Summary
このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。
Abstract
微小電極アレイ (Mea)生体外で神経機能研究に活躍しています。これらのデバイスは、長時間同時非侵襲的な記録/電気生理学的活性化を許可します。コミュニケーションを理解し、信号を神経回路網の伝搬しようとしたとき、すべての電極の周りのすべてのソースからの信号を検出のプロパティは不利ななります。神経ネットワークのいくつかのニューロンは、同時にアクティブにできるし、差別し、信号伝搬特性を追跡しにくく、重複する活動電位を生成することができます。この制限を考慮して分離し、高分解能を持つ軸索信号を増幅することができる電気生理学的コミュニケーションの評価に焦点を当てた体外セットアップを設けています。マイクロ流体デバイスと意味のインタ フェースで我々 は軸索と電極の配置の制御された神経の文化を区分することができます。このセットアップでは、数週間のコース上高い信号対雑音比とスパイクの伝搬の録音ができます。特殊なデータ解析アルゴリズムを組み合わせると、いくつかの通信の詳細な数量を提供しています前向性スパイク発火率、伝導障害伝播速度などの関連プロパティおよびコーディングのメカニズム。
このプロトコルは、基板統合測定上区分神経文化セットアップを作成する方法、このセットアップで神経細胞を培養する方法と正常に記録、分析およびそのような実験の結果を解釈する方法を示します。ここでは、神経回路および軸索の信号伝搬特性の理解を確立されたセットアップが簡略化する方法を示す.これらのプラットフォームは、ニューロン ネットワークの設計および制御可能な地形での in vitroモデルの新しい道を開きます。彼らは、同種の神経文化または共同文化構成、たとえば、感覚ニューロンと他の細胞型との間の通信は監視は、評価のコンテキストで使用できます。このセットアップは、神経発達、神経回路、コーディング、神経変性と再生に関するアプローチの情報を勉強する非常に興味深い状態を提供します。
Introduction
神経回路における電気通信を理解することは、通常の機能を明らかにし、機能不全に対処するための治療戦略を考案する基本的なステップです。ニューロンは、統合、計算し、細い軸索に沿って伝播活動電位 (APs) を中継します。従来の電気生理学的手法 (例えば、パッチク ランプ) は神経細胞の活動を研究するための強力な技術が、細胞体や樹状突起などのより大きい細胞構造に制限が多い。イメージング技術を提供高空間分解能、軸索信号を研究する代わりに、彼らが技術的に困難な実行し、長期の測定値1を許可しません。この文脈において微小電極アレイ (Mea) とマイクロ流体の組み合わせ2 培養神経回路網内の neuron´s 活動と信号伝送の基本特性を明らかに強力な貢献が出来る,3。
MEA 技術は、神経細胞培養の細胞外記録に依存します。この電気生理学的手法の主な利点は、長期的な同時刺激と非侵襲的方法3複数のサイトでの記録をサポートする能力です。Mea は、ガラス基板に埋め込まれた生体適合性、高い導電性と耐腐食性の電極から成っています。従来の携帯文化バイオ-コーティング、大幅細胞接着を促進することによって基板とセルの3,4間シールの抵抗になると互換性があります。また、彼らはデザインで汎用性が高く、電極のサイズ、形状、密度の異なる場合があります。全体的にみて、Mea は、同時のライブ イメージング、電気生理学的刺激の録音を許可の利点と従来の細胞培養容器として働きます。
MEA 技術の使用は、ニューラル ネットワークの5の重要な機能の研究に貢献しています。しかし、コミュニケーションと神経回路における Ap 伝搬を研究するため測定のパフォーマンスを制限する固有の機能があります。Mea は、単一細胞と軸索のようなも細胞レベル下の構造からの録音を有効にするが、ヒヨコの信号と比較して、軸索の信号を持って非常に低い信号対雑音比 (SNR)6。また、すべての電極の周りのすべてのソースからの細胞外の電位を感知の特徴は、神経回路の信号伝達特性のトラッキングを妨げます。
最近の研究より良い記録条件に軸索が育てることができる狭いマイクロ流路内で配置電極を持っていることによって得られること、ただし、実証しています。この構成により、sn 比の大幅な増加など、簡単にすることができます軸索信号を伝搬する検出7,8,9,10、11,12、 13。MEA 技術とマイクロ流体デバイスを同盟の戦略は、電気的に絶縁の微小環境軸索信号11を増幅する適切なを作成します。また、microgroove に沿って複数の検出電極の存在は軸索の信号伝搬特性の検出と評価のための基礎です。
ニューロン ネットワークの非常に制御可能な地形とそのような体外プラットフォームは、多くの研究の質問14に適応できます。これらのプラットフォームは神経文化のコンテキストで使用されること適したが、エンジニアの共同文化構成、神経細胞と他の細胞型との間の通信を監視および評価することができますに拡大することができます。このセットアップは、したがって多くの神経発達、神経回路、情報コーディング、神経変性と再生に関するなど神経関連研究を探検する非常に興味深い条件を提供します。さらに、ひと誘導多能性幹細胞15,16の新たなモデルとの組み合わせでは、神経系に影響を与える人間の病気のための潜在的な治療法の開発に新たな道を開くことができます。
私たちの研究室携帯電話やネットワークのレベルとその意義の生理・病態神経系で神経プロセスを理解する電極を組み合わせてマイクロ (µEF) このプラットフォームを使用してください。基板統合測定区分神経文化を作成する方法を示しますこの議定書の目的は、神経科学の分野でこのようなプラットフォームの値を指定すると、このプラットフォームで正常に録音する方法培養ニューロンの作り方分析し、そのような実験の結果を解釈します。このプロトコルは、情報伝達における神経文化の実験のツールボックスを豊かに確かに。
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Protocol
( Decreto レイ113/2013 で立法はポルトガル語に転置) 欧州連合 (EU) 指令 2010年、63、EU によると動物を含むすべてのプロシージャを行った。実験的プロトコル (0421/000/000/2017) は、特定のポルトガル語に公式機関動物福祉と実験 (Direção ジェラール山脈・ デ ・ Alimentação e Veterinária - DGAV) の両方のホスト機関の倫理委員会で承認されました。
1. 文化メディアとその他のソリューションの準備
注: はたて当日使用のコーティング溶液を準備します。未使用のコーティング溶液及び培地は、下記のとおり 4 ° C または-20 ° C で保存されるかもしれない。
- 0.05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) 実用的なソリューションの 10 mL を準備します。
- 精製 PEI を溶解することにより 0.25% (w/v) ペイ原液 20 mL を準備 (材料表参照) 滅菌水で。
- 8 mL の滅菌蒸留水に 0.25% (w/v) ペイ原液 2 mL を希釈します。よく混合し、使用します。未使用の溶液は 4 ° C で保存できます。
- 5 μ g/mL ラミニン溶液 1 mL を準備します。
- 基本培地の 995 μ L で 1 mg/mL ラミニン原液の 5 μ L を希釈 (材料の表を参照してください)。よく混合し、使用します。未使用ソリューションは、-20 ° C で 1-2 週間冷凍保存できます。
- HEPES バッファー ハンクの平衡塩溶液 (H HBSS) の 1 リットルを準備します。
- 50 mL の純水に粉末を HEPES 11.9 g を溶解することにより 1 M HEPES 溶液を準備します。7.2 pH を調整します。
- 800 mL の純水に 5.6 mM グルコース、0.3 mM ナトリウム リン酸水素 138 mM 塩化ナトリウム 0.44 mM リン酸-カリウム 5.33 mM 塩化カリウムを溶解することにより (カルシウムとマグネシウム) なし H HBSS ソリューションを準備します。
- 1 M HEPES 溶液 (15 mM の最終的な集中) 15 mL を追加します。
- 0.2 0.3 pH 調整目的 pH 7.4 1 を使用して以下のユニット N の塩酸または水酸化ナトリウム N 1。最終的な解決の容積を構成する超純水を追加します。
ろ過中に上昇する傾向に pH に注意してください。 - 0.22 μ m の気孔率 poly(ether sulfone) (PES) 膜を用いたろ過滅菌します。
- 10 mL を準備 H HBSS の 10% を含む熱非動化ウシ胎児血清 (hiFBS)。
- HiFBS H HBSS 9 mL に 1 mL を希釈します。よく混合し、使用します。未使用のソリューションは、3-4 週間の 4 ° C で保存できます。
- 1.5 mg/mL の 5 mL のトリプシン溶液を準備します。
- 使用前にすぐに H HBSS の 5 mL のトリプシンの 7.5 mg を溶解します。0.22 μ m の気孔率の PES 膜を用いたろ過滅菌します。
- 補われた媒体の 50 mL を準備します。
- 50 mL のコニカル チューブ ミックス基礎培地の 48.5 mL (材料の表を参照)、2% (v/v) B-27 サプリメント 0.5 mM L グルタミンそして 1% ペン/連鎖球菌 (10,000 U/mL ペニシリンおよび 10,000 μ g/mL ストマイ)。補われた媒体は、3-4 週間の 4 ° C で保存できます。
2. マイクロ流体と MEA デバイスの準備
注: セル播種前日に 2.1 2.11 の手順に従います。
- きれいなマイクロ流体デバイス作製とビニール テープを使用して他の残骸を削除します。デバイスのすべての領域に到達するデバイスに対してテープを軽く押します。
- 空気プラズマ クリーニング 3 分 (0.3 mbar) の表面をきれいにし、それを親水性の MEA。
- 簡単に 70% エタノールでマイクロ流体デバイスが水没し、層流フードの内部空気乾燥させます。
- 滅菌 90 mm シャーレ内各 MEA を置き、15 分間の紫外線 (UV) 照射によって殺菌しなさいそれら。
- 37 ° C で少なくとも 1 h の 0.05% (v/v) ペイ ソリューションの 500 μ L での孵化によって MEA 中央表面積をコートします。
注:17の他の人が説明したとおり、MEAs の PEI コーティングの poly(lysine) コーティングを使用してより少ないセルに結果します。 - MEA 表面からプリンスエド ワード島塗液を吸引させ、測定 4 x 1 ml の滅菌蒸留水します。電極が損傷することができますこの手順を洗う時に MEA の表面には触れないように注意します。
- 層流フードの内部実体顕微鏡に導かれ、センターの MEA チップ、MEA の中央の領域に 1 mL の滅菌水を追加します。
- マイクロ流体デバイス MEA 表面の上に置きます。
- 慎重に MEA の電極グリッドとマイクロ流体デバイスの溝を合わせます。
- 正しく揃うと、慎重に MEA やマイクロ流体デバイスに触れることがなく余分な水分を吸引します。
- 一晩乾燥し完全な付属品を許可する 37 ° C で µEFs を孵化させなさい。添付ファイルを容易にするために軽く押して、MEA に対してマイクロ流体デバイス。
注: は、細胞播種日 2.12 のステップを実行します。 - µEFs を完全に乾燥して、150 μ L の 5 μ g/mL ラミニン コート液とマイクロ流体井戸を読み込まれ、細胞を播種する前に少なくとも 2 時間の 37 ° C で孵化させなさい。
注: ラミニン溶液で µEF をロードするときは、ソリューションが溝を埋めることを確認します。真空を使用すると、溝の中に存在する可能性があります任意の空気の泡を削除できます。
3. 前頭前皮質の解剖
- 胚が除去の郭清範囲を準備します。
- 作業面の 70% エタノール手術器具を消毒します。
注: この解剖は無菌操作、消毒は汚染のチャンスを減らすのに役立ちます。 - 郭清範囲を閉じ込めると、胚が除去の手術器具をレイアウト、きれいなおむつを使用します。
- 冷たい H HBSS でいっぱい 4 90 mm シャーレを準備し、郭清範囲の近くに氷が付いている皿の上に置きます。
- 作業面の 70% エタノール手術器具を消毒します。
- 二酸化炭素 (CO2) 吸入による E-18 時間妊娠 Wistar ラットを安楽死させます。
- プロシージャが完了したら、CO2チャンバーから動物を削除し、安楽死、デスメタルなどの二次的な方法で死を確認します。
- 使い捨ておむつの上に動物の腹側を配置、下腹部を 70% エタノール スプレーし、鉗子、はさみの助けを借りて、子宮を公開する、皮膚を切って U 字型を作ります。
- 慎重に胚を子宮から離れて任意の結合組織を切断することによって削除し、冷たい H HBSS でペトリ皿のいずれかに配置します。
- それぞれの胚を胚嚢から削除し、鉗子、はさみの助けを借りて、胎児の首をはねます。
- Embryo´s 頭を冷 H HBSS でいっぱい 2 番目ペトリ皿に転送します。
- それぞれの胚の 3.6 3.7 の手順を繰り返します。
- 前頭前野を解剖します。
- Embryo´s 頭をペトリ皿 3 分の 1 に転送します。
- ピンセットのペアを使用して、脳を公開します。
- その空洞から脳を外し、冷たい H HBSS でそれをカバーします。
- 存在する場合、削除し、嗅球を破棄します。前頭前野を解剖し、髄膜を削除します。
- 冷たい H HBSS でいっぱい 4 ペトリ皿に前頭前野のフラグメントを転送します。
- 3.9.1 3.9.5 各胚のための手順を繰り返します。
4. 大脳皮質ニューロンの解離と µEF の文化
注: 次の手順は、層流フードの内部実行 15 分サイクル UV 殺菌の後。ボンネット内に配置すべての材料と同様に、表面積を作業する必要があります以前の 70% エタノール消毒すること。
- 1.5 の手順で説明するよう以前加重トリプシン H HBSS の 5 mL に溶解し、ソリューションをフィルターします。
- 以前 H HBSS の 5 mL の合計で解剖皮質部分を収集します。滅菌 15 mL の円錐管に転送します。
- 皮質の断片を含むチューブに作りたて 1.5 mg/mL のトリプシン溶液の 2.3 mL を追加します。
- 懸濁液を混合し、37 ° C、15 分インキュベート (簡潔に攪拌 5 分ごと)。
- 組織の消化を停止し、トリプシンを洗い流します。
- トリプシンを含む上清を捨てます。残りのトリプシンを不活化する H HBSS 含む 10% hiFBS 5 mL を追加します。軽く振りま します。
- 落ち着くし、上澄みを廃棄し、皮質の断片をしましょう。
- HiFBS 残基を削除する H HBSS の 5 mL を追加します。皮質フラグメント落ち着くし、上澄みを廃棄しなさい
- 再度 H HBSS の 5 mL と皮質の断片を洗います。
- 皮質フラグメント落ち着くし、上澄みを廃棄しなさい補われた神経細胞培地 5 mL を追加します。
- 機械的に 5 mL の血清学のピペットを持つ皮質フラグメントを切り離して考えるの上下にゆっくりとピペッティングにより 10-15 回。必要な場合は、細胞懸濁液が均質になるまで小口径ピペットを使用して手順を繰り返します。
- 残りの微量の組織を破棄するには、細胞懸濁液トラフ 40 μ m の細胞のストレーナーをフィルタ リングします。
- 実行可能なセルをカウントし、細胞密度を決定します。
- マイクロ チューブ、0.4% (w/v) トリパン ブルー 20 μ L 細胞懸濁液 20 μ L を追加します。磨砕液をよく混合し、10 μ L をカウント部屋ノイバウアーに転送します。
- 実行可能なセルをカウントし、実行可能なセルの細胞密度を決定します。
- 107セル/mL x 3.6 細胞密度を調整する (必要な場合、細胞懸濁液を遠心分離)。
- 細胞播種の直前に、µEF のすべての井戸からラミニン コーティングを削除します。µEF 軸索コンパートメントの各ウェルに補われた媒体の 50 μ L をピペットします。
- µEF ヒヨコ コンパートメントに細胞懸濁液 5 μ L をシードします。基板には添付ファイルのセルに 1 h、37 ° C で孵化させなさい。
- 軽く埋めるそれぞれ温め補われた培地で µEF のも。37 ° c 5% CO2付属の加湿器インキュベーター、µEF に転送します。
注: クイック培養培地の蒸発を避けるためには、µEF を運ぶシャーレの中の水で満たされた開かれたチューブを配置します。 - 文化のすべての 2-3 日培養培地の 50% を置き換えることで、必要な期間の文化を維持します。
注: 実験の後マイクロ流体は取外し可能測定から一晩水に µEF を浸すことによって。必要な場合、鉗子の助けを借りて、マイクロ流体は慎重にはがします。Mea は一晩培養 1% (v/v) 商業酵素洗剤で洗浄できます (材料の表を参照してください)。
5. 自発神経活動の記録
注: MEAs の萌芽期の大脳皮質ニューロンの文化の中には 7 日体外 (DIV) を取るが、2-3 週間 (14-21 部) 成熟し、展示する安定した活動と同時に通常自発を展示します。研究の目的を用いた電気生理学的測定を開始するタイミングを決定する実験者次第です。商業記録システムを使用してこのプロトコルで µEF から神経細胞活動の記録を実証 (ハードウェア詳細については材料の表を参照)、加熱モジュールを組み込みます。自由に利用できるソフトウェアを用いて録音を行うため (詳細についてはソフトウェアの材料表を参照)。
- 記録システム ・温度コント ローラー MEA をオンにし、37 ° C に到達する前置増幅器の温水のベース プレートを許可します。
注: 長期的な録音のため (> 一度に 30 分) 1 つは CO2の大気を保持しているシステムにする必要があります。 - プリアンプ (パッチアンプ用アダプター) に、µEF を配置します。
注: は、MEA チップがエッジを左上の参照番号と正しく揃っていることを確認します。用いて MEA チップは回転対称形が、このアライメント電極が、ハードウェア Id のピン配置の正しい向きに一致します。 - プリアンプ蓋のラッチを閉じて。
- 記録は、記録ソフトウェアを開き、記録パラメーターと (記録方式をセットアップする方法の詳細についてはソフトウェアのマニュアルを参照) の記録されたデータ ストリームのパスを定義します。
注: 20 kHz のサンプリング レートで集録は一般に十分なほとんどのアプリケーションです。高いサンプリング周波数スパイク タイミングでより高い精度が必要な場合はお勧めです。1 つはレコードのスパイクのみにしようとする、信号の低周波成分を減衰 300 Hz でハイパス フィルターを設定します。生およびフィルター処理されたデータが同時に記録されている場合データ ファイルのサイズが大きく広がります。生データのオフライン フィルタ リングを行うことは常にです。データを削減するには、ファイル サイズ 1 電極から記録 (溝内唯一電極など) を制限できます。 - データ集録を開始する開始 DAQをクリックします。活動と記録の開始の実行しているトレースを表示するかどうかはチェックしてください。
注: 騒音レベルは通常は溝に対応する微小電極でわずかに高いです。騒音レベルが高すぎる場合 (ピーク-ピーク振幅 > 50 μ V) または良い pin パッドの接触を妨げる汚れによる非定常複数の電極で、かもしれない。この問題は、通常 MEA 接触パッドと 70% のエタノールで湿らせた綿棒を使用してプリアンプ ピンを優しくクリーニング。 - 解析ソフトウェアで録音したファイルを開く (参照材料表) データを迅速に探索します。
6. データの分析
注: 次の手順は、µSpikeHunter ソフトウェア、µEF で記録されたデータを分析する (pauloaguiar@ineb.up.pt を求める電子メールに自由に利用できる)、aguiar 氏の研究室で開発した計算ツールを使用する方法を示します。グラフィカル ユーザー インターフェイス (図 2) を使用してデータを読み込む、スパイクに伝播する波を識別、その方向を決定する (前向性か逆行) 伝播速度を推定し、。µSpikeHunter は、60、120、および 256 電極測定と組み合わせて使用することができます MEA2100 家族システムを用いての録音から生成された HDF5 ファイルと互換性が。HDF5 ファイルを自由に利用できるソフトウェアを使用してマルチ チャネル実験者を用いて録音を簡単に変換できる (材料の表を参照してください)。
- 記録ファイルを選択する参照をクリックします。サンプリング レート、録音時間、録音データ ストリーム (例えば、生データ、フィルター処理されたデータ) の一覧を表示する [ファイル情報」ボタンをクリックします。
注: 真伝搬速度推定のため勧めします分析生データ ストリームを選択します。 - 分析のための電極 (単一行または microgroove に関連付けられた列) を選択し、信号ノイズの標準偏差 (SD) x 6 でスパイク検出しきい値 (正または負のフェーズ) を設定します。データの読み取りイベント検出器を適用し、特定された伝搬シーケンスを取得するをクリックします。
注: 条件を満たしている場合、検出された伝播のシーケンスの一覧は [解析] パネルを設定します。ユーザーは、表示し、およびトレース、電圧、電極間の相関、単一シーケンス伝播速度、kymograph オーディオの再生ツールを含む伝搬シーケンスのいくつかの解析ツールと対話できます。伝搬速度の推定は、電極のまたはすべてのペアの見積もりの平均値として任意のペアを得ることが、この推定は最も遠いペアを選択した場合より信頼性の高い。 - 興味の電極セットの前の手順を繰り返します。CSV ファイルにすべての識別された伝搬シーケンス (、電極のそれぞれ) に時間とスパイクの振幅を保存するすべてのイベントを保存をクリックするたびに。
- 文化 (例えば発火、スパイク間間隔) の活動のパターンのさらなる分析のためのデータ解析環境に CSV ファイルをインポートします。
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Representative Results
ここで説明されているプロトコルを使用して、µEF でシード E-18 ラット大脳皮質ニューロンが開発し、1 ヶ月以上のこれらの培養条件で健康を維持することができます。文化では、3 〜 5 日早く皮質ニューロンは µEF (図 1) の軸索のコンパートメントに向かって溝を通して成長します。15 日間培養後 µEF 上で培養した大脳皮質ニューロン活動の安定したレベルを示すことが予想が、溝に沿って活動電位の伝搬が期待されます。古い文化 (> 14 DIV) 従来 MEA 録音18,19のようにアクティビティのバーストによって支配される傾向にあります。
録音およびデータ分析
µSpikeHunter (図 2) と生データの分析は、検出および抽出 (溝) 内 4 電極のセットに沿ってスパイク波を伝搬するを許可しました。図 3には、これらのイベントのいずれかが表示されます。µSpikeHunter 電極 (遅延時間を提供する) のペアを選択の電圧波形と関連付けられている既知の電極間距離との間の相互相関に基づく伝播速度の推定を許可します。
抽出したデータを MATLAB のカスタム設計されたコードを使ってさらに行った。伝播の代表的なラスター プロット スパイク (16) のうち 11 に沿う波溝は、図 4 aに示すように。高と低活動 microgroove の瞬時発火率を図 4 bに示します。
µEF 録音は、電極ごとの動作のさまざまなレベルを示します。頻繁に、ヒヨコの区画に複数の電極が「サイレント」です。ただし、溝の内でほとんどの電極が活躍する傾向がある (図 5 a)。溝が信号増幅器8として機能することをよく説明されています。記録された信号の振幅は、ソース電流の大きさだけでなく周囲のメディアの抵抗にも依存します。Microgroove に沿って抵抗は、特に高いに比べてヒヨコ コンパートメント (図 5 b) の電極の測定信号の振幅を大幅に増加します。
図 1.萌芽期ラット大脳皮質ニューロンの µEF 上で培養しました。(a) µEF の写真。スケール バー: 1 cm。 培養、µEF で 5 日間、溝を渡ると軸索のコンパートメント (矢印) に達するいくつかの軸を示す皮質ニューロンの(b)の代表的なイメージ。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.µSpikeHunter の主要なグラフィカル ユーザー インターフェイスのスクリーン キャプチャします。ユーザーことができます µEF で記録されたデータを読み込む、スパイクに伝播する波を識別、その方向を決定する (前向性か逆行) 伝播速度を推定し、。Kymograph ツールでは、ユーザーを手動で、kymograph 上の線に基づく伝播速度を推定することができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.前向性伝搬スパイク波 4 電極 (E8 E11)、microgroove 内で感知します。各トレースを表す 1 つ電極 raw 記録 3 さんの µSpikeHunter の解析を行った後、最も遠い電極 (E8 と E11) 間の相互相関許可 0.52 m の伝搬速度の計算/s.してくださいここをクリックしてこの図の拡大版を表示します。
図 4.溝を通じて情報弾幕。(a)代表ラスター プロット 2 分の自発活動の記録 11 溝に沿って。各ドットは、伝搬スパイク波 (単体) 4 電極によって検出され、µSpikeHunter の分析によって識別を表します。高・低活動 microgroove それぞれ黄色と赤でハイライトされます。(b) 10 分に沿って 2 つの強調表示された溝 (レート符号化) のように瞬時発火率の進化。伝搬ユニットだけは発火率の計算のためと考えられました。メモ異なるにもかかわらず、アクティビティの同期発火率レベル。100 さんの標準偏差とガウス カーネルでスパイク イベントをたたみ込む瞬時発火率を算出この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.µEF の細胞外記録の品質。(a) 300 Hz。 電極行 1-7 ヒヨコのコンパートメントと行溝に 8-11 に対応で高域通過フィルターと 20 kHz のサンプリング レートで µEF 記録 (15 日間の in vitroラット大脳皮質ニューロン) の時間枠 (1 秒)。(b)スパイク振幅のフルレンジのボックスと、ウィスカのプロットは指定した行 (10 分の合計記録時間) から (スパイク 6 x 標準偏差で設定負相のみ、しきい値法を使用して検出) を抽出します。スパイクの振幅がヒヨコのコンパートメント (行 1-7; 16 アクティブ電極) の電極と比較して溝 (行 8-11; 16 溝) 内の電極の非常に大きい。一方通行 ANOVA、ダンの複数比較テスト * * *p < 0.0001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで提示されたプロトコルは、記録されたデータを分析する方法と、µEF、マイクロ流体デバイスと標準的な市販デザイン、MEA の構成を組み立てる方法を示しています。
実験を設計するとき研究者考慮しなければならない体外モデルがマイクログルーブ手配を拘束 MEA 固定グリッドによって制限されること。特定のマイクロまたは MEA の設計の使用の実験的ニーズが異なりますが、一般的には、同じ手順を実行する必要があります異なる µEF 構成に適用されます。
µEF アセンブリは、ユーザーが将来的に組み立てられた µEF を再利用しようとするかどうかの前に重要な意思決定の実験します。MEAs20マイクロ流体デバイスの共有結合に両面に酸素プラズマを用いた治療を行うことができます。しかし、このシールは頻繁になります MEA チップ、更なる実験に使用できなくなるパッシベーション膜の損害賠償不可逆的マイクロ流体デバイスをデタッチします。この問題を回避するために研究グループを (例えば、以前の実験から破片) の可能な欠点にもかかわらず、マウントされた µEF を再利用する傾向があります。に従って慎重に実験では、1 つすることができます安全にするための実験から、このプロトコルで説明されている手順のアタッチし、MEA を損なうことがなくマイクロ流体デバイスをデタッチします。
µEF の使用する軸索溝内のセットの分離。溝を交差する軸索の合理的な数に必要な時間が大きく細胞播種手順、すなわち播種細胞密度によって異なります。3 に 5 の内で全体マイクログルーブを横断するニューロンを使用してこのプロトコルで指定された密度を使用して、部
文化環境 (すなわちインキュベーターと湿度レベル) によってそれは文化のすべての 2 〜 3 日メディアを交換する必要があります。メディアを更新する場合は、メインのチャンネル内のメディアを維持しながら µEF 井戸からメディアを削除します。その後、優しくゆっくりと最終的なメディア ボリュームと井戸を充填する前にメイン チャンネルを通過することができます µEF の井戸にメディアを追加します。これらの推奨事項は、次の少なくとも 1 カ月の健康な状態でこれらの文化を維持することがおります。
このプラットフォームの主な利点は、分離、測定および軸索の信号を追跡する機能です。µEF 記録は簡単ですが、生成することができますデータの大量処理が面倒で、データ解析の知識が必要です。ここで使用する解析ソフト µSpikeHunter21は、高度なまだいくつかの詳細な定量化を可能にする直感的な計算ツール関連対策 (配布イベントなどや伝搬速度など)いくつかの手順を実行。データの分析は、このプロトコルの焦点ではない、ここで既に提供情報 µEF 記録から意味のあるデータを抽出できます。ただし、microgroove あたり単一軸索の信頼性の高い分離残る実行不可能であることに注意することが重要です。したがって、(のために複数の軸索 microgroove を通過) 非常に複雑なスパイク波形は発生し、スパイク タイミングと伝搬速度の計算に影響を与える可能性があります。この制限は異なる信号ソースを区別すること (5 μ m) 以下の非常に狭い溝13を使用しておよび/または技術21、スパイクによる減衰することができます。
体外培養における生体内で複雑さを要約できません、にもかかわらず µEF との組み合わせにより制御されたボトムアップ型研究のアプローチ。このプロトコルは初心者と熟練した MEA ユーザー神経回路の電気生理学的コミュニケーションを勉強するための新機能と信頼性のモデルを確立することに役立つと思います。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、フェダー - Fundo Europeu デ Desenvolvimento 競う 2020 年まで地域の資金によって融資された - FCT - カルーストを通じて競争力と国際化 (POCI)、ポルトガルの 2020 年とポルトガル語で Operacional プログラム資金パラ Ciência e、技術/Ministério da Ciência、技術 e Ensino 優れたプロジェクト PTDC/CTM-ナン/3146/2014 (POCI-01-0145-フェダー-016623) のフレームワーク。ホセ ・ C ・ マテウスは FCT (PD/BD/135491/2018 年) によって支えられました。サンパウロ aguiar 氏は、プログラム Ciência - プログラム Operacional ・ ・圏環境共生分野 (POPH) - 科学的な雇用促進、ESF と MCTES とプログラム Investigador FCT POPH とマイプ社会 Europeu によって支持されました。マイクロ流体デバイスをジョアン ペドロ コンデとバージニア州の朱の監督の下で INESC - サン ・ マイクロシス テムズ、ナノテクノロジー、ポルトガルで作製しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
