Summary

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Published: February 12, 2019
doi:

Summary

هنا يمكننا وصف بروتوكول لأسلوب مطاردة نبض عامة يسمح تحليل الحركية قابلة للطي والنقل، وتدهور البروتينات الواجب اتباعها في الخلايا الحية.

Abstract

وصف تشيس نبض المشعة أداة قوية لدراسة نضوج كونفورماشونال، والنقل إلى مواقعها الخلوية الوظيفية، وتدهور البروتينات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام أوقات قصيرة (نبض) راديولابيلينج (< 30 دقيقة) ورقابة مشددة من تشيس مرات، من الممكن تسمية سوى جزء صغير من تجمع مجموع البروتين واتبع الطي به. عندما جنبا إلى جنب مع نونريدوسينج/خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وإيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة (تكيف محددة)، يمكن دراسة الطي العمليات بقدر كبير من التفصيل. وقد استخدم هذا النظام لتحليل قابلة للطي للبروتينات مع تباين كبير في خصائص مثل البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات وحيدة ومتعددة تمرير transmembrane، N و O الغليكوزيلاتي البروتينات بشدة، والبروتينات مع أو بدون ثنائي كبريتيد واسعة النطاق الربط. أساليب مطاردة نبض هي أساس الدراسات الحركية إلى مجموعة من الميزات الإضافية، بما في ذلك شركة-والتعديلات بوستترانسلاشونال، أوليجوميريزيشن، والبلمره، أساسا يسمح تحليل البروتين من الولادة حتى الموت. دراسات نبض–تشيس في طي البروتين متكاملان مع أساليب أخرى البيوكيميائية والفيزيائية لدراسة البروتينات في المختبر بتقديم معلومات الفسيولوجية وزيادة الأزمنة. هي تكييف الأساليب كما هو موضح في هذه الورقة بسهولة لدراسة الطي تقريبا أي البروتين التي يمكن التعبير عنها في نظم الثدييات أو خلايا الحشرات.

Introduction

طي البروتينات البسيطة نسبيا حتى ينطوي على العديد من الإنزيمات المختلفة قابلة للطي ومرافقين الجزيئية، والتعديلات التساهمية1. إعادة تشكيل كاملة لهذه العمليات في المختبر مستحيل عمليا، نظراً للعدد الهائل من المكونات المختلفة المعنية. ولذلك مرغوب فيه للغاية، دراسة البروتين قابلة للطي في فيفو، في الخلايا الحية. تقنيات تشيس نبض المشعة إثبات أداة قوية لدراسة التوليف، قابلة للطي، والنقل، وتحلل البروتينات في بيئتهم الطبيعية.

التمثيل الغذائي وسم البروتينات خلال نبضة قصيرة مع 35S المسمى الميثيونين/سيستين، متبوعاً بعملية مطاردة في غياب تسمية المشعة، يتيح تتبع محددة من سكان بروتينات المركبة حديثا في أوسع الوسط الخلوية. ثم البروتينات المستهدفة يمكن أن تكون معزولة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن وتحليلها عن طريق الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو تقنيات أخرى. للعديد من البروتينات، ورحلتهم عبر الخلية تتميز بتعديلات مرئية في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. على سبيل المثال، غالباً ما يترافق نقل البروتينات الغليكوزيلاتي من هيولى (ER) إلى مجمع غولجي بإدخال تعديلات على جليكانس ن مرتبطة أو إضافة ربط س جليكانس2،3. هذه التعديلات يؤدي إلى زيادات كبيرة في الكتلة الجزيئية الواضحة، التي يمكن رؤية التغييرات التنقل في صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. يمكن أيضا علامة النضج بالانقسامات proteolytic، مثل الانقسام وإشارة-الببتيد أو إزالة برو-الببتيدات، أسفر عن تغييرات في الكتلة الجزيئية الواضحة التي يمكن اتباعها بسهولة على جل الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة4. النشاط الإشعاعي بمزايا كبيرة على تقنيات قابلة للمقارنة مثل مطاردات سيكلوهيكسيميدي، حيث تمنع تخليق البروتين الرواية، كما العلاجات أطول سامة للخلايا، ولا تستبعد غالبية البروتينات كبار السن، الحالة المستقرة من التحليل، وبعض البروتينات بإنصاف أيام. مقارنة البروتينات تحت كل نونريدوسينج والحد من الظروف يسمح تحليل ثنائي كبريتيد تشكيل السندات، خطوة هامة في طي العديد من البروتينات الافرازية4،،من56، 7.

هنا يصف لنا طريقة عامة لتحليل طي البروتين والنقل في خلايا سليمة، باستخدام نهج مطاردة نبض مشعة. بينما نحن وتهدف إلى توفير الأسلوب مفصلة قدر الإمكان، البروتوكول تتمتع بإمكانيات لا حدود لها تقريبا للقدرة على التكيف وسوف تسمح الأمثل لدراسة البروتينات المحددة كل قارئ.

البروتوكولين تشيس نبض البديلة، تقدم للخلايا ملتصقة (الخطوة 1، 1 من البروتوكول المعروضة هنا) وآخر لتعليق الخلايا (الخطوة 1، 2 من البروتوكول المعروضة هنا). الشروط المقدمة هنا تكفي لتصور بروتين أعربت مع المستويات المتوسطة إلى العليا التعبير. إذا كان القارئ يعمل مع البروتينات أعرب سيئة أو مختلف الظروف بوستريتمينت، مثل إيمونوبريسيبيتيشنز متعددة، من الضروري زيادة حجم صحن أو الخلية عدد مناسب.

لوقف نبض تشيس، مطاردة العينات المأخوذة في كل مرة نقطة الجميع مأخوذة من أنبوب واحد من الخلايا. خطوات الغسيل بعد أن يتم حذف النبض؛ بدلاً من ذلك، كذلك إدماج 35S هو منع إضعاف مع فائض عالية من الميثيونين غير مسمى وسيستين.

استخدام البروتوكولات المقدمة المشعة 35S المسمى سيستين والميثيونين لمتابعة عمليات طي البروتين الخلوي. ينبغي إجراء جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية باستخدام تدابير الحماية المناسبة للتقليل إلى أدنى حد من أي تعرض للمشغل والبيئة للإشعاع المشعة وأداؤها في أحد مختبرات معينة. كالنبض-المطاردة وسم تقنية غير فعالة نسبيا في الأوقات نبض قصيرة (< 15 دقيقة)، وأقل من 1% مبلغ بداية النشاط الإشعاعي الذي أدرج في البروتينات المركبة حديثا. بعد إثراء البروتين المستهدفة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن، العينة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على أقل من 0.05 في المائة مبلغ بداية النشاط الإشعاعي.

على الرغم من أن استقرت الميثيونين 35S وسيستين وسم ميكس، سوف يحدث بعض التحلل، مما أسفر عن المركبات المشعة المتطايرة،. حماية الباحث والجهاز، ينبغي اتخاذ بعض الاحتياطات. الباحث دائماً أن تمتثل لقواعد السلامة الإشعاعية المحلية وقد ارتداء فحم التمريض القناع، إلى جانب معطف مختبر وقفازات (مزدوجة). يجب فتح قنينة الأسهم مع 35S الميثيونين وسيستين دائماً في غطاء دخان، أو تحت نقطة تطلعات محلية. بقع التلوث المختبرات المعروفة بأجهزة الطرد المركزي والماصات وأحواض المياه، وحاضنات والهزازات. يتم تقليل التلوث من هذه المناطق باستخدام ماصة نصائح مع عامل تصفية فحم، أنابيب ميكروسينتريفوجي ختم إيجابية (انظر الجدول للمواد)، وحوض الفحم الاسفنجيات في المياه والحمامات، الفحم تصفية ورقات ملتصقاً بأطباق نبض–تشيس، الفحم من الحرس في نظام الشفط، وإخضاع الأطباق التي تحتوي على الحبوب الفحم في الحاضنات وحاويات التخزين.

Protocol

كانت تعالج جميع الكواشف الإشعاعية والإجراءات وفقا لجامعة أوترخت المحلية الإشعاع القواعد والأنظمة. 1-نبض تشيس نبض تشيس للخلايا ملتصقةملاحظة: وحدات التخزين نظراً لهنا تستند إلى 60 مم خلية ثقافة الأطباق. 35 ملم أو أطباق 100 مم، ضرب وحدات التخزين قبل 1/2 أو 2، على ال…

Representative Results

ويرد في الشكل 2قابلة للطي وإفراز gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-1 من تشيس نبض ملتصقة. هلام نونريدوسينج (NR الخلايا في الشكل) يبين طي عنصر مؤكسد من gp120. فورا بعد النبض وسم من gp120 5 دقيقة (0 دقيقة تشيس) يظهر كعصابة منتشر في الهلام أعلى، وكما تقدم تشيس، ترحيل الفرقة أ…

Discussion

أساليب مطاردة نبض كانت ضرورية لتطوير فهم العلماء من البروتين قابلة للطي في خلايا سليمة. في حين أننا حاولنا أن توفر طريقة عامة قدر الإمكان، هذا النهج ينطوي على إمكانية للاختلافات لا حدود لها تقريبا لدراسة مختلف العمليات التي تحدث خلال قابلة للطي، النقل، والحياة للبروتينات داخل الخلية.

<p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبر براكمان، في الماضي والحاضر، للمناقشات المثمرة وتساعد في تطوير الأساليب التي عرضت في هذا المقال. هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من “مجلس البحوث الأوروبية” ضمن الاتحاد الأوروبي “البرنامج الإطاري السابع” (FP7-2007-2013) N ° 235649 وفي هولندا منظمة من العلمية البحوث (جمعية البحث العلمي الهولندية) تحت درجة N برنامج صدى 711.012.008.

Materials

1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes Sarstedt 72.706.400
Acetic Acid Sigma A6283 glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20×25 cm GE Life Sciences 28956475
Bromophenol Blue Sigma B8026 Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films Kodak Z350370-50EA
Cell-culture media Various N/A Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine Various N/A Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper Whatman 1872047
Charcoal filtered pipette tips Molecular bioproducts 5069B
Charcoal vacu-guard Whatman 67221001
Coomassie Brilliant Blue R250 Sigma 112,553 for electrophoresis
Cysteine Sigma C7352 Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 
Dithiothreitol (DTT) Sigma 10197777001 Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix Perkin Elmer NEG772014MC Other size batches of label are available depending on useage
EDTA Sigma E1644 Molecular biology grade
Gel-drying equipment Various N/A
Glycerol Sigma G5516 Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper GE Life Sciences 3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 24020117
HEPES Sigma H4034 Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C
Kimwipes delicate task wipes VWR 21905-026
MES Sigma  M3671 Molecular biology grade
Methanol Sigma MX0490 
Methionine Sigma M5308 Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment Various N/A
NaCl Sigma S7653 Molecular biology grade
N-ethylmaleimide Sigma E3876 Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS Sigma P5368 Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads GE health-care 17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 Molecular biology grade
Triton X-100 Sigma T8787 Molecular biology grade
Trizma base (Tris) Sigma T6066 Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager Amersham 29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath Nalgene 5970-0320PK

References

  1. Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
  2. Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
  3. Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
  4. Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
  5. Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
  6. Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
  7. Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
  8. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
  9. Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
  10. Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
  11. Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
  12. Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
  13. Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
  14. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  15. Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
  16. Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).

Play Video

Cite This Article
McCaul, N., Yeoh, H. Y., van Zadelhoff, G., Lodder, N., Kleizen, B., Braakman, I. Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase. J. Vis. Exp. (144), e58952, doi:10.3791/58952 (2019).

View Video