Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول لأسلوب مطاردة نبض عامة يسمح تحليل الحركية قابلة للطي والنقل، وتدهور البروتينات الواجب اتباعها في الخلايا الحية.
Abstract
وصف تشيس نبض المشعة أداة قوية لدراسة نضوج كونفورماشونال، والنقل إلى مواقعها الخلوية الوظيفية، وتدهور البروتينات المستهدفة في الخلايا الحية. باستخدام أوقات قصيرة (نبض) راديولابيلينج (< 30 دقيقة) ورقابة مشددة من تشيس مرات، من الممكن تسمية سوى جزء صغير من تجمع مجموع البروتين واتبع الطي به. عندما جنبا إلى جنب مع نونريدوسينج/خفض مخزونات النشر الاستراتيجي-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) وإيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة (تكيف محددة)، يمكن دراسة الطي العمليات بقدر كبير من التفصيل. وقد استخدم هذا النظام لتحليل قابلة للطي للبروتينات مع تباين كبير في خصائص مثل البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات وحيدة ومتعددة تمرير transmembrane، N و O الغليكوزيلاتي البروتينات بشدة، والبروتينات مع أو بدون ثنائي كبريتيد واسعة النطاق الربط. أساليب مطاردة نبض هي أساس الدراسات الحركية إلى مجموعة من الميزات الإضافية، بما في ذلك شركة-والتعديلات بوستترانسلاشونال، أوليجوميريزيشن، والبلمره، أساسا يسمح تحليل البروتين من الولادة حتى الموت. دراسات نبض--تشيس في طي البروتين متكاملان مع أساليب أخرى البيوكيميائية والفيزيائية لدراسة البروتينات في المختبر بتقديم معلومات الفسيولوجية وزيادة الأزمنة. هي تكييف الأساليب كما هو موضح في هذه الورقة بسهولة لدراسة الطي تقريبا أي البروتين التي يمكن التعبير عنها في نظم الثدييات أو خلايا الحشرات.
Introduction
طي البروتينات البسيطة نسبيا حتى ينطوي على العديد من الإنزيمات المختلفة قابلة للطي ومرافقين الجزيئية، والتعديلات التساهمية1. إعادة تشكيل كاملة لهذه العمليات في المختبر مستحيل عمليا، نظراً للعدد الهائل من المكونات المختلفة المعنية. ولذلك مرغوب فيه للغاية، دراسة البروتين قابلة للطي في فيفو، في الخلايا الحية. تقنيات تشيس نبض المشعة إثبات أداة قوية لدراسة التوليف، قابلة للطي، والنقل، وتحلل البروتينات في بيئتهم الطبيعية.
التمثيل الغذائي وسم البروتينات خلال نبضة قصيرة مع 35S المسمى الميثيونين/سيستين، متبوعاً بعملية مطاردة في غياب تسمية المشعة، يتيح تتبع محددة من سكان بروتينات المركبة حديثا في أوسع الوسط الخلوية. ثم البروتينات المستهدفة يمكن أن تكون معزولة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن وتحليلها عن طريق الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أو تقنيات أخرى. للعديد من البروتينات، ورحلتهم عبر الخلية تتميز بتعديلات مرئية في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. على سبيل المثال، غالباً ما يترافق نقل البروتينات الغليكوزيلاتي من هيولى (ER) إلى مجمع غولجي بإدخال تعديلات على جليكانس ن مرتبطة أو إضافة ربط س جليكانس2،3. هذه التعديلات يؤدي إلى زيادات كبيرة في الكتلة الجزيئية الواضحة، التي يمكن رؤية التغييرات التنقل في صفحة الحزب الديمقراطي الصربي. يمكن أيضا علامة النضج بالانقسامات proteolytic، مثل الانقسام وإشارة-الببتيد أو إزالة برو-الببتيدات، أسفر عن تغييرات في الكتلة الجزيئية الواضحة التي يمكن اتباعها بسهولة على جل الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة4. النشاط الإشعاعي بمزايا كبيرة على تقنيات قابلة للمقارنة مثل مطاردات سيكلوهيكسيميدي، حيث تمنع تخليق البروتين الرواية، كما العلاجات أطول سامة للخلايا، ولا تستبعد غالبية البروتينات كبار السن، الحالة المستقرة من التحليل، وبعض البروتينات بإنصاف أيام. مقارنة البروتينات تحت كل نونريدوسينج والحد من الظروف يسمح تحليل ثنائي كبريتيد تشكيل السندات، خطوة هامة في طي العديد من البروتينات الافرازية4،،من56، 7.
هنا يصف لنا طريقة عامة لتحليل طي البروتين والنقل في خلايا سليمة، باستخدام نهج مطاردة نبض مشعة. بينما نحن وتهدف إلى توفير الأسلوب مفصلة قدر الإمكان، البروتوكول تتمتع بإمكانيات لا حدود لها تقريبا للقدرة على التكيف وسوف تسمح الأمثل لدراسة البروتينات المحددة كل قارئ.
البروتوكولين تشيس نبض البديلة، تقدم للخلايا ملتصقة (الخطوة 1، 1 من البروتوكول المعروضة هنا) وآخر لتعليق الخلايا (الخطوة 1، 2 من البروتوكول المعروضة هنا). الشروط المقدمة هنا تكفي لتصور بروتين أعربت مع المستويات المتوسطة إلى العليا التعبير. إذا كان القارئ يعمل مع البروتينات أعرب سيئة أو مختلف الظروف بوستريتمينت، مثل إيمونوبريسيبيتيشنز متعددة، من الضروري زيادة حجم صحن أو الخلية عدد مناسب.
لوقف نبض تشيس، مطاردة العينات المأخوذة في كل مرة نقطة الجميع مأخوذة من أنبوب واحد من الخلايا. خطوات الغسيل بعد أن يتم حذف النبض؛ بدلاً من ذلك، كذلك إدماج 35S هو منع إضعاف مع فائض عالية من الميثيونين غير مسمى وسيستين.
استخدام البروتوكولات المقدمة المشعة 35S المسمى سيستين والميثيونين لمتابعة عمليات طي البروتين الخلوي. ينبغي إجراء جميع العمليات مع الكواشف الإشعاعية باستخدام تدابير الحماية المناسبة للتقليل إلى أدنى حد من أي تعرض للمشغل والبيئة للإشعاع المشعة وأداؤها في أحد مختبرات معينة. كالنبض-المطاردة وسم تقنية غير فعالة نسبيا في الأوقات نبض قصيرة (< 15 دقيقة)، وأقل من 1% مبلغ بداية النشاط الإشعاعي الذي أدرج في البروتينات المركبة حديثا. بعد إثراء البروتين المستهدفة عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن، العينة للحزب الديمقراطي الصربي صفحة تحتوي على أقل من 0.05 في المائة مبلغ بداية النشاط الإشعاعي.
على الرغم من أن استقرت الميثيونين 35S وسيستين وسم ميكس، سوف يحدث بعض التحلل، مما أسفر عن المركبات المشعة المتطايرة،. حماية الباحث والجهاز، ينبغي اتخاذ بعض الاحتياطات. الباحث دائماً أن تمتثل لقواعد السلامة الإشعاعية المحلية وقد ارتداء فحم التمريض القناع، إلى جانب معطف مختبر وقفازات (مزدوجة). يجب فتح قنينة الأسهم مع 35S الميثيونين وسيستين دائماً في غطاء دخان، أو تحت نقطة تطلعات محلية. بقع التلوث المختبرات المعروفة بأجهزة الطرد المركزي والماصات وأحواض المياه، وحاضنات والهزازات. يتم تقليل التلوث من هذه المناطق باستخدام ماصة نصائح مع عامل تصفية فحم، أنابيب ميكروسينتريفوجي ختم إيجابية (انظر الجدول للمواد)، وحوض الفحم الاسفنجيات في المياه والحمامات، الفحم تصفية ورقات ملتصقاً بأطباق نبض--تشيس، الفحم من الحرس في نظام الشفط، وإخضاع الأطباق التي تحتوي على الحبوب الفحم في الحاضنات وحاويات التخزين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت تعالج جميع الكواشف الإشعاعية والإجراءات وفقا لجامعة أوترخت المحلية الإشعاع القواعد والأنظمة.
1-نبض تشيس
-
نبض تشيس للخلايا ملتصقة
ملاحظة: وحدات التخزين نظراً لهنا تستند إلى 60 مم خلية ثقافة الأطباق. 35 ملم أو أطباق 100 مم، ضرب وحدات التخزين قبل 1/2 أو 2، على التوالي. هذا البروتوكول يستخدم وقت نبض مرات 10 دقيقة ومطاردة من 0, 15 و 30، 60، 120 و 240 دقيقة. وهذه يمكن أن تختلف تبعاً للبروتينات المحددة قيد الدراسة (مناقشته أدناه).- بذور الخلايا ملتصقة (مثلاً، شو HEK 293، هيلا،) في خلية 60 ملم الست ثقافة الأطباق حيث أن تكون سوبكونفلوينت (80%-90%) في اليوم لمطاردة النبض. استخدام صحن واحد على الأقل كل نقطة الوقت و/أو شرط.
- إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة؛ أو فيروسي ترانسدوسي8 الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.
- غسل الأطباق مع 2 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (هانك لموازنة الحل الملح [حبس])، وإضافة 2 مل من المجاعة المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة تفتقر إلى الميثيونين وسيستين ومصل الدم البقري الجنين [FBS]، مثل الحد الأدنى المتوسطة الأساسية [MEM] دون الميثيونين وسيستين ولكن مع 10 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4)، ووضع الأطباق في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO2 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- نقل الأطباق على الرفوف في حمام مائي بريوارميد 37 درجة مئوية حيث أن أنهم على اتصال مع المياه ولكن لا تطفو. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
- في 40 ق، نضح المتوسطة التجويع، بوضع 600 ميليلتر الحل النبض (وسائط المجاعة + صحن µCi/35 ملم 55 التسمية، راجع الملاحظة السابقة خطوة 1.1.1) إلى الماصة، وإضافته بلطف إلى مركز الطبق في الضبط 1 دقيقة تكرار هذه الخطوة في فواصل زمنية 1 دقيقة ل t أنه الأطباق المتبقية. بدء تشغيل مع العينة تشيس أطول لتوفير الوقت من خلال التجربة.
ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث. - في 11 دقيقة بالضبط وجميع الأطباق التالية، باستثناء العينة تشيس 0 دقيقة، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة مباشرة إلى الطبق ونضح أنه ومرة أخرى، أضف 2 مل من تشيس المتوسطة. كرر هذه الخطوة عند فواصل زمنية 1 دقيقة للاطباق المتبقية. نقل جميع الأطباق إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
- في 16 دقيقة بالضبط، إضافة 2 مل من تشيس المتوسطة (العادي الثقافة المتوسطة + 10 مم حبيس [الأس الهيدروجيني 7.4]، سيستين 5 مم، والميثيونين 5 مم) مباشرة إلى الطبق عينة 0 دقيقة فوق المتوسط النبض إلى التوقف عن وضع العلامات؛ ثم نضح فورا ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة، وإضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج (حبس + 20 مم ن-اثيلماليميدي [NEM]).
ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة. لهذه العينة، المضي قدما إلى الخطوة 1.1.9 مباشرة. - نقل كل طبق مطاردة مرة أخرى إلى حوض ماء 2 دقيقة قبل كل مرة تشيس (مثلاً، 24 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، وفي الوقت الدقيق تشيس (مثلاً، 26 دقيقة لمطاردة 15 دقيقة)، نضح مطاردة وسائل الإعلام (أو تحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي إذا أثر العلاقات العامة إفراز أوتين) ونقل الطبق إلى صفيحة ألومنيوم المبردة. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت إيقاف المثلج.
- احتضان كل الأطباق على الجليد في المخزن المؤقت للتوقف لمدة دقيقة إيه فايف؛ ثم نضح الحل وقف وغسله مع 2 مل من محلول إيقاف المثلج. نضح الغسيل والاطباق مع 600 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت (الفوسفات مخزنة المالحة [برنامج تلفزيوني] + المنظفات نونديناتورينج [انظر الجدول للمواد] مثبطات البروتياز + + 20 مم NEM). استخدام مكشطة خلية لضمان أن يتم تفكيك الأطباق كمياً.
- نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة والطرد المركزي ل 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز و 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.
-
نبض تشيس لتعليق الخلايا
ملاحظة: لضمان كفاءة وسم، ينبغي نابض الخلايا بتركيز 3 × 106 إلى 5 × 106 خلايا/مل، وينبغي أن تكون وحدات التخزين تشيس 4 × حجم النبض. في المثال التالي، نحن نابض 5 × 106 خلايا في حجم 1 مل لمدة 10 دقائق، وأن تسفر عن خمسة مطاردة الوقت نقطة (0، 15، 30 و 60 و 120 دقيقة) 1 مل، الذي يحتوي على 1 × 106 خلايا كل الوقت نقطة. جميع الحلول هي نفسها كما هو الحال في الفرع 1-1.- ثقافة الخلايا تعليق (مثلاً، 3T3، جوركات) وفقا لبروتوكول منشورة سابقا9 حيث لا يوجد عدد كاف من الخلايا في وقت التجربة، على الأقل 1 × 106 خلايا كل مرة نقطة و/أو شرط.
- إذا لزم الأمر، ترانسفيكت الخلايا مع الكواشف المتوفرة تجارياً تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، أو فيروسي ترانسدوسي8 الخلايا يوم 1 قبل النبض-المطاردة التجربة مع بنية مناسبة للتعبير.
- بيليه 5 × 106 خلايا كل شرط في أنبوب 50 مل لمدة 5 دقائق في 250 x g في درجة حرارة الغرفة، وغسلها x 1 مع 5 مل من وسائط الإعلام، والتجويع بيليه لهم مرة أخرى، وريسوسبيند لهم في 1 مل من المجاعة وسائط الإعلام.
- نقل الخلايا إلى حمام مائي 37 درجة مئوية، واحتضان هذه النسبة 10-25 دقيقة تحرض الأنابيب كل 10-15 دقيقة لمنع الخلايا من تسوية في الجزء السفلي.
- بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت. 1 دقيقة بالضبط، إضافة µCi 275 (55 µCi/1 × 106 خلايا) من تسمية غير مخفف مباشرة إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا ودوامه لمزيج.
ملاحظة: عند التعامل مع المواد المشعة، من الضروري اتباع الاحتياطات المناسبة والقواعد المحلية لمنع التعرض العرضي و/أو التلوث. - في 11 دقيقة بالضبط، وقف وسم بإضافة 4 مل من مطاردة وسائل الإعلام. خلط العينة ونقل فورا 1 مل إلى أنبوب 15 مل على الجليد، والتي تحتوي على 9 مل من محلول إيقاف المثلج.
ملاحظة: هذا هو عينة تشيس 0 دقيقة. - كرر هذه الخطوات لكل نقطة الزمنية المتعاقبة. حالما يتم جمع جميع النقاط الزمنية، بيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية. نضح المتوسطة (أو تحويلها إلى أنبوب 15 مل جديدة إذا بعد إفراز البروتين). تغسل الخلايا مع 5 مل من محلول الإيقاف وبيليه الخلايا لمدة 5 دقائق في 250 x ز في 4 درجات مئوية.
- نضح الحل وقف وتماماً الخلايا مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل المثلج واحتضانها لهم لمدة 20 دقيقة على الجليد لضمان تحلل كامل. نقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنبوب وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 15,000-20,000 x ز عند 4 درجة مئوية بيليه الأنوية.
2-إيمونوبريسيبيتيشن
- الجمع بين الأضداد (انظر المناقشة) و 50 ميليلتر من حبات إيمونوبريسيبيتيشن (مثل البروتين A-سيفاروسي) (تعليق 10% [ت/ت] في المخزن المؤقت لتحلل + 0.25% ألبومين المصل البقري [جيش صرب البوسنة]) في ميكروسينتريفوجي أنبوب واحتضانها لهم عند 4 درجة مئوية ل ~ 30 دقيقة في شاكر.
- بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة ونضح المادة طافية. إضافة 200 ميليلتر من ليستي إلى الخليط حبة جسم واحتضان في 4 درجات مئوية في شاكر ح 1 أو رئيس-عبر رئيس إذا كان يتطلب إيمونوبريسيبيتيشن > ح 1.
- بيليه الخرز لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة. نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل إيمونوبريسيبيتيشن. ضع العينة في شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3 وتكرار الغسيل 1 x. ثم نضح المادة طافية وريسوسبيند الخرز في 20 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، الأس الهيدروجيني 6.8 (10 ملم تريس-HCl، يدتا 1 مم). الدوامة العينة.
- إضافة 20 ميليلتر من 2 × العازلة عينة دون الفلزي، الدوامة، الحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية، ودوامه مرة أخرى.
ملاحظة: إلا إذا كان إعداد عينات الحد، 2 ميليلتر من 500 مم DTT يضاف في هذه المرحلة. وبعد ذلك، انتقل إلى الخطوة 2.7. - بيليه الخرز كما هو موضح في الخطوة 2، 3. نقل ميليلتر 19 من المادة طافية نونريدوسيد إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة التي تحتوي على 1 ميليلتر من 500 مم DTT، الطرد المركزي بعينه، ودوامه من قبل أنها تدفئة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية مرة أخرى.
- تدور أسفل العينة لمدة 1 دقيقة في س 12,000 ز؛ وهذا هو عينة مخفضة. بارد عليه وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة وإضافة ميليلتر 1.1 م 1 NEM إلى انخفاض والعينة نونريدوسيد. دوامة وتدور أسفل العينات.
3-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة
- أولاً، تحديد المناسبة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة حل جل النسبة المئوية للبروتين للفائدة. على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp120، عندما يعمل في كاتشين ~ 60 ديجليكوسيلاتيد، ويتم تحليلها في جل 7.5 في المائة.
- إعداد الخليط جل حل دون تيميد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (x % الاكريلاميد، 375 مم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 8.8،] [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.05% فوق كبريتات الأمونيوم [الجزائرية] [w/v]) وديغا تحت الفراغ > 15 دقيقة. بينما هو جليحه الخليط هلام، دقة تنظيف ألواح الزجاج هلام مع الإيثانول 70% وأنسجة خالية من الوبر ووضعها في جهاز صب.
- إضافة تيميد إلى خليط جل حل (في تركيز نهائي من 0.005 في المائة [v/v]) ومزيج دقيق "الماصة؛" بين ألواح الزجاج، تاركاً مساحة سم ~1.5 لجل التراص. عناية تراكب الهلام مع منزوع ح2س أو الأيسوبروبانول وترك الأمر بلمرة.
- مرة واحدة قد بلمرة هلام حل، إعداد خليط جل التراص (الاكريلاميد 4%، 125 ملم تريس-HCl [الأس الهيدروجيني 6.8]، [w/v]، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% و 0.025% APS [w/v]).
- مسح الجزء العلوي من جل حل مع منزوع ح2س، وبعد ذلك، إزالة جميع المياه.
ملاحظة: استخدام ورق الترشيح لإزالة قطرات الماضي. - إضافة تيميد إلى خليط جل التراص (0.005 في المائة [v/v])، ومزيج دقيق، وتراكب هلام حل مع التراص هلام وإدراج مشط 15-جيدا. مرة واحدة وقد بلمرة هلام التراص، أنه نقل إلى دائرة تشغيل وملء الدوائر العليا والسفلي مع تشغيل المخزن المؤقت (25 مم تريس-HCl و 192 مم جليكاين [الأس الهيدروجيني 8.3] 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي [w/v]).
- تحميل 10 ميكروليتر من عينة كل حارة في مينيجيل 15-لين. تجنب تحميل العينات في المرحلة الأولى ولين الأخير على الجل وتحميل المخزن المؤقت الذي عينة نونريدوسينج في جميع الممرات الفارغة لمنع يبتسم العصابات. تشغيل المواد الهلامية في ثابت mA 25/هلام حتى الصبغ والجبهة في الجزء السفلي من الجل.
- إزالة المواد الهلامية من ألواح الزجاج، وصمة عار الهلام مع الحل تلطيخ البروتين (10% حمض الاستيك والميثانول 30% في ح2س + 0.25% الرائعة الأزرق R250 [w/v]) لمدة 5 دقائق مع الانفعالات، وثم، ديستين لمدة 30 دقيقة مع ديستينينج الحل (تلطيخ الحل دون الرائعة R250 الأزرق).
- ترتيب المواد الهلامية الوجه للأسفل على بلاستيك التفاف، ومن ثم، ضع 0.4 مم كروماتوغرافيا الورق فوقهم. وضع هلام ساندويتش اللوني للورق-الجانب الأسفل على هلام مجفف. بناء على تعليمات الشركة المصنعة، الجاف للمواد الهلامية ح 2 عند 80 درجة مئوية.
- نقل المواد الهلامية المجففة إلى كاسيت وتراكب لهم مع شاشة السينما أو الفوسفور أوتوراديوجرافي. في حالة استخدام الفيلم autoradiography، يجب إجراء هذه الخطوة في غرفة مظلمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 2قابلة للطي وإفراز gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-1 من تشيس نبض ملتصقة. هلام نونريدوسينج (NR الخلايا في الشكل) يبين طي عنصر مؤكسد من gp120. فورا بعد النبض وسم من gp120 5 دقيقة (0 دقيقة تشيس) يظهر كعصابة منتشر في الهلام أعلى، وكما تقدم تشيس، ترحيل الفرقة أسفل الجل عن طريق موزع أكثر قابلة للطي وسيطة (IT) حتى يتراكم على نطاق ضيق (NT) وهذا يمثل gp120 مطوية أصلاً. وهذا يحدث كما يزيد تشكيل روابط ثنائي كبريتيد اﻻكتناز البروتين، مما أدى إلى ترحيل أسرع من البروتين الكامل مخفضة. في جل الحد (R الخلايا في الشكل)، قد خفضت ثنائي كبريتيد السندات في جميع أشكال مثل أنه، في جميع الأوقات تشيس، أنها لا تؤثر في التنقل. وهذا ما يسمح تحليل لتعديلات أخرى. يمثل التحول مع مرور الوقت من رو إلى اتفاقية روتردام الانقسام إشارة-الببتيد بوستترانسلاشونال من gp120: يزيد التنقل نظراً لفقدان الببتيد إشارة، مما يزيد أثناء المطاردة البروتينات أكثر تحقيق إضعاف الأصلي وتفقد بهم الببتيد إشارة. في كلا من جل نونريدوسينج والحد، يبدأ الإشارة الانخفاض من ح ~ 1 فصاعدا بسبب إفراز gp120. وهذا يمكن رصدها من خلال تحليل وسائل الإعلام (المتوسطة في الشكل). مقارنة بين نونريدوسينج وتقليل المواد الهلامية يكشف ثنائي كبريتيد بوند التغييرات وإزالة الإشارات-الببتيد. وكان هذا ممكناً إلا لأن آخر تعديل وربط ن glycosylation جليكان من تعديلات، أزيلت من gp120 (والتحليل) بالهضم مع اندوجليكوسيداسي ح قبل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
ويبين الشكل 3الاتجار بسلسلة ثقيلة μ غلوبيولين مناعي M (IgM) من مطاردة نبض تعليق. يمثل تحولاً على مر الزمن من المفوض الساميER إلى المفوض الساميغولجي الاتجار بسلسلة μ لائحة غولجي، الذي يسبق إفراز من الخلية. هو سبب هذا التغيير في الكتلة الجزيئية تعديل جليكانس ن مرتبطة في غولجي.
الشكل 1 : رسم تخطيطي للبروتوكول من أجل مطاردة النبض، إيمونوبريسيبيتيشن، والحزب الديمقراطي الصربي صفحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : للطي وإفراز gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-1، يحدده تشيس نبض ملتصقة. أطباق سوبكونفلوينت 60 مم من خلايا هيلا معربا عن فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp120 كانت نبض المسمى لمدة 10 دقائق وطارده ليدل مرات. بعد إيمونوبريسيبيتيشن gp120، كانت ديجليكوسيلاتيد العينات وتحليلها باستخدام هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 7.5 في المائة. = وسيطة قابلة للطي؛ NT = gp120 الأصلية؛ Ru = gp120 انخفاض إشارة-الببتيد-أونكليفيد؛ Rc = gp120 إشارة-الببتيد-المشقوق مخفضة؛ NR: = نونريدوسينج؛ R = الحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الاتجار بسلسلة ثقيلة من IgM، تحددها تعليق نبض تشيس. أولاً – 29 5 106 μ+ ب الزنزانات نبض المسمى لمدة 5 دقائق وطارده ليدل مرات. بعد إيمونوبريسيبيتيشن، حللت العينات باستخدام هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 10%. HC = الغلوبولين المناعي μ سلسلة ثقيلة؛ LC = الغلوبولين المناعي السلسلة الخفيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أساليب مطاردة نبض كانت ضرورية لتطوير فهم العلماء من البروتين قابلة للطي في خلايا سليمة. في حين أننا حاولنا أن توفر طريقة عامة قدر الإمكان، هذا النهج ينطوي على إمكانية للاختلافات لا حدود لها تقريبا لدراسة مختلف العمليات التي تحدث خلال قابلة للطي، النقل، والحياة للبروتينات داخل الخلية.
عند القيام بعملية مطاردة نبض باستخدام خلايا ملتصقة بالاطباق، من الضروري لعلاج كل طبق نفس قدر الإمكان، كطبق منفصل يستخدم لكل نقطة الوقت و/أو شرط في تجربة. خاصة بالنسبة لمرات النبض ومطاردة قصيرة (< 5 دقيقة)، فمن الضروري الاحتفاظ رقابة مشددة على مرات النبض ومطاردة (مع جهاز توقيت رقمي). نبض مطاردات مع تعليق الخلايا يمكن أن تساعد على تقليل هذا التغير كما جميع عينات مأخوذة من أنبوب واحد. كما تلتزم بعض أنواع الخلايا أقل لثقافة الأطباق من غيرها، ينبغي الحرص على كفالة أن الخلايا لا جرفت خلال مختلف التغيرات المتوسطة. وهذا يمكن التغلب عليها أما باستخدام هذه الخلايا في تعليق أو بطلاء الأطباق مع بولي-L يسين أو الجيلاتين، على سبيل المثال، التمسك بالخلايا للاطباق الثقافة. لقياس إمكانية تكرار نتائج من الملصقات بين الأطباق، ينبغي دراسة عينة من ليستي بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي لفحص جميع عينات لمطابقة نمط العلامات والبروتين مجموع. وبدلاً من ذلك، ستقيم السائلة التﻷلؤ العد من ليساتيس مجموع التهم في الدقيقة (cpm) وإدماجها ولكن لا توفر معلومات عن السكان البروتين المسمى.
إذا كان بروتين المستهدف تسميات سيئة، هو زيادة الإشارة بزيادة عدد الخلايا (أو الأطباق) بدلاً من زيادة حجم التسمية. إطالة فترة نبض خيار عندما حركية عملية درس سوف يسمح بذلك. سوف تختلف الوقت المثالي نبض مع كل هدف نظراً لعوامل مثل مستوى التعبير، أن معدل النسخ، عدد ميثيونينيس/سيستينيس، ومعدل لطي البروتين. على هذا النحو، يجب أن يتم التجريب لتحديد أفضل توازن بين العوامل المذكورة أعلاه في كل تجربة مع مراعاة هدف التجريبية. إذا كانت وسيطة أثناء الطي هي قيد الدراسة، على سبيل المثال، من المرغوب فيه نبض التسمية لأقصر وقت ممكن أن يكون انطلاق المواد أقرب دولة تكشفت قدر الإمكان، مع الموازنة بين مستويات التعبير. وبدلاً من ذلك، إذا كان النقل أو تدهور البروتين هو هدف الدراسة، قد تطول مرات النبض لتوفير أعلى مستويات إشارة ممكنة دون المساس بالمعلومات الحركية. وبصفة عامة، يمكن أن تتراوح مرات النبض من 2-15 دقيقة عند استخدام هذا البروتوكول دون تعديل. أظهرت التجارب السابقة5 مدة ~ 10 s بعد النبض قبل إدراج النشاط الإشعاعي في تجمع البروتين الكلي؛ هذا المهم أن نضع في اعتبارنا عند اشتقاق المعلومات الحركية من تجارب نبض--تشيس. لفترة قصيرة نبض مرات (< 2 دقيقة)، وإبقاء جميع الأطباق في حوض ماء زمن نبض كامل. وإذا مدد مرات النبض (> ح 1) هي قيد الاستخدام، فمن المستحسن أن زيادة حجم النبض بمرة ونصف ووضع الأطباق على الروك في حاضنة 37 درجة مئوية خلال نبض لمنع الأطباق من الجفاف. في حين تتوفر حلول وضع العلامات التي تحتوي على الفرد 35S-ميثيونين/السيستين أو مزيج، المزيج المفضل حتى عندما يجري المسماة البروتينات التي تحتوي فقط على الميثيونين أو سيستين سواء اللازمة للحفاظ على تخليق البروتين عامة في الخلية. إذا استدعت ظروف تجريبية محددة الميثيونين/سيستين العلامات، يجب تعديل المستويات من الميثيونين/سيستين nonradioactive خلال النبض تبعاً لذلك.
تشيس مرات (وعدد النقاط الزمنية) مصممة بطريقة مماثلة. هو مكان انطلاق جيدة تعيين أول مرة تشيس (بعد مطاردة 0 دقيقة) بوصفه مساوياً للوقت النبض، ومضاعفة طول الفترة الزمنية لكل نقطة مرة متتالية ثم، (مثلاً، 5، 10 و 20 و 40 دقيقة). ولكن هذا يجب أن يكون الأمثل لكل البروتين محددة والسؤال.
لمنع تنشيط استجابات الإجهاد بسبب المجاعة (التي قد تؤثر على تخليق البروتين وقابلة للطي)، من الناحية المثالية، ينبغي أن تضاف بعض الميثيونين غير مسمى وسيستين المجاعة وراديولابيلينج الحلول. الكمية التي سوف تعتمد على خط الخلية والوقت وضع العلامات، وكمية من راديولابيل المستخدمة ووحدات تخزين الوسائط، وسوف تحتاج إلى اختبار. نقطة انطلاق جيدة هي 1% المبلغ سيستين والميثيونين في مستنبت الخلية، التي يمكن زيادة مع زيادة مرات النبض. فترات المجاعة، سواء مع أو بدون الأحماض الأمينية غير مسمى، يجب أن تبقى في النطاق من 15-30 دقيقة ضمان إدراج التسمية المناسبة ومنع تنشيط استجابات الإجهاد. عند استخدام نبض موسعة (ح إيه وان)، أن المجاعة غير مطلوب.
المخزن المؤقت تحلل الموصوفة هنا سوف تكون مناسبة لمعظم الأغراض، ولكن من حيث المبدأ، أي نظام العازلة، مثل حبيس، تريس، أو العلم، وسوف تعمل. تركيز مواد التنظيف اللازمة للخلايا سيتوقف على العدد من الخلايا وتخزين مواد التنظيف. ينبغي أن يكون التركيز دائماً أعلى تركيز مذيل الحرجة (CMC) والكمية من المنظفات كافية للخلايا. حكم التجربة تجريبية أن 200 ميليلتر من المنظفات نونديناتورينج 0.5% (انظر الجدول للمواد) غير كافية لما يعادل خلية ~ 1 ملغ بروتين (~ 1 × 106 خلايا). تركيز الملح والمنظفات قد تختلف أيضا وفقا للتطبيق، ولكن بشكل عام، الظروف التي كسر فتح الأنوية (الملح عالية، > 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي) ينبغي تجنب وجود الحمض الحر سوف تتداخل مع إيمونوبريسيبيتيشن. إذا كان لا يمكن تجنب هذا، على سبيل المثال، عندما ليساتيس خلية كاملة بما في ذلك نواة أو البروتينات الأعلاف تحتاج إلى تحليلها، يمكن المنفصمة الحمض النووي عن طريق تمرير الخلايا عن طريق إبرة قياس صغير قبل إيمونوبريسيبيتيشن. هذا المفضل على مدى سونيكيشن للحيلولة دون رغوة المفرط وإنتاج الأيروسولات المشعة.
إيمونوبريسيبيتيشن، الكمية المثلى للأجسام المضادة وأفضل أغسل المخزن المؤقت لكل تركيبة جسم مضاد-مستضد يجب اختبار دقيق لتحقيق توازن بين الإشارات مستضد المرجوة والخلفية. الأجسام المضادة وينبغي أن تكون حاضرة دائماً في فائض على مولدات المضادات لضمان إيمونوبريسيبيتيشن الكمية؛ هو نقطة انطلاق جيدة 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل إيمونوبريسيبيتيشن من صحن 35 ملم/1 × 106 خلايا. يمكن تقليل الخلفية عن طريق زيادة المنظفات أو تركيزات الملح. على وجه الخصوص، إضافة ≤0.1% مخزونات النشر الاستراتيجي يمكن أن يساعد على تقلل إلى حد كبير الخلفية لكن يمكن أيضا عرقلة التفاعلات جسم مضاد-مستضد. للتحكم بخصوصية الأجسام المضادة أثناء إيمونوبريسيبيتيشن، ينبغي أن تستخدم الخلايا المتطابقة التي تفتقر إلى البروتين المستهدف عندما تكون متاحة. إذا لم يكن هذا مباشرة، مثل عندما يتم تحليل البروتينات الذاتية، سيعمل overexpression أو نضوب للمستضد. للتحكم في الخلفية (وخصوصية)، أما سيرا بريمن (حيثما أمكن) أو ينبغي أن تستخدم ضوابط ايستب. للسيطرة على المستضدات الربط مباشرة إلى الخرز إيمونوبريسيبيتيشن، ينبغي أيضا استخدام الخرز دون الأجسام المضادة. وينبغي أن تعتبر الشروط المنصوص عليها هنا كنقطة انطلاق كما سيتطلب كل زوج جسم مضاد-مستضد الأمثل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وأوضاع المياه والصرف الصحي. في حالة الكثير من الخلفية، لا تزيد عدد يغسل ولكن بدلاً من ذلك الوقت للغسيل و/أو تكوين المخزن المؤقت الغسيل. إذا التعامل مع تفاعلات حساسية خاصة كما هو الحال في كويمونوبريسيبيتيشنز، قد يكون من الأفضل القيام بجميع الخطوات يغسل عند 4 درجة مئوية، باستخدام المخازن المؤقتة المثلج.
ميزة واحدة من الخلايا ملتصقة على خلايا تعليق هو أن المخدرات العلاجات يمكن أن يؤديها أي نقطة تقريبا خلال مطاردة النبض. إذا تم استخدامها مع مثبطات وصي، على سبيل المثال، فإنه من الممكن التمييز إثارة على شركة- مقابل بوستترانسلاشونال مراحل عملية قابلة للطي. يمكن تمديد هذه بتكييف في مخازن يغسل تحلل وإيمونوبريسيبيتيشن (نوقشت أعلاه) للسماح كويمونوبريسيبيتيشن مجمعات البروتين-وصي أثناء الطي10،،من1112.
علاج بوستليسيس من عينات سيوسع نطاق الأسئلة التي يمكن معالجتها. هضم البروتينات المستهدفة قبل إيمونوبريسيبيتيشن وستقدم معلومات إضافية كونفورماشونال، وقد استخدمت بنجاح لرصد قابلة للطي للبروتينات، وبخاصة تلك التي تفتقر إلى، ثنائي كبريتيد السندات13مبطلات محدودة 14. يمكن رصد تجميع البروتين وتكوين معقد بالطرد المركزي الكثافة--التدرج السكروز قبل15،إيمونوبريسيبيتيشن16.
للاستفادة الكاملة من مطاردات النبض، مطلوب توفير الكواشف عالية الجودة إيمونوبريسيبيتيشنز. عند دراسة وسيطة قابلة للطي، من الضروري أن يكون الأجسام المضادة التي قادرة على سحب إلى أسفل جميع أشكال البروتين قيد التحليل. إذا لم تتوفر الأجسام المضادة المحددة للبروتين المستهدف، وهذا يمكن أن يكون محل باستخدام العلامات تقارب. غير أن هذا يقيد بشدة جدوى أساليب بوستليسيس، مثل بروتيوليسيس المحدودة، لمباشرة التحقيق تشكيل البروتين، كما يمكن استرداد فقط الأجزاء الموسومة.
حساسية مطاردات نبض محدود بعدد بقايا الميثيونين وسيستين في البروتين في السؤال. البروتينات بإعداد منخفضة من بقايا الميثيونين/سيستين مقرونا بمستوى منخفض من تعبير لا يمكن اكتشافها في تجارب نبض--تشيس. عند إجراء التعديلات بوستليسيس مثل بروتيوليسيس المحدودة، سوف تكون الشظايا الميثيونين/سيستين-تتضمن فقط قابلة للاكتشاف.
ختاما، معين تقديم التفاصيل الحركية التي نبض مطاردات، مكملة للعديد من التقنيات والأدوات المستخدمة في دراسة بيولوجيا الخلية الجزيئية على مستوى مرتفع-الدولة الأخرى. على هذا النحو، تزال عنصرا قيماً في مربع الأدوات لعلم الأحياء الجزيئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبر براكمان، في الماضي والحاضر، للمناقشات المثمرة وتساعد في تطوير الأساليب التي عرضت في هذا المقال. هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من "مجلس البحوث الأوروبية" ضمن الاتحاد الأوروبي "البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) N ° 235649 وفي هولندا منظمة من العلمية البحوث (جمعية البحث العلمي الهولندية) تحت درجة N برنامج صدى 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
