Summary
Здесь мы описываем протокол для общего импульса Чейз метод, который позволяет кинетический анализ складывания, транспорта и деградации белков в живых клеток.
Abstract
Маркировки радиоактивных пульс Чейз является мощным инструментом для изучения конформационного созревания, транспорт до их функциональной сотовой местоположения и деградации белков-мишеней в живых клетках. С помощью коротких (пульс) radiolabeling раз (< 30 мин) и контролировались Чейз раз, можно пометить только небольшая часть общего белка бассейн и следовать его складывание. В сочетании с nonreducing/уменьшение электрофореза геля SDS-полиакриламид (SDS-PAGE) и иммунопреципитации с (конформация) антитела, складывающиеся процессы могут рассматриваться подробно. Эта система использовалась для анализа складывания белков с огромные различия в свойствах растворимые белки, единого и многоходовой трансмембранные белки, сильно N и O гликозилированного белки, и белков с и без обширных дисульфида склеивание. Пульс Чейз методы являются основой кинетических исследований в целый ряд дополнительных функций, включая co - Посттрансляционная модификации, олигомеризация и полимеризации, по существу позволяет анализ белка от рождения до смерти. Пульс Чейз исследования на сворачивание белков дополняют другие биохимические и биофизические методы для изучения белков в пробирке , обеспечивая увеличение временного разрешения и физиологической информации. Методы, как описано в этом документе приспособлены легко учиться, складывающиеся почти любой белок, который может быть выражен в системах млекопитающих и насекомых клеток.
Introduction
Складные даже сравнительно простые белки включает в себя множество различных складной ферменты, молекулярные сопровождающих и ковалентный модификации1. Полное восстановление этих процессов в vitro практически невозможно, учитывая огромное количество различных компонентов. Весьма желательно, таким образом, для изучения белков складывания в естественных условиях, в живых клетках. Радиоактивных пульс Чейз методики доказывают мощный инструмент для изучения синтеза, свертка, транспорта и деградации белков в их естественной среде.
Метаболические маркировки белков во время короткого импульса с 35S-меченых метионина/цистеина, затем Чейз в отсутствие радиоактивных метку, позволяет отслеживания населения вновь синтезируемых белков в широкой клеточного окружения. Затем целевых белков может быть изолированным через иммунопреципитации и проанализированы через SDS-PAGE или других методов. Для многих белков их путешествие через ячейку характеризуется изменениями, которые видны на геля SDS-PAGE. Например перевозки гликозилированного белков от эндоплазменный ретикулум (ER) в комплекс Гольджи часто сопровождается изменения N-связаны гликанов или добавлением гликаны, связанный с O2,3. Эти изменения вызывают значительное увеличение в очевидной молекулярной массы, которую можно увидеть изменения подвижности в SDS-PAGE. Созревания также может быть отмечен протеолитического расщепления, например сигнал пептид спайности или удаления pro пептиды, что привело к изменениям в очевидной молекулярной массы, которая может легко следовать на гель SDS-PAGE4. Радиоактивность имеет значительные преимущества перед сопоставимых методов, таких как циклогексимида погони, где предотвратить синтез новых белков, как длительного лечения токсичны для клеток и не исключает большинство старых, устойчивого состояния белков из анализ, как некоторые белки имеют периоды полураспада дней. Сравнение белков под оба nonreducing и уменьшение условий позволяет анализ формирования дисульфидными облигаций, важный шаг в сложенном многих выделительные протеины4,5,6, 7.
Здесь мы описываем общий метод для анализа сворачивание белков и транспорта в нетронутым клеток, используя подход радиоактивных пульс Чейз. Хотя мы стремились представить этот метод как как можно более подробно протокол имеет почти безграничным потенциалом для адаптации и позволит оптимизации для изучения специфических белков каждого читателя.
Предоставляются две альтернативные пульс Чейз протоколов, один для адэрентных клеток (шаг 1.1 протокола, представленные здесь) и один для подвески клеток (шаг 1.2 протокола, представленные здесь). Условия здесь являются достаточными для визуализации белок с средне высокий выражение уровня. Если читатель работает с слабо выраженной белки или различных рентгенологическое условий, таких как несколько immunoprecipitations, необходимо увеличить размер блюдо или мобильный телефон надлежащим образом.
Для подвески пульс Чейз Чейз проб, взятых в каждый момент времени все взяты из одной трубки клеток. Мыть шаги после импульса опущены; Вместо этого дальнейшее включение 35S предотвращается путем разбавления с высоким избыток немеченого метионина и цистеина.
Представлены протоколы используют радиоактивные 35S-меченых цистеина и метионина следовать клеточных процессов, сворачивание белков. Используя соответствующие защитные меры для сведения к минимуму любого воздействия оператора и окружающей среды, радиоактивного излучения и выполняться в назначенной лаборатории следует выполнять все операции с радиоактивными реагентов. Как пульс Чейз маркировки техника относительно неэффективными порой короткого импульса (< 15 мин), меньше, чем 1% от начальной суммы радиоактивности включена в вновь синтезируемых белков. После обогащения целевого белка через иммунопреципитация образец для SDS-PAGE содержит меньше чем 0,05% от суммы начального радиоактивности.
Хотя 35S метионина и цистеина, маркировки смеси стабилизируется, некоторые разложения, уступая летучих радиоактивных соединений, будет происходить. Чтобы защитить исследователь и аппарата, следует принять некоторые меры предосторожности. Исследователь всегда должен подчиняться правилам безопасности местных излучения и может носить уголь кормящих маски, кроме лаборатории пальто и перчатки (двойной). Складе флаконов с 35S метионина и цистеина всегда должен быть открыт в вытяжной шкаф или под местной стремление точки. Пятна загрязнения известных лабораторных центрифуг, пипетки, водяные бани, инкубаторы и шейкеры. С помощью пипетки советы с угольный фильтр, положительный печать microcentrifuge трубки (см. Таблицу материалы), аквариум угольные губки в воды ванны, угольный фильтр документах склеены в пульс Чейз блюда, уменьшается загрязнение этих областей Древесный уголь гвардия в системы аспирации и размещение блюда, содержащие уголь зерна в инкубаторы и хранения контейнеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все радиоактивные реагентов и процедуры были обработаны в соответствии с местными Утрехтского университета излучения правил и положений.
1. Пульс Чейз
-
Чейз импульса для адэрентных клеток
Примечание: Приведенные объемы основаны на 60 мм ячейку культуры блюда. Для 35 мм или 100 мм блюда умножьте томов на 1/2 или 2, соответственно. Этот протокол использует время импульса 10 мин и Чейз времен 0, 15, 30, 60, 120 и 240 мин. Они могут варьироваться в зависимости от специфических белков, изучается (обсуждается ниже).- Семя адэрентных клеток (например, ГЭС 293, HeLa, Чо) в шести блюд культуры клеток 60 мм, так что они будут subconfluent (80% - 90%), в день пульс Чейз. Используйте по крайней мере одно блюдо в момент времени и/или состояния.
- При необходимости, transfect клетки с коммерчески доступных трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя; или, как вирус передают8 клетки 1 день до пульс Чейз экспериментировать с соответствующей конструкции для выражения.
- Мыть посуду с 2 мл буфера мытья (Хэнк сбалансированного солевого раствора [HBSS]), добавить 2 мл среды голода (нормальной культуры среднего хватает метионина и цистеина и плода бычьим сывороточным [FBS], таких как минимум основных средних [мкм] без метионина и цистеина но с 10 мм HEPES, рН 7,4) и блюда в увлажненные инкубатора 37 ° C с 5% CO2 за 15 мин.
- Блюда можно передать стойки в ванну воду подогретую 37 ° C тем, что они находятся в контакте с водой, но не плавают. Запустите таймер.
- В 40 s, аспирационная среднего голода, составить 600 мкл раствора импульса (голодания СМИ + 55 мм Μки/35 блюдо этикетка, см. Примечание предшествующих шаг 1.1.1) в пипетку и добавить его нежно центр блюдо на точно 1 мин повторить этот шаг с интервалом 1 мин t Он оставшиеся блюда. Начните с длинной Чейз образец, чтобы сэкономить время во время эксперимента.
Примечание: При обработке радиоактивных материалов, крайне важно соблюдать надлежащие меры предосторожности и местные правила и правила для предотвращения случайного воздействия и/или загрязнения. - В Ровно 11 мин для всех следующих блюд, за исключением 0 мин Чейз образца, добавить 2 мл Чейз среды непосредственно в блюдо, аспирационная его и снова, добавить 2 мл Чейз среды. Повторите этот шаг с интервалом 1 мин оставшиеся блюда. Передать все блюда инкубатора 37 ° C.
- В ровно 16 мин, добавить 2 мл среды Чейз (нормальной культуры среднего + 10 мм HEPES [рН 7,4], хвоща 5 мм и 5 мм метионина) непосредственно на 0 мин образец блюдо на вершине импульса среднего остановить маркировки; Аспирационная немедленно, передавать блюдо охлаждением алюминиевой пластине затем добавить 2 мл ледяной стоп буфера (HBSS + 20 мм N- ethylmaleimide [NEM]).
Примечание: Это образец Чейз 0 мин. Для этого образца перейти непосредственно к шагу 1.1.9. - Перевести каждое блюдо Чейз обратно на водяной бане 2 мин перед каждой Чейз время (например, 24 мин для Чейз 15 мин) и, в то время точное Чейз (например, 26 мин для 15 мин Чейз), аспирационная Чейз СМИ (или перенести его на пробки microcentrifuge, если после pr otein секреции) и передать охлаждением алюминиевой пластине блюдо. Добавьте 2 мл ледяной стоп буфера.
- Инкубируйте все блюда на льду в буфере стоп для ≥5 мин; затем аспирационная универсальное решение и мыть его с 2 мл раствора ледяной стоп. Аспирационная мыть и лизируют блюда с 600 мкл буфера lysis (фосфат амортизированное saline [PBS] + nondenaturing моющее средство [см. Таблицу материалы] ингибиторы протеазы + 20 мм NEM). Используйте скребок ячейки, чтобы количественно лизированы блюда.
- Передать lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги для 10 мин на 15000-20000 x g и 4 ° C до Пелле ядер.
-
Чейз импульса для подвески клетки
Примечание: Для обеспечения эффективности маркировки, клетки должны пульсирующий в концентрации 3 х 106 -5 х 106 клеток/мл, и Чейз тома должен быть 4 x объем импульса. В следующем примере мы пульсирующий 5 х 106 клеток в объеме 1 мл в течение 10 мин, чтобы принести пять погони время точки (0, 15, 30, 60 и 120 мин) 1 мл, содержащие 1 х 106 клеток на момент времени. Все решения являются так же, как и в разделе 1.1.- Культура подвеска клетки (например, 3T3, Jurkat), согласно опубликованному ранее протокол9 , так что есть достаточное количество клеток во время эксперимента, по крайней мере 1 x 106 клеток / время точки или условие.
- При необходимости, transfect клетки с коммерчески доступных трансфекции реагентов в соответствии с инструкциями производителя, или вирусно передают8 клетки 1 день до пульс Чейз экспериментировать с соответствующей конструкции для выражения.
- Пелле 5 х 106 клеток / условие в 50 мл трубки 5 мин на 250 x g при комнатной температуре, мыть их 1 x с 5 мл голода СМИ, Пелле их снова и Ресуспензируйте их в 1 мл голода средств массовой информации.
- Передача клетки в ванну воды 37 ° C и инкубировать их на 10-25 мин агитировать трубы каждые 10-15 мин, чтобы не допустить урегулирования в нижней части клетки.
- Запустите таймер. На точно 1 мин добавить 275 Μки (55 Μки/1 x 106 клеток) неразбавленной лейбла непосредственно в пробирку, содержащую клетки и взболтать.
Примечание: При обработке радиоактивных материалов, крайне важно соблюдать надлежащие меры предосторожности и местные правила и правила для предотвращения случайного воздействия и/или загрязнения. - В Ровно 11 мин прекратить маркировки путем добавления 4 мл Чейз средств массовой информации. Смешать образца и немедленно передать 1 мл 15 мл на льду, содержащий 9 мл раствора ледяной стоп.
Примечание: Это образец Чейз 0 мин. - Повторите эти шаги для каждой точки раз подряд. После того, как собраны все моменты времени, Пелле клетки для 5 мин на 250 x g при 4 ° C. Аспирационная среднего (или передать его на новой трубки 15 мл, если после секрецию белка). Вымыть клетки с 5 мл раствора стоп и Пелле клетки для 5 мин на 250 x g при 4 ° C.
- Аспирационная универсальное решение, полностью Лизируйте клетки с 300 мкл буфера lysis ледяной и проинкубируйте 20 мин на льду обеспечить полный лизис. Передать lysate пробки microcentrifuge 1,5 мл и центрифуги для 10 мин на 15000-20000 x g при 4 ° C до Пелле ядер.
2. иммунопреципитации
- Объединить антитела (см. обсуждение) и 50 мкл иммунопреципитации бусины (например, белок А-Sepharose) (подвеска [v/v] 10% в буфера lysis + 0,25% альбумина bovine сыворотки [BSA]) в microcentrifuge трубки и инкубировать их в 4 ° C ~ 30 мин в шейкере.
- Пелле бусы за 1 мин на 12000 x g при комнатной температуре и удалить супернатант. Добавить 200 мкл lysate смесь антител шарик и Инкубируйте на 4 ° C в шейкере за 1 ч или головка над если иммунопреципитации требует > 1 час.
- Пелле бусы за 1 мин на 12000 x g при комнатной температуре. Аспирационная супернатант и добавьте 1 mL мыть буфера иммунопреципитации. Поместите образец в шейкере при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Пелле бисер, как описано в шаге 2.3 и повторите мыть 1 x. Затем аспирационная супернатант и Ресуспензируйте бисер в 20 мкл буфера TE, pH 6.8 (10 мм трис-HCl, ЭДТА 1 мм). Вихрь образца.
- 20 мкл 2 x буфер образца без восстанавливающего агента, вихревые, тепло его за 5 мин при 95 ° C и вихрь снова.
Примечание: если только Подготовка сокращение образцов, 2 мкл 500 мм DTT следует добавить в этот момент. Затем перейдите к шагу 2.7. - Пелле бисер, как описано в шаге 2.3. Перенесите 19 мкл nonreduced супернатант свежие microcentrifuge трубка, содержащая 1 мкл 500 мм DTT, центрифуга образца и вихрь его перед нагревом для 5 мин при 95 ° C снова.
- Спин вниз образца за 1 мин на 12000 x g; Это сокращение образца. Остудить до комнатной температуры и 1.1 мкл 1 М NEM как уменьшение, так и nonreduced образца. Вортекс и спин вниз образцы.
3. SDS-PAGE
- Во-первых определите соответствующие SDS-PAGE разрешая гель процент для протеина интереса. Например, gp120 ВИЧ-1, когда deglycosylated, работает на ~ 60 кДа и анализируется в 7,5% гель.
- Подготовьте разрешая гель смесь без TEMED согласно инструкциям производителя (x % акриламида, 375 мм трис-HCl [рН 8,8,] 0,1% SDS [w/v] и 0,05% Аммония пероксодисульфат [APS] [w/v]) и Дега под вакуумом для > 15 мин. В то время как смесь гель дегазации, тщательно очистите стеклянные пластины гелем с 70% этанола и безворсовой ткани и поместите их в аппарат литья.
- Добавьте TEMED разрешая гель смесь (в конечной концентрации 0,005% [v/v]), тщательно перемешать и Пипетка между пластинами стекла, оставляя ~1.5 см пространства для штабелируя гель. Тщательно overlay гель с дейонизированной H2O или изопропанолом и оставьте его для полимеризации.
- Как только разрешая Гель полимеризуется, подготовить укладки смеси гель (4% акриламида, 125 мм трис-HCl [pH 6.8], 0.1% SDS [w/v] и 0,025% APS [w/v]).
- Промойте в верхней части разрешая гель с дейонизированной H2O и затем удалите все воды.
Примечание: Используйте фильтр бумага для удаления последние капли. - Добавьте TEMED укладки смеси гель (0,005% [v/v]), перемешать и наложение разрешая гель с штабелируя гель и вставить гребень 15-хорошо. После штабелируя гель полимеризуется, передача его в работающей камере и заполнить верхней и нижней палат с запуском буфера (25 мм трис-HCl, 192 мм глицин [рН 8.3] и 0,1% SDS [w/v]).
- Загрузите 10 мкл образца за Лейн в пробирках 15-Лейн. Избежание загрузки образцов в первый и последний Лейн на геле и загрузить nonreducing буфер образца в все пустые полосы для предотвращения улыбаясь полос. Запустите гели при постоянном 25 мА/гель, до тех пор, пока краска фронт находится в нижней части геля.
- Удаление гели из стеклянных пластин, пятно гели с белком окрашивание раствора (уксусной кислоты 10% и 30% метанола в H2O + 0,25% блестящий синий R250 [w/v]) за 5 мин с перемешиванием и затем, Отмойте 30 мин с минигелей решение (окрашивание решение без блестящий синий R250).
- Организовать гели лицом вниз на пластиковые wrap и, затем, место бумажной хроматографии 0,4 мм поверх них. Поместите гель сэндвич хроматографии бумаги стороной вниз на гель фен. Следуя инструкциям изготовителя сухие гели втечение 2 ч при температуре 80 ° C.
- Передать кассету сушеные гели и обложи их с авторадиографии фильм или люминофора экрана. Если с помощью авторадиографии фильм, этот шаг должен выполняться в темной комнате.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Складные и секрецию gp120 ВИЧ-1 от Чейз адэрентных пульс показан на рисунке 2. Nonreducing гель (клетки NR на рисунке) показывает окислительного складывания gp120. Сразу же после импульса маркировки gp120 5 мин (0 мин Чейз) появляется как диффузные группа выше в гель, и по ходу погони, Группа переносит вниз гель через даже более рассеянным складывания интермедиаты (ИТ), до тех пор, пока он накапливается в полосе туго (NT) что представляет собой изначально сложить gp120. Это происходит как образования дисульфидных связей повышает компактность белка, заставляя его миграцию быстрее, чем полностью снижение белка. На сокращение гель (клетки R на рисунке) были сокращены дисульфидными облигаций на всех формах таким образом, что все время Чейз, они не влияют на мобильность. Это позволяет анализ других модификаций. Переход со временем от Ru к Rc представляет Посттрансляционная сигнал пептид расщепления gp120: мобильность увеличивается из-за потери сигнала пептид, который увеличивает во время погони, как больше белков достичь родной складки и потерять их сигнал пептид. На nonreducing и сокращение гель сигнал начинает уменьшаться от ~ 1 час вперед из-за секрецию gp120. Это может контролироваться путем анализа СМИ (средний на рисунке). Сравнение nonreducing и сокращение гели раскрывает дисульфидными облигаций изменения и удаления сигнала пептида. Это стало возможным только потому, что другой модификации, N-связаны гликозилирование и glycan модификации, были удалены из gp120 (и анализ), пищеварение с endoglycosidase H перед SDS-PAGE.
Торговля тяжелой цепи µ иммуноглобулина М (IgM) от погони пульс подвеска показан на рисунке 3. Переход со временем от ХКER для HCГольджи представляет торговля µ цепи от ER Гольджи, который предшествует секреции из ячейки. Это изменение в молекулярной массы является вызванные изменением N-связаны гликанов в Гольджи.
Рисунок 1 : Схема протокола для импульса Чейз, иммунопреципитации и SDS-PAGE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Складные и секрецию gp120 ВИЧ-1, определяется адэрентных пульс Чейз. Subconfluent 60 мм блюда клеток HeLa, выражая gp120 ВИЧ-1 были пульс помечены 10 мин и чеканка для указанного раз. После иммунопреципитация gp120 образцы были deglycosylated и проанализированы с использованием геля SDS-PAGE 7,5%. Он = складывающиеся промежуточных продуктов; NT = родной gp120; Ru = снижение gp120 сигнал пептид uncleaved; RC = снижение сигнала пептид расщепляется gp120; ВН: = nonreducing; R = снижение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Торговля тяжелой цепи IgM, определяется подвеска пульс Чейз. 5 x 10-6 I.29 µ+ B клетки были пульс помечены на 5 мин и чеканка для указанного раз. После иммунопреципитация образцы были проанализированы с использованием геля SDS-PAGE 10%. HC = µ тяжелые цепи иммуноглобулинов; LC = легкие цепи иммуноглобулинов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пульс Чейз методы имели важнейшее значение для понимания ученых белка, складывающиеся в нетронутым клеток. В то время как мы пытались обеспечить метод, который как можно больше общих, этот подход имеет потенциал для почти безграничные варианты для изучения различных процессов, которые происходят во время складывания, транспорта и жизнь белков внутри клетки.
При выполнении импульса Чейз, используя адэрентных клеток в блюдах, важно рассматривать каждое блюдо, то же самое как можно больше, как отдельное блюдо используется для каждой точки время или условие в эксперименте. Особенно для коротких импульсов и Чейз раз (< 5 мин), важно, чтобы сохранить жесткий контроль над время импульса и Чейз (с цифровым таймером). Пульс погони с подвеска клетки может помочь уменьшить эту изменчивость как все образцы взяты из одной трубки. Как некоторые типы клеток придерживаются менее хорошо культуры блюда, чем другие, следует обеспечить, что клетки не смыты во время различных средних изменений. Это может быть преодолено посредством этих клеток в суспензии или покрытие блюда с поли L-лизин или желатин, например, придерживаться клетки культуры блюда. Чтобы измерить воспроизводимость маркировки между блюдами, образец lysate должны быть изучены SDS-PAGE для проверки всех образцов для идентичных всего маркировки и белка шаблона. В качестве альтернативы ЖС подсчет лизатов создаст общее количество за минуту (cpm) включены, но не предоставит информацию о населении белка помечены.
Если целевой белок этикетки плохо, сигнал увеличивается, увеличивая количество клеток (или блюда), а не путем увеличения количества метки. Удлинение время импульса является вариант, когда кинетика процесса изучали позволит это. Идеальный импульса время будет зависеть от каждой цели вследствие таких факторов, как уровень, уровень транскрипции, количество methionines/которым и складной количество белка. Таким образом чтобы определить наилучший баланс между вышеупомянутых факторов в каждом эксперименте при сохранении в экспериментальных целях в виду должны быть предприняты экспериментов. Если промежуточные во время складывания в настоящее время изучаются, например, желательно пульс метки как короткое время как можно иметь исходный материал как можно ближе к разложенном состоянии как можно скорее, балансируя уровень выражения. В качестве альтернативы если транспорта или деградации белка является объектом изучения, пульс раз может быть продлен предоставлять высокий уровень сигнала можно без ущерба для кинетического информации. В общем раз пульс может варьироваться от 2-15 мин при использовании данного протокола без изменений. Предыдущие эксперименты5 продемонстрировал лаг времени ~ 10 сек после импульса до включения радиоактивности в пул общего белка; Это важно иметь в виду при создании производного кинетическая информацию от импульса Чейз экспериментов. Для коротких импульсов раз (< 2 мин), держать все блюда на водяной бане во время всего пульс. Если продлен импульса раз (> 1 ч), используется, рекомендуется увеличить объем импульса в 1,5 раза и место блюда на качалку в инкубаторе 37 ° C во время импульса для предотвращения блюда от высыхания. Хотя имеются маркировки растворы, содержащие отдельные 35S-метионина/хвоща или смеси, смеси является предпочтительным, даже тогда, когда белки, которые содержат только метионина и цистеина помечены как оба необходимы для поддержания синтеза общего белка в ячейке. Если экспериментальные условия требуют конкретных метионина/хвоща маркировки, уровни нерадиоактивных метионина/хвоща во время импульса должна корректироваться соответственно.
Аналогичным образом определяются Чейз раз (и количество точек времени). Хорошей отправной точкой, чтобы задать первый время Чейз (после 0 мин Чейз) как равное время импульса и, затем, вдвое продолжительность времени для каждой точки раз подряд (например, 5, 10, 20 и 40 мин). Однако это должны быть оптимизированы для каждого определенного белка и вопрос.
Чтобы предотвратить активации реакции стресса от голода (которая может влиять на синтез белка и складные), в идеале, следует добавить некоторые немеченого метионина и цистеина голода и radiolabeling решения. Количество будет зависеть от линии клетки, метки времени, количество радиоактивной используется и томах носителей и потребуется тестирование. Хорошая отправная точка составляет 1% от суммы цистеина и метионина в ячейку питательной среды, которая может быть увеличена с увеличением пульса раз. Периоды голода, с или без неподписанных аминокислоты, должны находиться в диапазоне от 15-30 мин для обеспечения включения адекватных лейбл и предотвращения активации реакции стресса. При использовании расширенного импульса (≥1 h), голода не требуется.
Буфер lysis, описанные здесь будет подходящим для большинства целей, но в принципе, любой буфер системы, такие как HEPES, трис или МЧС, будет работать. Стиральный порошок концентрации, необходимые для Лизируйте клетки будет зависеть количество клеток и стиральный порошок тома. Концентрация всегда должно быть выше критической мицеллы концентрации (CMC) и количество моющего средства достаточно, чтобы лизировать клетки. Эмпирическое правило, что 200 мкл nondenaturing 0,5% моющего средства (см. Таблицу материалы) достаточно лизировать клетки эквивалент ~ 1 мг белка (~ 1 х 106 клеток). Концентрация соли и моющих средств могут быть различными в зависимости от применения, но в целом, условия, которые нарушают открыть ядер (высокая соли, > 0,1% SDS) следует избегать, поскольку наличие свободной ДНК будет мешать иммунопреципитации. Если этого невозможно избежать, например, когда полный lysates клетки включая ядер или гранулированных белки должны быть проанализированы, ДНК может быть стриженый путем передачи клетки через небольшой иглы перед иммунопреципитации. Это предпочтительнее, чем sonication с целью предотвращения чрезмерного вспенивания и производства радиоактивных аэрозолей.
Для иммунопреципитации оптимальное количество антител и лучший мыть буфер для каждой комбинации антител антигена должны быть тщательно протестирован для достижения баланса между желаемой антигена сигнал и фон. Антитела должны всегда присутствовать в превышение над антигены обеспечить количественный иммунопреципитации; хорошей отправной точкой является 1 мкг антител в иммунопреципитации от 35 мм блюдо/1 x 106 клеток. Фон может быть уменьшена путем повышения моющего средства или концентрация соли. В частности дополнение ≤0.1% SDS может помочь существенно уменьшить фон, но может также нарушить взаимодействия антител антигена. Для управления для Специфичность антител в иммунопреципитации, идентичных клеток, не имеющих целевого белка должны использоваться при наличии. Если это не просто, например, когда анализируются эндогенного белки, гиперэкспрессия или истощение антигена будет работать. Для управления для фона (и специфичности), либо preimmune сера (где возможно) или изотипа контроль должен быть использован. Для управления для антигенов, привязка непосредственно к иммунопреципитации бусины, бусины без антитело должен также использоваться. Условия здесь следует считать как отправной точки каждой пары антител антигена потребует оптимизации буфер мыть и мыть условий. В случае слишком много фон не увеличивают количество стирок, но скорее время стирки или состав мыть буфера. Если особо чувствительных взаимодействия в coimmunoprecipitations таких как приходится иметь дело с, это может быть предпочтительнее выполнять все шаги мыть на 4 ° C, с помощью ледяной буферов.
Одним из преимуществ над подвеска клетки адэрентных клеток является что препарат лечения могут быть выполнены в практически в любой точке во время погони импульса. Если используется с сопровождающий ингибиторы, например, можно выделить его влияние на co - против Посттрансляционная этапов процесса складывания. Это может быть продлен путем адаптации лизис и иммунопреципитации мыть буферы (обсуждалось выше), чтобы разрешить coimmunoprecipitation белка сопровождающий комплексов во время складывания10,,1112.
Postlysis лечения образцов будет расширить сферу охвата вопросов, которые могут быть решены. Ограниченные протеазы переваривание белков-мишеней перед иммунопреципитации будет предоставлять дополнительную информацию конформационные и успешно используется для мониторинга, складывающиеся белков, особенно тех, кто не хватает дисульфидными облигаций13, 14. Агрегации белков и комплекс формирования может контролироваться центрифугированием градиент плотности сахарозы перед иммунопреципитации15,16.
В полной мере воспользоваться пульс погони, наличие высокого качества реагентов для immunoprecipitations. При изучении складной интермедиатов, важно иметь антитела, которые способны потянув вниз все формы белка под анализа. Если не доступны особые антитела для целевого белка, это можно заменить с помощью тегов сродства. Однако это серьезно ограничивает полезность postlysis методов, таких как ограниченного протеолиза, чтобы непосредственно зонд конформации белка, как только помеченный фрагменты могут быть восстановлены.
Чувствительность пульс погони ограничено количество метионина и цистеина остатки белка в вопросе. Белки с низкой количество метионина/хвоща остатков в сочетании с низким уровнем обнаружить в пульс Чейз экспериментов. При выполнении postlysis модификации, такие как ограниченного протеолиза, только метионина/цистеин содержащее фрагментов будет обнаружить.
Заключить, данный обеспечивают кинетическая подробно, что пульс погони, они дополняют многие другие методы и инструменты, используемые для изучения молекулярных клеточной биологии на стационарном уровне. Таким образом они по-прежнему быть бесценным компонентом в молекулярный биолог элементов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы поблагодарить всех членов Braakman лаборатории, прошлое и настоящее время, за их плодотворные дискуссии и помочь в разработке методов, представленных в этой статье. Этот проект получил финансирование от Европейского Совета исследований под Европейского союза седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) N ° 235649 и Нидерланды организации научных исследований (NWO) под эхо программа N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
