Summary
Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.
Abstract
Elektrot dizilerin (ölçü) yaygın olarak nöronal fonksiyon vitroincelemek için kullanılır. Bu cihazlar için uzun dönem eşzamanlı non-invaziv kayıt/stimülasyon elektrofizyolojik faaliyet izin. Ancak, her elektrot çevresinde tüm kaynaklardan gelen sinyalleri algılama özelliği iletişim anlamak ve nöronal devreler yayılmasında sinyal çalışırken olumsuz hale gelebilir. Nöronal ağ çeşitli nöronların aynı anda aktif olması ve çakışan Aksiyon potansiyelleri, ayrımcılık ve sinyal yayma izlemek üzere çıkarabilirsiniz. Bu sınırlama göz önüne alındığında, biz izole ve aksonal sinyalleri yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile yükseltmek yapabiliyor elektrofizyolojik iletişim değerlendirilmesi odaklı bir vitro Kur kurduk. Mikrosıvısal aygıtlar ve ölçü arabirim tarafından biz iyi kontrollü uyum akson ve microelectrodes nöronal kültürlerle bölümlendirirse edebiliyoruz. Bu kurulum birkaç hafta boyunca spike yayma yüksek sinyal gürültü oranı ile kayıtları verir. Özel veri analizi algoritmaları ile birlikte, çeşitli iletişim detaylı miktar sağlar ilgili yayılma hızı, iletim hatası, ateş oranı, Anterograd sivri gibi özellikler ve mekanizmaları kodlama.
Bu iletişim kuralı bir compartmentalized nöronal kültür kurulumu substrat entegre ölçü nasıl oluşturulacağı, nasıl bu kurulum nöronlarda kültür ve başarıyla kaydetmek, analiz etmek ve bu deneylerin sonuçlarını yorumlamak nasıl gösterir. İşte, nasıl kurulan Kur nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma anlayış kolaylaştırır göstermektedir. Bu platformlar yeni vitro modelleri ile mühendislik ve kontrol edilebilir nöronal ağ Topografyaları önünü. İçerikte homojen nöronal kültürlerin, ya da, örneğin, duyusal sinir hücreleri ve diğer hücre tipleri arasındaki iletişimi değerlendirildi ve izlendiği ortak kültür konfigürasyonları ile kullanılabilir. Bu kurulum, örneğin, çalışmaya açıkların, nöronal devreler, kodlama, ateş ve neuroregeneration yaklaşımlar bilgi çok ilginç koşullar sağlar.
Introduction
Nöronal devreler elektrik iletişimde anlayış normal fonksiyon açığa vurmak ve fonksiyon bozukluğu gidermek için tedavi stratejileri vasiyetle için temel bir adımdır. Nöronlar entegre, hesaplamak ve aksiyon potansiyelleri (APs) onların ince akson yaymak geçiş. Geleneksel elektrofizyolojik teknikleri (Örneğin, yama kelepçe) nöronal aktivite çalışmaya güçlü teknikleri vardır ama genellikle daha büyük hücresel yapılar, soma veya dendrites gibi sınırlıdır. Görüntüleme teknikleri teklif aksonal sinyalleri yüksek uzaysal çözünürlük ile çalışmak için bir alternatif, ama teknik olarak zordur gerçekleştirmek ve uzun vadeli ölçümleri1izin vermez. Bu bağlamda, elektrot dizilerin (ölçü) ve havacilik neuron´s etkinliği ve sinyal iletim nöronal ağlar vitro2 içinde temel özelliklerini ifşa içinde güçlü bir katkı yapabilir , 3.
MEA teknoloji nöronal kültürlerin ekstraselüler kayıtlarda dayanır. Uzun vadeli, eşzamanlı stimülasyon ve kayıt birden çok site ve non-invaziv yolu3desteklemek için onun yetenek bu elektrofizyolojik metodoloji başlıca avantajları şunlardır. Bana cam gofret alt katman içinde gömülü biyouyumlu, yüksek iletken ve korozyona dayanıklı microelectrodes yapılır. Bunlar geleneksel hücre kültür biyo-kaplamalar, hangi hücre adezyon önemli ölçüde teşvik substrat ve hücreleri3,4arasında sızdırmazlık direnç artışı ile uyumludur. Ayrıca, onlar tasarımında çok yönlü ve microelectrodes boyutu, geometri ve yoğunluğu değişebilir. Genel olarak, ölçü olarak geleneksel hücre kültür damarları eşzamanlı canlı görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar/dürtme izin avantajı ile çalışıyorum.
MEA teknolojinin kullanımı, sinir ağları5önemli özellikleri çalışma için katkıda bulunmuştur. Ancak, iletişim ve nöronal devre yayılmasında APs eğitimi için bana performansını sınırlayan doğal özellikleri vardır. Bana tek hücreleri ve aksonlar gibi bile hücre altı yapıları kayıtları etkinleştirir ancak somal sinyallere karşılaştırıldığında çok düşük sinyal-gürültü oranı (SNR)6aksonal sinyalleri var. Ayrıca, hücre dışı alan potansiyelleri her elektrot çevresinde tüm kaynaklardan gelen algılama karakteristik sinyal yayma nöronal devre izleme engellemektedir.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda, ancak, daha iyi kayıt koşulları içinde dar mikro içine aksonlar büyüyebilir uyumlu microelectrodes alarak elde edilebilir göstermiştir. Bu yapılandırma, öyle ki aksonal sinyaller yayma kolayca olabilir7,8,9,10,11,12SNR önemli bir artış tespit sağlar, 13. Bir elektriksel olarak yalıtılmış microenvironment aksonal sinyalleri11yükseltmek uygun mikrosıvısal aygıtları MEA teknolojisi ile İttifakı gayet stratejisi oluşturur. Ayrıca, birden çok algılama microelectrodes bir microgroove boyunca varlığını algılama ve aksonal sinyal yayma karakterizasyonu için esastır.
Böyle vitro platformları ile son derece kontrol edilebilir nöronal ağ Topografyaları birçok araştırma soruları14için adapte edilebilir. Bu platformlar nöronal kültür bağlamında kullanılmak üzere uygundur ama ortak kültür yapılandırmaları, sinir hücreleri ve diğer hücre tipleri arasındaki iletişimi nerede izlenen ve değerlendirildi mühendisi için genişletilebilir. Bu kurulum böylece sinirsel ilgili çalışmaları açıkların, nöronal devreler, bilgi kodlama, ateş ve neuroregeneration gibi bir dizi keşfetmek için çok ilginç koşullar sağlar. Ayrıca, onun insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler15,16 ortaya çıkan modelleri ile birlikte yeni yollar sinir sistemini etkiler insan hastalıkları için potansiyel tedavilerin geliştirilmesinde açabilirsiniz.
Laboratuarımıza bu platformu microelectrodes Havacilik (µEF) ile birleştiren cep ve ağ düzeyinde ve onların dolaylı fizyo - ve patolojik sinir sistemi nöronal süreçleri anlamak için kullanıyor. Böyle platformu Nörobilim alanında değeri göz önüne alındığında, bu iletişim kuralının amacını nasıl bölümlere nöronal kültür substrat entegre ölçü üzerinde oluşturmak için göstermektir kültür nöronlar bu platform ve başarılı bir şekilde kayıt nasıl yapılır analiz ve bu deneylerin sonuçlarını yorumlamak. Bu iletişim kuralı kesinlikle sinirsel iletişim çalışmada nöronal kültürler için deneysel araç zenginleştirmek olacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları hayvanları içeren Avrupa Birliği (AB) yönergesi 2010/63 / (Portekizce mevzuatı Decreto-Lei tarafından 113/2013 aktarılması) AB göre yapıldı. Deneysel protokol (0421/000/000/2017) hayvan refahı ve deneme (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) her iki Portekizce resmi yetki ve ana kurum Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hazırlanması Kültür Medya ve diğer çözümleri
Not: Taze kullanımı günde kaplama çözümleri hazırlayın. Kullanılmayan kaplama çözümleri ve Kültür medya-20 ° C veya 4 ° C altında detaylı olarak depolanabilir.
- 10 mL %0,05 (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) çalışma çözüm hazırlamak.
- Arıtılmış PEI çözülerek 20 mL % 0.25 (w/v) PEI stok çözeltisi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) steril su.
- 8 mL steril distile su içinde %0.25 (w/v) PEI stok çözelti 2 mL seyreltik. Mix iyi ve kullanın. Kullanılmayan çözüm 4 ° C'de depolanan
- 1 mL 5 µg/mL laminin çözeltisi hazırlamak.
- Seyreltik çözeltinin 1 mg/mL laminin hisse senedi bazal orta 995 µL içinde 5 µL ( Tablo malzemelerigörmek). Mix iyi ve kullanın. Kullanılmayan çözüm-20 ° C'de dondurulmuş 1-2 haftaya kadar saklanabilir.
- Hank'in HEPES tampon dengeli tuz solüsyonu (H-HBSS) 1 litre hazırlayın.
- 1 M HEPES çözüm HEPES toz Ultrasaf Su 50 ml 11.9 gram çözülerek hazırlayın. PH 7.2 için ayarlayın.
- H-HBSS çözüm (kalsiyum ve magnezyum) olmadan 5,33 mM potasyum klorür, 0,44 mM potasyum fosfat Yem mono, 138 mM sodyum klorür, 0.3 mM sodyum fosfat dibasic ve 800 mL Ultrasaf Su 5.6 mM glikoz çözülerek hazırlayın.
- 15 mL 1 M HEPES çözeltisi (15 mM son konsantrasyonu) ekleyin.
- PH 0,2-0,3 için ayarla birim istenen pH 7.4 1 kullanarak aşağıda N HCl veya 1 N NaOH. Nihai çözüm birimini oluşturan ultrasaf su ekleyin.
Not pH filtrasyon sırasında artış eğilimindedir. - Kullanarak bir 0,22 µm gözeneklilik poly(ether sulfone) (PES) membran filtrasyon tarafından sterilize.
- 10 mL hazırlamak H-HBSS % 10 içeren ısı-Fetal sığır Serum (hiFBS) inaktive olur.
- HiFBS H-HBSS 9 ml 1 mL seyreltik. Mix iyi ve kullanın. Kullanılmayan çözüm 4 ° C'de 3-4 hafta boyunca saklanır.
- 1.5 mg/mL 5 mL tripsin çözüm hazırlamak.
- Kullanımdan hemen önce H-HBSS 5 ml tripsin 7.5 mg geçiyoruz. Kullanarak 0,22 µm porozite PES membran filtrasyon tarafından sterilize.
- 50 mL ilave orta hazırlayın.
- Bazal orta 48,5 mL 50 mL konik tüp içinde karıştırın (bakınız Tablo malzemeler), % 2 (v/v) B-27 ek, 0,5 mM L-glutamin ve % 1 kalem/Strep (10.000 U/mL penisilin ve 10.000 µg/mL streptomisin). İlave orta 4 ° C'de 3-4 hafta boyunca saklanır.
2. mikrosıvısal ve MEA cihazların hazırlama
Not: bir gün önce hücre tohum adımları 2.1-2,11 gerçekleştirin.
- Temiz mikrosıvısal cihazlar imalat ve vinil bant kullanarak diğer enkaz kaldırmak için. Teyp aygıtının tüm alanlarda ulaşmak için aygıt karşı hafifçe bastırın.
- Plazma-temiz yüzeyi temizlemek ve daha hidrofilik sağlamak için MEA 3 dk (0.3 mbar) hava.
- Kısaca mikrosıvısal aygıt % 70 etanol içinde daldırın ve onları bir laminar akış başlık içinde kurumasını sağlar.
- Her MEA bir steril 90 mm Petri kabına yerleştirin ve ultraviyole (UV) ışık pozlama tarafından 15 dakika sterilize.
- MEA merkezi yüzey alanı 500 µL için en az 1 h 37 ° C'de % 0.05 (v/v) PEI çözümü ile kuluçka tarafından kat
Not:17başkaları tarafından açıklandığı gibi bana PEI kaplama poly(lysine) kaplama kullanmaktan daha kümeleme daha az hücre sonuçlanır. - PEI kaplama çözüm MEA yüzeyinden Aspire edin ve bana 4 yıkama x ile 1 mL steril distile su. Bu elektrotlar zarar verebilir gibi adımları yıkama sırasında MEA yüzeyine dokunmamasını dikkat et.
- Laminar akış çuval içinde bir stereomicroscope rehberliğinde, MEA çip ortalayın ve 1 mL steril su MEA merkezi alanına ekleyin.
- Mikrosıvısal aygıt MEA yüzey üzerine yerleştirin.
- Dikkatle mikrosıvısal aygıt microgrooves MEA elektrot kılavuz ile hizalayın.
- Düzgün hizalanmış zaman dikkatle fazla suyu MEA veya mikrosıvısal aygıt dokunmadan Aspire edin.
- µEFs gecede 37 ° C'de kuru ve tam ek izin vermek için kuluçkaya. Eki kolaylaştırmak için bana karşı mikrosıvısal cihaz hafifçe bastırın.
Not: adım 2.12 tohum hücre gününde gerçekleştirin. - µEFs tamamen kurumuş mikrosıvısal wells 150 µL 5 µg/mL laminin kaplama çözüm ile yük ve hücre tohum önce en az 2 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: çözüm microgrooves doldurur µEF laminin çözüm ile yüklenirken, emin olun. bir vakum içinde microgrooves mevcut olabilecek herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak için kullanın.
3. prefrontal korteks diseksiyon
- Diseksiyon alan embriyo kaldırılması için hazırlamak.
- Çalışma yüzeyi ve % 70 etanol ile cerrahi aletler dezenfekte edin.
Not: Bu diseksiyon steril müdahale olmasa da, dezenfeksiyon kirliliği azaltmak için yardımcı olur. - Temiz tek kullanımlık çocuk bezi diseksiyon alanı sınırlamak ve embriyo temizlenmesine yönelik Cerrahî aletler düzenlemek için kullanın.
- 4 90 mm Petri yemekler soğuk H-HBSS ile dolu hazırlamak ve onları buz diseksiyon alanının yakınında bir tepsiye yerleştirin.
- Çalışma yüzeyi ve % 70 etanol ile cerrahi aletler dezenfekte edin.
- Bir E-18 zaman hamile Wistar sıçan tarafından karbondioksit (CO2) inhalasyon ötenazi.
- Yordamı tamamlandığında, hayvan CO2 odasından kaldırın ve ötenazi, kan kaybı gibi ikincil bir yöntem tarafından ölüm onaylayın.
- Hayvan ventral haricinde tek kullanımlık çocuk bezi yerleştirin, alt karın % 70 etanol ile sprey ve forseps ve makas yardımı ile rahim ortaya çıkarmak için deri yoluyla kesilmiş bir U şekli olun.
- Dikkatle embriyoların rahim uzak herhangi bir bağ dokusu keserek kaldırmak ve bir Petri yemekler soğuk H-HBSS ile koyun.
- Her embriyo embriyonik onun sac kaldırma ve forseps ve makas yardımı ile embriyo başını kesmek.
- Embryo´s kafa soğuk H-HBSS ile dolu ikinci bir Petri kabına aktarın.
- 3.6-3.7 her embriyo için yineleyin.
- Prefrontal korteks incelemek.
- Bir embryo´s başı üçüncü bir Petri kabına aktarın.
- Forseps çifti beyin ortaya çıkarmak için kullanın.
- Beyin onun boşluğundan kaldır ve soğuk H-HBSS ile kaplayın.
- Varsa, kaldırmak ve olfaktör soğanları atın. Prefrontal korteks teşrih ve meninkslerde kaldırın.
- Prefrontal korteks parçaları soğuk H-HBSS ile dolu dördüncü Petri kabına aktarın.
- 3.9.1 - 3.9.5 her embriyo için adımları yineleyin.
4. kortikal nöronlar ayrılma ve µEF kültür
Not: bir 15dk UV sterilizasyon döngüsü sonra aşağıdaki yordamları bir laminar akış başlık içinde yapıldı. Yüzey alanı ve kapağın yerleştirilen tüm malzemeler çalışma % 70 etanol ile daha önce dezenfekte.
- 1.5. adımda açıklandığı gibi H-HBSS 5 ml daha önce ağırlıklı tripsin dağıtılması ve çözüm filtre.
- Daha önce 5 mL H-HBSS de toplamda disseke korteks parçaları toplamak. Onları steril 15 mL konik tüp aktarın.
- 2.3 mL taze hazırlanmış 1.5 mg/mL tripsin çözeltisi korteks parçaları içeren tüp ekleyin.
- Süspansiyon mix ve 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya (kısaca her 5 dk da tahrik).
- Doku sindirim durdurmak ve tripsin yıkamak.
- Tripsin içeren süpernatant atmak. Kalan tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için H-HBSS içeren % 10 hiFBS 5 mL ekleyin; yavaşça kışkırtmak.
- Sakin olun ve süpernatant atın korteks parçaları izin.
- HiFBS artıkları kaldırmak için H-HBSS 5 mL ekleyin. Sakin olun ve süpernatant atın korteks parçaları izin.
- Tekrar korteks parçaları H-HBSS 5 mL ile yıkayın.
- Sakin olun ve süpernatant atın korteks parçaları izin. 5 mL ilave nöronal orta de ekleyin.
- Mekanik olarak yavaş yavaş yukarı ve aşağı için pipetting tarafından korteks parçaları 5 mL gonore pipet ile ayırmak 10 - 15 kez. Gerekirse, hücre süspansiyon homojen olana bir küçük kalibreli pipet kullanarak yordamı yineleyin.
- Kalan undissociated dokularda hücre süspansiyon yalak 40 µm hücre süzgeç filtre uygulayarak atın.
- Hücrelerin sayısı ve hücre yoğunluğu belirlemek.
- Bir microtube %0,4 (w/v) Trypan mavi bir 20 µL hücre süspansiyon için 20 µL ekleyin. Homogenate de çözüm mix ve 10 µL odası sayma bir Neubauer aktarmak.
- Hücrelerin sayısı ve hücrelerin hücre yoğunluğunu belirlemek.
- 3.6 x 107 hücre/mL hücre yoğunluğu ayarlayın (hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi gerekirse).
- Tohum hemen önce hücre laminin kaplama µEF Bütün kuyulardan kaldırın. µEF aksonal bölmenin her şey için ilave orta 50 µL pipet.
- Hücre süspansiyon µEF somal yerde 5 µL tohum. Yüzey hücreleri eki izin vermek için 1 h, 37 ° C'de kuluçkaya.
- Yavaşça her doldurmak de, µEF ile ısıtılan desteklenmiştir orta. µEF % 5 CO2ile sağlanan 37 ° C'de bir nemlendirici kuluçka aktarın.
Not: hızlı kültür orta buharlaşma önlemek için µEF taşıyan Petri kabına içinde su ile dolu bir açılan microtube yerleştirin. - Kültürler her ikinci-üçüncü gün kültür kültür orta % 50'si eski yerine koymak için gerekli süre korumak.
Not: deneyler sonra Havacilik bana su µEF gecede çeker tarafından Ilişkisi kesildi. Gerekirse, havacilik forseps yardımıyla hafifçe kabuğu. Bana bir %1 (v/v) ticari enzimatik deterjan ile gece kuluçka tarafından temizlenir ( Tablo malzemelerigörmek).
5. kayıt spontan nöronal aktivite
Not: 7 gün tüp bebek (DIV), al ama 2-3 hafta (14-21 DIV olgun ve sergilemek için) etkinliği kararlı olarak embriyonik kortikal nöron kültürler üzerinde ölçü genellikle spontan aktivite sergilemek. Çalışma hedefler üzerinde dayalı elektrofizyolojik ölçümleri başlatmak karar deneyci kalmıştır. Bu protokol için bir ticari kayıt sistemi kullanarak kayıt µEF nöronal etkinliği gösterilmiştir ( Tablo reçetesi donanım Ayrıntılar için bakınız), Isıtma modülü ile dahil. Kayıtları gerçekleştirmek için serbestçe kullanılabilir bir yazılım kullanılan ( Tablo reçetesi yazılım Ayrıntılar için bakınız).
- Kayıt sistemi ve sıcaklık denetleyicisi MEA açmak ve 37 ° c ulaşmak için pre amplifikatör ısıtmalı taban plakası izin
Not: uzun süreli kayıtlar için (> 30 dk bir anda) bir de bir CO2 atmosfer tutar bir sistem olmalıdır. - µEF pre amplifikatör (headstage) koyun.
Not: MEA çip doğru kenar sol üst referans numarası ile uyumlu olun. Kullandığımız MEA çip rotasyonel simetrik olmakla beraber bu hizalama elektrotlar ve donanım kimliklerini PIN düzenini doğru yönünü eşleşir. - Kapatın ve pre amplifikatör kapak mandalı.
- Kaydetmek için kayıt yazılımı açın ve kayıt parametrelerini ve (nasıl kurulur bir kayıt düzeni Ayrıntılar için yazılımının kılavuzuna bakın) kaydedilen veri akışlarını yolunu tanımlayın.
Not: Bir 20 kHz örnekleme oranı ile yeterince genellikle çoğu uygulama için değil. Yüksek örnekleme sıklığı daha hassas spike zamanlamaları gerekliyse, tavsiye edilir. Bir kayıt sivri için çalışırsa, yüksek geçiren filtre alt frekans bileşenlerinin sinyal azalt 300 Hz de ayarlayın. Ham ve filtre uygulanmış verileri aynı anda kaydedilirse, bu önemli ölçüde veri dosya boyutunu artırır. Her zaman çevrimdışı ham veri filtreleme yapmak mümkündür. Veriyi azaltmak için dosya boyutu bir kayda (örneğin, tek microelectrodes microgrooves içinde) hangi microelectrodes da sınırlayabilirsiniz. - Veri toplama başlatmak için DAQ Başlat'ı tıklatın. Ekranda çalışan izleri etkinliği ve kayıt başlatma mesajı kontrol edin.
Not: Gürültü seviyesi genellikle biraz yüksek microgrooves için karşılık gelen microelectrodes. Gürültü seviyesi çok yüksek ise (pik pik genlik > 50 µV) ya da kararsız birkaç microelectrodes içinde iyi bir PIN pad temas engelleyen kir nedeniyle olabilir. Bu sorun genellikle yavaşça MEA kişi yastıkları ve % 70 etanol ile ıslatılmış bir pamuk bez kullanarak pre amplifikatör pimleri temizleyerek çözülmüştür. - Kaydedilen dosyayı analiz yazılımı açın (hızlı bir şekilde verileri incelemek için Malzemeler tablobkz:).
6. veri analizi
Not: Aşağıdaki adımlar µSpikeHunter yazılım, Aguiar'ın Laboratuvarı (pauloaguiar@ineb.up.pt için e-posta servisinin serbestçe kullanılabilir), µEF ile kaydedilen verileri çözümlemek için geliştirilen bir hesaplama aracı kullanmayı gösterir. Bir grafik kullanıcı arabirimi (Şekil 2) verileri yüklemek, yayılıyor spike dalgalar tanımlamak, kendi yönünü belirlemek için kullanılır (Anterograd ya da retrograd) ve yayılma hızları tahmin ediyoruz. µSpikeHunter 60, 120 ve 256-elektrot ölçü ile birlikte kullanılan MEA2100 ailesi sistemleri kullanılarak elde kayıtlarından oluşturulan HDF5 dosyaları ile uyumludur. Çok kanallı deneyci kullanılarak elde kayıtları kolayca serbestçe kullanılabilir yazılım kullanarak HDF5 dosyalarına dönüştürülebilir ( Tablo malzemelerigörmek).
- Kayıt dosyası seçmek için Gözat ' ı tıklatın. Sonra örnekleme hızı, kayıt süresi gibi (Örneğin, ham veri, filtre uygulanmış verileri) kaydedilen veri akışlarını bir liste listelemek için dosya bilgileri düğmesini tıklatın.
Not: için doğru yayılma hızı tahminlerini, ham veri akışı analizi için seçmek için önerilir. - Analiz için microelectrodes (tek satır ya da microgroove ile ilişkili sütun) seçin ve 6 sinyal gürültü standart sapma (SD) x spike algılama eşik değeri (pozitif veya negatif faz) ayarlayın. Olay dedektörü uygulayıp tanımlanan yayma dizileri elde etmek için Read Data düğmesini tıklayın.
Not: şartlar yerine gelirse, algılanan yayma sıralarının listesini analiz paneli dolduracaktır. Kullanıcı sonra görüntüleyebilir ve gerilim izleri, arası elektrot çapraz korelasyon, tek-sıra yayılma hızları, bir kymograph ve bir ses çalma aracı gibi yayılma sırası için birkaç analiz araçları ile etkileşim. Yayılma hızı tahmini microelectrodes veya tüm çiftleri için tahminleri ortalaması olarak herhangi bir çift için elde edilebilir olsa da, bu tahmini en uzak çift seçtiyseniz daha güvenilir. - Faiz elektrot kümeleri için önceki adımı yineleyin. CSV dosyasına tüm tanımlanan yayma serileri için Tüm olayları kaydetmek zaman ve genlik sivri (her microelectrodes üzerinde) kaydetmek için her zaman'ı tıklatın.
- CSV dosyaları veri analiz ortamına (Örneğin, ateş oranı, arası spike aralıkları) kültürünün aktivitesinin kalıplarının daha fazla çözümleme için almak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokolü kullanarak, E-18 sıçan kortikal nöronlar üzerinde µEF numaralı seribaşı geliştirmek ve bir aydan fazla için bu kültür koşullarda sağlıklı kalmak edebiliyoruz. En kısa zamanda 3-5 gün içinde kültür, kortikal nöronlar onların aksonlar ile microgrooves µEF (Şekil 1) aksonal bölmesinin doğru büyür. 15 gün sonra kültür, kortikal nöronlar üzerinde µEF kültürlü sürekli düzeylerini faaliyet göstermesi beklenen ve aksiyon potansiyelleri microgrooves boyunca yayılması bekleniyor. Eski kültürler (> 14 DIV) gibi geleneksel MEA kayıtları18,19etkinliği patlama tarafından hakim eğilimindedir.
Kayıtları ve veri analizi
Ham veri analizi ile µSpikeHunter (Şekil 2) algılama ve spike dalgalar (microgrooves içinde) 4 microelectrodes kümesi boyunca yayılıyor, ayıklama izin. Şekil 3 bu olaylardan biri görüntüler. Yayılma hızları, gerilim dalga biçimleri (belirli bir gecikme süresiyle koşuluyla) microelectrodes seçili çiftlerini ve ilişkili bilinen arası elektrot mesafe arasındaki çapraz korelasyon dayalı tahmini için izin µSpikeHunter.
Ayıklanan veriler daha da özel tasarlanmış kod MATLAB kullanarak analiz edildi. Yayma, bir temsilcisi raster Arsa spike dalgalar boyunca 11 (16 dışında) microgrooves Şekil 4aiçinde gösterilir. Ani ateş oranı yüksek - ve düşük-etkinlik microgroove için Şekil 4b' gösterilir.
µEF kayıtları elektrot yansıtılmasında değişen düzeyde sergi. Sık sık, birkaç microelectrodes somal yerde "sessiz" bulunmaktadır. Ancak, çoğu microelectrodes microgrooves içinde etkin olma eğilimindedir (Şekil 5a). İyi microgrooves Sinyal Amplifikatörler8olarak işlev açıklanan. Kaydedilmiş bir sinyal genliği sadece kaynak akımların boyutunu'de değil, aynı zamanda çevresindeki ortam direnci bağlıdır. Bir microgroove boyunca hangi büyük o somal yerde (Şekil 5b) microelectrodes ile karşılaştırıldığında ölçülen sinyallerin genlik artırır özellikle yüksek dirençtir.
Resim 1 . Embriyonik sıçan kortikal nöronlar üzerinde µEF kültürlü. (a) µEF fotoğrafı. Ölçek çubuğu: 1 cm. (b) temsilcisi görüntüsünü kortikal nöronlar microgrooves geçiş ve aksonal yuvası (oklar) ulaşan birçok akson gösterilen 5 gün için içinde µEF kültürlü. Ölçek çubuğu: 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Ekran yakalama µSpikeHunter ana grafik kullanıcı arabiriminin. Kullanıcı µEF ile kaydedilen verileri yüklemek, yayılıyor spike dalgalar tanımlamak, kendi yönünü belirlemek (Anterograd ya da retrograd) ve yayılma hızları tahmin ediyoruz. Bir kymograph Aracı el ile kymograph çizilen bir çizgi dayalı yayılma hızı tahmin etmek kullanıcı sağlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Bir microgroove içinde 4 microelectrodes (E8-E11) tarafından hissedilen Anterograd yayılıyor spike dalga. Her izleme bir elektrot ham kayıt 3 Bayan için analizi ile µSpikeHunter sonra temsil eder, en uzak microelectrodes (E8 ve E11) arasında çapraz korelasyon 0,52 m bir yayılma hızı hesaplama izin/s. lütfen tıklayınız için Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek.
Şekil 4 . Microgrooves aracılığıyla bilgi baraj. (a) temsilcisi raster Arsa spontan aktivite 2 dakika 11 microgrooves kaydetti. Her nokta 4 microelectrodes tarafından hissedilen ve analizi ile µSpikeHunter ile tanımlanan bir yayılıyor spike dalga (birim) temsil eder. Bir yüksek - ve düşük-etkinlik microgroove sarı ve kırmızı, sırasıyla vurgulanır. (b) evrimi (aynı derecede içinde oranı-kodlama) ani ateş oranı iki vurgulanan microgrooves 10 dakika boyunca için. Tek yayılıyor birimleri ateş oranı hesaplama için kabul edildi. Not rağmen farklı etkinlik eşitleme oranı düzeyleri ateş. Ani ateş oranı 100 Bayan standart sapması ile Gauss bir çekirdek spike olaylarla convolving hesaplanıp Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . µEF hücre dışı kayıtları kalitesi. (a) zaman penceresi (1 saniye) µEF kayıt (sıçan kortikal nöronlar, 15 gün vitro) 20 kHz ve yüksek geçiren filtrenin, 300 Hz. elektrot satır 1-7 somal bölme ve satır 8-11 microgrooves için karşılık gelen bir örnekleme oranı ile. (b) eksiksiz olarak spike genlikleri kutusu ve bıyık Arsa çıkarılan (sivri bir eşik, yalnızca, negatif faz ile 6 x standart sapma ayarla yöntemiyle tespit) belirtilen satırlardan (Toplam kayıt süresi 10 dakika). Sivri genlikleri somal yuvası (satır 1-7; 16 aktif microelectrodes) microelectrodes için karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha büyük microgrooves (satır 8-11; 16 microgrooves), içinde microelectrodes. Tek yönlü ANOVA, Dunn'ın birden çok karşılaştırma testi, ***p < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokolü nasıl bir mikrosıvısal aygıtı ve bir MEA standart ticari olarak mevcut tasarımları ile oluşan bir µEF montajı ve kaydedilen verileri çözümlemek nasıl gösterir.
Bir deney tasarımı yaparken, araştırmacılar vitro modeli microgroove ayarlamaları kısıtlar MEA sabit kılavuz tarafından sınırlı olduğu dikkate almak gerekir. Belirli mikrosıvısal veya MEA tasarım kullanımı belirli deneysel ihtiyaçlarına bağlı olacaktır ama genel olarak, aynı yordamı adımları farklı µEF yapılandırma için geçerli.
µEF montaj olup Kullanıcı monte µEF gelecekte yeniden kullanmak niyetinde olduğunu önce yapılması için kritik bir karar deneyleri. Her iki yüzeyde oksijen plazma ile tedavi bana20cihazlara mikrosıvısal kovalent bağ için yapılabilir. Geri dönüşümsüz mikrosıvısal aygıt ayırma pasivasyon katman zarar gibi ancak, bu kez mühürleme MEA cips daha fazla deneyler için kullanılamaz yapar. Bu sorunu aşmak için araştırma grupları olası sakıncaları (Örneğin, enkazı önceki deneyler) rağmen monte µEF yeniden eğilimindedir. Dikkatle takip ederek deneme deneme için bir can güvenli bir şekilde bu protokolü bölümünde özetlenen adımları ekleyin ve bana zarar vermeden mikrosıvısal aygıtların bağlantısını kesin.
µEF yalıtım aksonlar microgrooves içinde bir dizi sağlar. Microgrooves geçmeye aksonlar makul sayıda için gereken süreyi büyük ölçüde tohumlama yordam, yani numaralı seribaşı hücre yoğunluğu hücre bağlı olacaktır. Bu protokol için belirtilen yoğunluk kullanmak, 3-5 içinde tüm microgroove geçmeye neurons kullanın DIV.
Kültür ortamına bağlı olarak (Yani, inkübatör ve nem seviyesi), medya yerine 2-3 günde kültür için gerekli. Medya yenilenirken, medya medya ana kanal içinde korunarak µEF kuyulardan kaldırın. Daha sonra hafifçe medya yavaş yavaş ana kanallardan wells son ortam birimi ile dolduruyor önce akış izin µEF kuyu ekleyin. Bu öneriler en az bir ay boyunca sağlıklı koşullarda bu kültürleri korumak edebiliyoruz.
Bu platform önemli bir avantajı izole etmek, ölçmek ve aksonal sinyalleri izlemek için yeteneğidir. µEF kayıt basit olmasına rağmen büyük miktarda üretilebilir veri işlemek için hantal ve veri analizi iyi bilgi gerektirir. Burada kullanılan analiz yazılımı µSpikeHunter21, içeride bir gelişmiş için birkaç miktar detaylı sağlar sezgisel hesaplama aracı ölçüleri (Örneğin, yayılıyor olaylar, yayılma hızı vb) ile ilgili henüz bir kaç adım. Veri analizi bu protokolü odak noktası olmamasına rağmen burada zaten sağlanan bilgileri anlamlı veri çıkarma µEF kayıt sağlar. Ancak, microgroove başına tek bir akson güvenilir yalıtım kullanışsız kalır unutmamak gerekir. Böylece, çok karmaşık spike Waveform (birden çok aksonlar microgroove geçen) nedeniyle ortaya çıkan ve spike zamanlamaları ve yayılma hızı hesaplamaları etkiler. Bu sınırlama (aşağıda 5 mikron) çok dar microgrooves13 kullanarak ve/veya teknikleri21, sıralama spike aracılığıyla hangi farklı sinyal kaynakları ayırt edilmesine yardımcı zayıflatılmış.
Vitro kültürü tam vivo karmaşıklık özetlemek olamaz olsa bile, onların birlikte µEF iyi kontrollü aşağıdan yukarıya araştırma yaklaşımlar sağlar. Bu iletişim kuralı hem yeni başlayanlar ve nöronal devreler elektrofizyolojik iletişimde çalışmak için yeni ve güvenilir modelleri kurulması yeterli MEA kullanıcılar yardımcı olacağını umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser FEDER - yarışmak 2020 yoluyla Fundo Europeu de Desenvolvimento bölgesel para tarafından finanse edildi - Operacional programı için rekabet ve küreselleşme (POCI), Portekiz 2020 ve Portekizce tarafından fon FCT - Fundação para Ciência e bir Teknoloji / Ministério da Ciência, PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623) projesi çerçevesinde teknoloji e Ensino çift. José C Mateus FCT (PD/BD/135491/2018) tarafından desteklenmiştir. Paulo Aguiar Programa Ciência - Programa Operacional Türk Humano (POPH) - promosyon bilimsel istihdam, ESF ve MCTES ve program Investigador FCT, tarafından POPH ve Fundo sosyal Europeu desteklenmiştir. Mikrosıvısal aygıtları INESC - Microsystems ve Nanoteknolojide, Portekiz, João Pedro Conde ve Virginia Chu gözetiminde fabrikasyon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
