Summary
Der er blevet beskrevet en detaljeret protokol for rensning og efterfølgende analyse af et monoklonalt antistof fra den høstede cellekultur væske (HCCF) af automatiserede mikrobioreaktorer. Brug af Analytics til at bestemme kritiske kvalitets attributter (CQAs) og maksimering af begrænset prøvevolumen til at udtrække vitale oplysninger er også præsenteret.
Abstract
Monoklonale antistoffer (mAbs) er en af de mest populære og velkarakteriserede biologiske produkter fremstillet i dag. Mest almindeligt produceret ved hjælp af kinesisk hamster ovarie (CHO) celler, kultur og procesbetingelser skal optimeres for at maksimere antistof titre og opnå mål kvalitet profiler. Denne optimering bruger typisk automatiserede mikroskala bioreaktorer (15 mL) til at screene flere procesbetingelser parallelt. Optimerings kriterier omfatter kultur præstationer og de kritiske kvalitetsegenskaber (CQAs) for det monoklonale antistof (mAb), som kan påvirke dets virkning og sikkerhed. Målinger af kultur præstationer omfatter cellevækst og næringsstof forbrug, mens CQAs omfatter MABS N-glykosylering og aggregerings profiler, opladnings varianter og molekylvægt. Denne detaljerede protokol beskriver, hvordan man renser og efterfølgende analyserer HCCF-prøver, der produceres af et automatiseret mikrobioreaktor system, for at opnå værdifulde præstationsmålinger og output. For det første anvendes et automatiseret protein en hurtig proteinvæske kromatografi (FPLC) metode til at rense mAb fra høstede cellekultur prøver. Når de er koncentreret, analyseres Les profilerne ved massespektrometri ved hjælp af en specifik platform (Se tabellen over materialer). Antistof molekylvægte og aggregerings profiler bestemmes ved hjælp af størrelses udelukkelses kromatografi-multipel vinkel lysspredning (SEC-Mik), mens opladnings varianterne analyseres ved hjælp af mikrochip kapillar zone elektroforese (mCZE). Ud over de kultur præstationsmålinger, der er taget under bioreaktor processen (dvs. kultur levedygtighed, celletal og almindeligt forekommende metabolitter, herunder glutamin, glucose, laktat og ammoniak), analyseres brugte medier for at identificere begrænsende næringsstoffer til forbedre fodrings strategierne og det overordnede proces design. Derfor beskrives også en detaljeret protokol for den absolutte kvantificering af aminosyrer ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) af brugte medier. De metoder, der anvendes i denne protokol, udnytter platforme med høj dataoverførselshastighed, der er kompatible med et stort antal småprøver.
Introduction
Protein Therapeutics bruges til at behandle et voksende udvalg af medicinske tilstande, herunder vævstransplantation komplikationer, autoimmune lidelser, og kræftformer1. Siden 2004, USA Food and Drug Administration (USFDA) har dokumenteret en stigende andel af biologiske licensansøgninger (Blas) af alle godkendelser reguleret af Center for Drug evaluering og forskning (CDer), med BLAs tegner sig for over 25% i 2014 og 20152.
I betragtning af dette ekspanderende marked, biofarmaceutiske producenter udfordres med hurtigt at levere mere produkt med ensartet kvalitet. Bestræbelserne på at øge produktudbyttet har fokuseret på CHO Cell Engineering og produktionslinje screening, selv om de mest markante forbedringer skyldes fremskridt i Media/feed strategi optimering og cellekultur miljøkontrol1, 3 , 4 , 5 under fremstillingsprocessen.
Da mAbs produceres i et biologisk system, kan der være iboende protein variabilitet. Antistof sammensætning kan ændres post-translationelt, såsom glykosylering eller påvirket af nedbrydning eller enzymatiske reaktioner. Disse strukturelle variationer kan fremkalde farlige immunreaktioner eller ændre antistof binding, hvilket igen kan reducere eller eliminere den tilsigtede terapeutiske funktion5. Således er kritiske kvalitetsegenskaber (CQAs) af monoklonale antistoffer-N-glycan profil, charge variant distribution, og procentdelen af antistof i monomerisk form-regelmæssigt overvåget og kontrolleret som en del af en kvalitet af design (QbD) tilgang under fremstillingsprocesser1,6. I et reguleret produktionsmiljø skal terapeutiske proteiner opfylde godkendelseskriterier, der skal gives i licens som et godkendt kommercielt lægemiddel7. De metoder, der præsenteres heri vil typisk være en del af kvaliteten karakterisering proces for et antistof7,8, og enhver protein forsker vil være fortrolig med deres brug.
I tidligere arbejde9er anvendelse og drift af mikrobioreaktorer til høj gennemløbs screening af celle dyrkningsbetingelser i opstrøms bioprocessing blevet beskrevet. Det rensede produkt, der er fremstillet af de varierende medie forhold, underkastes N-glycan-analyse ved hjælp af LC-MS. Glykosylations mønstre af terapeutiske proteiner kan påvises og karakteriseres ved hjælp af LC-MS-teknikker10,11og tilstedeværelsen af forskellige Les arter er blevet knyttet til bioprocess parametre såsom foder strategi, ph, og temperatur12. Virkningen af de varierende medie forhold på produkternes kvalitet, angivet med procentdelen af den resulterende IgG i monomerisk form, evalueres også med størrelses ekskluderende kromatografi-multi-Angle lysspredning (SEC-Mik)13,14 , 15. den Charge variant profil repræsenterer en række ændringer16 , der kan påvirke funktionen af et produkt. Mikrokapillar zone elektroforese (mCZE) er en teknik, der giver en betydeligt hurtigere analyse tid i forhold til traditionel kation udveksling (CEX) kromatografi og kapillar isoelektrisk fokusering (cIEF) metoder, der anvendes til opladning variant analyse17 ,18. Brugt bioreaktor medier blev analyseret for at spore aminosyre forbrug under protein produktion, da det vedrører ændringer i antistof identifikation attributter19,20,21,22 , 23.
Protein analyse giver os mulighed for at identificere kritiske procesparametre (Cpp'er) baseret på relationerne mellem proces input og ændringer i CQAs. Under bioprocess udvikling, identificere og måle Cpp'er fundamentalt viser proceskontrol og sikrer, at produktet ikke har ændret sig, hvilket er afgørende i stærkt regulerede produktionsmiljøer. I dette dokument præsenteres analytiske teknikker til måling af nogle af de biokemiske egenskaber ved det protein, der er mest relevant for produkt-CQAs (N-glycan profil, opladnings varianter og størrelses homogenitet).
Protocol
1. oprensning af antistof
Bemærk: ækvibrations bufferen for det in-House antistof er 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. Den anvendte elueringsbuffer er 0,1 M eddikesyre. Bufferne og harpiks (protein A) er afhængige af det specifikke antistof, der er renset. Kolonne volumen svarer til den senge højde af harpiks. Mængden af anvendt Mobil fase bestemmes i forhold til kolonne volumen.
- Initialisering af renseanlægget
- Åbn den software, der er knyttet til renseanlægget. Ved hjælp af manuelle anvisninger skal du ækvibrere kolonnen med equilibrations bufferen ved en strømningshastighed på 2 mL/min for 40 min. stop den manuelle kørsel efter ligevægt.
- I brøk kollektoren placeres 15 mL koniske rør til opsamling af renset antistof eluat og 50 mL koniske rør for at indsamle gennemstrømning under høj salt vask. Sørg for, at brøk indsamleren nulstilles til startpositionen ved at åbne og lukke brøk kollektoren før starten af kørslen. Fraktionen opsamler fastholdes ved 7 °C.
Bemærk: brøk kollektoren kan nulstilles manuelt under fanen Brøk samler i Indstillingerfor både 15 ml og 50 ml rør.
- Prøve injektion
Bemærk: den høstede cellekultur væske, der anvendes i følgende procedurer, er opnået fra ovarieceller fra kinesisk hamster, som dyrkes i automatiserede mikro-bioreaktorer9.- Tilsæt 0,22 μm filtreret høst cellekultur væske til en tom 12 mL sprøjte, hvis dyse ende er begrænset.
- Hold sprøjten med dysen vendt nedad, sæt sprøjtens stempel på, indtil en lille del af stemplet er i. Sørg for, at væsken ikke lækker, drej sprøjten med dysen opad og Fjern hætten.
- Hold stadig sprøjten med dysen opad, trykcylinderen for at fjerne enhver luft, indtil cellekultur væsken er på spidsen af dysen. Sæt sprøjtedysen i den manuelle Indsprøjtnings port på renseanlægget, og drej den for at stramme den.
- Tryk stemplet ned, indtil hele prøven er injiceret og synlig i den vedlagte 10 mL stor volumen prøve løkke.
- Åbn den gemte metodes fil. Gem resultatfilen på den ønskede placering, og Angiv filnavnet, når du bliver bedt om det. Hit løb efter prøven er blevet injiceret i den store volumen prøve løkke.
- Kørsel af rensningsmetoden
- Vælg den gemte metode, og klik på Kør, når du bliver bedt om instrumentet software (trin 1.2.5).
Bemærk: systemet er konfigureret til at køre følgende trin. Brugeren behøver ikke gøre noget, mens instrumentet kører. - Kolonnen med tre kolonne volumener (CV'er) i ækvibrations bufferen med en strømningshastighed på 2 mL/min. Når kolonnen er ækvibreret, vil systemet ved hjælp af prøve sløjfen med stor volumen injicere prøven på kolonnen med en strømningshastighed på 1 mL/min.
- Et fald i UV-signalet ved 280 Nm indikerer, at prøven er færdig med at blive indlæst. Kolonnen vaskes med en ækvibrations buffer ved en strømningshastighed på 2 mL/min, indtil UV-signalet falder til under 25 mAU.
- Brug fire CV'er på 25 mM Tris med 1 M NaCl ved pH 7,5 til at udføre en sekundær høj salt vask med en strømningshastighed på 2 mL/min. System brøk kollektoren samler ethvert protein/DNA, der kommer ud af søjlen under salt vask i 50 mL rør.
- Anvend fem CV'er for elueringsbuffer med en strømningshastighed på 1 mL/min for at belyse antistoffet fra søjlen. Eluatet opsamles i 15 mL rør baseret på UV-signal. Når UV 280-signalet er over 35 mAU, starter samlingen; samlingen slutter, når signalet falder til under 50 mAU; Dette kaldes peak skæring.
Bemærk: peak skæring sikrer normalisering af elueringsprofiler og for at undgå eluering af spidsbelastning, som kan indeholde protein aggregater24. - Kolonnen vaskes med tre CV'er af ækvibrationbuffer. Kørslen slutter efter vaske trinnet.
- Efter eluering neutraliseres det rensede protein med 1 M Tris base til en pH-værdi på ~ 5,5. Proteinkoncentrationen måles ved hjælp af et mikrovolumen UV-Vis Spektrofotometer ved 280 Nm og 260 nm og opbevares ved 4 °C.
- Koncentrer det oprensede antistof ved hjælp af centrifugal enheder (trin 2). Derefter underkastes den rensede antistof til Les analyse ved hjælp LC-MS og efter sammenlægning profil analysere ved hjælp af SEC-Mik (trin 3 & 4).
Bemærk: det oprensede antistof bør ikke fryses uden yderligere buffer udveksling, da hyppige fryse-tø-cyklusser kan forårsage sammenlægning og udfældning.
- Vælg den gemte metode, og klik på Kør, når du bliver bedt om instrumentet software (trin 1.2.5).
2. koncentration af renset antistof
Bemærk: Tris-acetat bufferen er 0,1 M eddikesyre neutraliseret med 1 M Tris base til en pH-værdi på ~ 5,5.
- Indsæt 100 kDa-filtre i centrifugeglas.
- Filtrene vaskes med 500 μL dobbeltdestilleret vand. Centrifuge i 10 min ved 14.000 x g ved stuetemperatur (RT). Gentag dette trin to gange. Filtrat kasseres.
- De skyllede filtre overføres til friske centrifugerør, og 500 μL af prøven tilsættes til hvert filter. Centrifuger i 10 min. ved 14.000 x g.
- Vend filteret om til et nyt spin rør. Centrifuger i 2 min ved 1.000 x g for at samle den koncentrerede prøve.
- Prøve koncentrationerne ved hjælp af et UV-Vis-Spektrofotometer. Spektrofotometer er tomt ved hjælp af en opløsning af Tris-acetatbuffer. Brug en koefficient for protein udryddelse på 1,37 mL • (mg • cm)-1 ved 280 Nm for en 1% (% m/v) IgG-opløsning.
- Brug den koncentrerede prøve til at tilberede 12,5 μl 2 mg/ml arbejdsopløsning til Les-analyse og 30 μl 3,5 mg/ml arbejdsopløsning til SEC-Mik.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. Prøverne skal opbevares i køleskab ved 4 °C. Ved 2 mg/mL koncentration skal disse prøver være stabile i mindst tre måneder ved 4 °C, mens højere koncentrationer kan udløse.
3. analyse af N-glycans ved hjælp af massespektroskopi
- N-glycan-mærkning og isolering
- Start med antistofkoncentrationer på 2 mg/mL i en passende buffer såsom neutral natriumfosfat, citrat eller HEPES buffer. Forbered en intakt mAb-standard (såsom NIST mAb) ved 2 mg/mL til behandling sammen med eksperimentelle prøver for at fungere som en positiv kontrol.
Bemærk: antistofferne skal være i en endelig buffer, der ikke indeholder SDS, og mindre end 0,1 mM nukleophiler (såsom Tris, DTT, glycin eller histidin). SDS i prøve bufferen skal fjernes. Hvis nucleophiler er i bufferen, derefter fortynde dem ned eller udføre en buffer udveksling, da de vil forstyrre sættet. Den generelle protokol er forsynet med Les-kittet. - 7,5 μL af antistofferne fortyndes med 15,3 μL LC-MS-grade vand i 1 mL rør, der leveres med kittet, og derefter denatur med 6 μL 5% opløsning af et enzym venligt og MS-venligt overfladeaktivt stof ved 90 °C i 3 min.
- Afkøle prøverne i 3 min. til stuetemperatur (RT). Tilsæt derefter 1,2 μL PNGase F og Inkuber i 5 min ved 50 °C.
- Efter afkøling 3 min til RT, etiket de spaltet N-glycans ved at tilføje 12 μL fluorescerende mærkning reagens opløst i vandfri dimethylformamid (DMF) og vente i 5 min. fortynde den mærkede N-glycan-blanding med 358 μL acetonitril (ACN).
- Placer en hydrofile interaktions kromatografi (hilic) plade i en vakuum manifold med shims og affalds bakken. Brug en multikanals pipette til et stort antal prøver.
- Tilstand brøndene med 200 μL vand, hvor vakuum er justeret, så væsken vil tage 15-30 s at passere gennem den HILIC harpiks. Ækvibrere med 200 μl 85% ACN før indlæsning af den ACN-fortyndede Les blanding (400 μl), idet vakuum påføres, efter at hver ny væske tilsættes til brøndene. Harpiksen vaskes med 600 μL 1% myresyre (FA)/90% ACN to gange.
- Udskift affalds bakken med 600 μL opsamlings glas. Elute de mærkede N-glycaner med SPE-elueringsbuffer (3 aflukninger på hver 30 μL) ind i opsamlings rørene. De samlede elutioner fortyndes med 310 μL DMF/ACN-prøve diluent. Prøverne afpipetteres i Autosampler-hætteglas for at være klar til fluorescens (FLR)-MS-analyse.
Bemærk: disse prøver er stabile, når de opbevares ved-80 °C i mindst 1 måned. Opbevar den hilic plade i sin originale emballage, tapede lukket og inde i en ekssikkator til fremtidig brug.
- Start med antistofkoncentrationer på 2 mg/mL i en passende buffer såsom neutral natriumfosfat, citrat eller HEPES buffer. Forbered en intakt mAb-standard (såsom NIST mAb) ved 2 mg/mL til behandling sammen med eksperimentelle prøver for at fungere som en positiv kontrol.
- LC-MS analyse af mærkede N-glycans
- Analysér de mærkede N-glycan elueringsprøver på et ultra-præstations væskekromatografi system (UPLC) koblet til en Fluorescensdetektor og firpolet Time-of-Flight (Q-ToF) massespektrometer. Brug en kolonne, der er godkendt til kromatografisk separation af de mærkede glycaner og varme til 60 °C under separationer.
Bemærk: kolonnen skal skylles med 60% acetonitril og 40% H2O før brug: 50 CV'er før første brug eller 20 CV'er, hvis kolonnen har været brugt før.- Brug 50 mm ammonium formiat (AMF) (lavet med mobilt fase koncentrat) og 100% LC-MS-grade ACN til de mobile faser. Den AmF er følsom over for pH-ændringer og er brugbar i 1 måned efter blanding. Indstil den indledende strømningshastighed til 0,4 mL/min, med LC gradient giver stigende AmF under elueringsfasen.
- Indstil FLR-detektoren til at måle ved ex 265/EM 425 nm med en samplingfrekvens på 2 Hz. Indstil Q-ToF til MS1 positiv ion-følsomheds tilstand med et masse interval på 100-2000 daltons (da), en scanningstid på 0,25 sekunder og kontinuum-dataindsamling. Brug leucin lavt (2 ng/μl i 50% ACN/0,1% FA) til intern masse reference i tilstanden "Anvend ikke korrektion".
Bemærk: den interne masse reference korrektion vil blive anvendt senere under databehandlingen. - Resuspension af dextran stigen sekventielt i 22,5 μL H2O, 25 ΜL DMF og 52,5 μl ACN. Der fremstilles 10 μL aliquoter til opbevaring ved-80 °C, da stigen ikke er stabil i mere end 24 timer ved højere temperaturer (stuetemperatur, 4 °C). Dextran-stigen nedbrydes efter mere end én fryse-tø-cyklus.
- Placer prøverne i Autosampler sat til 10 °C. Læg et hætteglas med dextran-stigen sammen med prøver, da oplysningerne om Opbevaringstiden for stigen vil blive brugt til opgaver, mens masse oplysningerne bruges til at validere identifikationer. Brug 10 μL injektioner til prøverne og 7,5 μL injektioner til stigen. Injicer prøverne i tre eksemplarer. Kør den indlæste metode.
- Analysér de mærkede N-glycan elueringsprøver på et ultra-præstations væskekromatografi system (UPLC) koblet til en Fluorescensdetektor og firpolet Time-of-Flight (Q-ToF) massespektrometer. Brug en kolonne, der er godkendt til kromatografisk separation af de mærkede glycaner og varme til 60 °C under separationer.
- N-glycan-identifikation for LC-MS-data
- Udfør databehandling med et program, der er optimeret til hydrofile interaktionkromatografi fluorescens massespektrometri (HILIC-FLR-MS) data.
- Anvend interne masse reference korrektioner i programmet. Udpege dextran stigen injektioner som "standard" i prøve information. I analysemetode, indstille separation sammensatte opbevaring gange til dem af stigen forbindelser, der blev detekteret under kørslen.
- For at sikre, at område% returneres for identificerede glycaner, skal du ændre analysemetoden: Klik på Kvantificerings indstillinger under fanen behandling -Kalibrer og Indstil "kalibreringskurve tilpasningstype" til "relativ respons (%)".
4. analyse af antistof sammenlægning ved hjælp af SEC-Mik
- Forberedelse af prøver
- 3,5 mg/mL (trin 2) fortyndet protein overføres til et hætteglas med en glasindsats på 150 μL. Brug en gel læsse spids til at pipet ind i den nederste klokke af indsatsen for at undgå indførelse af bobler.
- Hætteglasset med en septa hætte og analysér med det samme. Opbevares ved 4 °C, hvis de analyseres senere.
- Konfiguration af SEC-Mik og ækvilibrering
Bemærk: Analysér aggregering på SEC-Mik, der er konfigureret med en ultra højtryksvæskekromatografi (UHPLC) med en maler detektor og refraktiv indeks detektor, der styres af den.- Konfigurer en metodefil i UHPLC-softwaren til kontrol af UHPLC-systemet, der indstiller strømningshastigheden til 0,4 mL/min med en mobil fase med 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) (fortyndet fra 10x), injektionsvolumen til 5 μL, kolonne temperaturen til 25 °C , og diode array Detector (far) til at overvåge 280 Nm. Indstil kørselstiden til 20 min. Ækvibrere systemet i mindst 4 timer forud for en prøveanalyse.
- Grænsefladen mellem UHPLC-og multi vinkel-lysspredning-brydningsindeks (maler-RI)-detektorer kræver brug af den analoge udgang på far. Indstil DAD dæmpning til 1.000 mAU i DAD Method fil og AU/UV indstilling til 1 (UV instrument ≫ kanaler ≫ Channel 1).
- Tænd for DAD-lampen 30 min før påbegyndelse af analysen og Indstil bølgelængden til 280 Nm. Samtidig skal du rense referencecellen brydningsindeks (RI) i 15 min, eller indtil den oprindelige plan er stabil og derefter lukke referencecellen.
- Konfigurer SEC-Mik software sekvens, indstilling af indsamlings tiden til 12 min, injektionsvolumen til 5 μL, DN/DC til 0,185 mL/g, A280 ekstinktionskoefficient, hvis tidligere eksperimentelt bestemt eller til 1,37 mL * (mg * cm)-1, og koncentrationen af Prøve. Klik på Kør , og vent på, at dialogboksen "venter på at injicere" vises på skærmen.
Bemærk: A280 ekstinktionskoefficienten er specifik for proteinet af interesse og bør bestemmes eksperimentelt. - Konfigurer en eksempel liste i UHPLC-softwaren i samme rækkefølge som i, og Indsend.
Bemærk: det er vigtigt at køre en system egnethedskontrol før og efter en løbetur. Kvægserum albumin bruges typisk til at kontrollere for peak udvidelse, et tegn på, at SEC kolonne kan have brug for rengøring eller udskiftning. Den samme BSA standard injektion kan bruges til at angive signal justering, Peak udvidelse, og detektor normalisering.
-
Samlet analyse med en software
- Klik på fanen markerede procedurer. Angiv det mindsteniveau af despiking påkrævet; ingen er normalt tilstrækkelig.
- Kontroller, at oprindelige planer er blevet tegnet korrekt, og Juster om nødvendigt til LS1-, LS2-, LS3-, RI-og UV-kanaler. Angiv det maksimale interesseområde.
- Gennemgå den molekylære massefordeling for at bekræfte, at de kaldte toppe indeholder partikler af samme størrelse.
5. Oplad variant analyse
- Prøveforberedelse og mærkning
- Start med 80 μL af en 3,5 mg/mL antistof opløsning. Afhold prøven ved hjælp af en 0,5 mL Afsaltningkolonne (7k MWCO). Forbered kolonnen ved først at snappe af den nederste prop, og løsner derefter den øverste prop og placerer den i et 1,7 mL mikro-centrifugeglas. Centrifuger kolonnen for afsaltningen i 1 min. ved 1.500 x g.
Bemærk: Markér kolonnens ydre med en prik, så den kan placeres i den oprindelige retning for de næste trin. - Kolonnen overføres til et nyt mikro-centrifugeglas. Tilsæt 80 μL fortyndet protein til toppen af søjlen. Juster kolonnen til den oprindelige retning. Centrifuger i 2 min. ved 1.500 x g. Fjern prøven fra centrifugen, kassér afsaltningkluden og bland prøven godt.
Bemærk: afsaltningen er kun nødvendig, hvis prøve matrixen indeholder primære aminer, hjælpestoffer, der vil perturere prøve elektroforese eller andre uforenelige stoffer. - Prøven fortyndes til en endelig koncentration på 2 mg/mL i et volumen på 25 μL og tilsættes 5 μL af mærknings bufferen (Se tabel over materialer: Oplad variant reagens sættet) i 96-brønd pladen. Forbered mærknings reagenset ved at fortynde den nødvendige mængde etiketterings reagens (Se tabel over materialer: Oplad variant reagens sættet) 1:30 i dimethylformamid. Prøven inkubates i 10 minutter ved stuetemperatur væk fra lys.
Bemærk: det er vigtigt at tø og derefter straks bruge denne reagens og bruge det inden for 10 min af blanding med DMF. - Efter inkuberet tilsættes 60 μL reagenskvalitet vand og blandes godt ved pipettering. Dæk pladen med en pladeforsegling, og centrifuger pladen ved 1.000 x g i 1 min.
- Start med 80 μL af en 3,5 mg/mL antistof opløsning. Afhold prøven ved hjælp af en 0,5 mL Afsaltningkolonne (7k MWCO). Forbered kolonnen ved først at snappe af den nederste prop, og løsner derefter den øverste prop og placerer den i et 1,7 mL mikro-centrifugeglas. Centrifuger kolonnen for afsaltningen i 1 min. ved 1.500 x g.
- Klargøring af opladnings variant-chippen
- Forbered opladnings variant chippen ved at fjerne opbevaringsopløsningen og vaske brøndene 1, 3, 4, 7, 8 og 10 med vand. Udskift derefter vandet med pH 7,2 løbe buffer (Se tabel over materialer: Oplad variant reagens kit).
- Der tilsættes 750 μL pH 7,2-løbe buffer til stødpude røret, og stødpude røret placeres på det viste sted i øverste venstre hjørne af prøve bakken. Fjern nu plade forseglingen fra 96-brønd pladen, tryk på aflæsnings pladen på instrumentets brugergrænseflade, og sæt pladen i gxii-prøve bakken.
Bemærk: pH 7,2 buffere blev anvendt til denne analyse. pH 5.6-7.2 buffere kan anvendes afhængigt af proteinet pI. Ved brug af lavere pH-buffere kan der være behov for længere prøve kørselstider. - Tryk på knappen Fjern chip på brugergrænsefladen. Sørg for, at elektroderne er fri for partikler, og hvis ikke, Rengør med en fnugfri vatpind. Når du indsætter chippen, skal du sørge for, at vinduet i midten af chippen er fri for partikler eller pletter. Rengør om nødvendigt med en fnugfri, blød klud.
Bemærk: når du arbejder med kapillar elektroforese-chips, skal du fjerne buffer ved vakuum aspiration efterfulgt af den umiddelbare tilsætning af den næste løsning for at undgå, at brøndene tørrer ud. For at minimere introduktionen af bobler skal du øve reverse pipetteringsteknik. Ved håndtering af chippen, være opmærksom på den skrøbelige kapillær strækker sig fra bunden af chippen, at sikre, at det ikke tørrer ud og ikke bryder gennem grov håndtering. - Luk låget til spån kammeret, og vælg HT protein Charge variant -analysen. Klik på knappen Kør . Følg anvisningerne for at vælge prøve brønde, plade type, analyse tidspunkt (68, 90 eller 100 s) og filnavn. Klik på Start i slutningen af prompterne.
- Chip oprydning kræver vask af hver brønd 2x med vand, efterfulgt af tilsætning af lager buffer (Se tabel over materialer: Oplad variant reagens kit). Når du er i lager bufferen, skal du udskifte chippen i instrumentet og vælge HT-protein opladnings testen, når du bliver bedt om det. På hovedskærmen skal du vælge vask på brugergrænsefladen. Når du er færdig, Fjern chippen, tør elektroderne med vand og en fnugfri vatpind, og opbevar chippen ved 4 °C.
- Analyse af gebyr variant
- Åbn instrumentet analyse software. Importer kørslen ved at gå til fil ≫ Importer datafil... og klikke på den ønskede *. gxd-fil. Kun navnet vil blive overført til software, så omdøbning af brøndene er fordelagtigt (værktøjer ≫ prøve navn Editor). Vælg de filer, der skal eksporteres, ved at holde Skift nede, mens du vælger filerne. Klik på filer ≫ Eksporter... og vælg RAW data boks og derefter AIA format boks.
- Åbn fanen Gennemse projekter i analysesoftwaren. Klik på database ≫ Importer data... og vælg den eksporterede *. CDF-filer.
- Når importeret, navigere til fanen injektioner , skal du vælge de filer, der skal analyseres, højreklik og gå til proces... I det vindue, der dukker op, skal du markere afkrydsningsfeltet ud for proces og vælge radio boksen "Brug specificeret behandlingsmetode" og den ønskede behandlingsmetode fra rullelisten. Vælg Kalibrer og Kvantiterer på rullelisten umiddelbart under mærket "How:". Når først forarbejdet, navigere hen til den resultater tab og indskrive den indpasning i den kromatogrammer.
Bemærk: behandlingsmetoden skal verificeres for hver metode. Som udgangspunkt er de parametre, der anvendes til den aktuelle forarbejdningsmetode, medtaget i den supplerende fil.
Bemærk: eksport af data kan ske i form af en rapport, eller kun den maksimale kvantificering kan eksporteres. Disse kan gøres på samme tid som behandling eller fra resultatvinduet.
6. aminosyreanalyse
- Opsætning af Standardkurven for absolut aminosyre kvantificering med LC-MS
- Den udvidede aminosyre blanding (EAA) forberedes ved at opløse 59,45 mg ASN, 59,00 mg hyp, 65,77 mg GLN og 91,95 mg TRP i 25 mL 0,1 N HCl. Den endelige koncentration af hver aminosyre i LR-blandingen er 18 nmol/μL.
- Forbered den interne standard (ISTD) stamopløsning ved at opløse 58,58 mg NVA og 44,54 mg SAR i 50 mL HCl.
- Forbered de komplette aminosyre standarder ved at kombinere aminosyre stamopløsningen indeholdende ALA, ASP, ARG, cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, ser, thr, TRP, tyr, Val ved 1 nmol/μL hver med EAA-blandingen for endelige aminosyre koncentrationer på 900 , 225, 90, 22,5 og 9 pmol/μL. Tilsæt den forberedte ISTD-bestand til aminosyre standarderne for en endelig koncentration på enten 90 pmol/μL eller 900 pmol/μL for at skabe "lave" og "høje" interne standarder til brug som positive kontroller for metoden.
- Aminosyre koncentrationerne i prøve hætteglas placeres i Autosampler af UPLC. Der genereres en kalibreringskurve (9 til 900 pmol/μL) i apparatets software baseret på aminosyre standard koncentrationerne ved hjælp af følgende anvisninger.
- Brug Q-ToF i elektro spray Ionisation (ESI) positiv følsomheds tilstand koblet til en UPLC for intakt aminosyreanalyse. Til kromatografisk separation anvendes en normal fase kolonne lavet til aminosyre separationer. Følgende buffere forberedes med reagenser af massespektrometri-kvalitet: A = acetonitril + 0,1% myresyre og B = 100 mM ammonium format. Indstil LC-strømningshastigheden til 0,6 mL/min og kolonne temperatur til 40 °C.
- Brug følgende 15-minutters gradient betingelser for aminosyre separationer: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min).
- Brug kolonne listerne "eksempel type" og "conc A" i MS Acquisition-programmet til at oprette en kalibreringskurve til fremtidig analyse af rå bioreaktor medier i kvantificerings programmet. Hvis du vil have vist disse kolonner i anskaffelses programmet, skal du bruge kommandoen Tilpas skærm... , når du højreklikker på den øverste menubjælke.
- Prøve typen for aminosyre standarderne vil være "standard", mens medie prøverne vil være "analysand". Udfyld kolonnen "conc A" med de numeriske koncentrationer af standarderne i de påkrævede enheder (ex: pmol/μL).
- Kør de forberedte aminosyre standardkoncentrationer mindst to gange. Kontrollér, at UPLC-instrumentet og massespektrometer fungerer korrekt ved at kontrollere ISTD-toppene.
- Brug indstillingen "Rediger metode" i programmet kvantitation til at oprette en kvantificerings metode (*. mdb-fil). Definer alle aminosyrer af interesse i kvantificerings applikationen, såsom sammensat navn, m/z-værdi og forventet retentions tid. Rediger integrations parametrene for metoden her.
- Brug den oprettede aminosyre metode på standardprøverne til at oprette kalibreringskurven. Denne kurve kan eksporteres til en *. CDB-fil til brug sammen med medie eksemplerne ved hjælp af kommandoen eksporter ≫ kalibrering... .
- I programmet kvantitation skal du gemme det ønskede layout i en *. qlt-fil for at anvende de fremtidige datasæt ved hjælp af "Gem layout som...". Navn (injektion navn), område og conc er de vigtigste outputkolonner.
- Aminosyreanalyse af rå bioreaktor medier af LC-MS
- Centrifuger rå bioreaktor medier ved 1.962 x g i 5 minutter og passerer gennem et 0,22 μm filter.
- Følg op med en perklor Acid oprydning for at fjerne protein og partikler: Bland det filtrerede bioreaktor medie med 0,4 N HClO4 ved et 1:1-forhold, og centrifuge ved 14.700 x g i 5 minutter ved rt. Saml de afklarede medier i Autosampler hætteglas.
Bemærk: Juster injektionsvolumenet efter behov for at få aminosyre koncentrationerne til at falde inden for kalibreringsområdet. Afhængigt af instrumentet kan injektionsvolumenet justeres mellem 0,1 μL og 10 μL. - Kør medie prøver i tre eksemplarer af LC-MS. brug "proces eksempler" under kvantificerings programmet sammen med metoden (*. mdb) og kalibrerings filen (*. CDB). Metoden og kalibreringskurven vil automatisk blive anvendt på de rå medie prøver af kvantificerings applikationen, når alle indsprøjtninger er afsluttet.
- Hvis du vil eksportere data til analyse i et andet program (f. eks. et regneark), skal du bruge kommandoen "Udskriv" og oprette en *. XPS-eller *. PDF-fil.
Representative Results
Den høstede cellekultur væske fra den automatiserede mikroskala bioreaktor renses ved hjælp af hurtig protein væskekromatografi (FPLC), som det ses i figur 1 , og de rensede proteiner ' kritiske kvalitetsegenskaber (CQAs) var karakteriseret ved forskellige efterfølgende analytiske metoder. Dette er en vigtig fordel ved det automatiserede mikrobioreaktor system; forskelle i CQAs kan hurtigt vurderes på tværs af en lang række betingelser. N-glycan-data fra CHO-producerede mAbs, der behandles af massespektrometri, skal fremstå som kromatogrammer vist i figur 2. Figuren skildrer en sammenligning mellem to kromatogrammer, der viser, at mannose 5 Peak (M5) fra en prøve er betydeligt lavere. Hvis der kun observeres en støjende baseline i stedet for toppe, kan dette betyde, at kromatografi opsætningen er defekt, eller at proceduren ikke er vellykket. Ved hjælp af kontrolelementer kan fejlfinding forenkles. Først vurdere FLR toppe fra dextran stigen; disse toppe indikerer, at kromatografisystemet fungerer korrekt. Derefter sammenlignes de eksperimentelt opnåede toppe med dem, der er opnået fra en forarbejdet intakt mAb-standard. Hvis toppene fra standarden er synlige, men der ikke identificeres nogen prøve toppe, blev mAb-prøverne ikke behandlet korrekt. Dette kan skyldes SDS eller nukleophile tilstedeværelse i bufferen interfererende med N-glycan mærkning og rensning.
SEC-Mik kan bruges til at vurdere to flere CQAs: aggregerings profilen og antistof molekylvægten. Et repræsentativt SEC-maler kromatogram kan sammenlignes med det, der er vist i figur 3. Den molekylære massefordeling og den absolutte molekylvægt blev bestemt ved hjælp af den påkrævede software med en ekstinktionskoefficient på 1,37 mL * (mg * cm)-1 og en DN/dc på 0,185 ml/g. Da spids kald og indstilling af grundlinjen i softwaren udføres manuelt, kan resultaterne variere lidt fra bruger til bruger. Den absolutte molekylvægt af monomere IgG1 fra figur 3 er 1,504 x 105 da ± 0,38% (blå) og det højere ordre kompleks er 7,799 x 105 da ± 3,0% (rød). Polydispersitet af aggregaterne er meget større end monomer, som angivet ved den røde molær massefordeling af peak 1 (figur 3). Den lille prøvemængde og betydningen af aggregering som en CQA gør denne teknik til et yderst værdifuldt supplerende analytisk værktøj til det automatiserede mikrobioreaktor system.
Resultatet af mCZE er et elektro pherogram, som i figur 4, som viser opladnings varianten profil for et monoklonalt antistof. Profilen er en unik signatur for det protein, der undersøges, og er meget følsomt over for drifts-pH. Også synlig er en Free-Dye peak til venstre for Charge variant profil. Ved etablering af en drifts-pH-værdi, er operatøren et vist skøn til at afbalancere opløsning og signal; Derudover skal operatøren sikre en god adskillelse fra den frie farve spids, som migrerer ved ~ 30 s. Prøven kan afsaltes efter mærkning for at fjerne denne top, selv om dette fører til et betydeligt tab af signal. Når der er etableret en drifts-pH-værdi, kan prøve profilerne sammenlignes. Mens generelt konsekvent, ændringer i mærkningen effektivitet eller forskelle i hjælpestoffer kan føre til mindre forskelle i migrationen af en prøve og den Charge variant profil gør elektro pherogrammer svært at direkte sammenligne. I stedet er sammenligningsmetoden normalt baseret på procentdelene af grundlæggende, primære og sure arter. I dette tilfælde kan relative forskelle så små som 1-2% identificeres ved hjælp af mCZE.
Amino syre forbrug kan overvåges for at afgøre, om udtømning forårsager ændringer i CQAs. Kromatogrammer udlæsninger fra massespektrometer kan anvendes til at evaluere den vellykkede oprettelse af en kalibreringskurve for den absolutte kvantificering af aminosyrer i rå bioreaktor medie prøver. Figur 5 viser to totale IONKROMATOGRAMMER (tic) og et ekstraheret ionkromatogram (xic) som repræsentative resultater under denne proces. I figur 5Aviser den viste tic baggrunds signalet fra buffer systemet, da kun et tomt vand blev injiceret. Figur 5 B skildrer en repræsentativ tic af aminosyre standarden, hvor små toppe, der svarer til de enkelte aminosyre arter, kan observeres (såsom lysin ved 7,96 minutter), når man sammenlignes med det tomme vand. For at integrere toppunktet og lette kvantificeringen af toparealet (og dermed koncentrationen) anvendes XIC, hvor kun signalet fra et defineret "kromatogram massevindue" vises. Afhængigt af instrumentets følsomhed og kvaliteten af kromatografi separationen skal det optimale masse vindue bestemmes af brugeren. I dette eksempel (figur 5C) vises xic af lysin (m/z = 147,1144) med et masse vindue på 10 ppm, hvor lysin i aminosyre standarden elutter kolonnen ved 8,03 minutter.
Figur 1 . Repræsentativt kromatogram af rensnings ordningen ved anvendelse af FPLC-teknikken (fast protein Liquid kromatografi). Rensnings metodens faser, der svarer til volumen (mL), er mærket langs x-aksen. UV-absorbans ved 280 Nm (mAU y-akse, solid Line) overvåges i hele rensnings cyklussen. Ikke-specifikt bundne urenheder forskydes ved stigende ledningsevne (mS/cm y-akse, stiplede linje) under den høje salt vask. antistof er elueret fra protein en kolonne med indførelsen af elueringsbuffer (conc B, punkteret linje), når pH falder til 4 (ikke vist). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Et repræsentativt fluorescens kromatogram fremstillet af mærkede glycaner, der er masse verificeret. X-aksen er retentionstiden (minutter), mens y-aksen er signalintensitet. Toppen på 14,94 min repræsenterer mannose 5 (M5) glycan, hvor en stor forskel mellem M5 signalstyrken kan observeres mellem de to prøver, der er overlagt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Molekylvægt fordeling af IgG1 monoklonalt antistof. Kromatogram af et intakt IgG1 monoklonalt antistof adskilt af størrelses ekskluderende chromatografi i 1x PBS (pH 7.4). Absorbans overvåges ved 280 Nm (sort; venstre akse) og lysspredning og brydningsindeks detektorer blev brugt til at beregne den absolutte molekylvægt af hver spids (rød og blå; højre akse). Højmolekylære arter er indikeret med et toppunkt mærket "HMW". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Oplad variant profilen for et IgG1 monoklonalt antistof. Dette elektroferogram genereres på en mcze-platform. En Free-Dye peak migrerer på ~ 30 s og er godt adskilt fra IgG1. Til kvantificering blev toppe opdelt i grundlæggende, primære og sure arter ved hjælp af instrument data analysis software. Den røde linje skitserer de integrerede spids arealer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Repræsentative resultater af ionkromatogrammer til massespektrometrisk-baseret aminosyreanalyse af rå bioreaktor medier. X-aksen er tid (minutter), mens y-aksen er signalintensitet (a) en vand blind tjener som den negative kontrol og afslører baggrunds signalet observeret i løbet af væskekromatografi gradient (B) 225 pmol/μl aminosyre standard anvendes her som en positiv kontrol, da de enkelte toppe observeret i dette totale ionkromatogram repræsenterer de forskellige aminosyrer i standard blandingen, der er løst kromatografisk (C) et repræsentativt udvundet ionchromatogram for m /z 147,1144, som er lysin. 7,96 min Peak i B svarer til 8,03 Peak i C af lysin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
HCCF indeholder snavs og store partikler, der kan tilstoppe og ødelægge dyre instrumentering, og derfor er kultur afklaring nødvendig før yderligere downstream-behandling. Centrifugering er generelt den første fremgangsmåde til at adskille celler og andre uopløselige partikler fra proteiner efterfulgt af filtration. Denne filtrerede HCCF udsættes derefter for hurtig Proteinvæske kromatografi (FPLC) til rensning. Rensning af HCCF fra automatiserede mikrobioreaktorer for at opnå produktet er et vigtigt skridt i efterfølgende forarbejdning. Her anvendes et stationære fplc-system med et protein a-søjle til at opnå monoklonale antistoffer fra hccf. Analytics til upstream-processer kan give nyttig indsigt i cellernes adfærd og vejlede bioprocess design, hvilket hjælper med at opnå et konsistent og pålideligt kvalitetsprodukt. Analytics giver os også mulighed for at linke kritiske kvalitets attributter (CQAs) til upstream-og downstream-processer. Præsenteret her er fire assays, der er almindeligt anvendt i karakteriseringen af monoklonale antistoffer. Disse teknikker er robuste, pålidelige og let deployerbare til proces-og produktanalyse fra en række opstrøms kilder, som kun er delvist renset og stadig kan indeholde restniveauer af DNA og HCP.
Ved oprydning af prøver til analyse skal der findes en vigtig balance mellem at lave en prøve, som er tilstrækkelig ren til analyse, samtidig med at variabiliteten i bioreaktoren bevares. De to mest almindeligt forurenende kontaminerende produkter er DNA og HCP, som kan kontrolleres ved at måle forholdet absorbans ved 260/280 Nm og gennem SDS-PAGE eller μCE-SDS. De analyser, der præsenteres her, er ikke følsomme over for lave niveauer af DNA-indhold. Produktets renhed er > 95% ren, som bestemt af μCE-SDS.
Beregning af opladnings varianten med et mikrokapillær elektroforese system giver en høj dataoverførselsmetode til at identificere opladnings varianter, med chips og reagenser, der er relativt nemme at implementere. Karakteren af teknikken og kemien i mærknings reagenset er både følsom over for hjælpestoffer og andre primære aminer, hvilket kræver et afsaltningtrin for de fleste prøve matrixer. Fra erfaring, lave niveauer af DNA Co-migrere med Free-Dye fra mærkningen reaktion og ikke påvirker kvaliteten af resultaterne. Mens variabiliteten af grund-, hoved-og sure topkvantificering typisk er < 1%, kan højere niveauer af DNA og andre forurenende stoffer øge variabiliteten af analysen. Det er ekstremt vigtigt at være i overensstemmelse med protein mærkning og sikre hurtig brug af DMF efter fjernelse fra flasken og blandes med farvestoffet. Lysin og/eller histidin standarder anbefales som mærknings kontrol. Over tid og afhængigt af prøve kvaliteten kan spåner foul eller miste belægningen på mikrofluidics kanaler, hvilket fører til større støj, tilstedeværelsen af spøgelses toppe og større prøve-til-prøve variation. For at identificere denne forekomst blev blanks og en system egnetheds standard (dvs. NISTmAb) samtidig analyseret med prøverne med jævne mellemrum. Når chip problemer opstår, kan chips vaskes med opbevaringsløsningen eller udskiftes.
De metoder, der anvendes til Les-analyse af terapeutiske glykoproteiner, involverer primært væskekromatografi (LC) og/eller massespektrometri (MS), hvor lektin-mikroarray analysen vinder popularitet som en tredje løsningsmodel25. Den metode, der er beskrevet i dette papir, bruger både LC og MS, som har fordele og ulemper. Massespektrometriske metoder har fordelen ved masse verifikation af de analyserede glycaner, hvilket ikke er muligt med LC-baserede metoder ved hjælp af en fluorescerende detekteringsudgang eller lektin-mikroarrays. Denne metode bruger LC-og fluorescens registrering til at tildele Les-identiteter ved hjælp af opbevaringstiden sammenligning med en dextran Ladder-standard. Fluorescens overvågning giver mulighed for øget følsomhed og kvantificering på grund af den lethed af dens påvisning, hvor MS alene måske ikke være i stand til at kvantificere lav overflod arter på grund af den dårlige ionisering effektivitet oligosaccharider. Masse oplysningerne fra MS bruges til at bekræfte Les-identiteter, men behandlingssoftwaren bruger ikke masse oplysninger som de primære tildelingskriterier. Derfor, uden reproducerbar kromatografi og let opløse toppe, denne metode kan lide med hensyn Les tildelinger. Heldigvis kan masse informationen hjælpe med Les-tildelinger, selv i situationer, hvor kromatografien er subpar, såsom forskydninger i retentionstiden, der hindrer reproducerbare Les tildelinger. Hvis denne metode anvendes uden MS, skal kromatografien være på højeste niveau, da masse oplysninger ikke kan bruges til at korrigere for tidsforskydningen i opholdstiden.
Den aminosyre analysemetode, der er beskrevet her, udnytter LC-MS til hurtig kvantitation af underivatiserede aminosyrer i rå cellekultur medier. Alternative aminosyre analysemetoder kræver aminosyre forædling agenter for at muliggøre UV-detektion26. LC-MS-metoden giver vigtige fordele i forhold til LC-UV-metoden: det giver mulighed for identifikation baseret på både retentionstiden og ionmassen i modsætning til LC-UV-metoden, som er begrænset af en mangel på masse karakterisering. Desuden giver LC-MS-metoden tid og reproducerbarheds fordele, da LC-UV-metoden kræver en tidskrævende forædling-reaktion, som kan give prøve variabilitet27. Men, injektion af rå cellekultur medier i LC-MS metode kan forårsage skadelige virkninger på MS signal på grund af ion skimmer fouling. En kalibrerings stige injiceres hyppigt som et system egnethedskontrol, og prøverække følge er randomiseret til at forhindre bias i dataene.
Cellekultur processen for antistof produktion ved hjælp af mikrobioreaktorer er tidligere beskrevet9. I denne undersøgelse, detaljerede protokoller for monoklonale antistof karakterisering metoder, der maksimerer data erhvervet fra begrænset prøvevolumener er veldefinerede. Begrænsede mængder af høstet cellekultur Fluid kan undertiden begrænse de erhvervede produktoplysninger og udvælgelse af de rigtige analytiske procedurer for at opnå produktkvalitet data er afgørende. Analytics er vigtigt for at sammenkæde upstream-procesparametrene med ændringerne i produktkvaliteten. Her gives der en retningslinje, så brugerne har ret til at karakterisere mAbs, når de arbejder med mikrobioreaktorer.
Disclosures
Denne publikation afspejler forfatterens synspunkter og bør ikke opfattes som en repræsentant for fda's synspunkter eller politikker.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Scott Lute for den analytiske støtte, han ydede. Delvis intern finansiering og støtte til dette arbejde leveres af CDER critical path-programmet (CA #1-13). Dette projekt er delvist understøttet af en udnævnelse til praktik-/forsknings deltagelses programmet på kontoret for bioteknologiske produkter, U.S. Food and Drug Administration, administreret af Oak Ridge Institute for Science and Education gennem en Interagency aftale mellem det amerikanske energiministerium og FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| Akta Avant 25 | General Electric Life Sciences | 28930842 | |
| Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin | Millipore Sigma | 115115830 | Purification Stationary Phase |
| Omnifit 10cm Column | Diba Fluid Intelligence | 006EZ-06-10-AA | Housing for Stationary Phase |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Superloop 10 mL | GE Healthcare | 18-1113-81 | |
| µDawn Multi Angle Light Scattering Detector | Wyatt | WUDAWN-01 | |
| 0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane | Merck Millipore | SLGV033RB | |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mL Syringe | Covidien | 8881512878 | |
| 1290 Infinity Binary Pump | Agilent Technologies | G4220A | |
| 1290 Infinity DAD | Agilent Technologies | G4212A | |
| 1290 Infinity Sampler | Agilent Technologies | G4226A | |
| 1290 Infinity Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent Technologies | G1316C | |
| 15 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352097 | |
| 150 uL Glass Inserts with Polymer Feet | Agilent Technologies | 5183-2088 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning Inc. | 352070 | |
| 96-Well Plate | Bio-Rad | 127737 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695072 | |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | BPA996-4 | |
| ACQUITY I-Class UPLC BSM | Waters Corporation | 18601504612 | |
| ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager | Waters Corporation | 186015000 | |
| ACQUITY UPLC FLR Detector | Waters Corporation | 176015029 | |
| Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters | Merck Millipore | UFC810096 | |
| Amino Acid Standard, 1 nmol/µL | Agilent Technologies | 5061-3330 | |
| Amino Acid Supplement | Agilent Technologies | 5062-2478 | |
| Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis | Waters Corporation | 186007081 | |
| Blue Screw Caps with Septa | Agilent Technologies | 5182-0717 | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22363352 | |
| Charge Variant Chip | Perkin Elmer | 760435 | |
| Charge Variant Reagent Kit | Perkin Elmer | CLS760670 | |
| Chromatography Water (MS Grade) | Fisher Chemical | W6-4 | |
| Dimethylformamide | Thermo Scientific | 20673 | |
| Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters Corporation | 186001831 | |
| Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
| GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample | Waters Corporation | 176003712 | |
| GXII Buffer Tubes | E&K Scientific | 697075- NC | |
| GXII Detection Window Cleaning Cloth | VWR | 21912-046 | |
| GXII HT Touch | Perkin Elmer | CLS138160 | |
| GXII Ladder Tubes | Genemate | C-3258-1 | |
| GXII Lint-Free Swab | ITW Texwipe | TX758B | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Intact mAb Mass Check Standard | Waters Corporation | 186006552 | |
| Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm | Imtakt | WAA25 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840274100 | |
| Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector | Wyatt | WTREX-11 | |
| Perchloric acid | Aldrich Chemistry | 311421 | |
| Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels | Labcon | 1034-960-008 | |
| Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 | |
| RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder | Waters Corporation | 186007982 | |
| Screw Top Clear Vial 2mL | Agilent Technologies | 5182-0715 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium Iodide | Sigma Aldrich | 383112 | |
| TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L | Tosoh Biosciences | 003449 | |
| UNIFI Scientific Information System | Waters Corporation | 667005138 | |
| Vacuum Manifold Shims | Waters Corporation | 186007986 | |
| Vacuum Pump | Waters Corporation | 725000604 | |
| Xevo G2 Q-ToF | Waters Corporation | 186005597 | |
| Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL | Thermo Scientific | 89883 |
References
- Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
- New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
- Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
- International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).
- Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
- Yang, J. -M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
- Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
- Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
- Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
- Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
- Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
- Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
- Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
- Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
- Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
- Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
- Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
- Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
- Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
- Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).
