Summary
Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.
Abstract
Pulso-perseguição radioativo rotulagem é uma poderosa ferramenta para estudar a maturação conformacional, o transporte para sua localização celular funcional e a degradação de proteínas do alvo em células vivas. Com curto (pulso) radioativos vezes (< 30 min) e rigidamente controlado tempos de perseguição, é possível rotular apenas uma pequena fração da piscina proteína total e siga sua dobradura. Quando combinado com os/redução electroforese do gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e imunoprecipitação com anticorpos (conformação específicos), processos de dobramento pode ser examinado em grande detalhe. Este sistema tem sido usado para analisar o dobramento de proteínas com uma enorme variação nas propriedades, tais como proteínas solúveis, proteínas transmembrana única e multi-pass, fortemente glicosilados N - e O proteínas e proteínas com e sem bissulfeto de extensivo criar laços. Pulso-perseguição métodos são a base de estudos cinéticos em uma gama de recursos adicionais, incluindo co - e modificações do posttranslational oligomerização e polimerização, essencialmente, permitindo a análise de uma proteína desde o nascimento até a morte. Estudos de pulso-perseguição no enrolamento de proteínas são complementares com outros métodos de bioquímicos e biofísicos para estudar proteínas em vitro , fornecendo informações fisiológicas e maior resolução temporal. Os métodos descritos dentro deste papel adaptam-se facilmente para estudar o dobramento de quase qualquer proteína que pode ser expressa em sistemas de mamíferos ou inseto-célula.
Introduction
A dobradura do mesmo relativamente simples proteínas envolve muitas enzimas diferentes de dobramento moleculares chaperones e modificações covalentes1. Uma reconstituição completa destes processos em vitro é praticamente impossível, dado o vasto número de diferentes componentes envolvidos. Portanto, é altamente desejável, para estudar a proteína dobra na vivo, em células vivas. Técnicas de pulso-perseguição radioativo provam uma poderosa ferramenta para estudar a síntese, dobradura, transporte e degradação de proteínas em seu ambiente natural.
A metabólica rotulagem de proteínas durante um curto pulso com 35S-rotulado metionina/cisteína, seguido de uma perseguição na ausência de um marcador radioativo, permite o acompanhamento específico de uma população de proteínas recém sintetizadas no meio de uma maior celular. Em seguida, proteínas alvo podem ser isolado através de imunoprecipitação e analisaram através de SDS-PAGE ou outras técnicas. Para muitas proteínas, sua viagem através da célula é marcada por modificações visíveis no gel de SDS-PAGE. Por exemplo, o transporte de proteínas glicosilados de retículo endoplasmático (ER) para o complexo de Golgi é muitas vezes acompanhado por modificações de N-ligados os glicanos ou a adição de O-ligados os glicanos2,3. Essas modificações causam grandes aumentos na massa molecular aparente, que pode ser vista por alterações de mobilidade em SDS-PAGE. Maturação também pode ser marcada por clivagens proteolíticas, tais como o peptídeo sinal clivagem ou a remoção de pro-peptídeos, resultando em mudanças na massa molecular aparente que possa ser seguido facilmente em gel de SDS-PAGE4. Radioactividade tem consideráveis vantagens sobre técnicas comparáveis como perseguições de cicloheximida, onde síntese proteica romance é impedida, como tratamentos mais longos são tóxicos para as células e não excluem a maioria das proteínas mais velhas, de estado estacionário do análise, como algumas proteínas têm meias-vidas de dias. A comparação de proteínas sob ambos os e reduzir as condições permite a análise da formação de ligação dissulfeto, um passo importante para a dobradura de muitas proteínas secretoras4,5,6, 7.
Aqui nós descrevemos um método geral para a análise de proteínas e transporte nas células intactas, usando uma abordagem de pulso-perseguição radioativo. Enquanto nós ter mirado para fornecer o método como detalhada quanto possível, o protocolo tem um potencial quase ilimitado para adaptabilidade e permitirá otimização estudar proteínas específicas de cada leitor.
São fornecidos dois protocolos alternativos de pulso-perseguição, um para as células aderentes (etapa 1.1 do protocolo aqui apresentado) e outra para células de suspensão (etapa 1.2 do protocolo aqui apresentado). As condições fornecidas aqui são suficientes para visualizar uma proteína expressada com níveis de médio a alto-expressão. Se o leitor está trabalhando com proteínas mal expressas ou várias condições pós-tratamento, como moleculas múltiplas, é necessário aumentar o tamanho do prato ou número de células adequadamente.
Para perseguição de pulso de suspensão, as amostras de perseguição em cada ponto de tempo são todos retiradas um único tubo de células. As etapas de lavagem após o pulso são omitidos; em vez disso, mais incorporação de 35S é evitada pela diluição com um elevado excesso de sem rótulo de metionina e cisteína.
Os protocolos apresentados usam radioativo 35S-rotulado cisteína e metionina para acompanhar os processos de enrolamento de proteínas celulares. Todas as operações com reagentes radioativos devem ser realizadas utilizando medidas de proteção adequadas para minimizar a exposição do operador e o ambiente de radiação radioativa e ser realizada em um laboratório designado. Como o pulso-chase rotulando técnica é relativamente ineficaz em momentos de pulso curto (< 15min), menos de 1% do montante inicial da radioatividade é incorporado em proteínas recém sintetizadas. Após o enriquecimento da proteína do alvo através da imunoprecipitação, a amostra para SDS-PAGE contém menos de 0,05% do montante inicial da radioactividade.
Embora a 35S metionina e cisteína, mistura de rotulagem é estabilizado, uma decomposição, produzindo compostos voláteis radioactivos, ocorrerá. Para proteger o pesquisador e o aparelho, devem ser tomadas algumas precauções. O pesquisador deve sempre obedecer as regras de segurança de radiação local e pode usar um carvão enfermagem máscara, além de um jaleco e luvas (duplas). Frascos de estoque com 35S metionina e cisteína sempre devem ser abertos em uma coifa, ou sob um ponto de aspiração local. Pontos de contaminação do laboratório conhecidos são centrífugas, pipetas, banhos de água, incubadoras e agitadores. A contaminação destas áreas é reduzida pelo uso de pontas de pipetas com um filtro de carvão, positivo-selo microcentrifuga tubos (ver Tabela de materiais), esponjas de aquário carvão em papéis de filtro água banhos, carvão colados nos pratos, pulso-perseguição guarda do carvão vegetal no sistema de aspiração e o posicionamento dos pratos contendo grãos de carvão em incubadoras e recipientes de armazenamento.
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Protocol
Todos os reagentes radioativos e procedimentos foram tratados em conformidade com os regulamentos e regras locais de radiação de Universidade de Utrecht.
1. pulso Chase
-
Perseguição de pulso para células aderentes
Nota: Os volumes dados aqui baseiam-se em pratos de cultura de células de 60 mm. Para 35mm ou pratos de 100 milímetros, multiplique os volumes por 1/2 ou 2, respectivamente. Este protocolo usa um tempo de pulso de 10 min e chase vezes de 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Estas podem ser variadas dependendo as proteínas específicas estudadas (discutidas abaixo).- Semente células aderentes (por exemplo, HEK 293, HeLa, CHO) em seis pratos de cultura de células de 60 mm, para que eles sejam subconfluent (80-90%), no dia da perseguição pulso. Use pelo menos um prato por ponto de tempo e/ou condição.
- Se necessário, transfect as células com reagentes de transfecção comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante; ou, Viralmente transduce8 células 1 dia antes do pulso-perseguição experimentarem com a construção adequada para a expressão.
- Lavar a louça com 2 mL de tampão de lavagem (Hank está equilibrada solução salina [HBSS]), adicione 2 mL do meio de inanição (normal meio de cultura falta de metionina e cisteína e soro bovino fetal [FBS], como meio essencial mínimo [MEM] sem metionina e cisteína Mas com 10 mM HEPES, pH 7,4) e colocar os pratos numa incubadora umidificado de 37 ° C com 5% de CO2 por 15 min.
- Transferi os pratos para as prateleiras em um banho de água escaldadas 37 ° C para que eles estejam em contacto com água, mas não flutuar. Inicie um timer.
- Em 40 s, Aspire o meio de inanição, elaborar 600 µ l da solução de pulso (fome media + 55 prato µCi/35 milímetros rótulo, consulte a observação anterior etapa 1.1.1) dentro da pipeta e adicioná-lo suavemente para o centro do prato em exatamente 1 min. Repita este passo em intervalos de 1 min para t pratos restantes. Comece com a amostra de perseguição mais longa para economizar tempo durante seu experimento.
Nota: Ao manusear material radioativo, é essencial seguir as precauções apropriadas e regras locais e regulamentos para prevenir exposição acidental e/ou contaminação. - A exatamente 11 min e para todos os seguintes pratos, exceto para a amostra de perseguição min 0, adicionar 2 mL do meio de perseguição diretamente ao prato, Aspire- e novamente, adicionar 2 mL do meio de perseguição. Repita este passo em intervalos de 1 min para os pratos restantes. Transferi todos os pratos para uma incubadora de 37 ° C.
- A exatamente 16 min, adicione 2 mL do meio de perseguição (meio de cultura normal + 10 mM HEPES [pH 7,4], cisteína de 5 mM e 5 mM metionina) diretamente para o prato de amostra 0 min em cima o meio de pulso para impedir a rotulagem; em seguida, Aspire imediatamente, transferir a cápsula para uma placa de alumínio refrigerado e adicionar 2 mL de tampão de parada gelada (HBSS + 20 mM N- proteà [NEM]).
Nota: Esta é a amostra de perseguição 0 min. Para este exemplo, vá direto ao passo 1.1.9. - Cada prato de perseguição de transferência para o banho de água a 2 min antes de cada tempo de perseguição (por exemplo, 24 min. para uma perseguição de 15 min) e, no assunto exato momento (por exemplo, 26 min. para uma perseguição de 15 min), aspirar a mídia de perseguição (ou transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora se seguindo pr secreção de otein) e transferir a cápsula para uma placa de alumínio refrigerado. Adicione 2 mL de tampão de parada gelada.
- Incubar os pratos no gelo no buffer de paragem para ≥ 5 min; em seguida, Aspire a solução stop e lave-a com 2 mL de solução de paragem gelada. Aspire a lavagem e lyse pratos com 600 µ l de tampão de lise (tampão fosfato salino [PBS] + detergente nondenaturing [ver Tabela de materiais] + inibidores da protease + 20 mM NEM). Use um raspador de célula para garantir que os pratos lysed quantitativamente.
- Transfira o lisado no tubo de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugação por 10min a 15.000-20.000 x g e 4 ° C para os núcleos de Pelotas.
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Perseguição de pulso para suspensão de células
Nota: Para garantir a eficiente rotulação, células devem ser pulsadas em uma concentração de 3 x 106 a 5 x 106 células/mL, e volumes de perseguição devem ser 4 vezes o volume do pulso. No exemplo a seguir, nós pulsada 5 x 106 células em um volume de 1 mL para 10 min, para produzir cinco chase tempo pontos (0, 15, 30, 60 e 120 min) de 1 mL, contendo 1 x 106 células por ponto de tempo. Todas as soluções são as mesmas do ponto 1.1.- Cultura das células de suspensão (por exemplo, 3T3, Jurkat) de acordo com um protocolo previamente publicado9 para que haja um número suficiente de células no momento da experiência, pelo menos, 1 x 106 células por tempo apontam e/ou condição.
- Se necessário, transfect células com reagentes de transfecção comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante, ou transduce Viralmente8 células 1 dia antes do pulso-perseguição experimentarem com a construção adequada para a expressão.
- 5 x 106 células por condição em um tubo de 50 mL durante 5 min à x 250 g à temperatura de Pelotas, lavá-los 1 x 5 ml de mídia de fome, de pelotas-los novamente e ressuspendê-los em 1 mL de mídia de fome.
- Transferir as células para banho maria a 37 ° C e incube-os para 10-25 min. agitar os tubos de cada 10-15 min para impedir que as células fixando-se na parte inferior.
- Inicie o temporizador. Em exatamente 1 minuto, adicionar µCi 275 (55 µCi/1 x 106 células) do rótulo não diluído diretamente para o tubo contendo células e agitar.
Nota: Ao manusear material radioativo, é essencial seguir as precauções apropriadas e regras locais e regulamentos para prevenir exposição acidental e/ou contaminação. - Exatamente 11 min, pare de rotulagem adicionando 4 mL de mídia de perseguição. Misturar a amostra e imediatamente transfira 1 mL para um tubo de 15 mL no gelo, contendo 9 mL de solução de paragem gelada.
Nota: Esta é a amostra de perseguição 0 min. - Repita essas etapas para cada ponto de tempo sucessivos. Uma vez que todos os pontos de tempo são coletados, pelota as células por 5 min a 250 x g a 4 ° C. Aspire o meio (ou transferi-lo para um novo tubo de 15 mL se você seguir a secreção de proteínas). Lavar as células com 5 mL de solução de paragem e de pelotas as células por 5 min a 250 x g a 4 ° C.
- Aspirar a solução stop, completamente lisar as células com 300 µ l de tampão de Lise gelada e incube-os por 20 min no gelo para garantir uma lise completa. Transfira o lisado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar durante 10 minutos a 15.000-20.000 x g a 4 ° C para os núcleos de Pelotas.
2. a imunoprecipitação
- Combinar o anticorpo (veja a discussão) e 50 µ l de grânulos imunoprecipitação (por exemplo, a proteína um Sepharose) (suspensão de 10% [v/v] em lise + 0,25% albumina de soro bovino [BSA]) numa microcentrifuga tubo e incube-os a 4 ° C ~ 30 min em uma coqueteleira.
- Os grânulos por 1 min a 12.000 x g , à temperatura de pelotas e aspirar o sobrenadante. Adicionar 200 µ l de lisado para a mistura de anticorpo-grânulo e incubar a 4 ° C em uma coqueteleira para 1h ou cabeça-sobrecabeça se requer a imunoprecipitação > 1 h.
- Granule os grânulos por 1 min a 12.000 x g , à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de tampão de lavagem da imunoprecipitação. Coloca a amostra em um shaker em temperatura ambiente por 5 min.
- Os grânulos de Pelotas, conforme descrito na etapa 2.3 e repita a lavagem 1X. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 µ l de tampão TE, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). A amostra de vórtice.
- Adicionar 20 µ l de 2x do amortecedor da amostra sem o agente redutor, vórtice, aqueça-a durante 5 min à 95 ° C e o vórtice novamente.
Nota: se apenas preparar amostras redutoras, 2 µ l de 500 mM DTT deve ser adicionado neste ponto. Em seguida, prossiga para a etapa 2.7. - Conforme descrito na etapa 2.3, Granule os grânulos. Transferir a 19 µ l do sobrenadante nonreduced para um tubo de microcentrifugadora fresco contendo 1 µ l de 500 mM DTT, centrifugar a amostra e o vórtice antes aquecendo-a novamente por 5 min a 95 ° C.
- Girar a amostra por 1 min a 12.000 x g; Esta é a amostra reduzida. Resfriá-lo até a temperatura ambiente e adicionar 1.1 µ l de 1 M, NEM para a redução e a amostra nonreduced. Vórtice e spin-down as amostras.
3. SDS-PAGE
- Primeiro, determine a SDS-PAGE resolução gel de percentagem adequada para a proteína de interesse. Por exemplo, o HIV-1 gp120, quando deglycosylated, é executado em ~ 60 kDa e é analisado em um gel de 7,5%.
- Prepare a mistura de gel de resolução sem TEMED de acordo com as instruções do fabricante (x % do acrilamido, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] 0,1% SDS [w/v] e 0,05% persulfato de amónio [APS] [w/v]) e desgaseificar sob vácuo para > 15 min. Enquanto a mistura de gel é a desgaseificação, cuidadosamente Limpe as placas de vidro de gel com 70% de etanol e fiapos de tecidos e colocá-los em um aparelho de fundição.
- Adicionar TEMED para a mistura de gel de resolução (em uma concentração final de 0.005% [v/v]), homogeneizar e pipetar entre placas de vidro, deixando espaço de ~1.5 cm para o gel de empilhamento. Cuidadosamente, sobrepor o gel com desionizada H2O ou isopropanol e deixá-lo para polimerizar.
- Uma vez que o gel de resolução tem polimerizado, preparar a mistura de gel de empilhamento (4% acrilamida, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1% SDS [w/v] e 0.025% APS [w/v]).
- Lave a parte superior do gel resolvendo com desionizada H2O e, em seguida, remova toda a água.
Nota: Utilize papel de filtro para remover as últimas gotas. - Adicionar TEMED para a mistura de gel de empilhamento (0.005% [v/v]), misture bem e o gel de resolução com gel de empilhamento de sobreposição e inserir um pente 15-bem. Uma vez que o gel de empilhamento tem polimerizado, transferi-lo para uma câmara de execução e encher as câmaras superiores e inferiores com executando o tampão (25 mM Tris-HCl, glicina 192mm [pH 8.3] e 0,1% SDS [w/v]).
- Carrega 10 µ l de amostra por lane em um minigel 15 faixas. Evitar carregar as amostras na primeira e a última pista no gel e carregar o amortecedor da amostra os em todas as faixas vazias para evitar que o sorriso de bandas. Execute o gel constante um 25 mA/gel até a frente do corante é na parte inferior do gel.
- Retire o gel as chapas de vidro, manchar o gel com solução de proteína-coloração (ácido acético a 10% e 30% de metanol em H2O + 0,25% brilhante azul R250 [w/v]) por 5 min com agitação e em seguida, destain por 30 min com descoloração (coloração de solução solução sem R250 azul brilhante).
- Organize os géis de face para baixo sobre um plástico enrole e, em seguida, coloque o papel de cromatografia de 0.4 mm em cima deles. Coloque o gel de sanduíche cromatografia em papel-lado para baixo em um gel secador. Seguindo as instruções do fabricante, secar o gel para 2 h a 80 ° C.
- Transferir os géis secos para uma gaveta e sobrepô-los com tela de cinema ou fósforo autoradiografia. Se usando a película de autoradiografia, esta etapa deve ser realizada em um quarto escuro.
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Representative Results
O dobramento e a secreção de HIV-1 gp120 de uma perseguição de pulso aderentes é mostrado na Figura 2. O gel os (NR de células na figura) mostra o dobramento oxidativo da gp120. Imediatamente após o pulso de rotulagem da gp120 5 min (0 min perseguição) aparece como uma banda difusa superior no gel, e no decorrer do assunto, a banda migra para baixo o gel através de ainda mais difundida dobradura intermediários (IT), até que se acumula na banda apertada (NT) Isso representa gp120 nativamente dobrado. Isto ocorre à medida que a formação de ligações dissulfureto aumenta a compacidade da proteína, fazendo com que a migrar mais rápido do que a proteína totalmente reduzida. Sobre o gel redutor (células R na figura), foram reduzidos o dissulfeto em todas as formas tais que, em todos os momentos de perseguição, eles não afetam a mobilidade. Isto permite a análise de outras modificações. A mudança ao longo do tempo do Ru para Rc representa a clivagem de peptídeo sinal posttranslational da gp120: a mobilidade aumenta devido à perda do peptídeo sinal, que aumenta durante a perseguição, como proteínas mais atingir a dobra nativa e perdem seu peptídeo sinal. Sobre o gel redutor e os, o sinal começa a diminuir de ~ 1 h em diante devido a secreção de gp120. Isto pode ser monitorado, analisando os meios de comunicação (Medium na figura). Uma comparação entre as redução e os géis revela alterações de ligação dissulfeto e remoção de peptídeo-sinal. Isto só foi possível porque outra modificação, glycosylation N-ligados e modificações de glicano, foram retiradas gp120 (e análise) por digestão com endoglycosidase H antes de SDS-PAGE.
O tráfico da cadeia pesada de imunoglobulina M (IgM), de uma perseguição de pulso suspensão µ é mostrado na Figura 3. Uma mudança ao longo do tempo do HCER para HCGolgi representa o tráfico da cadeia µ da emergência para o Golgi, que precede a secreção da célula. Esta mudança na massa molecular é causada pela modificação do N-ligados os glicanos no Golgi.
Figura 1 : Diagrama esquemático do protocolo para pulso chase, imunoprecipitação e SDS-PAGE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Dobradura e secreção de HIV-1 gp120, determinado pela perseguição de pulso aderentes. Pratos de Observacao 60mm de células HeLa expressando gp120 do HIV-1 foram pulso rotulado por 10 min e perseguido pelo indicado vezes. Após a imunoprecipitação da gp120, as amostras foram deglycosylated e analisaram usando um gel de SDS-PAGE de 7,5%. -= Dobramento intermediários; NT = gp120 nativo; Ru = gp120 peptídeo-sinal-uncleaved reduzida; RC = gp120 peptídeo-sinal-clivada reduzida; NR: = os; R = redução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Tráfico de cadeia pesada de IgM, determinado pela perseguição de pulso suspensão. 5 x 106 células do I.29 µ+ B foram pulso rotulado por 5 min e perseguido pelo indicado vezes. Depois de imunoprecipitação, as amostras foram analisadas usando um gel de SDS-PAGE 10%. HC = cadeia pesada de imunoglobulina µ; LC = cadeia leve de imunoglobulina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Pulso-perseguição métodos têm sido essenciais para o desenvolvimento da compreensão dos cientistas de proteína nas células intactas de dobramento. Enquanto tentamos fornecer um método que é tão geral quanto possível, esta abordagem tem o potencial para variações quase ilimitadas estudar vários processos que ocorrem durante o dobramento, o transporte e a vida das proteínas dentro da célula.
Ao realizar uma perseguição de pulso usando células aderentes em pratos, é essencial para tratar cada prato o mesmo tanto quanto possível, como um prato separado é usado para cada ponto de tempo e/ou condição de um experimento. Especialmente para curtos tempos de pulso e chase (< 5min), é essencial manter um controlo apertado sobre os pulso e chase vezes (com um temporizador digital). Perseguições de pulso com células de suspensão podem ajudar a reduzir essa variabilidade como todas as amostras são tomadas a partir de um único tubo. Alguns tipos de células aderem menos bem para pratos de cultura do que outros, deve ter cuidado para garantir que as células não são lavadas durante as várias mudanças de médio. Isto pode ser superado usando essas células em suspensão ou revestindo os pratos com poli-L-lisina ou gelatina, por exemplo, para aderir as células para os pratos de cultura. Para medir a reprodutibilidade de rotulagem entre pratos, uma amostra de lisado deve ser examinada por SDS-PAGE para verificar todas as amostras para idêntico padrão de rotulagem e proteína total. Alternativamente, contagem de cintilação líquida dos lysates irá estabelecer o total contagens por minuto (cpm) incorporada, mas não fornecerá informações sobre a população de proteína rotulada.
Se uma proteína alvo rotula mal, o sinal é aumentado pelo aumento do número de células (ou pratos) ao invés de aumentando a quantidade de etiqueta. Alongar o tempo de pulso é uma opção quando a cinética do processo estudado vai permitir isso. O tempo de pulso ideal varia com cada destino devido a factores como o nível de expressão, a taxa de transcrição, o número de methionines/cisteínas e a taxa de dobramento da proteína. Como tal, deve proceder-se a experimentação para determinar o melhor equilíbrio entre os fatores acima mencionados em cada experimento, mantendo o objectivo experimental em mente. Se estão sendo estudados intermediários durante o dobramento, por exemplo, é desejável para um tempo como possível ter matérias-primas mais próximo uma dobradas possível, equilibrando os níveis de expressão de pulso o rótulo como short. Alternativamente, se o transporte ou a degradação de uma proteína é alvo de estudo, tempos de pulso podem ser aumentados para fornecer os mais altos níveis de sinal possível sem comprometer informações cinéticas. Em geral, vezes de pulso podem variar de 2-15 min quando usando este protocolo sem modificação. De experimentação anterior5 demonstrou-se um tempo de latência de ~ 10 s após o pulso antes da incorporação de radioactividade para o pool de proteínas totais; é importante manter em mente ao derivar informações cinéticas de experimentos de pulso-perseguição. Diminutivo de pulso vezes (< 2 min), manter todos os pratos em banho-maria durante o tempo de pulso inteiro. Se estendido vezes pulso (> 1h) estão sendo usados, é aconselhável aumentar o volume do pulso por 1,5 vezes e coloque um roqueiro em uma incubadora de 37 ° C durante o pulso para evitar que os pratos de secar pratos. Enquanto as soluções de rotulagem contendo individual 35S-metionina/cisteína ou uma mistura estão disponíveis, a mistura é preferível mesmo quando proteínas que só contêm metionina ou cisteína estão sendo rotuladas como ambos são necessários para manter a síntese proteica geral na célula. Se condições experimentais exigem rotulagem específica metionina/cisteína, os níveis de metionina/cisteína nonradioactive durante o pulso devem ser ajustados em conformidade.
Chase vezes (e o número de pontos de tempo) são determinados de forma semelhante. Um bom ponto de partida é para definir a primeira vez de perseguição (após a perseguição de 0 min) como iguais para o tempo de pulso e, em seguida, duplicar o comprimento de tempo para cada ponto de tempo sucessivos (p. ex., 5, 10, 20 e 40 min). No entanto, isto deve ser otimizado para cada proteína específica e pergunta.
Para evitar a ativação das respostas de estresse por inanição (que pode afetar a síntese de proteínas e dobramento), idealmente, devem ser adicionados algum sem rótulo de metionina e cisteína para as soluções de inanição e radioativos. A quantidade vai depender da linhagem celular, o tempo de rotulagem, a quantidade do radiolabel usado e volumes de meios de comunicação e vai precisar de testes. Um bom ponto de partida é de 1% do montante da cisteína e a metionina presente no meio de cultura de células, que pode ser aumentado com o aumento de tempos de pulso. Períodos de fome, seja com ou sem aminoácidos sem rótulo, devem ser mantidos na faixa de 15 a 30 min para garantir a incorporação de rótulo adequado e impedir a ativação das respostas de estresse. Quando usando um pulso estendido (≥ 1 h), a fome não é necessário.
A Lise descrito aqui será adequado para a maioria dos fins, mas em princípio, qualquer sistema de tampão, como HEPES, Tris ou MES, vai funcionar. A concentração de detergente necessária para lyse pilhas dependerá do número de células e o volume de detergente. A concentração deve ser sempre acima da concentração crítica micelle (CMC) e a quantidade de detergente suficiente para lyse pilhas. Uma regra empírica é que 200 µ l de detergente nondenaturing 0,5% (ver Tabela de materiais) é suficiente para lyse o equivalente de célula de ~ 1 mg de proteína (~ 1 x 106 células). A concentração de sal e detergentes podem também variar de acordo com o aplicativo, mas em geral, as condições que quebrar abrir núcleos (sal elevado, > 0,1% SDS) devem ser evitados como a presença de DNA gratuito irá interferir com a imunoprecipitação. Se isso não pode ser evitado, por exemplo, quando lysates célula completa incluindo núcleos ou peletizadas proteínas precisa ser analisado, DNA pode ser cortado, passando as células através de uma agulha de pequeno calibre antes da imunoprecipitação. Isto é preferido por sonication a fim de evitar a formação de espuma excessiva e a produção de aerossóis radioativos.
Para a imunoprecipitação, tanto a quantidade ideal de anticorpos e o tampão de lavagem melhor para cada combinação de antígeno-anticorpo devem ser testados exaustivamente para alcançar um equilíbrio entre o antígeno desejado sinal e plano de fundo. Os anticorpos devem estar sempre presentes em excesso sobre antígenos para garantir imunoprecipitação quantitativa; um bom ponto de partida é de 1 µ g de anticorpos por imunoprecipitação de um prato de 35mm/1 x 106 células. O fundo pode ser diminuído, aumentando o detergente ou concentrações de sal. Em particular, a adição de 0.1% SDS pode ajudar a reduzir muito o fundo, mas também pode interromper a interações antígeno-anticorpo. Para controlar para a especificidade dos anticorpos durante a imunoprecipitação, células idênticas que falta a proteína alvo devem ser usadas quando disponível. Se isso não é simples, como quando endógenas proteínas estão sendo analisadas, a superexpressão ou esgotamento do antígeno vai funcionar. Para controlar para plano de fundo (e especificidade), ou soros preimmune (quando possível) ou controles de isotipo devem ser usados. Para controlar para antígenos vinculando diretamente a imunoprecipitação grânulos, grânulos sem anticorpo também devem ser usados. As condições fornecidas aqui devem ser consideradas como ponto de partida, como cada par de antígeno-anticorpo exigirá uma otimização de tampão de lavagem e lavagem de condições. Em caso de muito fundo, não aumentam o número de lavagens, mas prefiro o tempo de lavagem e/ou a composição do tampão de lavagem. Se interações particularmente sensíveis, tais como em coimmunoprecipitations tem que ser tratada, pode ser preferível para realizar todas as etapas de lavagem a 4 ° C, usando amortecedores geladas.
Uma vantagem das células aderentes sobre células de suspensão é aquela droga de tratamentos podem ser realizados em praticamente qualquer ponto durante a perseguição de pulso. Se usado com inibidores de acompanhante, por exemplo, é possível diferenciar os seus efeitos sobre as co - contra posttranslational as fases de um processo de dobra. Isto pode ser estendido, adaptando os buffers de lavagem Lise e imunoprecipitação (discutidos acima) para permitir que o coimmunoprecipitation dos complexos proteína-acompanhante durante o dobramento de11,10,12.
Postlysis tratamento de amostras irá alargar o âmbito das questões que podem ser abordados. Digestão de proteínas do alvo antes de imunoprecipitação fornecerá informações adicionais conformacionais e tem sido usada com sucesso para monitorar o dobramento de proteínas, especialmente aqueles que faltam dissulfeto títulos13, protease limitada 14. Agregação de proteínas e a formação do complexo podem ser monitorados por centrifugação de gradiente de densidade de sacarose antes da imunoprecipitação15,16.
Para tirar pleno partido das perseguições de pulso, a disponibilidade de reagentes de alta qualidade é necessária para moleculas. Ao examinar o dobramento intermediários, é essencial ter anticorpos que são capazes de atrair todas as formas da proteína sob análise. Se não existem anticorpos específicos para a proteína do alvo, este pode ser substituído usando marcas de afinidade. No entanto, isso restringe severamente a utilidade dos métodos postlysis, como a proteólise limitada, para sondar diretamente a conformação da proteína, como apenas fragmentos marcados podem ser recuperados.
A sensibilidade de perseguições de pulso é limitada pelo número de resíduos de metionina e cisteína da proteína em questão. Proteínas com baixo número de resíduos de metionina/cisteína juntamente com um nível baixo de expressão são indetectáveis em experimentos de pulso-perseguição. Ao realizar modificações postlysis como proteólise limitada, apenas fragmentos de metionina/cisteína-contendo será detectáveis.
Para concluir, dado o detalhe cinético que perseguições de pulso fornecer, eles são complementares para muitas outras técnicas e ferramentas utilizadas para estudar Biologia celular molecular a nível de estado estacionário. Como tal, eles continuam a ser um componente inestimável na caixa de ferramentas do biólogo molecular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer todos os membros do laboratório Braakman, passado e presente, para suas discussões frutuosos e ajudam a desenvolver os métodos apresentados neste artigo. Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) N ° da União Europeia 235649 e Holanda organização de científico pesquisa (NWO) sob o eco-programa N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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