciandolo dispositivi microfluidici e MEAs, siamo in grado di compartimenti stagni di colture neuronali con un allineamento ben controllato di assoni e microelettrodi. Questa configurazione permette registrazioni di propagazione di spike con un elevato rapporto segnale-rumore nel corso di diverse settimane. Combinato con algoritmi di analisi di dati specializzate, fornisce dettagliata quantificazione di comunicazione diverse proprietà come la velocità di propagazione, tasso di infornamento, insufficienza di conduzione anterograda picchi correlate e meccanismi di codifica.
Questo protocollo viene illustrato come creare un setup di compartimenti neuronali cultura su substrato-integrato MEAs, come cultura di neuroni in questa configurazione e come correttamente registrare, analizzare e interpretare i risultati di tali esperimenti. Qui, ci mostra come il programma di installazione stabilita semplifica la comprensione della comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale. Queste piattaforme spianano la strada per i nuovi modelli in vitro con topografie rete neuronale ingegnerizzati e controllabile. Sono utilizzabili nel contesto di colture neuronali omogenee, o con configurazioni di co-coltura dove, ad esempio, comunicazione tra neuroni sensoriali e altri tipi di cellule è monitorata e valutata. Questa configurazione fornisce condizioni molto interessanti da studiare, ad esempio, neurosviluppo, circuiti neuronali, informazioni coding, gli approcci di neurodegenerazione e neurorigenerazione.
Introduction
Comprendere la comunicazione elettrica in circuiti neuronali è un passo fondamentale per rivelare la funzione normale e di elaborare strategie terapeutiche per affrontare la disfunzione. Neuroni integrano, elaborare e inoltrare i potenziali di azione (APs) che si propagano lungo i loro assoni sottili. Tradizionali tecniche elettrofisiologiche (ad es., toppa morsetto) sono potenti tecniche per studiare l’attività neuronale, ma sono spesso limitate per le più grandi strutture cellulari, come il soma o dendriti. Tecniche di imaging offrono un’alternativa per studiare axonal segnali ad alta risoluzione spaziale, ma essi sono tecnicamente difficili da eseguire e non consentono a lungo termine misure1. In questo contesto, la combinazione di microelettrodi (MEA) e microfluidica può apportare un contributo prezioso nel divulgare le proprietà fondamentali di neuron´s attività e segnale di trasmissione all’interno di reti neuronali in vitro2 , 3.
Tecnologia MEA si basa su registrazioni extracellulari di colture neuronali. I principali vantaggi di questa metodologia elettrofisiologico sono la sua capacità di sostenere a lungo termine, simultanea stimolazione e la registrazione in più siti e in un modo non invasivo3. MEAs sono costituiti di microelettrodi biocompatibili, ad alti conduttivi e resistenti alla corrosione, incorporati in un substrato di wafer di vetro. Sono compatibili con cella convenzionale cultura bio-rivestimenti, che attraverso la promozione di adesione delle cellule significativamente aumentare la resistenza di tenuta tra il substrato e cellule3,4. Inoltre, sono versatile nel disegno e possono variare in densità, geometria e dimensione di microelettrodi. Nel complesso, MEAs lavorare come recipienti di coltura convenzionale delle cellule con il vantaggio di permettere registrazioni live-imaging ed elettrofisiologica simultanea/stimolazione.
L’uso della tecnologia MEA ha contribuito allo studio delle caratteristiche importanti di reti neurali5. Tuttavia, ci sono caratteristiche intrinseche che ne limitano le prestazioni di MEAs per lo studio della comunicazione e della propagazione di APs in un circuito neuronale. MEAs attivare le registrazioni da singole cellule e strutture anche sottocellulari come assoni, ma rispetto ai somali segnali, segnali axonal hanno un bassissimo rapporto segnale-rumore (SNR)6. Inoltre, la caratteristica di rilevamento di potenziali di campo extracellulare da tutte le fonti intorno ogni microelettrodo ostacola il tracciamento di propagazione del segnale in un circuito neuronale.
Studi recenti hanno dimostrato, tuttavia, che si possono conseguire migliori condizioni di registrazione avendo microelettrodi allineati all’interno di microcanali strette in cui assoni possono crescere. Questa configurazione fornisce un significativo aumento nella SNR tale che segnali axonal di moltiplicazione può essere facilmente rilevato7,8,9,10,11,12, 13. La strategia di allearsi dispositivi microfluidici con tecnologia MEA crea un microambiente elettricamente isolato adatto per amplificare segnali axonal11. Inoltre, la presenza di multiple microelettrodi rilevamento lungo un microsolco è fondamentale per la rilevazione e la caratterizzazione di propagazione del segnale assonale.
Tali piattaforme in vitro con topografie rete neuronale altamente controllabile possono essere adattati a molte domande di ricerca14. Queste piattaforme sono adatte ad essere utilizzati nel contesto delle culture di un neurone, ma possono essere espansa per configurazioni di co-coltura, dove la comunicazione tra neuroni e altri tipi di cellule può essere monitorata e valutata l’ingegnere. Questa configurazione fornisce così le condizioni molto interessante per scoprire una serie di studi correlati neurali come neurosviluppo, circuiti neuronali, codifica dell’informazione, neurodegenerazione e neurorigenerazione. Inoltre, la sua combinazione con i modelli emergenti di cellule staminali umane pluripotenti indotte15,16 può aprire nuove strade nello sviluppo di potenziali terapie per malattie che colpiscono il sistema nervoso.
Il nostro laboratorio utilizza questa piattaforma che unisce microelettrodi con microfluidica (µEF) per capire i processi neuronali a livello di rete e cellulare e loro implicazione nella fisio – e patologico del sistema nervoso. Dato il valore di tale piattaforma nel campo delle neuroscienze, lo scopo del presente protocollo è illustrato come creare una cultura neuronale compartimenti sopra MEAs substrato-integrato, come i neuroni di cultura in questa piattaforma e come registrare con successo, analizzare e interpretare i risultati di tali esperimenti. Questo protocollo arricchirà certamente la casella degli strumenti sperimentale per colture neuronali nello studio della comunicazione neurale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui Mostra come assemblare un µEF, composto da un dispositivo microfluidico e un MEA con disegni standard disponibile in commercio e come analizzare i dati registrati.
Quando si progetta un esperimento, i ricercatori devono tener conto che il modello in vitro è limitato dalla griglia fissa MEA, che vincola il microsolco accordi. L’uso di un particolari microfluidici o MEA design dipenderà molto le esigenze sperimentali specifiche ma, in generale, la stessa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata finanziata da FEDER – Fundo Europeu de Desenvolvimento fondi regionali fino al 2020 la COMPETE – Operacional programma per la competitività e l’internazionalizzazione (POCI), 2020 di Portogallo e dal portoghese finanzia attraverso FCT – Fundação para un Ciência e un Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior nel quadro del progetto PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus è stato sostenuto da FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar è stata sostenuta da Ciência Programa – Programa Operacional Potencial Humano (POPH) – promozione del lavoro scientifico, FSE e MCTES e programma Investigador FCT, POPH e Fundo Social Europeu. I dispositivi microfluidici furono fabbricati presso INESC – microsistemi e nanotecnologie, in Portogallo, sotto la supervisione di João Pedro Conde e Virginia Chu.
Materials
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
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