Summary
כאן נתאר פרוטוקול עבור שיטה כללית. צ'ייס הדופק המאפשר ניתוח קינטי של קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים להיות בעקבות בתאים חיים.
Abstract
תיוג רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק הוא כלי רב עוצמה עבור הלומדים ההבשלה הסתגלותי, התעבורה מיקומם הסלולר פונקציונלי, ההשפלה של היעד חלבונים בתאים חיים. באמצעות לזמנים קצרים (פעימה) radiolabeling (< 30 דקות) ומבוקר בחוזקה פעמים צ'ייס, זה אפשרי תווית רק חלק קטן של הבריכה הכולל חלבון ולעקוב אחרי הקיפול שלה. בשילוב עם nonreducing/הפחתת מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), immunoprecipitation עם נוגדנים (קונפורמציה-ספציפי), קיפול תהליכים אפשר לבחון בפירוט רב. במערכת זו נעשה שימוש כדי לנתח את קיפול חלבונים עם וריאציה ענק מאפיינים כגון חלבונים מסיסים, חלבונים transmembrane יחיד, מרובה עוברים, בכבדות N O glycosylated חלבונים, חלבונים עם ובלי דיסולפידי נרחב מליטה. . צ'ייס הדופק שיטות הן הבסיס של לימודי קינטית לתוך מגוון של תכונות נוספות, לרבות co - שינויים posttranslational, oligomerization ואת פלמור, בעיקרו של דבר המאפשר הניתוח של חלבון מלידה למוות. . צ'ייס הדופק מחקרים על קיפול חלבונים הם משלימים עם שיטות אחרות הביוכימי, biophysical ללמוד חלבונים במבחנה על ידי מתן רזולוציה טמפורלית מוגברת אינפורמציה פיזיולוגית. השיטות כפי שמתואר בתוך הנייר הזה מותאמים בקלות ללמוד קיפול של כמעט כל חלבון זה יכול לבוא לידי ביטוי במערכות יונקים או חרק-cell.
Introduction
קיפול של אפילו יחסית פשוטה חלבונים כרוך השונות מתקפלים אנזימים רבים, מלווים מולקולרית ו שינויים קוולנטיות1. שיחזור מלא של אלה תהליכים במבחנה הוא בלתי אפשרי כמעט, בהתחשב ומספר עצום של מרכיבים שונים המעורבים. לכן, רצוי מאוד, ללמוד חלבון מתקפל ויוו, בתאים חיים. טכניקות רדיואקטיבי. צ'ייס הדופק להוכיח כלי רב עוצמה עבור הלומדים את סינתזה, קיפול, תחבורה, והשפלה של חלבונים בסביבתם הטבעית.
חילוף החומרים תיוג של חלבונים במהלך דופק קצר עם 35התווית על-ידי S מתיונין/ציסטאין, ואחריו מרדף בהיעדר תווית רדיואקטיבי, מאפשר מעקב מסוים של אוכלוסייה של חלבונים לאחרונה מסונתז ב חצרו הסלולר רחב יותר. לאחר מכן, חלבונים היעד יכול להיות מבודדים באמצעות immunoprecipitation, נותחו באמצעות מרחביות-עמוד או בטכניקות אחרות. חלבונים רבים, המסע שלהם דרך התא מסומן על-ידי שינויים הנראים לעין על ג'ל מרחביות-דף. לדוגמה, העברת מהחלבונים glycosylated תוך-פלזמית (ER) למתחם גולג'י לעיתים קרובות מלווה שינויים של glycans מקושרים-N או התוספת של2,O מקושרים glycans3. שינויים אלה גורמות גדול לעלייה המסה המולקולרית לכאורה, אשר ניתן לראות על ידי ניידות שינויים בדף-מרחביות. ההבשלה יכולים גם להיות מסומנים על ידי אדמירל הפרוטאוליטי, כגון אות-פפטיד מחשוף או ההסרה של pro-פפטידים, וכתוצאה מכך שינוי המסה המולקולרית לכאורה ניתן בעקבות בקלות על ג'ל מרחביות-דף4. רדיואקטיביות יש יתרונות ניכר על טכניקות דומות כגון cycloheximide רודף, איפה סינתזה של חלבון הרומן מנועה, כמו טיפולי ארוך רעילים לתאים, אינה שוללת את הרוב המכריע של מבוגר, מצב יציב מהחלבונים ניתוח, כמו כמה חלבונים יש מחצית החיים של ימים. ההשוואה של חלבונים תחת שניהם nonreducing הפחתת התנאים מאפשר הניתוח של היווצרות קשר דיסולפידי, צעד חשוב בקיפול של הרבה חלבונים הפרשה4,5,6, 7.
כאן אנו מתארים שיטה כללית לניתוח של קיפול חלבונים ותעבורה תאים שלמים, תוך שימוש בגישה רדיואקטיבי. צ'ייס דופק. בעוד אנחנו כיוונת לספק שיטת כמו מפורט ככל האפשר, הפרוטוקול פוטנציאלי כמעט בלתי מוגבלת של הסתגלות ויאפשר אופטימיזציה ללמוד חלבונים ספציפיים של כל קורא.
שני פרוטוקולים הדופק חלופי-צ'ייס, אחד עבור תאים חסיד (שלב 1.1 של פרוטוקול המובאת כאן) ואחד עבור השעיה תאים (שלב 1.2 של פרוטוקול המובאת כאן) הינם מסופקים. התנאים הניתנים כאן מספיקים להמחיש חלבון שבאה לידי ביטוי עם רמות בינונית-גבוהה הביטוי. אם הקורא הוא עובד עם חלבונים ביטוי לקוי או תנאים posttreatment שונים, כגון immunoprecipitations מרובות, זה הכרחי להגדיל את גודל המנה או הנייד שלי כראוי.
לצ'ייס הדופק ההשעיה, הדגימות צ'ייס שצולמו לכל נקודת זמן כל לקוחים מתוך שפופרת אחת של תאים. השלבים לשטוף אחרי הדופק מושמטים; במקום זאת, בהמשך תיאגוד 35S נמנעת באמצעות דילול עם עודף גבוה של מתיונין ללא תווית, ציסטאין.
הפרוטוקולים הציג להשתמש רדיואקטיבי 35התווית על-ידי S ציסטאין ומתיונין לעקוב אחר תהליכים קיפול חלבונים תאיים. כל הפעולות עם ריאגנטים רדיואקטיבי צריכה להתבצע באמצעות אמצעי הגנה מתאימים כדי למזער כל חשיפה של המפעיל לבין הסביבה לקרינה רדיואקטיבית, ניתן לבצע בתוך מעבדה ייעודית. . המרדף הדופק תיוג טכניקה הוא יעיל יחסית בזמנים קצרים הדופק (< 15 דקות), פחות מ 1% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות מעוגנת את החלבונים עתה מסונתז. לאחר העשרת של חלבון המטרה באמצעות immunoprecipitation, המדגם מרחביות-דף מכיל פחות מ- 0.05% מהסכום ההתחלתי של רדיואקטיביות.
למרות מתיונין 35S של ציסטאין תיוג מיקס מתייצב, כמה ריקבון, מניב רדיואקטיבי תרכובות נדיפות, תתרחש. כדי להגן על החוקר, את המנגנון, כמה אמצעי זהירות יש לנקוט. החוקר תמיד צריך לציית? לחוקים בטיחות קרינה מקומית, ניתן ללבוש של פחם סיעוד מסכה, מלבד חלוק מעבדה וכפפות (זוגי). מניות צלוחיות עם 35S מתיונין, ציסטאין תמיד אמור להיפתח בשכונה fume, או תחת נקודת שאיפה מקומיים. מעבדה ידוע זיהום שהנקודות צנטריפוגות, פיפטות, מרחצאות מים, חממות, ומנענעים. הזיהום של אזורים אלה מצטמצם באמצעות פיפטה טיפים עם מסנן פחם, צינורות microcentrifuge חיובי-חותם (ראה טבלה של חומרים), אקווריום פחם ספוגים מים אמבטיות, פחם מסנן עיתונים מודבקים את הכלים. צ'ייס דופק, פחם משמר מערכת השאיפה, ואת המיקום של מאכלים המכילים גרגרים פחם חממות, מיכלי אחסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ריאגנטים רדיואקטיבי והתהליכים שטופלו בהתאם המקומי אוניברסיטת אוטרכט קרינה חוקים ותקנות.
1. דופק צ'ייס
-
הדופק צ'ייס על תאים חסיד
הערה: אמצעי האחסון שניתנו כאן מבוססים על 60 מ מ תא תרבות מנות. 35 מ מ או מנות 100 מ מ, הכפילו את אמצעי האחסון ב- 1/2 או 2, בהתאמה. פרוטוקול זה משתמש זמן הדופק של פי 10 דקות וצ'ייס של 0, 15, 30, 60, 120 ו- 240 דקות. אלה יכולים להיות מגוונים בהתאם חלבונים ספציפיים הנלמדים (נדונה להלן).- זרע תאים חסיד (למשל, HEK 293, הלה, צ'ו) במנות תרבות תא 60 מ מ 6, כך הם יהיו subconfluent (80% - 90%) ביום של המרדף דופק. השתמש צלחת לפחות אחת לכל נקודת זמן ו/או תנאי.
- אם נדרש, transfect את התאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים בהתאם להוראות היצרן; לחלופין, לשווק מגלי8 התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.
- לשטוף את הכלים עם 2 מ של מאגר לשטוף (של האנק מאוזנת תמיסת מלח [HBSS]), להוסיף 2 מ של רעב בינוני (נורמלי תרבות בינוני חסר מתיונין, ציסטאין, סרום שור בעובר [FBS], כגון בינוני חיוני מינימלי [מ] ללא מתיונין, ציסטאין אבל עם 10 מ מ HEPES, pH 7.4), למקם את הכלים 37 ° C humidified חממה עם 5% CO2 למשך 15 דקות.
- להעביר את הכלים המדפים באמבט מים prewarmed-37 ° C כך הם במגע עם מים אך לא לצוף. להפעיל טיימר.
- בגיל 40 s, תשאף המדיום הרעבה, ולהורות על 600 µL של פתרון הדופק (רעב מדיה + צלחת µCi/35 מ מ 55 תווית, לראות את הפתק הקודם שלב 1.1.1) אל הפיפטה ולהוסיף אותו בעדינות במרכז המנה-בדיוק 1 דק. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות ב- t הוא מנות הנותרים. להתחיל עם הדגימה צ'ייס הארוך כדי לחסוך זמן במהלך הניסוי שלך.
הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום. - -בדיוק 11 דקות ועבור כל המנות הבאות, חוץ המדגם צ'ייס 0 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני ישירות לצלחת תשאף את זה, שוב, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני. חזור על שלב זה במרווחים 1 דקות עבור מנות הנותרים. העברת כל המנות חממה 37 ° C.
- בדיוק 16 דקות, להוסיף 2 מ של צ'ייס בינוני (נורמלי תרבות בינוני + 10 מ מ HEPES [pH 7.4], 5 מ מ ציסטאין ומתיונין 5 מ מ) ישירות אל המנה מדגם 0 דקות על המדיום הדופק להפסיק תיוג; לאחר מכן, תשאף מיד, להעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר ולהוסיף 2 מ של מאגר עצירה כקרח (HBSS + 20 מ מ N- ethylmaleimide [NEM]).
הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0. עבור דוגמה זו, להמשיך היישר לשלב 1.1.9. - העברת כל מנה צ'ייס בחזרה אל המים הרותחים 2 דקות לפני כל הזמן צ'ייס (למשל, מין 24 על מרדף 15 דקות), בזמן המדויק צ'ייס (למשל, 26 דקות עבור מרדף 15 דקות), תשאף התקשורת צ'ייס (או להעביר אותו צינור microcentrifuge אם בעקבות יחסי ציבור הפרשת otein) ולהעביר את הצלחת צלחת אלומיניום מקורר. להוסיף 2 מ של מאגר עצירה קר כקרח.
- דגירה כל המנות על הקרח במאגר עצירה ≥5 דקות; לאחר מכן, תשאף הפתרון להפסיק, לשטוף אותו עם 2 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון. האחות לשטוף את ואת lyse מנות עם 600 µL של פירוק מאגר (באגירה פוספט תמיסת מלח [PBS] + אבקת nondenaturing [ראה טבלה של חומרים] מעכבי פרוטאז + 20 מ מ NEM). להשתמש במגרדת התא כדי להבטיח כי הכלים הם lysed באופן כמותי.
- להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ו- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.
-
הדופק צ'ייס עבור תאים השעיה
הערה: כדי להבטיח תיוג יעיל, תאים צריך להיות פעמו-ריכוז של 3 x 106 5 x 106 תאים למ"ל, כרכים צ'ייס צריך להיות 4 x האחסון דופק. בדוגמה הבאה, אנחנו פעמו 5 x 106 תאים נפח של 1 מ ל 10 דקות, להניב חמש צ'ייס זמן נקודות (0, 15, 30, 60 ו- 120 דקות) של 1 מ"ל, המכיל תאים6 עונה 1 פרק 10 לכל נקודת זמן. כל הפתרונות יהיו זהים לאלה בסעיף 1.1.- התרבות התאים ההשעיה (למשל, 3T3, Jurkat) על פי פרוטוקול שפורסמו בעבר9 כך יש מספר מספיק של תאים בזמנו של הניסוי, לפחות עונה 1 פרק 106 תאים בכל פעם הצבע ו/או תנאי.
- אם נדרש, transfect תאים עם ריאגנטים זמינים מסחרית תקנים על פי הוראות היצרן, או לשווק מגלי8 התאים יום אחד לפני. צ'ייס הדופק הניסוי עם הבונה המתאים לביטוי.
- גלולה 5 x 106 תאים לכל תנאי בשפופרת 50 מל במשך 5 דקות ב 250 x g בטמפרטורת החדר, ותוא וקינ 1 x 5 מ של רעב מדיה, גלולה אותם שוב, ואני resuspend אותם ב 1 מ"ל של רעב מדיה.
- להעביר את התאים באמבט מים 37 ° C, דגירה אותם עבור 10-25 מינימלית להתסיס הצינורות כל 10-15 דקות כדי למנוע את התאים ליישוב בתחתית.
- התחל את הטיימר. ב בדיוק 1 דקה, להוסיף µCi 275 (55 µCi/1 x 106 תאים) של תווית מדולל ישירות אל הצינור המכיל תאים ו מערבולת לערבב.
הערה: בעת טיפול חומר רדיואקטיבי, זה חיוני לעקוב אחר הזהירות המתאימה ואת מקומי חוקים ותקנות למניעת חשיפה מקרית ו/או זיהום. - בדיוק 11 דקות, הפסיק תיוג על-ידי הוספת 4 מ"ל של צ'ייס מדיה. לערבב המדגם ולהעביר מיד 1 מ"ל ל צינור 15 מ"ל בקרח, המכיל 9 מיליליטר כקרח להפסיק פתרון.
הערה: זהו המדגם צ'ייס דקות 0. - חזור על שלבים אלה עבור כל נקודת זמן רצופים. לאחר כל הזמן נקודות נאספים, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס. האחות המדיום (או להעביר אותו צינור 15 מ"ל אם בעקבות הפרשת חלבון). לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר להפסיק פתרון, גלולה את התאים עבור 5 דקות ב x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס.
- האחות הפתרון להפסיק, לחלוטין lyse התאים עם 300 µL מאגר פירוק קר כקרח, דגירה אותם במשך 20 דקות על קרח כדי להבטיח פירוק מוחלט. להעביר את lysate 1.5 mL microcentrifuge ובשעות צנטריפוגה 10 דקות ב 15,000-20,000 x g ב- 4 ° C עד הצניפה הגרעינים.
2. Immunoprecipitation
- לשלב נוגדנים (ראה את הדיון) ו- 50 µL של immunoprecipitation חרוזים (למשל, חלבון A-Sepharose) (10% השעיה [וי/v] מאגר פירוק + 0.25% אלבומין שור [BSA]) ב- microcentrifuge צינור, דגירה אותם ב 4 ° C ~ 30 דקות ב שייקר.
- גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. להוסיף 200 µL של lysate התערובת נוגדן-חרוז, דגירה ב 4 ° C ב שייקר 1 h או ראש-ראש-נגמר אם דורש immunoprecipitation > 1 h.
- גלולה של חרוזי 1 דקות ב x 12,000 g בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל immunoprecipitation שטיפת המאגר. מקם את הדגימה ב שייקר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3 וחזור לשטוף את 1 x. לאחר מכן, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את החרוזים ב 20 µL טה מאגר, pH 6.8 (10 מ"מ טריס-HCl, 1 מ מ EDTA). מערבולת המדגם.
- להוסיף 20 µL של 2 x דוגמת המאגר ללא הסוכן של צמצום, מערבולת, אחמם את זה למשך 5 דקות ב 95 ° C, ו מערבולת שוב.
הערה: אם רק הכנת דוגמאות תוך צמצום, 2 µL של 500 מ מ DTT להוסיף בשלב זה. לאחר מכן, המשך לשלב 2.7. - גלולה החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.3. להעביר µL 19 של תגובת שיקוע nonreduced צינור microcentrifuge טריים המכילים µL 1 של 500 מ מ DTT, centrifuge את הדגימה, ואת מערבולת בעבר חימום זה עבור 5 דקות ב 95 ° C שוב.
- בדוגמה עבור 1 דקות ב x 12,000 g; זוהי הדוגמה מופחת. תירגע עד לטמפרטורת החדר ומוסיפים µL 1.1 של 1 מ' NEM את מופחת והן את הדגימה nonreduced. מערבולת, ספין למטה הדגימות.
3. מרחביות-דף
- ראשית, קובעים את המתאים מרחביות-דף פתרון ג'ל אחוז עבור החלבון עניין. לדוגמה, HIV-1 gp120, כאשר deglycosylated, פועל במהירות ~ 60 kDa ומנותח ב- 7.5% ג'ל.
- להכין לתערובת ג'ל פתרון ללא TEMED על פי הוראות היצרן (x % אקרילאמיד, 375 מ"מ טריס-HCl [pH 8.8,] מרחביות 0.1% [w/v], ו 0.05% קירור [APS] [w/v]), דגה תחת ואקום עבור > 15 דקות. בעוד התערובת ג'ל הוא degassing, ביסודיות לנקות צלחות זכוכית ג'ל עם 70% אתנול ורקמות נטולת ולמקם אותם לתוך מנגנון הליהוק.
- הוסף TEMED לתערובת ג'ל פתרון (ב ריכוז סופי של 0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, פיפטה בין לוחות זכוכית, עוזב ~1.5 ס מ מרחב הג'ל הערימה. כיסוי את הג'ל עם יונים H2O או אלכוהול איזופרופיל ובזהירות אנו נותנים פולימריזציה.
- ברגע הג'ל פתרון כולל polymerized, להכין לתערובת ג'ל הערימה (אקרילאמיד 4%, מ מ 125 [pH 6.8], טריס-HCl 0.1% מרחביות [w/v], 0.025% APS [w/v]).
- ריקון העליון של הג'ל פתרון עם יונים H2O ולהסיר, אז כל המים.
הערה: השתמש נייר סינון כדי להסיר את הטיפות האחרונות. - להוסיף TEMED לתערובת ג'ל הערימה (0.005% [וי/v]), לערבב ביסודיות, ואת כיסוי הג'ל פתרון עם ג'ל הערימה והכנס מסרק 15-. טוב. ברגע הג'ל הערמה יש polymerized, להעביר אותו התא פועל ולמלא התאים העליונים והתחתונים עם הפעלת מאגר (25 מ מ טריס-HCl, גליצין 192 מ"מ [pH 8.3] ו- 0.1% מרחביות [w/v]).
- לטעון µL 10 מדגם לכל ליין minigel 15-ליין. להימנע מטעינה את הדגימות הראשון ולא את הסמטה האחרונה הג'ל וטען המאגר מדגם nonreducing ב כל מסלולים ריקים כדי למנוע החיוכים של להקות. לפעול ג'לים-קבוע mA/ג'ל 25 עד החזית צבע היא בחלק התחתון של הג'ל.
- הסר את ג'לים הזכוכיות, כתם של ג'לים עם פתרון מכתים חלבון (חומצה אצטית 10%-30% מתנול H2O + 0.25% מבריק הכחול R250 [w/v]) עבור חמש דקות עם עצבנות, ולא לאחר מכן, destain במשך 30 דקות עם destaining פתרון (צביעת פתרון ללא R250 כחול מבריק).
- לארגן ג'ל פנים כלפי מטה על פלסטיק לעטוף, אז, במקום נייר כרומטוגרפיה 0.4 מ מ מעליהם. מניחים ג'ל כריך כרומטוגרפיה הנייר-הצד למטה על גבי ג'ל מייבש. עקבתי אחרי ההוראות של היצרן, לייבש את ג'לים עבור 2 h ב- 80 מעלות צלזיוס.
- להעביר את ג'לים מיובשים קסטה, כיסוי אותם עם מסך קולנוע או זרחן autoradiography. אם משתמש autoradiography סרט, שלב זה חייב להתבצע בחדר חשוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קיפול ואת הפרשת HIV-1 gp120 לצ'ייס הדופק חסיד מוצג באיור2. הג'ל nonreducing (תאים NR באיור) מציגה קיפול חמצוני של gp120. מיד אחרי הדופק תיוג של 5 דקות (מינימום 0 צ'ייס) gp120 שמופיע בתור להקת ' מאטום לשקוף ' גבוה יותר בג'ל ולאחר בהמשך צ'ייס, הלהקה נודד למטה הג'ל דרך אפילו יותר תופס קיפול intermediates (IT) עד הוא מצטבר בלהקה חזק (NT) זה מייצג gp120 מקופל באופן מקורי. מצב זה מתרחש כפי היווצרות חוב דיסולפידי מגביר את הקומפקטיות של החלבון, גורם לו להעביר מהר יותר חלבון מלא מופחת. על הג'ל להפחית (תאים R באיור), הקשרים דיסולפידי בטפסים כל שיצומצם כזה, בכל עת צ'ייס, הם אינם משפיעים על ניידות. פעולה זו מאפשרת הניתוח של שינויים אחרים. המעבר במשך הזמן מ- Ru Rc מייצג את המחשוף אות-פפטיד posttranslational של gp120: הניידות מגביר בשל האובדן של פפטיד האות, אשר גדלה במהלך המרדף חלבונים נוספים להשיג הקיפול יליד ולאבד פפטיד האות שלהם. על שני nonreducing והפחתת הג'ל, האות מתחילה ירידה מ ~ 1 h ואילך בשל הפרשת gp120. זה יכול להיות במעקב על-ידי ניתוח התקשורת (בינוני באיור). השוואה של ג'לים nonreducing והפחתת חושף שינויים קשר דיסולפידי והסרה אות-פפטיד. זה היה אפשרי רק בגלל שינוי אחר, מקושר ל- N גליקוזילציה ובשינויי glycan, הוצאו מן gp120 (וניתוח) על ידי עיכול עם endoglycosidase H לפני מרחביות-דף.
הסחר של שרשרת כבדה ממוצע אימונוגלובולינים ז (IgM) החל מרדף הדופק ההשעיה מוצג באיור3. שינוי לאורך זמן מ- HCER HCגולג'י מייצג את הסחר של רשת ממוצע מחדר המיון כדי גולג'י, אשר מקדים הפרשת מהתא. שינוי זה מסה מולקולרית נגרמת על ידי השינוי של glycans מקושרים-N ב- גולג'י.
איור 1 : תרשים סכמטי של הפרוטוקול עבור הדופק צ'ייס, immunoprecipitation, עמודים מרחביות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : מתקפלות, הפרשת HIV-1 gp120, נקבע על ידי חסיד הדופק צ'ייס. מנות subconfluent 60 מ מ של תאים הלה לבטא gp120 HIV-1 היו הדופק שכותרתו 10 דקות ורדפו עבור הצביעו פעמים. לאחר immunoprecipitation של gp120, הדגימות היו deglycosylated, נותחה באמצעות ג'ל מרחביות-דף 7.5%. זה = intermediates מתקפלים; NT = gp120 מקורי; Ru = gp120 אות-פפטיד-uncleaved מופחת; Rc = gp120 אות פפטיד-ביקע מופחת; עלון נאט ו: = nonreducing; R = צמצום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : סחר של שרשרת כבדה IgM, נקבע על ידי השעיית הדופק צ'ייס. בתאי B ממוצע+ I.29 5 x 106 היו דופק עם תוויות עבור 5 דקות ורדפו עבור הצביעו פעמים. לאחר immunoprecipitation, הדגימות נותחו באמצעות ג'ל מרחביות-דף 10%. HC = ממוצע בנוגדנים שרשרת כבדה; LC = שרשרת אור בנוגדנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. צ'ייס הדופק שיטות היו חיוניים לפיתוח הבנה המדענים של חלבון מתקפל לתוך תאים שלמים. ניסינו לספק שיטה זה כמו כללי ככל האפשר, גישה זו יש הפוטנציאל של וריאציות כמעט בלתי מוגבלת ללמוד תהליכים שונים המתרחשים בזמן קיפול, את התחבורה ואת החיים של חלבונים בתוך התא.
בעת ביצוע מרדף הדופק באמצעות תאים חסיד במנות, זה חיוני לטיפול כל מנה זהה ככל האפשר, צלחת נפרדת משמש עבור כל נקודת זמן ו/או תנאי בניסוי. במיוחד עבור הדופק קצר וזמני צ'ייס (< 5 דקות), זה חיוני כדי לשמור על שליטה הדוקה על הפעמים הדופק וצ'ייס (עם טיימר דיגיטלי). הדופק רודף עם תאים ההשעיה שיכולה לסייע להפחית את ההשתנות כמו הדוגמאות לקוחים מתוך צינור יחיד. כמו כמה סוגי תאים מקפידים פחות טוב תרבות מנות יותר מאחרים, להקפיד על מנת להבטיח כי התאים לא נשטפו במהלך השינויים בינוני שונים. זה ניתן להתגבר על ידי או באמצעות תאים אלה ההשעיה או על ידי ציפוי הכלים עם פולי-L ליזין או ג'לטין, לדוגמה, לדבוק לתאים המנות תרבות. כדי למדוד את הפארמצבטית של תיוג בין הצלחות, מדגם של lysate צריך להיבדק על ידי מרחביות-דף כדי לבדוק את כל הדגימות זהה הכולל דוגמה תיוג וחלבון. לחלופין, גזים ספירת lysates תקים סה כ ספירות-לפי-דקה (cpm) שולבו אבל לא יספק מידע על האוכלוסייה חלבון הנקרא.
אם חלבון המטרה תוויות לקוי, האות הוא גדל על-ידי הגדלת מספר התאים (או מנות) במקום להגדיל את כמות תווית. הארכת הזמן הדופק הוא אופציה כאשר קינטיקה של תהליך לימודי תאפשר את זה. הזמן האידיאלי הדופק תשתנה בהתאם לכל מטרה בשל גורמים כגון רמת ביטוי, הקצב שעתוק, מספר methionines/cysteines ואת קצב מתקפלים של החלבון. ככזה, ניסויים חייב להתבצע כדי לקבוע את האיזון הטוב ביותר בין הגורמים הנ ל ניסוי תוך שמירה על המטרה ניסיוני בראש. אם הם נחקר intermediates בזמן קיפול, לדוגמה, רצוי דופק את התווית עבור כמו קצר זמן ניתן לקבל חומר המוצא קרוב למצב פרש ככל האפשר, תוך איזון רמות הביטוי. לחלופין, אם תחבורה או השפלה של חלבון המטרה של המחקר, עשוי להיות מאורכים הדופק פעמים כדי לספק את הרמות הגבוהות ביותר של אות אפשרי מבלי להתפשר על מידע קינטי. באופן כללי, הדופק פעמים יכול לנוע בין 2-15 דקות בעת שימוש בפרוטוקול זה ללא שינוי. ניסויים קודמים5 הוכיחה זמן השהיה של ~ 10 s אחרי הדופק לפני שילוב של רדיואקטיביות לתוך הבריכה הכולל חלבון; זה חשוב לזכור בעת קריאת מידע קינטי של הדופק-צ'ייס ניסויים. בקיצור דופק פעמים (< 2 דקות), לשמור את כל הצלחות על האמבט במים במשך הזמן הדופק כולו. אם מורחב הדופק פעמים (> 1 h) נמצאים בשימוש, זה רצוי להגביר את עוצמת הדופק פי 1.5 ומניחים מנות על כיסא נדנדה ב חממה 37 ° C במהלך הדופק כדי למנוע ייבוש הכלים. בעוד קיימים פתרונות תיוג המכיל בודדים 35S-מתיונין/ציסטאין או שילוב, השילוב הוא מועדף גם כאשר חלבונים המכילים רק מתיונין או ציסטאין להיות מסומנים כמו שניהם נדרשים כדי לשמור על סינתזה של חלבון כללי בתא. אם התנאים ניסיוני מחייבים מתיונין ספציפי/ציסטאין תיוג, רמות nonradioactive מתיונין ציסטאין במהלך הדופק שתישמר בהתאם.
צ'ייס פעמים (מספר נקודות זמן) נקבעים באופן דומה. מקום התחלה טובה היא לקבוע בפעם הראשונה צ'ייס (לאחר המרדף דקות 0) שווה את הזמן דופק, ואז להכפיל את משך הזמן עבור כל נקודת זמן רצופים (למשל, 5, 10, 20 ו- 40 דקות). עם זאת, זה חייב להיות מוטבת לכל חלבון ספציפי או שאלה.
כדי למנוע את ההפעלה של תגובות הלחץ על ידי רעב (אשר עשוי להשפיע על סינתזת חלבונים וקיפול), באופן אידיאלי, כמה מתיונין ללא תווית, ציסטאין צריך להתווסף הפתרונות הרעבה, radiolabeling. הכמות תהיה תלויה על הקו תא, הפעם תיוג, כמות radiolabel המשמש אמצעי אחסון במדיה, תצטרך להיבדק. נקודת התחלה טובה היא 1% מהסכום של ציסטאין ומתיונין הנוכחי במדיום התרבות תאים, אשר יכולים להיות מוגברת עם הגדלת הדופק פעמים. תקופות רעב, עם או ללא חומצות אמינו ללא תווית, צריכה להישמר בטווח של 15-30 דקות כדי להבטיח תווית נאותה התאגדות ולמנוע את ההפעלה של תגובות דחק. בעת שימוש של הדופק מורחבת (h. ≥1), רעב אינו נדרש.
בעקרון, יפעלו כל מערכת מאגר, כגון HEPES, טריס או MES, המאגר פירוק המתוארים כאן יהיה מתאים לרוב המטרות. דטרגנט הריכוז הדרוש כדי lyse תאים תלויות מספר תאים ונפח דטרגנט. הריכוז תמיד צריך להיות מעל ריכוז קריטי מיצלה (CMC) ואת כמות מספיקה כדי lyse תאים דטרגנט. כלל אצבע אמפירי זה µL 200 של סבון nondenaturing 0.5% (ראה טבלה של חומרים) מספיקה lyse המקבילה תא ~ 1 מ"ג של חלבון (~ 1 x 106 תאים). ריכוז המלחים וחומרי ניקוי יכול גם להיות מגוונים על פי היישום, אך באופן כללי, תנאי זה לשבור לפתוח גרעינים (מלח גבוהה, > 0.1% מרחביות) יש להימנע ככל הנוכחות של DNA חופשי יפריע immunoprecipitation. אם זה לא ניתן למנוע, למשל, כאשר lysates תא מלאה כולל גרעינים או מגורען חלבונים צריך להיות מנותח, דנ א יכול הטייה על ידי עובר התאים דרך מחט מד קטן לפני immunoprecipitation. . זה המועדף נגמר sonication על מנת למנוע שימוש מופרז קצף ואת הייצור של אירוסולים רדיואקטיבי
עבור immunoprecipitation, כמות אופטימלית של נוגדנים והן המאגר שטיפת הטוב ביותר עבור כל שילוב נוגדן אנטיגן חייב להיבדק ביסודיות כדי להשיג איזון בין האות הרצוי אנטיגן ורקע. נוגדנים תמיד צריך להיות נוכח עודף מעל אנטיגנים כדי להבטיח immunoprecipitation כמותיים; נקודת התחלה טובה היא µg 1 של נוגדנים לכל immunoprecipitation מ- 35 מ מ צלחת/1 x 106 תאים. ניתן להקטין את הרקע על ידי הגדלת את חומרי ניקוי או ריכוזי מלח. בפרט, התוספת של ≤ 0.1% מרחביות שיכולה לסייע להפחית באופן משמעותי את הרקע, אבל גם עשוי לשבש את האינטראקציות נוגדן-אנטיגן. כדי לשלוט על ייחודה של נוגדנים במהלך immunoprecipitation, תאים זהים חסר החלבון היעד אמור לשמש כאשר היא זמינה. אם זו אינה פשוטה, כגון כאשר נבחנים חלבונים אנדוגני, תפעל ביטוי או דלדול של אנטיגן. כדי לשלוט על רקע (וספציפיות), או סרה preimmune (במידת האפשר) או פקדים isotype אמור לשמש. כדי לשלוט עבור אנטיגנים האיגוד ישירות אל immunoprecipitation חרוזים, חרוזים ללא נוגדנים צריך לשמש גם. התנאים שסופק כאן להתייחס כנקודת התחלה, כמו כל זוג נוגדן אנטיגן ידרוש לאופטימיזציה של שטיפת מאגר ותנאים לשטוף. במקרה של יותר מדי רקע, לא להגדיל את מספר שוטף אבל מעדיף את הזמן של כביסה ו/או ההרכב של המאגר לשטוף. אם האינטראקציות רגישים במיוחד כגון coimmunoprecipitations יש לטפל בו, ייתכן שיהיה עדיף לבצע את כל השלבים שטיפת ב 4 ° C, באמצעות מאגרי קר כקרח.
אחד היתרונות של תאים חסיד ההשעיה תאים הוא הסם ניתן לבצע טיפולים כמעט בכל שלב במהלך המרדף דופק. אם עם מעכבי המלווה, לדוגמה, לא ניתן יהיה להבדיל השלכותיה על co - לעומת posttranslational השלבים של תהליך קיפול. זה ניתן להאריך על ידי התאמת המאגרים שטיפת פירוק ו- immunoprecipitation (שנדונו לעיל) כדי לאפשר את coimmunoprecipitation של חלבון-חלבון סוכך מתחמי במהלך10,מתקפל11,12.
הטיפול postlysis של דגימות תתרחב הטווח של שאלות ניתן לטפל. פרוטאז מוגבל בעיכול חלבונים היעד לפני immunoprecipitation תספק מידע הסתגלותי נוסף שימש בהצלחה לעקוב אחר קיפול של חלבונים, במיוחד אלה חסר דיסולפידי אג ח13, 14. ניתן לנטר צבירת חלבון ואת היווצרות מורכבות על ידי צנטריפוגה צפיפות-הדרגה סוכרוז לפני15,immunoprecipitation16.
כדי לנצל את מלוא היתרונות של הדופק מרדפים, הזמינות של ריאגנטים באיכות גבוהה נדרשת עבור immunoprecipitations. כאשר בחינת ביניים מתקפלים, זה חיוני כדי להיות נוגדנים המסוגלים מושך למטה כל צורות של החלבון תחת ניתוח. אם נוגדנים ספציפיים כדי החלבון היעד אינם זמינים, זה יכול להיות מוחלף על ידי באמצעות תגי קירבה. עם זאת, זה קשות מגביל התועלת של שיטות postlysis, כמו proteolysis מוגבלת, לחקור ישירות קונפורמציה של חלבון, כפי שניתן יהיה לשחזר רק מתויג חלקים.
הרגישות של הדופק רודף הוא מוגבל על ידי מספר שאריות מתיונין, ציסטאין בחלבון המדובר. חלבונים עם מספר נמוך של מתיונין/ציסטאין שאריות בשילוב עם רמת ביטוי נמוך לא ניתנים לגילוי בניסויים. צ'ייס דופק בעת ביצוע שינויים postlysis כגון proteolysis מוגבלת, יהיה רק חלקים מתיונין/ציסטאין-המכיל לזיהוי.
לסיכום, נתון הפירוט קינטי דופק רודף לספק, הם משלימים רבים אחרים טכניקות וכלים למדתי ביולוגיה מולקולרית של התא באותה רמת מצב יציב. בתור שכזה, הם ממשיכים להיות מרכיב יקר ערך בארגז הכלים של הביולוג מולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה לכל החברים של המעבדה Braakman, מעבר, להציג, דיונים פוריים שלהם ולעזור בפיתוח שיטות שהוצגו במאמר זה. הפרויקט קיבל מימון של המועצה האירופית למחקר תחת של האיחוד האירופי תכנית המסגרת השביעית (האיחוד FP7/2007-2013) N ° 235649 והן הולנד הארגון של מדעי למחקר (בתחרות) תחת אקו-תוכנית N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
