Summary
Questo protocollo mira a dimostrare come combinare in vitro microelettrodi con dispositivi microfluidici per lo studio della trasmissione del potenziale d'azione in colture neuronali. Analisi dei dati, vale a dire l'individuazione e la caratterizzazione dei materiali di moltiplicazione di potenziali di azione, è eseguita utilizzando un nuovo avanzato, ma facile da usare e liberamente disponibile, strumento computazionale.
Abstract
Matrici di microelettrodi (MEA) sono ampiamente usate per studiare la funzione di un neurone in vitro. Questi dispositivi permettono di registrazione/stimolazione non invasiva simultanea di attività elettrofisiologica per lunghi periodi. Tuttavia, la proprietà di rilevamento di segnali provenienti da tutte le fonti intorno ogni microelettrodo può diventare sfavorevole quando si cerca di capire la comunicazione e propagazione nei circuiti neuronali del segnale. In una rete neuronale, diversi neuroni possono essere attivati simultaneamente e possono generare potenziali di azione sovrapposti, rendendo difficile per discriminare e tenere traccia di propagazione del segnale. Tenendo conto di questa limitazione, abbiamo stabilito un'installazione in vitro focalizzata sulla valutazione elettrofisiologica comunicazione, che è in grado di isolare e amplificare i segnali axonal con elevata risoluzione spaziale e temporale. Interfacciandolo dispositivi microfluidici e MEAs, siamo in grado di compartimenti stagni di colture neuronali con un allineamento ben controllato di assoni e microelettrodi. Questa configurazione permette registrazioni di propagazione di spike con un elevato rapporto segnale-rumore nel corso di diverse settimane. Combinato con algoritmi di analisi di dati specializzate, fornisce dettagliata quantificazione di comunicazione diverse proprietà come la velocità di propagazione, tasso di infornamento, insufficienza di conduzione anterograda picchi correlate e meccanismi di codifica.
Questo protocollo viene illustrato come creare un setup di compartimenti neuronali cultura su substrato-integrato MEAs, come cultura di neuroni in questa configurazione e come correttamente registrare, analizzare e interpretare i risultati di tali esperimenti. Qui, ci mostra come il programma di installazione stabilita semplifica la comprensione della comunicazione neuronale e propagazione del segnale assonale. Queste piattaforme spianano la strada per i nuovi modelli in vitro con topografie rete neuronale ingegnerizzati e controllabile. Sono utilizzabili nel contesto di colture neuronali omogenee, o con configurazioni di co-coltura dove, ad esempio, comunicazione tra neuroni sensoriali e altri tipi di cellule è monitorata e valutata. Questa configurazione fornisce condizioni molto interessanti da studiare, ad esempio, neurosviluppo, circuiti neuronali, informazioni coding, gli approcci di neurodegenerazione e neurorigenerazione.
Introduction
Comprendere la comunicazione elettrica in circuiti neuronali è un passo fondamentale per rivelare la funzione normale e di elaborare strategie terapeutiche per affrontare la disfunzione. Neuroni integrano, elaborare e inoltrare i potenziali di azione (APs) che si propagano lungo i loro assoni sottili. Tradizionali tecniche elettrofisiologiche (ad es., toppa morsetto) sono potenti tecniche per studiare l'attività neuronale, ma sono spesso limitate per le più grandi strutture cellulari, come il soma o dendriti. Tecniche di imaging offrono un'alternativa per studiare axonal segnali ad alta risoluzione spaziale, ma essi sono tecnicamente difficili da eseguire e non consentono a lungo termine misure1. In questo contesto, la combinazione di microelettrodi (MEA) e microfluidica può apportare un contributo prezioso nel divulgare le proprietà fondamentali di neuron´s attività e segnale di trasmissione all'interno di reti neuronali in vitro2 , 3.
Tecnologia MEA si basa su registrazioni extracellulari di colture neuronali. I principali vantaggi di questa metodologia elettrofisiologico sono la sua capacità di sostenere a lungo termine, simultanea stimolazione e la registrazione in più siti e in un modo non invasivo3. MEAs sono costituiti di microelettrodi biocompatibili, ad alti conduttivi e resistenti alla corrosione, incorporati in un substrato di wafer di vetro. Sono compatibili con cella convenzionale cultura bio-rivestimenti, che attraverso la promozione di adesione delle cellule significativamente aumentare la resistenza di tenuta tra il substrato e cellule3,4. Inoltre, sono versatile nel disegno e possono variare in densità, geometria e dimensione di microelettrodi. Nel complesso, MEAs lavorare come recipienti di coltura convenzionale delle cellule con il vantaggio di permettere registrazioni live-imaging ed elettrofisiologica simultanea/stimolazione.
L'uso della tecnologia MEA ha contribuito allo studio delle caratteristiche importanti di reti neurali5. Tuttavia, ci sono caratteristiche intrinseche che ne limitano le prestazioni di MEAs per lo studio della comunicazione e della propagazione di APs in un circuito neuronale. MEAs attivare le registrazioni da singole cellule e strutture anche sottocellulari come assoni, ma rispetto ai somali segnali, segnali axonal hanno un bassissimo rapporto segnale-rumore (SNR)6. Inoltre, la caratteristica di rilevamento di potenziali di campo extracellulare da tutte le fonti intorno ogni microelettrodo ostacola il tracciamento di propagazione del segnale in un circuito neuronale.
Studi recenti hanno dimostrato, tuttavia, che si possono conseguire migliori condizioni di registrazione avendo microelettrodi allineati all'interno di microcanali strette in cui assoni possono crescere. Questa configurazione fornisce un significativo aumento nella SNR tale che segnali axonal di moltiplicazione può essere facilmente rilevato7,8,9,10,11,12, 13. La strategia di allearsi dispositivi microfluidici con tecnologia MEA crea un microambiente elettricamente isolato adatto per amplificare segnali axonal11. Inoltre, la presenza di multiple microelettrodi rilevamento lungo un microsolco è fondamentale per la rilevazione e la caratterizzazione di propagazione del segnale assonale.
Tali piattaforme in vitro con topografie rete neuronale altamente controllabile possono essere adattati a molte domande di ricerca14. Queste piattaforme sono adatte ad essere utilizzati nel contesto delle culture di un neurone, ma possono essere espansa per configurazioni di co-coltura, dove la comunicazione tra neuroni e altri tipi di cellule può essere monitorata e valutata l'ingegnere. Questa configurazione fornisce così le condizioni molto interessante per scoprire una serie di studi correlati neurali come neurosviluppo, circuiti neuronali, codifica dell'informazione, neurodegenerazione e neurorigenerazione. Inoltre, la sua combinazione con i modelli emergenti di cellule staminali umane pluripotenti indotte15,16 può aprire nuove strade nello sviluppo di potenziali terapie per malattie che colpiscono il sistema nervoso.
Il nostro laboratorio utilizza questa piattaforma che unisce microelettrodi con microfluidica (µEF) per capire i processi neuronali a livello di rete e cellulare e loro implicazione nella fisio - e patologico del sistema nervoso. Dato il valore di tale piattaforma nel campo delle neuroscienze, lo scopo del presente protocollo è illustrato come creare una cultura neuronale compartimenti sopra MEAs substrato-integrato, come i neuroni di cultura in questa piattaforma e come registrare con successo, analizzare e interpretare i risultati di tali esperimenti. Questo protocollo arricchirà certamente la casella degli strumenti sperimentale per colture neuronali nello studio della comunicazione neurale.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state eseguite secondo la direttiva 2010/63/UE Unione europea (UE) (recepita legislazione portoghese dal Decreto-Lei 113/2013). Il protocollo sperimentale (0421/000/000/2017) è stato approvato dal comitato etico dell'autorità ufficiale portoghese sul benessere degli animali e sperimentazione (Direção Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) e dell'host Institution.
1. preparazione di terreni di coltura e di altre soluzioni
Nota: Appena preparare le soluzioni di rivestimento il giorno del suo utilizzo. Le soluzioni di rivestimento inutilizzati e terreni di coltura possono essere conservati a-20 ° C o a 4 ° C come dettagliato di seguito.
- Preparare 10 mL di un 0,05% (v/v) soluzione di lavoro Poly(ethylene imine) (PEI).
- Preparare 20 mL della soluzione madre di 0.25% (p/v) PEI sciogliendo PEI purificata (Vedi Tabella materiali) in acqua sterile.
- Diluire 2 mL di soluzione madre di PEI di 0.25% (p/v) in 8 mL di acqua distillata sterile. Mescolare bene e utilizzare. La soluzione non utilizzata può essere conservata a 4 ° C.
- Preparare 1 mL di una soluzione di laminina 5 µ g/mL.
- Diluire 5 µ l di soluzione madre di laminina 1 mg/mL in 995 µ l di sostanza basale (Vedi Tabella materiali). Mescolare bene e utilizzare. La soluzione non utilizzata possa essere conservata a-20 ° C fino a 1-2 settimane.
- Preparare 1 L di soluzione salina bilanciata di Hank tamponata HEPES (H-HBSS).
- Preparare soluzione HEPES 1 M sciogliendo 11,9 g di polvere HEPES in 50 mL di acqua ultrapura. Regolare il pH a 7,2.
- Preparare soluzione H-HBSS (senza calcio e magnesio) sciogliendo 5,33 mM di cloruro di potassio, 0,44 millimetri di fosfato di potassio monobasico, cloruro di sodio 138 mM, 0,3 mM sodio fosfato bibasico e 5,6 millimetri di glucosio in 800 mL di acqua ultrapura.
- Aggiungere 15 mL di soluzione 1 M HEPES (concentrazione finale di 15 mM).
- Regolare il pH a 0.2-0.3 unità sotto il pH desiderato 7.4 utilizzo 1 N HCl o NaOH N 1. Aggiungere acqua ultrapura per compensare il volume di soluzione finale.
Nota il pH tende a salire durante la filtrazione. - Sterilizzare mediante filtrazione utilizzando una membrana di poly(ether sulfone) (PES) di 0,22 µm porosità.
- Preparare 10 mL di H-HBSS contenente 10% inattivati siero bovino fetale (hiFBS).
- Diluire 1 mL di hiFBS in 9 mL di H-HBSS. Mescolare bene e utilizzare. Soluzione non utilizzata può essere memorizzata a 4 ° C per 3-4 settimane.
- Preparare 5 mL di 1,5 mg/mL soluzione di tripsina.
- Immediatamente prima dell'uso, sciogliere 7,5 mg di tripsina in 5 mL di H-HBSS. Sterilizzare mediante filtrazione utilizzando una membrana PES porosità di 0,22 µm.
- Preparare 50 mL di terreno completato.
- In una provetta conica da 50 mL, mescolare 48,5 mL di sostanza basale (Vedi Tabella materiali), 2% (v/v) supplemento B-27, 0,5 mM L-Glutammina e 1% Pen/Strep (10.000 U/mL di penicillina e 10.000 µ g/mL di streptomicina). Medio completato possa essere memorizzato a 4 ° C per 3-4 settimane.
2. microfluidica e preparazione di dispositivi MEA
Nota: Eseguire la procedura 2.1-2.11 il giorno prima della semina delle cellule.
- Pulire i dispositivi microfluidici per rimuovere fabbricazione e altri detriti utilizzando nastro in vinile. Premere delicatamente il nastro contro il dispositivo per raggiungere tutte le aree del dispositivo.
- Aria al plasma-pulire il MEA per 3 min (0,3 mbar) per pulire la superficie e renderlo più idrofilo.
- Brevemente immergere dispositivi microfluidici in etanolo al 70% e lasciarli asciugare all'aria all'interno di una cappa a flusso laminare.
- Posizionare ogni MEA in un sterile 90mm di Petri e sterilizzarli con 15 min di esposizione alla luce ultravioletta (UV).
- Ricoprire la superficie centrale MEA incubando con 500 µ l di soluzione allo 0,05% (v/v) PEI per almeno 1 h a 37 ° C.
Nota: Come descritto da altri17, rivestimento PEI di MEAs provoca meno cella clustering rispetto all'utilizzo di rivestimento poly(lysine). - Aspirare la soluzione di rivestimento PEI dalla superficie MEA e lavare MEAs 4 x con 1 mL di sterile di acqua distillata. Fare attenzione a non toccare la superficie MEA durante fasi di lavaggio, come questo può danneggiare gli elettrodi.
- Guidati da un microscopio stereoscopico all'interno di una cappa a flusso laminare, centro del chip MEA e aggiungere 1 mL di acqua sterile per la zona centrale di MEA.
- Posizionare il dispositivo microfluidico in cima alla superficie MEA.
- Allineare con cura le Microscanalature del dispositivo microfluidico con la griglia microelettrodo di MEA.
- Quando correttamente allineati, aspirare accuratamente l'acqua in eccesso senza toccare il MEA o il dispositivo microfluidico.
- Incubare il µEFs durante la notte a 37 ° C per asciugare e consentono l'adesione completa. Per facilitare l'allegato, premere delicatamente il dispositivo microfluidico contro il MEA.
Nota: Eseguire passaggio 2.12 il giorno della semina cellulare. - Una volta che il µEFs sono completamente essiccati, caricare i pozzetti di microfluidica con 150 µ l di 5 µ g/mL di soluzione di rivestimento laminina e incubare a 37 ° C per almeno 2 h prima della semina delle cellule.
Nota: Quando si carica µEF con soluzione di laminina, assicurarsi che la soluzione riempie le Microscanalature. utilizzare un aspirapolvere per rimuovere qualsiasi bolla d'aria che potrebbe essere presente entro le Microscanalature.
3. prefrontale dissezione
- Preparare l'area di dissezione per rimozione di embrione.
- Disinfettare la superficie di lavoro e gli strumenti chirurgici con etanolo al 70%.
Nota: Anche se la dissezione non è una procedura sterile, disinfezione aiuta a ridurre le probabilità di contaminazione. - Utilizzare un pannolino pulito monouso per limitare l'area di dissezione e stendere gli strumenti chirurgici per la rimozione dell'embrione.
- Preparare 4 piatti di Petri di 90 mm riempito con freddo H-HBSS e mettetele su un vassoio con ghiaccio vicino alla zona di dissezione.
- Disinfettare la superficie di lavoro e gli strumenti chirurgici con etanolo al 70%.
- Eutanasia di un ratto Wistar tempo-incinta E-18 per inalazione di anidride carbonica (CO2).
- Al termine della procedura, rimuovere l'animale dalla camera CO2 e confermare la morte di un metodo secondario dell'eutanasia, come il dissanguamento.
- Posizionare il lato ventrale animale fino il pannolino usa e getta, spruzzare il basso addome con etanolo al 70% e, con l'aiuto di pinze e forbici, fare una forma a U tagliare attraverso la pelle per esporre l'utero.
- Rimuovere gli embrioni dall'utero di tagliare qualsiasi tessuto connettivo delicatamente e metterli in uno dei piatti Petri con freddo H-HBSS.
- Rimuovere ogni embrione dal suo sacco embrionale e, con l'aiuto di pinze e forbici, decapitare l'embrione.
- Trasferire la testa di embryo´s per un secondo piatto di Petri riempito con H-HBSS freddo.
- Ripetere i passaggi da 3.6-3.7 per ciascun embrione.
- Sezionare la corteccia prefrontale.
- Trasferire una testa di embryo´s ad un terzo di Petri.
- Utilizzare un paio di pinze per esporre il cervello.
- Rimuovere il cervello dalla sua cavità e coprirlo con H-HBSS freddo.
- Se presente, rimuovere e scartare i bulbi olfattivi. Sezionare la corteccia prefrontale e rimuovere le meningi.
- Trasferire i frammenti di corteccia prefrontale a un quarto di Petri riempito con H-HBSS freddo.
- Ripetere i passaggi 3.9.1 - 3.9.5 per ciascun embrione.
4. corticale neuroni dissociazione e cultura su µEF
Nota: Le seguenti procedure sono state eseguite all'interno di una cappa a flusso laminare dopo un 15 min il ciclo di sterilizzazione UV. Lavoro superficie, nonché tutti i materiali collocati all'interno della cappa deve essere precedentemente disinfettata con etanolo al 70%.
- Come descritto al punto 1.5, sciogliere la tripsina precedentemente ponderata in 5 mL di H-HBSS e filtrare la soluzione.
- Raccogliere i pezzi di corteccia in precedenza sezionati in un totale di 5 mL di H-HBSS. Trasferirli in una provetta conica sterile 15 mL.
- Aggiungere 2,3 mL di soluzione di tripsina 1,5 mg/mL preparata al momento nella provetta contenente i frammenti di corteccia.
- Mescolare la sospensione e incubare a 37 ° C per 15 min (agitare brevemente ogni 5 min).
- Interrompere la digestione del tessuto e sciacquare la tripsina.
- Eliminare il supernatante contenente la tripsina. Aggiungere 5 mL di H-HBSS contenente 10% hiFBS per inattivare la tripsina rimanente; Agitare delicatamente.
- Lasciate che frammenti di corteccia sistemarsi e poi scartare il surnatante.
- Aggiungere 5 mL di H-HBSS per rimuovere i residui di hiFBS. Lasciate che frammenti di corteccia stabilirsi e scartare il surnatante.
- Lavare nuovamente i frammenti di corteccia con 5 mL di H-HBSS.
- Lasciate che frammenti di corteccia stabilirsi e scartare il surnatante. Aggiungere 5 mL di terreno di un neurone completato.
- Meccanicamente dissociare frammenti di corteccia con una pipetta sierologica 5ml pipettando lentamente su e giù per 10 - 15 volte. Se necessario, ripetere la procedura utilizzando una pipetta di piccolo calibro fino a quando la sospensione cellulare diventare omogeneo.
- Scartare i rimanenti tessuti dissociati filtrando il trogolo di sospensione cellulare un colino di cella 40 µm.
- Conta cellule vitali e determinare la densità delle cellule.
- In una microprovetta, aggiungere 20 µ l di 0,4% (p/v) tripan blu fino ad una sospensione di cellule 20 µ l. Mescolare bene a omogeneato la soluzione e trasferire 10 µ l in un alloggiamento di conteggio di Neubauer.
- Conta cellule vitali e determinare la densità delle cellule delle cellule vitali.
- Regolare la densità delle cellule a 3.6 x 107 cellule/mL (se necessario, centrifugare la sospensione cellulare).
- Immediatamente prima della semina cellulare, rimuovere laminin rivestimento da tutti i pozzetti della µEF. Pipettare 50 µ l di terreno completato in ciascun pozzetto del compartimento axonal µEF.
- 5 µ l di sospensione cellulare nel vano somali µEF del seme. Incubare a 37 ° C per 1 h, per consentire l'attaccamento di cellule al substrato.
- Delicatamente e riempire ogni bene di µEF con il mezzo di completati riscaldato. Trasferire la µEF di un incubatore di umidificatore a 37 ° C, fornito con 5% CO2.
Nota: Per evitare l'evaporazione veloce mezzo di coltura, posizionare una microprovetta aperta riempita con acqua all'interno della capsula di Petri che trasportano il µEF. - Mantenere le colture per il periodo richiesto sostituendo il 50% del terreno di coltura ogni secondo al terzo giorno della cultura.
Nota: Dopo gli esperimenti, la microfluidica può essere staccato dal MEAs immergendo il µEF in acqua durante la notte. Se necessario, Sbucci delicatamente la microfluidica con l'aiuto di pinze. MEAs possono essere puliti tramite incubazione overnight con un detergente enzimatico commerciale 1% (v/v) (Vedi Tabella materiali).
5. registrazione spontanea attività neuronale
Nota: Colture di neuroni corticali embrionali su MEAs presentano in genere attività spontanea appena 7 giorni in vitro (DIV), ma prendere 2-3 settimane (14-21 DIV) a maturare ed esibiscono stabile attività. Spetta allo sperimentatore di decidere quando iniziare le misurazioni elettrofisiologiche sulla base degli obiettivi dello studio. In questo protocollo, la registrazione dell'attività neuronale da µEF dimostrata tramite un sistema di registrazione commerciale (Vedi Tabella materiali per dettagli hardware), con un modulo di riscaldamento incorporato. Per eseguire la registrazione, abbiamo usato un software liberamente disponibile (Vedi Tabella materiali particolari software).
- Attivare il MEA registrazione di sistema e il regolatore di temperatura e consentire la piastra di base riscaldata del preamplificatore per raggiungere i 37 ° C.
Nota: per le registrazioni a lungo termine (> 30 min alla volta) uno dovrebbe anche avere un sistema che mantiene un'atmosfera di CO2 . - Posizionare il µEF sul preamplificatore (headstage).
Nota: Assicurarsi che il chip MEA è correttamente allineato con il numero di riferimento in alto a sinistra bordo. Il chip MEA che usiamo è simmetrico rotazionale, ma questo allineamento corrisponde il corretto orientamento della disposizione dei pin degli elettrodi e l'ID hardware. - Chiudere e bloccare il coperchio del preamplificatore.
- Per registrare, aprire il software di registrazione e definire i parametri di registrazione e il percorso dei flussi di dati registrati (vedere il manuale del software per informazioni dettagliate su come impostare uno schema di registrazione).
Nota: Un'acquisizione con una frequenza di campionamento di 20 kHz è generalmente sufficiente per la maggior parte delle applicazioni. Una maggiore frequenza di campionamento è consigliabile se più precisione è necessaria in tempi di spike. Se si intende solo ai picchi record, è possibile impostare un filtro passa-alto a 300 Hz, che si attenua le componenti di frequenza inferiore del segnale. Se dati grezzi e filtrati vengono registrati simultaneamente, questo aumenterà notevolmente la dimensione del file di dati. È sempre possibile fare offline filtraggio dei dati grezzi. Per ridurre i dati dimensioni uno possono anche limitare microelettrodi da cui al record (ad esempio, soli microelettrodi all'interno Microscanalature). - Fare clic su Avviare DAQ per avviare l'acquisizione dei dati. Controllare se il display visualizza in esecuzione tracce di attività e avviare la registrazione.
Nota: Il livello di rumore è di solito leggermente superiore in microelettrodi corrispondente le Microscanalature. Se il livello di rumore è troppo alto (ampiezza picco-picco > 50 µV) o instabile in parecchi microelettrodi, potrebbe essere a causa di sporcizia che ostacolano un buon contatto di pin-pad. Questo problema è solitamente risolto pulendo delicatamente le pastiglie di contatto MEA e i perni di preamplificatore utilizzando un batuffolo di cotone inumidito con etanolo al 70%. - Aprire il file registrato nel software di analisi (Vedi Tabella materiali) per esplorare rapidamente i dati.
6. analisi dei dati
Nota: La procedura seguente mostra come utilizzare il software di µSpikeHunter, uno strumento computazionale sviluppato al laboratorio di Aguiar (liberamente disponibile su richiesta via e-mail a pauloaguiar@ineb.up.pt), per analizzare i dati registrati con µEF. Un'interfaccia utente grafica (Figura 2) viene utilizzata per caricare i dati, identificare i materiali di propagazione punto fluttua, determinare la loro direzione (anterograda o retrograda) e stimare la velocità di propagazione. µSpikeHunter è compatibile con file HDF5 generati da registrazioni ottenute mediante sistemi di MEA2100-famiglia, che possono essere utilizzati in combinazione con 60 - 120- e 256-elettrodo MEAs. Le registrazioni ottenute utilizzando lo sperimentatore multicanale possono essere facilmente convertite in file HDF5 usando software liberamente disponibile (Vedi Tabella materiali).
- Fare clic su Sfoglia per selezionare il file di registrazione. Quindi, fare clic sul pulsante Info File per elencare la frequenza di campionamento, la durata della registrazione, nonché un elenco dei flussi di dati registrati (ad es., dati grezzi, dati filtrati).
Nota: Per le valutazioni di velocità di propagazione vero, si consiglia di selezionare il flusso di dati non elaborati per l'analisi. - Selezionare microelettrodi (singola riga o colonna associata microsolco) per analisi e impostare il valore di soglia di rilevamento di picco (fase positiva o negativa) alle 6 volte la deviazione standard (SD) di segnale rumore. Fare clic su Leggi dati per applicare il rilevatore di evento e ottenere le sequenze di propagazione identificati.
Nota: Se i criteri sono soddisfatti, un elenco di sequenze rilevate propagazione popolerà il pannello di analisi. L'utente può quindi visualizzare e interagire con diversi strumenti di analisi per la sequenza di propagazione, incluse tracce di tensione Inter-microelettrodo cross-correlazioni, velocità di propagazione di singolo-sequenza, un kymograph e uno strumento di riproduzione audio. Anche se la stima di velocità di propagazione può essere ottenuta per qualsiasi coppia di microelettrodi o come la media delle stime per tutte le coppie, questa stima è più affidabile se è selezionata la coppia più lontana. - Ripetere il passaggio precedente per gli insiemi di microelettrodo di interesse. Ogni volta fare clic su Salva tutti gli eventi per salvare il tempo e l'ampiezza delle punte (su ciascuno dei microelettrodi) per tutte le sequenze di propagazione identificati in un file CSV.
- Importare i file CSV in ambienti di analisi di dati per ulteriori analisi dei pattern di attività della cultura (per esempio, rateo, Inter-spike intervalli).
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Representative Results
Mediante il protocollo descritto qui, i neuroni corticali del ratto E-18 seminati su µEF sono in grado di sviluppare e rimanere in buona salute in queste condizioni di coltura per più di un mese. Appena 3-5 giorni nella cultura, i neuroni corticali crescono loro assoni attraverso Microscanalature verso il compartimento axonal di µEF (Figura 1). Dopo 15 giorni nella cultura, neuroni corticali coltivati su µEF sono tenuti ad esporre i livelli costanti di attività e propagazione dei potenziali d'azione lungo le Microscanalature è previsto. Più vecchie colture (> 14 DIV) tendono ad essere dominato da scoppio di attività come convenzionale MEA registrazioni18,19.
Registrazioni e analisi dei dati
Analisi di dati grezzi con µSpikeHunter (Figura 2) ha permesso la rilevazione e l'estrazione di propagazione delle onde di spike lungo set di 4 microelettrodi (all'interno di Microscanalature). Nella figura 3 viene visualizzato uno di questi eventi. µSpikeHunter ammessi per la stima della velocità di propagazione, basato sulla cross-correlazione tra le forme d'onda di tensione selezionato paia di microelettrodi (fornendo un tempo di ritardo) e la distanza di Inter-elettrodo nota associata.
I dati estratti è stata ulteriormente analizzati utilizzando codice personalizzato progettato in MATLAB. Una trama raster rappresentativi della propagazione delle onde lungo 11 (su 16) di spike Microscanalature è mostrato nella Figura 4a. Il tasso di infornamento istantanea per un alto - e una bassa attività microsolco è mostrato in Figura 4b.
Registrazioni di µEF presentano diversi livelli di attività al microelettrodo. Diversi microelettrodi nel vano di somali sono frequentemente, "silenziosi". Tuttavia, la maggior parte dei microelettrodi all'interno Microscanalature tendono ad essere attivi (Figura 5a). Esso è ben descritto che le Microscanalature funzionare come segnale amplificatori8. L'ampiezza di un segnale registrato dipende non solo sulla dimensione delle correnti di origine, ma anche la resistività del mezzo circostante. La resistenza lungo un microsolco è particolarmente elevata, che aumenta notevolmente l'ampiezza dei segnali misurati rispetto a quelle dei microelettrodi nel vano somali (Figura 5b).
Figura 1 . Neuroni corticali del ratto embrionale coltivati su µEF. (a) fotografia di µEF. Barra della scala: 1cm (b) immagine rappresentativa dei neuroni corticali coltivate nella µEF per 5 giorni, mostrando diversi assoni attraversando le Microscanalature e raggiungendo il vano assonale (frecce). Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Screen capture dell'interfaccia utente grafica principale µSpikeHunter. L'utente può caricare i dati registrati con µEF, identificare moltiplicazione punto fluttua, determinare la loro direzione (anterograda o retrograda) e stimare la velocità di propagazione. Uno strumento di kymograph consente all'utente di stimare manualmente la velocità di propagazione basata su una linea tracciata la kymograph. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Anterograda propagazione onda percepita da 4 microelettrodi (E8-E11) all'interno di un microsolco. Ogni traccia rappresenta una registrazione raw microelettrodo per MS. 3 dopo analisi con µSpikeHunter, la cross-correlazione tra la più lontani microelettrodi (E8 ed E11) consentito il calcolo di una velocità di propagazione di 0,52 m/s. , fare clic qui per Mostra una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Diga di informazioni attraverso le Microscanalature. (a) rappresentante raster plot di 2 minuti di attività spontanea registrati lungo 11 Microscanalature. Ogni punto rappresenta una moltiplicazione punto fluttua (unità) rilevato da 4 microelettrodi e identificati attraverso l'analisi con µSpikeHunter. Un'alta e una bassa attività microsolco sono evidenziati in giallo e rosso, rispettivamente. (b) evoluzione del tasso di infornamento istantanea (come nel tasso di codifica) per le Microscanalature evidenziati due lungo 10 minuti. Sola unità di moltiplicazione sono state considerate per il calcolo del tasso di infornamento. Nota la sincronizzazione di attività, nonostante i diversi livelli dei tassi di infornamento. Il tasso di infornamento istantanea è stato calcolato convoluzione gli eventi spike con un kernel gaussiano con una deviazione standard di 100 ms. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Qualità delle registrazioni extracellulari in µEF. (a) finestra di tempo (1 secondo) di una registrazione µEF (neuroni corticali del ratto al 15 giorni in vitro) con una frequenza di campionamento di 20 kHz e un filtro passa-alto a 300 Hz. righe di elettrodo da 1-7 corrispondono ai somali vano e righe 8-11 per le Microscanalature. (b) Box and whisker trama dell'intera gamma di ampiezze di spike estratte (picchi rilevati usando un metodo di soglia, con fase negativa solo, fissato a 6 deviazione standard di x) dalle righe specificate (tempo totale di registrazione di 10 minuti). Le ampiezze dei picchi sono significativamente più grandi in microelettrodi all'interno Microscanalature (righe 8-11; 16 Microscanalature), rispetto ai microelettrodi del compartimento somali (righe 1-7; 16 microelettrodi attivi). One-way ANOVA, Dunn di più test di confronto, * * *p < 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato qui Mostra come assemblare un µEF, composto da un dispositivo microfluidico e un MEA con disegni standard disponibile in commercio e come analizzare i dati registrati.
Quando si progetta un esperimento, i ricercatori devono tener conto che il modello in vitro è limitato dalla griglia fissa MEA, che vincola il microsolco accordi. L'uso di un particolari microfluidici o MEA design dipenderà molto le esigenze sperimentali specifiche ma, in generale, la stessa procedura di procedura dovrebbe applicarsi alle configurazioni diverse µEF.
Una decisione critica da effettuarsi prima del µEF assembly se l'utente intende riutilizzare il µEF assemblato in futuro gli esperimenti. Trattamento con plasma ad ossigeno su entrambe le superfici può essere fatto per legare covalentemente dispositivi microfluidici a MEAs20. Tuttavia, questa tenuta spesso rende i chip MEA inutilizzabile per ulteriori esperimenti, come lo scollegamento del dispositivo microfluidico irreversibilmente danneggia lo strato di passivazione. Per aggirare questo problema, gruppi di ricerca tendono a riutilizzare il µEF montato, nonostante gli inconvenienti possibili (ad es., detriti da precedenti esperimenti). Seguendo attentamente la procedura descritta in questo protocollo, da esperimento a esperimento, si può tranquillamente collega e scollega dispositivi microfluidici senza danneggiare il MEA.
L'uso di µEF permette l'isolamento di un insieme di assoni all'interno le Microscanalature. Il tempo richiesto per un numero ragionevole di assoni ad attraversare le Microscanalature dipenderà molto la semina procedura, vale a dire cella seminato densità cellulare. Utilizzando la densità specificata nel presente protocollo, i neuroni utilizzano per attraversare l'intero microsolco entro 3 a 5 DIV.
A seconda dell'ambiente di coltura (cioè, incubatore e livello di umidità), potrebbe essere necessario sostituire il supporto ogni 2 o 3 giorni di cultura. Al momento del rinnovo media, rimuovere il supporto dai pozzi di µEF pur mantenendo media all'interno i principali canali. Poi, delicatamente aggiungere media dei pozzetti µEF facendolo fluire lentamente attraverso i principali canali prima di riempire i pozzetti con volume finale media. Seguendo questi consigli, siamo in grado di mantenere queste culture in condizioni sane per almeno un mese.
Un vantaggio chiave di questa piattaforma è la capacità di isolare, misurare e monitorare segnali assonali. Anche se la registrazione di µEF è semplice, la grande quantità di dati che possono essere generati è scomodo da gestire e richiede una buona conoscenza di analisi dei dati. Il software di analisi utilizzato qui, µSpikeHunter21, è un avanzato ma intuitivo strumento di calcolo, che consente la quantificazione dettagliata di diverse misure (ad es., propagazione eventi, velocità di propagazione ecc.) correlate a a pochi passi. Anche se l'analisi dei dati non è il fuoco di questo protocollo, le informazioni qui fornite già permettono l'estrazione di dati significativi da una registrazione di µEF. Tuttavia, è importante notare che l'isolamento affidabile di un singolo assone a microsolco rimane impraticabile. Così, le forme d'onda di picco molto complesso (a causa di più assoni passando attraverso il microsolco) possono sorgere e influenzano i tempi di spike e i calcoli di velocità di propagazione. Questa limitazione può essere attenuata utilizzando Microscanalature molto stretta (inferiore a 5 µm)13 e/o tramite spike ordinamento tecniche21, che aiutano a distinguere le fonti di segnale differenti.
Anche se in vitro culture non possono riassumere la complessità completo in vivo , loro combinazione con µEF permette approcci di ricerca bottom-up ben controllato. Ci auguriamo che questo protocollo aiuterà i principianti e utenti MEA competenti stabilire modelli nuovi ed affidabili per lo studio elettrofisiologico comunicazione in circuiti neuronali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata finanziata da FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento fondi regionali fino al 2020 la COMPETE - Operacional programma per la competitività e l'internazionalizzazione (POCI), 2020 di Portogallo e dal portoghese finanzia attraverso FCT - Fundação para un Ciência e un Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior nel quadro del progetto PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus è stato sostenuto da FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar è stata sostenuta da Ciência Programa - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - promozione del lavoro scientifico, FSE e MCTES e programma Investigador FCT, POPH e Fundo Social Europeu. I dispositivi microfluidici furono fabbricati presso INESC - microsistemi e nanotecnologie, in Portogallo, sotto la supervisione di João Pedro Conde e Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
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