Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं से एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का शोधन और विश्लेषण एक स्वचालित माइक्रोबायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करते हुए

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/58947
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II, U.S. Food and Drug Administration

Summary

स्वचालित microbioreactors की काटा सेल संस्कृति तरल पदार्थ (HCCF) से एक monoclonal एंटीबॉडी के शोधन और बाद में विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (CQAs) का निर्धारण करने और महत्वपूर्ण जानकारी निकालने के लिए सीमित नमूना मात्रा को अधिकतम करने के लिए विश्लेषिकी का उपयोग भी प्रस्तुत किया जाता है।

Abstract

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) आज निर्मित सबसे लोकप्रिय और अच्छी तरह से विशेषता जैविक उत्पादों में से एक है। सबसे अधिक चीनी हम्सटर अंडाशय (सीएचओ) कोशिकाओं, संस्कृति और प्रक्रिया की स्थिति का उपयोग कर उत्पादित एंटीबॉडी titers को अधिकतम करने और लक्ष्य गुणवत्ता प्रोफाइल को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। आमतौर पर, इस अनुकूलन स्वचालित microscale bioreactors (15 एमएल) समानांतर में एकाधिक प्रक्रिया शर्तों स्क्रीन करने के लिए उपयोग करता है. अनुकूलन मापदंड संस्कृति प्रदर्शन और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb) उत्पाद है, जो इसकी प्रभावकारिता और सुरक्षा को प्रभावित कर सकते हैं की महत्वपूर्ण गुणवत्ता गुण (CQAs) शामिल हैं. संस्कृति प्रदर्शन मैट्रिक्स सेल विकास और पोषक तत्वों की खपत में शामिल हैं, जबकि CQAs है mAb एन ग्लाइकोसिलेशन और एकत्रीकरण प्रोफाइल, प्रभारी वेरिएंट, और आणविक वजन शामिल हैं. इस विस्तृत प्रोटोकॉल शुद्ध और बाद में मूल्यवान प्रदर्शन मैट्रिक्स और outputs हासिल करने के लिए एक स्वचालित microbioreactor प्रणाली द्वारा उत्पादित एचसीएफ नमूनों का विश्लेषण करने के लिए कैसे वर्णन करता है। सबसे पहले, एक स्वचालित प्रोटीन एक तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) विधि काटा सेल संस्कृति के नमूने से mAb को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एक बार केंद्रित, ग्लिकन प्रोफाइल एक विशिष्ट मंच का उपयोग कर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं (सामग्री की तालिका कोदेखें). एंटीबॉडी आणविक वजन और एकत्रीकरण प्रोफाइल आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी-एकाधिक कोण प्रकाश प्रकीर्णन (एसईसी-MALS) का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं, जबकि प्रभारी वेरिएंट माइक्रोचिप केशिका क्षेत्र इलेक्ट्रोफोरोसिस (एमसीईई) का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं। bioreacter प्रक्रिया के दौरान कब्जा कर लिया संस्कृति प्रदर्शन मैट्रिक्स के अलावा (यानी, संस्कृति व्यवहार्यता, सेल मायने रखता है, और glutamine, ग्लूकोज, लैक्टेट, और अमोनिया सहित आम चयापचयों), खर्च मीडिया के लिए सीमित पोषक तत्वों की पहचान करने के लिए विश्लेषण किया है खिला रणनीतियों और समग्र प्रक्रिया डिजाइन में सुधार होगा. इसलिए, खर्च किए गए मीडिया के तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) द्वारा एमिनो एसिड के निरपेक्ष परिमाणीकरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की गई विधियाँ बड़ी संख्या में छोटे-मात्रा नमूने के लिए संगत हैं जो उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म्स का लाभ ले।

Introduction

प्रोटीन चिकित्सा ऊतक प्रत्यारोपण जटिलताओं, autoimmune विकारों, और कैंसर1सहित चिकित्सा शर्तों की बढ़ती विविधता के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. 2004 के बाद से, संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (USFDA) दवा मूल्यांकन और अनुसंधान के लिए केंद्र द्वारा विनियमित सभी अनुमोदनों के जीवविज्ञान लाइसेंस अनुप्रयोगों (BLAs) की बढ़ती अनुपात प्रलेखित किया गया है , BLAs के साथ 25% से अधिक के लिए लेखांकन 2014 और 20152में |

इस विस्तार बाजार को ध्यान में रखते हुए, biopharmaceutical निर्माताओं जल्दी से लगातार गुणवत्ता के साथ और अधिक उत्पाद देने के साथ चुनौती दी है. उत्पाद उपज बढ़ाने के प्रयास ों को चो सेल इंजीनियरिंग और उत्पादन लाइन स्क्रीनिंग पर ध्यान केंद्रित किया है, हालांकि सबसे महत्वपूर्ण सुधार मीडिया / फ़ीड रणनीति अनुकूलन और सेल संस्कृति पर्यावरण नियंत्रण1में अग्रिम के कारण कर रहेहैं, 3 , 4 , 5 विनिर्माण प्रक्रिया के दौरान.

चूंकि mAbs एक जैविक प्रणाली में उत्पादित कर रहे हैं, वहाँ निहित प्रोटीन परिवर्तनशीलता हो सकता है. एंटीबॉडी संरचना को अनुवाद के बाद बदला जा सकता है, जैसे ग्लाइकोसिलेशन या निम्नीकरण या एंजाइमी प्रतिक्रियाओं से प्रभावित। इन संरचनात्मक विविधताओं खतरनाक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं भड़काने या एंटीबॉडी बंधन है, जो बारी में कम या इरादा चिकित्सीय समारोह5को खत्म कर सकते हैं बदल सकते हैं. इस प्रकार, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (सीक्यूए) - एन-ग्लिकन प्रोफाइल, चार्ज संस्करण वितरण, और मोनोमेरिक रूप में एंटीबॉडी का प्रतिशत - के दौरान डिजाइन (क्यूबीडी) दृष्टिकोण द्वारा एक गुणवत्ता के भाग के रूप में नियमित रूप से निगरानी और नियंत्रित किया जाता है विनिर्माणप्रक्रिया1,6. एक विनियमित उत्पादन वातावरण में, चिकित्सीय प्रोटीन स्वीकृति मानदंडों को पूरा करने के लिए एक अनुमोदित वाणिज्यिक दवा उत्पाद7के रूप में लाइसेंस प्राप्त करना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत तरीकों आम तौर पर एक एंटीबॉडी के लिए गुणवत्ता विशेषता प्रक्रिया का हिस्सा होगा7,8, और किसी भी प्रोटीन वैज्ञानिक उनके उपयोग से परिचित हो जाएगा.

पूर्व कार्य9में अपस्ट्रीम जैव प्रसंस्करण में सेल कल्चर की स्थिति की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए माइक्रोबायोरिएक्टरों के अनुप्रयोग और प्रचालन का वर्णन किया गया है। अलग-अलग मीडिया स्थितियों से प्राप्त शुद्ध उत्पाद एन-ग्लिकन विश्लेषण के अधीन है चिकित्सीय प्रोटीन के LC-MS. Glycosylation पैटर्न का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है और LC-MS तकनीक का उपयोग कर विशेषता10,11, और विभिन्न ग्लिकन प्रजातियों की उपस्थिति फ़ीड रणनीति, पीएच, और तापमान12के रूप में जैव प्रक्रिया मानकों से जोड़ा गया है। उत्पाद की गुणवत्ता पर अलग मीडिया की स्थिति का प्रभाव, एकमेरिक रूप में जिसके परिणामस्वरूप आईजीजी के प्रतिशत से संकेत दिया, भी आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के साथ मूल्यांकन किया जाता है- मल्टी-एंगल लाइट स्कैटरिंग (एसईसी-मेल्स)13,14 , 15. प्रभारी संस्करण प्रोफ़ाइल16 संशोधनों की एक संख्या है कि एक उत्पाद के समारोह को प्रभावित कर सकता है का प्रतिनिधित्व करता है. माइक्रोकैपिलरी ज़ोन इलेक्ट्रोफोरोसिस (एमसीजेडई) एक तकनीक है जो पारंपरिक धन विनिमय (सीईएक्स) क्रोमैटोग्राफी और केशिका आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (सीआईईएफ) तरीकों की तुलना में काफी तेजी से विश्लेषण समय प्रदान करता है जो चार्ज संस्करण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाता है17 ,18. खर्च bioreacter मीडिया प्रोटीन उत्पादन के दौरान एमिनो एसिड की खपत को ट्रैक करने के लिए विश्लेषण किया गया था के रूप में यह एंटीबॉडी की पहचान गुण में परिवर्तन से संबंधित है19,20,21,22 , 23.

प्रोटीन विश्लेषण हमें प्रक्रिया आदानों और CQAs में परिवर्तन के बीच संबंधों के आधार पर महत्वपूर्ण प्रक्रिया पैरामीटर (CPPs) की पहचान करने की अनुमति देते हैं। bioprocess विकास के दौरान, की पहचान करने और सीजीपी को मापने मौलिक प्रक्रिया नियंत्रण को दर्शाता है और यह सुनिश्चित करता है कि उत्पाद नहीं बदला है, जो अत्यधिक विनियमित विनिर्माण वातावरण में आवश्यक है. इस पत्र में, उत्पाद CQAs (एन ग्लिकन प्रोफ़ाइल, चार्ज वेरिएंट, और आकार एकरूपता) के लिए सबसे उचित प्रोटीन की जैव रासायनिक विशेषताओं में से कुछ को मापने के लिए विश्लेषणात्मक तकनीक प्रस्तुत कर रहे हैं।

Protocol

1. एंटीबॉडी की शुद्धि

नोट: घर में एंटीबॉडी के लिए तुल्यता बफर 25 एमएम Tris, 100 m NaCl, पीएच 7.5 है। एल्यूशन बफर का उपयोग 0.1 एम एसिटिक अम्ल है। बफ़र्स और राल (Protein A) शुद्ध विशिष्ट एंटीबॉडी पर निर्भर हैं. स्तंभ मात्रा राल के बिस्तर ऊंचाई के बराबर है. उपयोग किए गए मोबाइल चरण की मात्रा स्तंभ मात्रा के संदर्भ में निर्धारित की जाती है.

  1. शुद्धि प्रणाली को प्रारंभ करना
    1. शोधन प्रणाली से जुड़ा सॉफ्टवेयर खोलें. मैन्युअल अनुदेशों का प्रयोग करके कॉलम को 40 मिनट के लिए 2 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर समभन बफर के साथ समभित करें।
    2. भिन्न संग्राहक में, उच्च लवण धोने के दौरान प्रवाह-थ्रू एकत्र करने के लिए शुद्ध एंटीबॉडी एल्यूएट और 50 एमएल शंकु-ट्यूब ों को एकत्र करने के लिए 15 एमएल शंकु नलियों को रखें। सुनिश्चित करें कि भिन्न संग्राहक को चलाने की शुरुआत से पहले भिन्न संग्राहक को खोलकर और बंद करके प्रारंभ स्थिति पर रीसेट किया गया है. भिन्न संग्राहक 7 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है।
      नोट: अंश कलेक्टर सेटिंग्स में अंश कलेक्टर टैब के तहत मैन्युअल रूप से रीसेट किया जा सकता है, दोनों के लिए 15 एमएल और 50 एमएल ट्यूब.
  2. नमूना इंजेक्शन
    नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाओं में इस्तेमाल काटा सेल संस्कृति तरल पदार्थ स्वचालित माइक्रो बायोरिएक्टर्स9में सुसंस्कृत चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं से प्राप्त किया गया है।
    1. एक खाली 12 एमएल सिरिंज जिसका नोजल अंत छाया हुआ है करने के लिए 0.22 डिग्री फ़िल्टर्ड फसल सेल संस्कृति तरल पदार्थ जोड़ें।
    2. नीचे का सामना करना पड़ नोजल के साथ सिरिंज पकड़े, प्लंजर का एक छोटा सा हिस्सा अंदर है जब तक सिरिंज प्लंजर डालें। सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ लीक नहीं है, नोजल के साथ सिरिंज को चालू करें और टोपी को हटा दें।
    3. अभी भी ऊपर का सामना करना पड़ नोजल के साथ सिरिंज पकड़े, सिलेंडर धक्का किसी भी हवा को दूर करने के लिए जब तक सेल संस्कृति तरल पदार्थ नोजल की नोक पर है. शुद्धि प्रणाली पर मैनुअल इंजेक्शन बंदरगाह में सिरिंज नोजल डालें और कसने के लिए मोड़।
    4. सभी नमूना इंजेक्शन है और संलग्न 10 एमएल बड़ी मात्रा नमूना पाश में दिखाई देता है जब तक प्लंजर पर नीचे पुश.
    5. सहेजी गई विधि फ़ाइल खोलें. परिणाम फ़ाइल को आवश्यक स्थान पर सहेजें और संकेत मिलने पर फ़ाइल नाम निर्दिष्ट करें. हिट रन के बाद नमूना बड़ी मात्रा नमूना पाश में इंजेक्ट किया गया है.
  3. शुद्धि विधि चल रहा है
    1. बचाया विधि का चयन करें और साधन सॉफ्टवेयर (चरण 1.2.5) द्वारा संकेत दिया जब चलाने के लिए क्लिक करें।
      नोट:: सिस्टम निम्न चरणों को चलाने के लिए सेट किया गया है। साधन चल रहा है, जबकि उपयोगकर्ता कुछ भी नहीं की जरूरत है।
    2. कॉलम को 2 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर सम्यति बफर के तीन स्तंभ खंडों (CVs) के साथ समान रूप से संबद्ध करें। एक बार स्तंभ समरूपित है, प्रणाली, बड़ी मात्रा नमूना पाश का उपयोग कर, 1 mL/min की प्रवाह दर पर स्तंभ पर नमूना इंजेक्ट करेगा.
    3. 280 एनएम पर यूवी संकेत में एक बूंद इंगित करता है कि नमूना लोड हो रहा है समाप्त हो गया है। 2 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर संतुलन बफर के साथ कॉलम को तब तक धोएं जब तक कि यूवी सिग्नल 25 MAU से नीचे न गिर ता।
    4. 2 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर माध्यमिक उच्च नमक धोने के लिए पीएच 7.5 पर 1 एम एन सीएल के साथ 25 एम एम ट्राइस के चार CVs का उपयोग करें। प्रणाली अंश कलेक्टर किसी भी प्रोटीन इकट्ठा करेगा / डीएनए कि 50 एमएल ट्यूबों में नमक धोने के दौरान स्तंभ से आता है.
    5. स्तंभ से एंटीबॉडी को दूर करने के लिए 1 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर एल्यूशन बफर के पांच CVs को लागू करें। यूवी संकेत के आधार पर 15 एमएल ट्यूबों में एल्यूएट लीजिए; जब यूवी 280 संकेत 35 mAU से ऊपर है, संग्रह शुरू होता है; संग्रह समाप्त होता है जब संकेत 50 MAU नीचे चला जाता है; इसे पीक कटिंग कहा जाता है।
      नोट: पीक काटने elution प्रोफाइल के सामान्यीकरण सुनिश्चित करता है और elution चोटी पूंछ जो प्रोटीन समुच्चय24हो सकता है से बचने के लिए .
    6. समरूप बफर के तीन CVs का उपयोग करस्तंभ को धो लें। रन धोने के कदम के बाद समाप्त होता है.
    7. elution के बाद तुरंत शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर बेअसर 1 M Tris आधार का उपयोग कर एक पीएच करने के लिए $5.5. 280 एनएम और 260 एनएम पर एक माइक्रोवॉल्यूम यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करप्रोटीन एकाग्रता को मापने और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. केन्द्रापसारक इकाइयों (चरण 2) का उपयोग करशुद्ध एंटीबॉडी ध्यान केंद्रित। फिर LC-MS का उपयोग कर के ग्लाइकन विश्लेषण करने के लिए शुद्ध एंटीबॉडी विषय और एकत्रीकरण प्रोफ़ाइल के बाद एसईसी-MALS का उपयोग कर विश्लेषण (चरण 3 और 4).।
      नोट: शुद्ध एंटीबॉडी आगे बफर विनिमय के बिना जमे हुए नहीं किया जाना चाहिए के रूप में लगातार फ्रीज-थॉ चक्र एकत्रीकरण और वर्षा पैदा कर सकता है।

2. शुद्ध एंटीबॉडी की एकाग्रता

नोट: Tris-ऐसीटेट बफर है 0.1 M एसिटिक एसिड के साथ बेअसर 1 M Tris बेस के एक पीएच करने के लिए $5.5.

  1. अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 100 केडीए फिल्टर डालें।
  2. फिल्टर को डबल आसुत पानी के 500 डिग्री सेल्सियस से धो लें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 14,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। इस चरण को दो बार दोहराएँ. छानना छोड़ ें।
  3. ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए कुल्ला फिल्टर स्थानांतरण और प्रत्येक फिल्टर करने के लिए नमूना के 500 डिग्री एल जोड़ें। 14,000 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
  4. फिल्टर को एक ताजा स्पिन ट्यूब में उलटा करें। केंद्रित नमूना इकट्ठा करने के लिए 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  5. एक यूवी-Vis स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर नमूना सांद्रता निर्धारित करें। Tris-ऐसीटेट बफर के एक समाधान का उपयोग कर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर खाली. एक 1% (% m/v) आईजीजी समाधान के लिए 280 एनएम पर 1.37 एमएल • (mg •cm)-1 के एक प्रोटीन विलुप्त होने गुणांक का उपयोग करें।
  6. ग्लिकन विश्लेषण के लिए 12.5 मिलीग्राम/एमएल कार्य समाधान तैयार करने के लिए संकेंद्रित नमूने का उपयोग करें और एसईसी-एमएल के लिए 3.5 मिलीग्राम/एमएल कार्य समाधान तैयार करें।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में रखा जाना चाहिए। 2 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता पर, इन नमूनों को कम से कम तीन महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर होना चाहिए, जबकि उच्च सांद्रता वेग हो सकती है।

3. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर एन ग्लिकन का विश्लेषण

  1. N-Glycan लेबलिंग और अलगाव
    1. एक उपयुक्त बफर जैसे तटस्थ सोडियम फॉस्फेट, साइट्रेट या HEPES बफर में 2 मिलीग्राम/एमएल की एंटीबॉडी सांद्रता के साथ प्रारंभ करें। एक बरकरार mAb मानक तैयार (जैसे NIST mAb) पर 2 mg/mL एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए प्रयोगात्मक नमूनों के साथ प्रक्रिया करने के लिए।
      नोट: एंटीबॉडी कोई एसडीएस और कम से कम 0.1 एम एम न्यूक्लिओफिल (जैसे Tris, DTT, ग्लिसिन या histidine) युक्त एक अंतिम बफर में होना चाहिए। नमूना बफ़र में SDS निकाला जाना चाहिए। यदि नाभिकरागी बफर में हैं, तो उन्हें पतला करें या एक बफर एक्सचेंज करें क्योंकि वे किट के साथ हस्तक्षेप करेंगे। सामान्य प्रोटोकॉल ग्लिकन किट के साथ प्रदान की जाती है.
    2. किट के साथ प्रदान की गई 1 एमएल ट्यूबों में एलसी-एमएस-ग्रेड पानी के 15.3 डिग्री एल के साथ एंटीबॉडी के 7.5 डिग्री एल को पतला करना और फिर 3 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर एक एंजाइम के अनुकूल और एमएस के अनुकूल सर्फेक्टेंट के 5% समाधान के 6 डिग्री एल का उपयोग करके विकृत करना।
    3. कमरे के तापमान (आरटी) के लिए 3 मिनट के लिए नमूने शांत। फिर, 50 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए PNGase एफ के 1.2 डिग्री एल और इनक्यूबेट जोड़ें।
    4. आरटी के लिए 3 मिनट ठंडा करने के बाद, एनहाइड्रोसेंट टैगिंग एजेंट के 12 डिग्री एल जोड़कर एन-ग्लिकैनकोज को एनहाइड्रोस डाइमेथिलफॉर्मामाइड (डीएमएफ) में मिलाकर लेबल करें और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। एसिटोनिल (एसीएन) के 358 जेडएल के साथ लेबल किए गए एन-ग्लिकन मिश्रण को अलग करें।
    5. शिम और अपशिष्ट ट्रे के साथ एक वैक्यूम कई गुना में एक हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (HILIC) प्लेट रखें। नमूनों की बड़ी संख्या के लिए एक multichannel pipette का उपयोग करें.
    6. 200 डिग्री सेल्सियस पानी के साथ कुओं की स्थिति, जहां वैक्यूम समायोजित किया जाता है ताकि तरल HILIC राल के माध्यम से पारित करने के लिए 15-30 s ले जाएगा। एसीएन-डिलिब्रेट लेबल ग्लिकैन मिश्रण (400 डिग्री सेल्सियस) को लोड करने से पहले 85% ए सी एन के 200 डिग्री एल के साथ बराबरी, प्रत्येक नए तरल को कुओं में जोड़ने के बाद वैक्यूम लागू करना। 1% फोरमिक एसिड (एफए) के 600 $L के साथ राल धो लें /
    7. अपशिष्ट ट्रे को 600 जेडएल संग्रह ट्यूबों से बदलें। संग्रह ट्यूबों में SPE elution बफर (3 30 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक के 3 elutions) के साथ लेबल N-glycans Elute. DMF/ACN नमूना diluent के 310 $L के साथ जमा elutions को पतला. ऑटो पारखी शीशियों में नमूने Pippette फ्लोरोसेंट (FLR)-एमएस विश्लेषण के लिए तैयार हो.
      नोट: इन नमूनों को स्थिर कर रहे हैं जब कम से कम 1 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. अपने मूल पैकेजिंग में HILIC प्लेट स्टोर, टेप बंद और भविष्य में उपयोग के लिए एक desicator अंदर.
  2. लेबल किए गए N-glycans का LC-MS विश्लेषण
    1. एक अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) प्रणाली एक फ्लोरोसेंट डिटेक्टर और चौपाया समय के उड़ान (क्यू-टूएफ) बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित प्रणाली पर लेबल एन ग्लिकन elution नमूने का विश्लेषण करें। जुदाई के दौरान लेबल ग्लिकन और गर्मी के 60 डिग्री सेल्सियस के क्रोमाग्राफिक जुदाई के लिए अनुमोदित स्तंभ का उपयोग करें।
      नोट: स्तंभ 60% एस्टोनिट्रिल और 40% एच2O उपयोग करने से पहले के साथ निकाल दिया जाना चाहिए: 50 CVs पहले उपयोग करने से पहले या 20 CVs स्तंभ से पहले इस्तेमाल किया गया है, तो।
      1. मोबाइल चरणों के लिए 50 एमएम अमोनियम फोरमेट (एमएफ) (मोबाइल फेज कंध्यानि के साथ बनाया गया) और 100% एलसी-एमएस-ग्रेड एसीएन का उपयोग करें। AmF पीएच परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है और मिश्रण के बाद 1 महीने के लिए उपयोगी है. प्रारंभिक प्रवाह दर को 0.4 एमएल/मिनट पर सेट करें, जिसमें एलसी ग्रेडिएंट एल्यूशन चरण के दौरान एमएफ में वृद्धि प्रदान करता है।
      2. FLR डिटेक्टर सेट पूर्व 265/EM 425 एनएम की एक नमूना दर के साथ 2 हर्ट्ज. MS1 सकारात्मक आयन संवेदनशीलता मोड के लिए क्यू-ToF सेट, 100-2,000 daltons (डा), 0.25 सेकंड और सातत्य डेटा अधिग्रहण के एक स्कैन समय के एक बड़े पैमाने पर सीमा के साथ. आंतरिक जन संदर्भ के लिए ल्यूकोइन एनकेफेलिन (2 एनजी/जेडएल में 50% ACN/0.1% एफए) का उपयोग करें, "सुधार लागू न करें" मोड में।
        नोट: आंतरिक जन संदर्भ सुधार बाद में डेटा संसाधन के दौरान लागू किया जाएगा।
      3. एच2ओ के 22.5 डिग्री एल, डीएमएफ के 25 डिग्री एल और एसीएन के 52.5 डिग्री एल में डेक्सट्रान सीढ़ी को क्रमिक रूप से निलंबित करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए 10 डिग्री सेल्सियस तैयार करें, क्योंकि उच्च तापमान (कमरे का तापमान, 4 डिग्री सेल्सियस) पर 24 डिग्री से अधिक के लिए सीढ़ी स्थिर नहीं है। डेक्सट्रन सीढ़ी एक से अधिक फ्रीज-थॉव चक्र के बाद कम हो जाती है।
      4. नमूने ऑटो पारखी सेट में 10 डिग्री सेल्सियस के लिए रखें। नमूने के साथ डेक्सट्रान सीढ़ी की एक शीशी लोड, सीढ़ी के प्रतिधारण समय जानकारी के रूप में कार्य के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, जबकि बड़े पैमाने पर जानकारी पहचान मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया. नमूने के लिए 10 जेडएल इंजेक्शन और सीढ़ी के लिए 7.5 डिग्री एल इंजेक्शन का प्रयोग करें। त्रिफला में नमूने इंजेक्ट करें। लोड की गई विधि चलाएँ।
  3. LC-MS डेटा के लिए N-Glycan पहचान
    1. हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी फ्लोरोसेंट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HILIC-FLR-एमएस) डेटा के लिए अनुकूलित एक कार्यक्रम के साथ डेटा प्रसंस्करण प्रदर्शन।
    2. प्रोग्राम के भीतर आंतरिक जन संदर्भ सुधार लागू करें। नमूना जानकारीमें "मानक" के रूप में डेक्सट्रान सीढ़ी इंजेक्शन नामित | विश्लेषण विधिमें, पृथक्करण यौगिक प्रतिधारण समय को चलाने के दौरान पाए गए सीढ़ी यौगिकों के लिए सेट करें।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि चिह्नित ग्लिकन के लिए Area % वापस आ जाएगा, विश्लेषण विधि संशोधित करें: संसाधन टैब के अंतर्गत, क्वांटिटेशन सेटिंग्स क्लिक करें - कैलिब्रेट करें और "कैलिब्रेशन वक्र फ़िट प्रकार" को "रिश्तेदार प्रतिसाद (%)" पर सेट करें.

4. एसईसी-मेल्स का उपयोग करके एंटीबॉडी एकत्रीकरण का विश्लेषण

  1. नमूना तैयारी
    1. 3.5 mg/mL (चरण 2) पतला प्रोटीन एक शीशी के लिए एक 150 डिग्री सेल्सियस गिलास डालने के साथ स्थानांतरण. बुलबुले की शुरूआत से बचने के लिए डालने के नीचे की घंटी में पाइप करने के लिए एक जेल लोडिंग टिप का प्रयोग करें।
    2. एक सेप्टा टोपी के साथ शीशी कैप और तुरंत विश्लेषण. बाद में विश्लेषण करते समय 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एसईसी-मेल्स विन्यास और साम्य
    नोट: MALS सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित एक MALS डिटेक्टर और रिफ्रैक्टिव इंडेक्स डिटेक्टर के साथ एक अल्ट्रा उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (UHPLC) के साथ विन्यस्त एसईसी-MALS पर एकत्रीकरण का विश्लेषण करें।
    1. UHPLC प्रणाली के नियंत्रण के लिए UHPLC सॉफ्टवेयर में एक विधि फ़ाइल कॉन्फ़िगर करें, प्रवाह दर 1x Phosphate बफर्ड Saline (PBS) के एक मोबाइल चरण के साथ 0.4 mL/min करने के लिए सेट (पीबीएस) (10x से पतला), इंजेक्शन की मात्रा करने के लिए 5 डिग्री सेल्सियस, स्तंभ तापमान करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस , और Diode सरणी डिटेक्टर (डीएडी) 280 एनएम की निगरानी करने के लिए. 20 मिनट के लिए रन समय सेट करें. किसी भी नमूना विश्लेषण करने से पहले कम से कम 4 ज के लिए सिस्टम को बराबर करें।
    2. UHPLC और मल्टी कोण प्रकाश तितर बितर के बीच इंटरफेस - रिफ्रैक्टिव इंडेक्स (MALS-RI) डिटेक्टरों DAD पर अनुरूप उत्पादन के उपयोग की आवश्यकता है. DAD विधि फ़ाइल में 1,000 MAU करने के लिए DAD क्षीणन सेट और AU/UV सेटिंग करने के लिए 1 (यूवी साधन gt; चैनल और चैनल 1)।
    3. विश्लेषण की शुरुआत से पहले 30 मिनट DAD दीपक चालू करें और 280 एनएम करने के लिए तरंगदैर्ध्य सेट. एक ही समय में, 15 मिनट के लिए या आधार रेखा स्थिर है और उसके बाद संदर्भ कक्ष बंद करें जब तक कि Refractive Index (RI) संदर्भ कक्ष पर ्ज परबल।
    4. एसईसी-MALS सॉफ़्टवेयर अनुक्रम कॉन्फ़िगर करें, संग्रह समय को 12 मिनट के लिए सेट करना, इंजेक्शन वॉल्यूम को 5 डिग्री सेल्सियस, dn/dc से 0.185 एमएल/g, A280 विलुप्त होने गुणांक यदि पहले प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया गया हो या 1.37 एमएल *(mg*cm)-1, और की सांद्रता नमूना. चलाएँ क्लिक करें और स्क्रीन पर प्रकट करने के लिए "इंजेक्ट करने के लिए प्रतीक्षा कर रहा है" संवाद के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट: A280 विलुप्त होने गुणांक ब्याज के प्रोटीन के लिए विशिष्ट है और प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए.
    5. MALS-RI सॉफ्टवेयर और सबमिट के रूप में एक ही क्रम में UHPLC सॉफ्टवेयर में एक नमूना सूची कॉन्फ़िगर करें।
      नोट: यह एक सिस्टम उपयुक्तता जाँच से पहले और एक रन के बाद चलाने के लिए महत्वपूर्ण है। Bovine सीरम एल्बुमिन आम तौर पर पीक चौड़ीकरण के लिए जाँच करने के लिए प्रयोग किया जाता है, एक संकेत है कि एसईसी स्तंभ सफाई या प्रतिस्थापन की आवश्यकता हो सकती है. एक ही बीएसए मानक इंजेक्शन संकेत संरेखण निर्दिष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, चोटी चौड़ीकरण, और डिटेक्टर सामान्यीकरण.
  3. MALS सॉफ्टवेयर के साथ सकल विश्लेषण
    1. चिह्नित प्रक्रियाओंके टैब पर क्लिक करें. आवश्यक despiking के न्यूनतम स्तर निर्दिष्ट करें; कोई भी आमतौर पर पर्याप्त है.
    2. सत्यापित करें कि आधार रेखा सही रूप से आरेखित किया गया है और यदि आवश्यक हो, LS1, LS2, LS3, RI, और UV चैनल के लिए समायोजित करें। ब्याज की चोटी क्षेत्र निर्धारित करें.
    3. आणविक द्रव्यमान वितरण की समीक्षा करने के लिए पुष्टि करें कि कहा जाता चोटियों समान आकार के कणों होते हैं.

5. प्रभारी संस्करण विश्लेषण

  1. नमूना तैयारी और लेबलिंग
    1. 3.5 मिलीग्राम/एमएल एंटीबॉडी समाधान के 80 डिग्री सेल्सियस के साथ शुरू करें। 0.5 एमएल Desalting स्तंभ (7k MWCO) का उपयोग कर नमूना Desalt. पहले नीचे डाट से तड़क द्वारा स्तंभ तैयार है, तो शीर्ष डाट ढीला, और यह एक 1.7 एमएल माइक्रो-केंद्रक ट्यूब में रखकर. 1,500 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए desalting स्तंभ centrifuge .
      नोट: एक डॉट के साथ स्तंभ के बाहरी चिह्नित करें ताकि इसे अगले चरणों के लिए मूल अभिविन्यास में रखा जा सके।
    2. स्तंभ को एक नई माइक्रो-अपकेंद्रन ट्यूब में स्थानांतरित करें. कॉलम के शीर्ष पर पतला प्रोटीन के 80 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. स्तंभ को मूल ओरिएंटेशन में संरेखित करें. 1,500 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज | अपकेंद्रित्र से नमूना निकालें, desalting स्तंभ को त्यागें और नमूना अच्छी तरह से मिश्रण.
      नोट: Desalting केवल आवश्यक है अगर नमूना मैट्रिक्स प्राथमिक amines शामिल हैं, excipients कि नमूना electrophoresis परेशान होगा, या अन्य असंगत पदार्थ.
    3. 25 डिग्री सेल्सियस की मात्रा में 2 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए नमूने को हल करें और 96-वेल प्लेट में लेबलिंग बफर के 5 डिग्री एल (सामग्री की तालिका देखें: चार्ज वेरियंट रिएजेंटकिट) जोड़ें। लेबलिंग अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा को कम करके लेबलिंग अभिकर्मक तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें: चार्ज वेरियंट रिएजेंट किट) 1:30 डाइमेथिलफॉर्मामिड में। प्रकाश से दूर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह thaw करने के लिए महत्वपूर्ण है और फिर तुरंत इस अभिकर्मक का उपयोग करें और DMF के साथ मिश्रण के 10 मिनट के भीतर इसका इस्तेमाल करते हैं.
    4. इनक्यूबेटिंग के बाद, अभिकर्मक ग्रेड पानी के 60 डिग्री एल जोड़ें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। प्लेट सील से प्लेट को ढककर 1 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर चढ़ाएं।
  2. चार्ज संस्करण चिप की तैयारी
    1. भंडारण समाधान को हटाने और कुओं धोने 1, 3, 4, 7, 8, और 10 पानी के साथ चार्ज भिन्न चिप तैयार करें। फिर पानी को पीएच 7.2 रनिंग बफर से बदलें (सामग्री की तालिका देखें: चार्ज वेरियंट रिएजेंट किट)।
    2. बफर ट्यूब के लिए बफर चल रहा पीएच 7.2 के 750 डिग्री एल जोड़ें और नमूना ट्रे के ऊपरी बाएँ हाथ के कोने पर संकेत स्थान में बफर ट्यूब जगह है। अब 96-वेल प्लेट से प्लेट सील निकालें, इंस्ट्रूमेंट यूजर इंटरफेस पर प्लेट अनलोड करें, और प्लेट को GXII नमूना ट्रे में डालें।
      नोट: pH 7.2 बफ़र्स इस विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया. pH 5-6-7.2 बफ़र्स प्रोटीन pI के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. कम pH बफ़र्स का उपयोग करते समय, अब नमूना रन समय की आवश्यकता हो सकती है।
    3. उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पर अनलोड चिप बटन दबाएँ। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड किसी भी कणों से मुक्त कर रहे हैं, और यदि नहीं, एक लिंट मुक्त झाड़ू के साथ साफ. चिप डालने जब सुनिश्चित करें कि चिप के केंद्र में खिड़की कणों या smudges से मुक्त है. यदि आवश्यक हो, एक लिंट मुक्त नरम कपड़े के साथ साफ.
      नोट: केशिका इलेक्ट्रोफोरोसिस चिप्स के साथ काम करते समय, वैक्यूम आकांक्षा द्वारा बफर को हटा दें, इसके बाद अगले समाधान के तत्काल इसके बाद कुओं को सुखाने से रोका जा सकता है। बुलबुले की शुरूआत को कम करने के लिए, रिवर्स पाइपिंग तकनीक का अभ्यास करें। चिप को संभालते समय, चिप के नीचे से फैली नाजुक केशिका का ध्यान रखें, यह सुनिश्चित करें कि यह सूख न जाए और किसी न किसी तरह से हैंडलिंग के माध्यम से टूट न जाए।
    4. चिप चैम्बर के लिए ढक्कन बंद करें और एचटी प्रोटीन चार्ज संस्करण परख का चयन करें। चलाएँ बटन क्लिक करें. नमूना कुओं, प्लेट प्रकार, परख समय (68, 90, या 100 s), और फ़ाइल नाम का चयन करने के लिए संकेतों का पालन करें. संकेतों के अंत में प्रारंभ करें क्लिक करें.
    5. चिप सफाई पानी के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 2x की धुलाई की आवश्यकता है, भंडारण बफर के अलावा के बाद (सामग्री की तालिका देखें: चार्ज संस्करण अभिकर्मककिट). एक बार भंडारण बफर में, साधन में चिप की जगह है और, जब संकेत दिया, एचटी प्रोटीन चार्ज परख का चयन करें. मुख्य स्क्रीन पर उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पर धो का चयन करें। एक बार पूरा हो जाने पर, चिप को हटा दें, पानी और एक लिंट-मुक्त झाड़ू के साथ इलेक्ट्रोड को पोंछ लें, और चिप को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. चार्ज संस्करण विश्लेषण
    1. साधन विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें. फ़ाइल पर जाकर रन आयात करें और डेटा फ़ाइल आयात करें... और वांछित *.gxd फ़ाइल पर क्लिक करें. केवल नाम सॉफ्टवेयर पर ले जाया जाएगा, तो कुओं का नाम बदलने फायदेमंद है (उपकरणऔर नमूना नाम संपादक). फ़ाइलों का चयन करते समय पारी नीचे पकड़े द्वारा निर्यात किया जा करने के लिए फ़ाइलों का चयन करें। क्लिक करें फ़ाइल और निर्यात करें... और रॉ डेटा बॉक्स और उसके बाद AIA स्वरूप बॉक्स का चयन करें।
    2. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में प्रोजेक्ट ब्राउज़ करें टैब खोलें. डेटाबेस पर क्लिक करें और डेटा आयात करें ... और निर्यात किए गए * का चयन करें। CDF फ़ाइलें.
    3. एक बार आयात, इंजेक्शन टैब पर नेविगेट, विश्लेषण किया जा करने के लिए फ़ाइलों का चयन करें, राइट क्लिक करें और प्रक्रिया पर जाएँ ... ऊपर पॉप अप करने वाली विंडो में, प्रक्रिया के आगे वाले चेक बॉक्स का चयन करें और "निर्दिष्ट संसाधन विधि का उपयोग करें" रेडियो बॉक्स और ड्रॉप-डाउन बॉक्स से इच्छित संसाधन विधि का चयन करें. ड्रॉप-डाउन बॉक्स में तुरंत नीचे लेबल "कैसे:" का चयन करें कैलिब्रेट और Quantitate. एक बार संसाधित, परिणाम टैब पर नेविगेट और chromatograms के एकीकरण की जाँच करें.
      नोट: संसाधन विधि प्रत्येक विधि के लिए सत्यापित करने के लिए की आवश्यकता है। प्रारंभिक बिंदु के रूप में, वर्तमान संसाधन विधि के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर अनुपूरक फ़ाइल में शामिल किए जाते हैं.
      नोट: डेटा का निर्यात एक रिपोर्ट के रूप में किया जा सकता है या केवल चोटी परिमाणीकरण निर्यात किया जा सकता है. ये प्रसंस्करण के रूप में या परिणाम विंडो से एक ही समय किया जा सकता है.

6. एमिनो एसिड विश्लेषण

  1. एलसी-एमएस द्वारा निरपेक्ष एमिनो एसिड परिमाणीकरण के लिए मानक वक्र की स्थापना
    1. 59.45 मिलीग्राम Asn भंग करके विस्तारित एमिनो एसिड (EAA) मिश्रण तैयार करें, 59.00 मिलीग्राम हाइप, 65.77 मिलीग्राम Gln की, और 91.95 मिलीग्राम Trp के 25 एमएल में 0.1 एन एच सीएल. ईएए मिश्रण में प्रत्येक एमिनो अम्ल की अंतिम सांद्रता 18 दमोल/जेडएल है।
    2. एचसीएल के 50 एमएल में 58.58 मिलीग्राम नवा और 44.54 मिलीग्राम सर के घोल को भंग करके आंतरिक मानक (ISTD) स्टॉक समाधान तैयार करें।
    3. Ala, Asp, Arg, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val पर 1 nmol/ , 225, 90, 22.5, और 9 pmol/$L. विधि के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए "कम" और "उच्च" आंतरिक मानकों का उपयोग करने के लिए या तो 90 pmol/$L या 900 pmol/$L की अंतिम एकाग्रता के लिए एमिनो एसिड मानकों के लिए तैयार ISTD स्टॉक जोड़ें।
    4. UPLC के autosampler में नमूना शीशियों में एमिनो एसिड सांद्रता रखें. निम्नलिखित निर्देशों का उपयोग कर एमिनो एसिड मानक सांद्रता के आधार पर साधन सॉफ्टवेयर में एक अंशांकन वक्र (9 से 900 pmol/
    5. इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण में क्यू-टूएफ का उपयोग करें (ESI) सकारात्मक संवेदनशीलता मोड बरकरार एमिनो एसिड विश्लेषण के लिए एक UPLC करने के लिए युग्मित. क्रोमैटोग्राफीय जुदाई के लिए, एमिनो एसिड जुदाई के लिए बनाया एक सामान्य चरण स्तंभ का उपयोग करें। मास स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड अभिकर्मकों के साथ निम्नलिखित बफर तैयार करें: ए जेड एसीटोनिट्रिल ़ 0ण्1% फॉरेमिक अम्ल तथा ठ 100 उम अमोनियम रूप। एलसी प्रवाह दर को 0ण्6 एमएल/मिनट और स्तंभ तापमान को 40 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    6. एमिनो एसिड जुदाई के लिए निम्नलिखित 15 मिनट ढाल शर्तों का उपयोग करें: 14% बी (0-3 मिनट), 14-100% बी (3-10 मिनट), 100% बी (10-13 मिनट), 100-8% बी (13-14 मिनट), 8% बी (14-15 मिनट)।
    7. परिमाणीकरण कार्यक्रम में कच्चे तेल bioreacter मीडिया के भविष्य के विश्लेषण के लिए एक अंशांकन वक्र बनाने के लिए एमएस अधिग्रहण कार्यक्रम में "नमूना प्रकार" और "एक" स्तंभ लिस्टिंग का प्रयोग करें. इन स्तंभों को प्राप्ति प्रोग्राम में प्रकट करने के लिए, शीर्ष मेनू पट्टी पर राइट-क्लिक करते समय प्रदर्शन अनुकूलित करें आदेश का उपयोग करें.
    8. एमिनो एसिड मानकों के लिए नमूना प्रकार हो जाएगा "मानक" जबकि मीडिया के नमूने हो जाएगा "Analyte". आवश्यक इकाइयों में मानकों की संख्यात्मक सांद्रता के साथ "कंस ए" कॉलम भरें (उदा.: pmol/
    9. तैयार एमिनो एसिड मानक सांद्रता कम से कम दो बार चलाते हैं. सत्यापित करें कि UPLC साधन और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर ISTD चोटियों की जाँच करके ठीक से काम कर रहे हैं.
    10. परिमाणविधि (*.mdb फ़ाइल) बनाने के लिए परिमाणीकरण अनुप्रयोग में "संपादित विधि" विकल्प का उपयोग करें। परिमाणीकरण अनुप्रयोग में ब्याज की सभी एमिनो एसिड को परिभाषित करें, जैसे यौगिक नाम, m/z मान और अपेक्षित प्रतिधारण समय. विधि के लिए एकीकरण पैरामीटर यहाँ परिवर्तित करें।
    11. अंशांकन वक्र बनाने के लिए मानक नमूनों पर बनाया एमिनो एसिड विधि का प्रयोग करें. इस वक्र निर्यात का उपयोग कर मीडिया नमूने के साथ उपयोग के लिए एक *.cdb फ़ाइल में निर्यात किया जा सकता है और कैलिब्रेशन ... आदेश.
    12. परिमाणीकरण आवेदन में, "के रूप में सहेजें लेआउट..." का उपयोग कर भविष्य datasets के लिए लागू करने के लिए एक *.Qlt फ़ाइल के लिए वांछित लेआउट सहेजें। नाम (इंजेक्शन का नाम), क्षेत्र और कोन सबसे महत्वपूर्ण आउटपुट स्तंभ हैं।
  2. एलसी-एमएस द्वारा कच्चे बायोरिएक्टर मीडिया का एमिनो एसिड विश्लेषण
    1. सेंट्रीफ्यूज क्रूड बायोरिएक्टर मीडिया 5 मिनट के लिए 1,962 x ग्राम पर और एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं।
    2. प्रोटीन और कण पदार्थ को हटाने के लिए एक perchloric एसिड सफाई के साथ पालन करें: एक 1:1 अनुपात और सेंट्रीफ्यूज पर 0.4 एन HCLO4 के साथ फ़िल्टर्ड bioreact मीडिया मिश्रण 5 मिनट के लिए 14,700 x ग्राम पर आरटी. ऑटो नमूना शीशियों में स्पष्ट मीडिया लीजिए.
      नोट: एमिनो एसिड सांद्रता अंशांकन रेंज के भीतर गिर बनाने के लिए आवश्यक के रूप में इंजेक्शन की मात्रा समायोजित करें. उपकरण के आधार पर, इंजेक्शन की मात्रा के बीच समायोजित किया जा सकता है 0.1 $L और 10 $L.
    3. LC-MS द्वारा ट्रिपलिकेट में मीडिया नमूने चलाएँ. विधि (*.mdb) और अंशांकन फ़ाइल (*.cdb) के साथ परिमाणीकरण प्रोग्राम के अंतर्गत "प्रक्रिया नमूने" का उपयोग करें. विधि और अंशांकन वक्र स्वचालित रूप से सभी इंजेक्शन पूरा कर रहे हैं एक बार परिमाणीकरण आवेदन द्वारा कच्चे तेल मीडिया के नमूने के लिए लागू किया जाएगा.
    4. किसी अन्य प्रोग्राम (जैसे स्प्रेडशीट) में विश्लेषण के लिए डेटा निर्यात करने के लिए, "प्रिंटकरें" आदेश का उपयोग करें और एक *.xps या *.pdf फ़ाइल बनाएँ.

Representative Results

स्वचालित माइक्रोस्केल बायोरिएक्टर से काटा गया सेल संस्कृति तरल पदार्थ तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है, जैसा कि चित्रा 1 में देखा गया है और शुद्ध प्रोटीन की महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषताओं (सीक्यूए) को विभिन्न विशेषताओं द्वारा विशेषता थी डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक तरीके। यह स्वचालित माइक्रोबायोरिएक्टर प्रणाली का एक प्रमुख लाभ है; CQAs में मतभेद तेजी से शर्तों की एक विस्तृत श्रृंखला भर में मूल्यांकन किया जा सकता है. जन-स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा संसाधित किए जाने वाले चो-उत्पादित mAbs से N-glycan डेटा चित्र 2में दिखाए गए क्रोमैटोग्राम की तरह दिखाई देना चाहिए। यह आंकड़ा दो क्रोमैटोग्राम के बीच तुलना को दर्शाता है जो दर्शाता है कि एक नमूने से मैनोस 5 चोटी (एम 5) काफी कम है। केवल एक शोर आधार रेखा चोटियों के बजाय मनाया जाता है, तो यह प्रक्रिया सफल नहीं है कि क्रोमैटोग्राफी सेटअप दोषपूर्ण है कि इसका मतलब हो सकता है। नियंत्रणों का उपयोग करके, समस्या निवारण को सरलीकृत किया जा सकता है. सबसे पहले, डेक्सट्रन सीढ़ी से FLR चोटियों का आकलन; इन चोटियों से संकेत मिलता है कि क्रोमैटोग्राफी प्रणाली सही ढंग से काम कर रहा है। अगले, एक संसाधित बरकरार mAb मानक से प्राप्त उन लोगों के साथ प्रयोगात्मक प्राप्त चोटियों की तुलना करें। मानक से चोटियों दिखाई दे रहे हैं, लेकिन कोई नमूना चोटियों की पहचान कर रहे हैं, तो mAb नमूने सही ढंग से संसाधित नहीं किए गए थे। यह एन ग्लिकन लेबलिंग और शोधन के साथ हस्तक्षेप करने वाले बफर में एसडीएस या न्यूक्लिओफिल उपस्थिति के कारण हो सकता है।

एसईसी-MALS दो और CQAs का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: एकत्रीकरण प्रोफ़ाइल और एंटीबॉडी के आणविक वजन. एक प्रतिनिधि एसईसी-MALS क्रोमैटोग्राम चित्र 3में दर्शाए गए एक के बराबर है। आण्विक द्रव्यमान वितरण और निरपेक्ष आण्विक भार का निर्धारण 1.37 एमएल*(एमजी *सेमी)-1 तथा 0.185 एमएल/जी के एक डी एन/डीसी के विलुप्त होने गुणांक के साथ आवश्यक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। पीक कॉलिंग और सॉफ़्टवेयर में आधार रेखा सेट करने के रूप में मैन्युअल रूप से किया जाता है, परिणाम उपयोगकर्ता से उपयोगकर्ता के लिए थोड़ा भिन्न हो सकते हैं। चित्र 3 से मोनोमेरिक आईजीजी 1 का निरपेक्ष आण्विक भार 1.504 x 105 दा है - 0.38% (नीला) और उच्च क्रम परिसर 7.799 x 105 दा है 3.0% (लाल)। समुच्चयों की बहुपरिक्षेपता मोनोमर की तुलना में बहुत अधिक है, जैसा किशिखर 1 के लाल मोलर द्रव्यमान वितरण द्वारा दर्शाया गया है (चित्र 3)। एक CQA के रूप में नमूना और एकत्रीकरण के महत्व की छोटी मात्रा इस तकनीक स्वचालित microbioreacter प्रणाली के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान पूरक विश्लेषणात्मक उपकरण बनाते हैं.

सीसीजेडई का परिणाम एक इलेक्ट्रोफेरोग्राम है, जैसे चित्र 4में, जो मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए आवेश परिवर्ती प्रोफाइल को दर्शाता है। प्रोफ़ाइल प्रोटीन की जांच की जा रही है और ऑपरेटिंग पीएच के लिए अत्यधिक संवेदनशील है के लिए एक अद्वितीय हस्ताक्षर है. इसके अलावा दिखाई प्रभारी संस्करण प्रोफ़ाइल के बाईं ओर एक मुक्त डाई चोटी है. जब एक ऑपरेटिंग पीएच की स्थापना, वहाँ संकल्प और संकेत संतुलन के लिए ऑपरेटर के लिए कुछ विवेक है; इसके अलावा, ऑपरेटर मुक्त डाई चोटी जो $ 30 s पर माइग्रेट से अच्छा जुदाई सुनिश्चित करना चाहिए. नमूना इस चोटी को दूर करने के लिए लेबलिंग के बाद desalted किया जा सकता है, हालांकि यह संकेत में एक महत्वपूर्ण नुकसान की ओर जाता है. एक बार एक ऑपरेटिंग पीएच स्थापित है, नमूना प्रोफाइल की तुलना में किया जा सकता है. जबकि आम तौर पर संगत, लेबलिंग दक्षता या excipients में मतभेद में परिवर्तन एक नमूना के प्रवास में मामूली अंतर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और प्रभारी संस्करण प्रोफ़ाइल electropherograms सीधे तुलना करने के लिए मुश्किल बना रही है. इसके बजाय, तुलना की विधि आमतौर पर बुनियादी, मुख्य, और अम्लीय प्रजातियों के प्रतिशत पर आधारित है. इस मामले में, 1-2% के रूप में छोटे रूप में रिश्तेदार मतभेद एम सी जेडई का उपयोग कर पहचाना जा सकता है।

एमिनो एसिड की खपत कमी CQAs में परिवर्तन पैदा कर रहा है, तो यह निर्धारित करने के लिए निगरानी की जा सकती है. क्रोमैटोग्राम readouts बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर से कच्चे बायोरिएक्टर मीडिया नमूनों में एमिनो एसिड की पूर्ण मात्रानिर्धारण के लिए एक अंशांकन वक्र के सफल निर्माण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्र 5 इस प्रक्रिया के दौरान प्रतिनिधि परिणामों के रूप में दो कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) और एक निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) को दर्शाया गया है। चित्र 5कमें दिखाया गया टीआईसी बफर सिस्टम से पृष्ठभूमि संकेत को दर्शाता है क्योंकि केवल एक पानी खाली इंजेक्शन लगाया गया था। चित्र 5 बी एमिनो एसिड मानक के एक प्रतिनिधि टीसी दर्शाया गया है, जहां, जब पानी खाली की तुलना में, छोटे चोटियों कि व्यक्तिगत एमिनो एसिड प्रजातियों के अनुरूप मनाया जा सकता है (जैसे 7.96 मिनट पर lysine के रूप में). चोटी को एकीकृत करने और चोटी क्षेत्र के परिमाणीकरण की सुविधा के लिए (और इसलिए एकाग्रता), XIC एक परिभाषित "क्रोमेटोग्राम जन खिड़की" से केवल संकेत प्रदर्शित किया जाता है, जहां प्रयोग किया जाता है. साधन की संवेदनशीलता और क्रोमैटोग्राफी जुदाई की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, इष्टतम जन खिड़की उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जाना होगा. इस उदाहरणमें( चित्र 5ब्), 10 पीपीएम की द्रव्यमान विंडो के साथ लाइसिन का XIC (m/z ] 147.1144) दिखाया गया है जहाँ एमिनो अम्ल मानक में lysine स्तंभ से 8ण्03 मिनट पर दूर होता है।

Figure 1
चित्र 1 . फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) तकनीक का उपयोग कर शुद्धीकरण योजना के प्रतिनिधि क्रोमैटोग्राम। खंड (एमएल) के संगत शुद्धिकरण विधि चरण े ग-अक्ष के साथ लेबल किए गए हैं। 280 एनएम (MAU y-अक्ष, ठोस रेखा) पर यूवी अवशोषण शुद्धि चक्र भर में नजर रखी है। उच्च साल्ट वॉश के दौरान गैर-विशेष रूप से बाध्य अशुद्धियों को चालकता (एमएस/सेमी वाई-अक्ष, डैश्ड लाइन) द्वारा विस्थापित किया जाता है। एंटीबॉडी को प्रोटीन ए कॉलम से हटा दिया जाता है जिसमें एल्यूशन बफर (कॉनक बी, डॉटेड लाइन) की शुरूआत होती है जब पीएच घटकर 4 (नहीं) दिखाया गया है) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2| टैग किए गए ग्लाइकेन से प्राप्त एक प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट क्रोमैटोग्राम जो बड़े पैमाने पर सत्यापित होते हैं. x-अक्ष अवधारण समय (मिनट) है जबकि y-अक्ष संकेत तीव्रता है. 14.94 मिनट पर चोटी Mannose 5 (M5) ग्लिकन, जहां M5 संकेत शक्ति के बीच एक बड़ा अंतर दो नमूनों कि मढ़ा रहे हैं के बीच देखा जा सकता है का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3| IgG1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के आणविक वजन वितरण. 1x पीबीएस (pH7.4) में आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग एक बरकरार IgG1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के क्रोमैटोग्राम। अवशोषण 280 एनएम (काला; बाएँ अक्ष) पर नजर रखी है और प्रकाश प्रकीर्णन और अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टरों प्रत्येक चोटी (लाल और नीले, सही अक्ष) के निरपेक्ष आणविक वजन की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. उच्च आणविक वजन प्रजातियों "HMW" लेबल चोटी के साथ संकेत दिया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . एक IgG1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के प्रभारी संस्करण प्रोफ़ाइल. यह इलेक्ट्रोफेरोग्राम एक सीसीजेडई मंच पर उत्पन्न होता है। एक मुक्त डाई चोटी $ 30 s पर माइग्रेट करता है और अच्छी तरह से IgG1 से अलग है. परिमाणीकरण के लिए, चोटियों साधन डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बुनियादी, मुख्य, और अम्लीय प्रजातियों में विभाजित किया गया. लाल रेखा एकीकृत शिखर क्षेत्रों की रूपरेखा देती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5| कच्चे बायोरिएक्टर मीडिया के मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित एमिनो एसिड विश्लेषण के लिए आयन क्रोमैटgrams के प्रतिनिधि परिणाम. ग-अक्ष समय (मिनट) होता है जबकि y-अक्ष संकेत तीव्रता है (A) एक जल रिक्त ताक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है और तरल वर्णलेखिकी प्रवणता के पाठ्यक्रम पर अभिवृत्त पृष्ठभूमि संकेत का पता चलता है (ठ) 225 प्रोमोल/ मानक यहाँ एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है, के रूप में इस कुल आयन क्रोमैटोग्राम में मनाया व्यक्तिगत चोटियों मानक मिश्रण के विभिन्न एमिनो एसिड का प्रतिनिधित्व करते हैं chromatographically हल किया जा रहा है (सी) एक प्रतिनिधि निकाले आयन chromatogram m के लिए /z 147.1144, जो lysine है. ठ में 7ण्96 न्यूनतम शिखर लाइसिन के ब् में 8ण्03 शिखर से मेल खाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एचसीसीएफ मलबे और बड़े कणों कि रोकना और महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन को नष्ट कर सकते हैं शामिल हैं, इस प्रकार संस्कृति स्पष्टीकरण आगे बहाव प्रसंस्करण से पहले की जरूरत है। सेंट्रीफ्यूगेशन आम तौर पर निस्पंदन के बाद प्रोटीन से कोशिकाओं और अन्य अघुलनशील कणों को अलग करने का पहला दृष्टिकोण है। इस फ़िल्टर्ड एचसीएफ तो शुद्धीकरण के लिए फास्ट प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (FPLC) के अधीन है। उत्पाद प्राप्त करने के लिए स्वचालित माइक्रोबायोरिएक्टरों से एचसीएफ का शुद्धिकरण डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग में एक महत्वपूर्ण कदम है। यहां, एक प्रोटीन ए कॉलम के साथ एक बेंचटॉप एफपीएलसी प्रणाली एचसीसीएफ से मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अपस्ट्रीम प्रक्रियाओं के लिए Analytics सेल व्यवहार में उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और जैव प्रक्रिया डिज़ाइन का मार्गदर्शन कर सकता है, जिससे संगत और विश्वसनीय गुणवत्ता उत्पाद प्राप्त करने में मदद मिल सकती है. Analytics हमें क्रिटिकल क्वालिटी एट्रिब्यूट (CQAs) को अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं से लिंक करने की भी अनुमति देता है. यहाँ प्रस्तुत चार परख है कि आमतौर पर monoclonal एंटीबॉडी की विशेषता में उपयोग किया जाता है. इन तकनीकों को मजबूत कर रहे हैं, विश्वसनीय, और आसानी से अपस्ट्रीम स्रोतों जो केवल आंशिक रूप से शुद्ध कर रहे हैं और अभी भी डीएनए और एचसीपी के अवशिष्ट स्तर हो सकता है की एक किस्म से प्रक्रिया और उत्पाद विश्लेषण के लिए deployable.

जब विश्लेषिकी के लिए नमूने की सफाई, एक महत्वपूर्ण संतुलन एक नमूना है कि विश्लेषण के लिए पर्याप्त रूप से साफ है, जबकि bioreacter में मौजूद परिवर्तनशीलता के संरक्षण बनाने के बीच मारा जाना चाहिए. उत्पाद को प्रभावित करने वाले दो सबसे आम संदूषक डीएनए और एचसीपी हैं, जिन्हें 260/280 एनएम पर अनुपात अवशोषण को मापने के द्वारा और एसडीएस-पेज या जेडसीई-एसडीएस के माध्यम से जांच की जा सकती है। यहाँ प्रस्तुत परख डीएनए सामग्री के निम्न स्तर के प्रति संवेदनशील नहीं हैं. उत्पाद की शुद्धता है और 95% शुद्ध है, के रूप में द्वारा निर्धारित किया गया है $CE-SDS.

एक microcapillary electrophoresis प्रणाली के साथ प्रभारी संस्करण विश्लेषण एक उच्च throughput विधि चार्ज वेरिएंट की पहचान करने के लिए प्रदान करता है, चिप्स और अभिकर्मकों कि अपेक्षाकृत लागू करने के लिए आसान कर रहे हैं के साथ. तकनीक की प्रकृति और लेबलिंग अभिकर्मक के रसायन दोनों excipients और अन्य प्राथमिक amines के प्रति संवेदनशील हैं, इस प्रकार सबसे नमूना matrixes के लिए एक desalting कदम की आवश्यकता होती है. अनुभव से, डीएनए के निम्न स्तर लेबलिंग प्रतिक्रिया से मुक्त डाई के साथ सह-प्रवास करते हैं और परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करते हैं। जबकि बुनियादी, मुख्य, और अम्लीय शिखर परिमाणीकरण की परिवर्तनशीलता आम तौर पर है;1%, डीएनए और अन्य contaminants के उच्च स्तर परख की परिवर्तनशीलता को बढ़ा सकते हैं. यह प्रोटीन लेबलिंग के साथ संगत होना और बोतल से हटाने और डाई के साथ मिलाया जा रहा है के बाद DMF के शीघ्र उपयोग सुनिश्चित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. Lysine और/या histidine मानकों लेबलिंग नियंत्रण के रूप में सिफारिश कर रहे हैं. समय के साथ और नमूना गुणवत्ता के आधार पर, चिप्स बेईमानी कर सकते हैं या microfluidics चैनलों पर कोटिंग खो, अधिक से अधिक शोर करने के लिए अग्रणी, भूत चोटियों की उपस्थिति, और अधिक से अधिक नमूना करने के लिए नमूना भिन्नता. इस घटना की पहचान करने के लिए, रिक्त स्थान और एक सिस्टम उपयुक्तता मानक (यानी NISTmAb) समवर्ती नियमित अंतराल पर नमूनों के साथ विश्लेषण किया गया. जब चिप मुद्दों उठता है, चिप्स भंडारण समाधान के साथ धोया जा सकता है या बदला.

चिकित्सीय ग्लाइकोप्रोटीन के ग्लिकन विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों में मुख्य रूप से तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) और/या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) शामिल है, जिसमें लैक्टिन माइक्रोरे विश्लेषण को तीसरे विकल्प25के रूप में लोकप्रियता प्राप्त हो रही है। इस पेपर में वर्णित विधि LC और MS दोनों का उपयोग करता है, जिसमें लाभ और नुकसान हैं. मास स्पेक्ट्रोमेमीट्रिक तरीकों का विश्लेषण glycans के बड़े पैमाने पर सत्यापन का लाभ है, जो एक फ्लोरोसेंट का पता लगाने के उत्पादन या लैक्टिन microarrays का उपयोग कर LC आधारित तरीकों के साथ संभव नहीं है. इस विधि एक dextran सीढ़ी मानक करने के लिए प्रतिधारण समय तुलना का उपयोग कर ग्लाइकैन पहचान आवंटित करने के लिए एलसी और फ्लोरोसेंट का पता लगाने का उपयोग करता है. फ्लोरोसेंट निगरानी इसकी पहचान की आसानी के कारण बढ़ी हुई संवेदनशीलता और परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है, जहां एमएस अकेले ओलिगोसैकेराइड की खराब आयनीकरण दक्षता के कारण कम बहुतायत प्रजातियों की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम नहीं हो सकता है। एमएस से जन जानकारी ग्लिकन पहचान की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन संसाधन सॉफ़्टवेयर प्राथमिक असाइनमेंट मापदंड के रूप में जन जानकारी का उपयोग नहीं करता है। इसलिए, reproduible क्रोमैटोग्राफी और आसानी से resolvable चोटियों के बिना, इस विधि ग्लिकन कार्य के बारे में पीड़ित कर सकते हैं. सौभाग्य से, जन जानकारी ग्लिकन असाइनमेंट के साथ उन परिस्थितियों में भी मदद कर सकती है जब क्रोमैटोग्राफी उपपार होती है, जैसे कि अवधारण समय में बदलाव जो reproduible ग्लाइकन असाइनमेंट में बाधा डालती है। एमएस के बिना इस विधि का उपयोग किया जाता है, तो क्रोमैटोग्राफी उच्चतम स्तर पर होना चाहिए क्योंकि निवास समय बहाव के लिए जन जानकारी का उपयोग नहीं किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित एमिनो एसिड विश्लेषण विधि कच्चे सेल संस्कृति मीडिया में underivatized एमिनो एसिड के तेजी से परिमाणीकरण के लिए LC-MS का इस्तेमाल करता है. वैकल्पिक एमिनो एसिड विश्लेषण विधियों एमिनो एसिड derivatization एजेंटों यूवी पता लगाने26सक्षम करने के लिए की आवश्यकता है. LC-MS विधि LC-UV विधि पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है: यह दोनों प्रतिधारण समय और आयन द्रव्यमान के रूप में LC-UV विधि है, जो बड़े पैमाने पर लक्षण की कमी के द्वारा सीमित है के रूप में पहचान के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एलसी-एमएस विधि समय और पुन: उत्पादनीयता लाभ प्रदान करती है, क्योंकि एलसी-यूवी विधि के लिए समय लेने वाली डेरीवासीकरण प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है, जो नमूना परिवर्तनशीलता27प्रदान कर सकती है। हालांकि, एलसी-एमएस विधि में कच्चे सेल संस्कृति मीडिया के इंजेक्शन आयन स्किमर दूषण के कारण एमएस संकेत पर हानिकारक प्रभाव पैदा कर सकता है। एक अंशांकन सीढ़ी एक प्रणाली उपयुक्तता की जांच के रूप में अक्सर इंजेक्शन है, और नमूना आदेश डेटा में पूर्वाग्रह को रोकने के लिए यादृच्छिक है.

माइक्रोबायोरिएक्टरों का उपयोग करके एंटीबॉडी उत्पादन के लिए कोशिका संवर्धन प्रक्रिया को पहले9बताया गया है . इस अध्ययन में, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशेषता विधियों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल जो सीमित नमूना मात्रा से प्राप्त डेटा को अधिकतम करते हैं, अच्छी तरह से परिभाषित होते हैं। काटा सेल संस्कृति तरल पदार्थ की सीमित मात्रा में कभी कभी उत्पाद प्राप्त की जानकारी और उत्पाद की गुणवत्ता डेटा प्राप्त करने के लिए सही विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का चयन प्रतिबंधित कर सकते हैं आवश्यक है. Analytics उत्पाद की गुणवत्ता में परिवर्तनों के लिए अपस्ट्रीम प्रक्रिया पैरामीटर को एक साथ लिंक करना महत्वपूर्ण है. यहाँ, एक दिशानिर्देश उपयोगकर्ताओं के लिए प्रदान की जाती है जब microbioreactors के साथ काम कर mAbs की विशेषता है.

Disclosures

यह प्रकाशन लेखक के विचारों को दर्शाता है और एफडीए के विचारों या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए.

Acknowledgments

लेखकों विश्लेषणात्मक समर्थन वह प्रदान के लिए स्कॉट Lute शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. आंशिक आंतरिक धन और इस काम के लिए समर्थन CDER महत्वपूर्ण पथ कार्यक्रम (सीए #1-13) द्वारा प्रदान की जाती है. इस परियोजना के भाग में जैव प्रौद्योगिकी उत्पाद, अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन, विज्ञान और शिक्षा के लिए ओक रिज संस्थान द्वारा प्रशासित के कार्यालय में इंटर्नशिप/ अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम के लिए एक नियुक्ति के द्वारा समर्थित है एक के माध्यम से अमेरिकी ऊर्जा विभाग और एफडीए के बीच अंतर एजेंसी समझौते.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO DG44 Cell Line Invitrogen A1100001
Akta Avant 25 General Electric Life Sciences 28930842
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin Millipore Sigma 115115830 Purification Stationary Phase
Omnifit 10cm Column Diba Fluid Intelligence 006EZ-06-10-AA Housing for Stationary Phase
Tris Base Fisher Scientific BP154-1
Superloop 10 mL GE Healthcare 18-1113-81
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector Wyatt WUDAWN-01
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane Merck Millipore SLGV033RB
10X Phosphate Buffered Saline Corning 46-013-CM
12 mL Syringe Covidien 8881512878
1290 Infinity Binary Pump Agilent Technologies G4220A
1290 Infinity DAD  Agilent Technologies G4212A
1290 Infinity Sampler Agilent Technologies G4226A
1290 Infinity Thermostat Agilent Technologies G1330B
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent Technologies G1316C
15 mL Falcon tube Corning Inc. 352097
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet  Agilent Technologies 5183-2088
50 mL Falcon tube Corning Inc. 352070
96-Well Plate Bio-Rad 127737
Acetic Acid Sigma-Aldrich 695072
Acetonitrile Fisher Chemical BPA996-4
ACQUITY I-Class UPLC BSM Waters Corporation 18601504612
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager Waters Corporation 186015000
ACQUITY UPLC FLR Detector Waters Corporation 176015029
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters Merck Millipore UFC810096
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL  Agilent Technologies 5061-3330
Amino Acid Supplement Agilent Technologies 5062-2478
Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis Waters Corporation 186007081
Blue Screw Caps with Septa Agilent Technologies 5182-0717
CD OptiCHO AGT Medium Thermo Fisher Scientific A1122205
Centrifuge Tubes Eppendorf 22363352
Charge Variant Chip Perkin Elmer 760435
Charge Variant Reagent Kit Perkin Elmer CLS760670
Chromatography Water (MS Grade) Fisher Chemical W6-4
Dimethylformamide Thermo Scientific 20673
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates Waters Corporation 186001831
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample Waters Corporation 176003712
GXII Buffer Tubes E&K Scientific 697075- NC
GXII Detection Window Cleaning Cloth VWR 21912-046
GXII HT Touch Perkin Elmer CLS138160
GXII Ladder Tubes Genemate C-3258-1
GXII Lint-Free Swab ITW Texwipe TX758B
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Intact mAb Mass Check Standard Waters Corporation 186006552
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm Imtakt WAA25
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 840274100
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector Wyatt WTREX-11
Perchloric acid Aldrich Chemistry 311421
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels Labcon 1034-960-008
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black Greiner Bio-One 655209
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder Waters Corporation 186007982
Screw Top Clear Vial 2mL Agilent Technologies 5182-0715
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-1
Sodium Iodide Sigma Aldrich 383112
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L Tosoh Biosciences 003449
UNIFI Scientific Information System Waters Corporation 667005138
Vacuum Manifold Shims Waters Corporation 186007986
Vacuum Pump Waters Corporation 725000604
Xevo G2 Q-ToF Waters Corporation 186005597
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL Thermo Scientific 89883

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
  2. New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015).
  3. Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
  4. Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
  5. Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
  6. Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
  7. International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).
  8. Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
  9. Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  10. Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
  11. Yang, J. -M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
  12. Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
  13. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
  14. Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
  15. Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
  16. Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
  17. Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
  18. Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
  19. Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
  20. Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
  21. Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
  22. Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
  23. Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
  24. Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
  25. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
  26. Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
  27. Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 147 माइक्रो-बायोरिएक्टर चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं सेल संस्कृति स्क्रीनिंग ग्लिकन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी बहु कोण प्रकाश प्रकीर्णन
चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं से एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का शोधन और विश्लेषण एक स्वचालित माइक्रोबायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करते हुए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Velugula-Yellela, S. R., Powers, D.… More

Velugula-Yellela, S. R., Powers, D. N., Angart, P., Faustino, A., Faison, T., Kohnhorst, C., Fratz-Berilla, E. J., Agarabi, C. D. Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System. J. Vis. Exp. (147), e58947, doi:10.3791/58947 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter