Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine allgemeine Puls-Jagd-Methode, die die kinetische Analyse der Faltung, Transport und Abbau von Proteinen in lebenden Zellen einzuhaltenden erlaubt.
Abstract
Kennzeichnung von radioaktiven Puls-Jagd ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Konformationsänderungen Reifung, den Transport zu ihrer zellulären Platzes und der Verschlechterung der Zielproteine in lebenden Zellen. Mit kurzen (Puls) enzymatische Zeiten (< 30 min) und streng kontrolliert Chase Zeiten, es ist möglich, beschriften Sie nur einen Bruchteil des gesamten Protein Pools und folgen seinen Falten. In Kombination mit nonreducing/Reduzierung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunopräzipitation mit (Konformation) Antikörper kann Falten Prozesse im Detail untersucht werden. Dieses System wurde verwendet, um die Faltung von Proteinen mit eine große Variation in Eigenschaften wie lösliche Proteine, Einzel- und Multi-Pass transmembranen Proteine, stark N und O-glycosylierten Proteine und Proteine mit und ohne umfangreiche Disulfid analysieren die Verklebung. Puls-Jagd-Methoden sind die Basis für kinetische Untersuchungen in eine Reihe von zusätzlichen Funktionen, einschließlich Co- und posttranslationale Modifikationen, Oligomerisierung und Polymerisation, im wesentlichen erlaubt die Analyse eines Proteins von der Geburt bis zum Tod. Puls-Chase-Studien zur Proteinfaltung ergänzen sich mit anderen biochemischen und biophysikalischen Methoden für ein Studium Proteine in Vitro durch höhere zeitliche Auflösung und physiologische Informationen. Die Methoden, wie in diesem Dokument beschrieben sind leicht angepasst, zur Untersuchung der Faltung von fast jedem Protein, das in Säugetieren oder Insekt-Zelle Systeme ausgedrückt werden kann.
Introduction
Die Faltung auch relativ einfache Proteine umfasst viele verschiedene klappbaren Enzyme, molekulare Chaperone und kovalente Modifikationen1. Eine vollständige Wiederherstellung der diese Prozesse in Vitro ist praktisch unmöglich, angesichts die Vielzahl von verschiedenen Komponenten beteiligt. Es ist daher höchst wünschenswert, Proteinfaltung in Vivo, in lebenden Zellen zu studieren. Radioaktiven Puls-Jagd Techniken beweisen ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Synthese, Falten, Transport und Abbau von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung.
Die metabolische Kennzeichnung von Proteinen während eines kurzen Impuls mit 35S-Label Methionin/Cystein, gefolgt von einer Verfolgungsjagd in Ermangelung eines radioaktiven Labels, können spezielle Tracking einer Bevölkerung der neu synthetisierten Proteine im weiteren zellulären Milieu. Dann können Zielproteine isoliert über Immunopräzipitation und analysiert per SDS-PAGE oder andere Techniken. Für viele Proteine zeichnet sich ihre Reise durch die Zelle durch Änderungen, die auf SDS-PAGE Gel sichtbar sind. Beispielsweise wird der Transport des glykosylierten Proteinen aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) an der Golgi-Komplex oft durch Modifikationen von Glykoproteinen N verbunden oder die Zugabe von O-linked Glykane2,3begleitet. Diese Änderungen verursachen hohe Zuwächse in die scheinbare molekulare Masse, die durch Mobilität Veränderungen im SDS-PAGE zu sehen ist. Reifung kann auch gekennzeichnet werden, durch proteolytische Spaltungen, wie Signal-Peptid Spaltung oder die Entfernung von Pro-Peptide, was zu Veränderungen in der scheinbaren molekulare Masse, die SDS-PAGE Gel4leicht verfolgt werden können. Radioaktivität hat erhebliche Vorteile gegenüber vergleichbaren Techniken wie Cycloheximide jagt, wo wird Roman Proteinsynthese vorgebeugt, da längere Behandlungen giftig für Zellen sind und schließen nicht die Mehrheit der älteren, stationäre Proteine aus, die Analyse, wie einige Proteine haben Halbwertszeiten von Tagen. Der Vergleich der Proteine unter beide nonreducing und reduzierenden Bedingungen erlaubt die Analyse von Disulfid Bindung Bildung, ein wichtiger Schritt bei der Faltung von vielen Sekretorische Proteine4,5,6, 7.
Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode für die Analyse der Proteinfaltung und Transport in intakten Zellen mit einem radioaktiven Puls-Chase-Ansatz. Während wir haben die Methode als bereitstellen soll detailliert wie möglich, das Protokoll hat ein fast grenzenloses Potential für Anpassungsfähigkeit und ermöglicht die Optimierung des Lesers bestimmte Proteine zu studieren.
Zwei alternative Puls-Jagd-Protokolle, eine für adhärente Zellen (Schritt 1.1 des Protokolls, die hier vorgestellten) und eine für Aussetzung Zellen (Schritt 1.2 des hier vorgestellten Protokolls) stehen zur Verfügung. Die Bedingungen zur Verfügung gestellt, hier sind ausreichend, um ein Protein mit Medium-High Ausdruck Niveaus ausgedrückt zu visualisieren. Wenn der Leser mit schlecht ausgedrückten Proteine oder verschiedenen Behandlungsgruppen Bedingungen, z. B. mehrere Immunperoxidase funktioniert ist es notwendig zu Gericht vergrößern oder Handy-Nummer entsprechend.
Für Aufhängung Puls Chase sind Chase Proben, die zu jedem Zeitpunkt alle aus einem einzigen Rohr Zellen getroffen. Die Wäsche Schritte nach dem Puls der Zeit entfallen; Stattdessen wird weiter Aufnahme von 35S durch Verdünnung mit einem hohen Überschuss der unbeschrifteten Methionin und Cystein verhindert.
Die vorgestellten Protokolle verwenden radioaktiven 35S-Label Cystein und Methionin-Proteinfaltung Zellprozesse folgen. Alle Operationen mit radioaktiven Reagenzien sollten durchgeführt werden, über geeignete Schutzmaßnahmen zur Minimierung des Bedieners und der Umwelt gegenüber radioaktiver Strahlung ausgesetzt und in einem bestimmten Labor durchgeführt werden. Als der Puls-Chase Kennzeichnung Technik ist relativ ineffizient bei kurzen Impulszeiten (< 15 min), weniger als 1 % des Grundbetrags von Radioaktivität in die neu synthetisierte Proteine aufgenommen wird. Nach der Anreicherung von Ziel-Protein über Immunopräzipitation enthält die Probe für SDS-PAGE weniger als 0,05 % des Grundbetrags der Radioaktivität.
Obwohl die 35S Methionin und Cystein Kennzeichnung Mischung wird stabilisiert, wird einige Zersetzung, nachgiebig flüchtige radioaktive Verbindungen auftreten. Um der Forscher und das Gerät zu schützen, sollten einige Vorkehrungen getroffen werden. Der Forscher sollte immer die lokalen Strahlung Sicherheitsregeln einhalten und kann eine Kohle Pflege Maske, neben einem Laborkittel und (Doppel-) Handschuhe tragen. Lager Fläschchen mit 35S Methionin und Cystein sollte immer unter einem Abzug oder unter einem lokalen Aspiration Punkt geöffnet werden. Bekannte Labor Kontamination Spots sind Zentrifugen, Pipetten, Wasserbäder, Inkubatoren und Schüttele-Apparat. Die Kontamination von diesen Bereichen wird reduziert, indem Pipettenspitzen mit einem Aktivkohlefilter, Positive Dichtung Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle der Materialien), Aquarium Holzkohle Schwämme in Wasser Bäder, Holzkohle Filterpapiere geklebt in der Puls-Chase-Gerichte, Holzkohle Wache in die Aspiration und die Platzierung der Speisen mit Holzkohle Körner in Inkubatoren und Lagerbehälter.
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Protocol
Alle radioaktiven Reagenzien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit örtlichen Universität Utrecht Strahlung Regeln und Vorschriften gehandhabt.
1. Puls Chase
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Puls-Chase für adhärente Zellen
Hinweis: Die hier angegebenen Volumen basiert auf 60 mm Zelle Kultur Gerichte. Für 35 mm oder 100 mm Schalen die Bände mit 1/2 oder 2, jeweils multipliziert. Dieses Protokoll verwendet eine Taktzeit von 0, 15, 30, 60, 120 und 240 min. 10 min und Chase Zeiten. Diese können je nach den spezifischen Proteinen untersucht (unten besprochen) variiert werden.- Samen adhärente Zellen (z. B.HEK 293, HeLa, CHO) in sechs 60 mm Zelle Kultur Gerichte, so dass sie Subconfluent (80-90 %) am Tag der Jagd Puls. Verwenden Sie mindestens ein Gericht pro Zeitpunkt und/oder Zustand.
- Bei Bedarf transfizieren Sie Zellen mit handelsüblichen Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers; oder Viral transduzieren8 Zellen 1 Tag vor der Puls-Jagd mit dem entsprechenden Konstrukt für Ausdruck experimentieren.
- Den Abwasch mit 2 mL Waschpuffer (Hank es ausgeglichen Salzlösung [HBSS]), fügen Sie 2 mL Hunger Medium (normale Kulturmedium fehlt Methionin und Cystein und fötalen Rinderserum [FBS], wie minimale wesentliche Medium [MEM] ohne Methionin und Cystein aber mit 10 mM HEPES, pH 7,4) und legen Sie die Gerichte in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 für 15 Minuten.
- Übertragen Sie die Gerichte zu den Racks in eine vorgewärmte 37 ° C Wasserbad, so dass sie in Kontakt mit Wasser aber nicht schwimmen. Einen Timer gestartet wird.
- Bei 40 s, Aspirieren das Hunger-Medium, 600 µL Puls-Lösung (Hunger Medien + 55 µCi/35-Millimeter-Teller zu kennzeichnen, finden Sie im vorhergehenden Schritt 1.1.1 Hinweis) erarbeiten in der Pipette, und fügen Sie es sanft in die Mitte des Tellers genau 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt in 1 min Abständen für t He übrigen Gerichte. Starten Sie mit der längsten Chase Probe bei Ihrem Experiment Zeit sparen.
Hinweis: Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen ist es wichtig, entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und lokale Regeln und Vorschriften, versehentliche Belichtung und/oder Kontamination zu verhindern. - Fügen Sie bei genau 11 min und für alle folgenden Gerichte, außer für die 0 min Chase Probe 2 mL Chase Medium direkt auf den Teller hinzu, aspirieren Sie es, und wieder 2 mL Chase Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt in 1 min Abständen für die restlichen Gerichte. Übertragen Sie alle Gerichte auf einem 37 ° C Inkubator.
- Bei genau 16 min, fügen Sie 2 mL Chase Medium (normale Kulturmedium + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM Cystein und Methionin 5 mM) direkt an die 0 min Probenschale auf das Puls-Medium zu stoppen, Kennzeichnung; dann aspirieren Sie sofort, übertragen Sie das Gericht auf eine gekühlte Aluminiumplatte, und 2 mL eiskaltes Stop Puffer (HBSS + 20 mM N- Ethylmaleimide [NEM]).
Hinweis: Dies ist die 0 min Chase Probe. In diesem Beispiel gehen Sie direkt zu Schritt 1.1.9. - Jedes Gericht Chase ins Wasserbad 2 min vor jedem Chase (z. B.24 min für eine 15 min Chase) zu übertragen und, damals genaue Chase (z.B.26 min. für ein 15 min Chase) Aspirieren der Chase-Medien (oder zu einem Microcentrifuge Schlauch zu übertragen, wenn folgende Pr Otein Sekretion) und das Gericht auf eine gekühlte Aluminium-Platte übertragen. 2 mL eiskaltes Stop Puffer hinzugeben.
- Inkubieren Sie alle Gerichte auf dem Eis in der Stop-Puffer für ≥5 min; dann aspirieren Sie die Stop-Lösung und waschen Sie es mit 2 mL eiskalte Hand. Aspirieren Sie die Wäsche und lösen Sie Gerichte mit 600 µL Lyse Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung [PBS] + nondenaturing Waschmittel [siehe Tabelle der Materialien] Proteaseinhibitoren + 20 mM NEM). Verwenden Sie Zelle Schaber, um sicherzustellen, dass die Gerichte quantitativ lysiert werden.
- Übertragen Sie auf einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 10 min bei 15.000-20.000 X g und 4 ° C zu die Kernen Pellets die lysate.
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Puls-Jagd nach Aussetzung Zellen
Hinweis: Um effiziente Kennzeichnung zu gewährleisten, sollte die Zellen in einer Konzentration von 3 x 106 , 5 x 106 Zellen/mL gepulst werden und sollen Chase Mengen 4 x das Puls-Volumen. Im folgenden Beispiel, gepulst wir 5 x 106 Zellen in einem Volumen von 1 mL für 10 min, weichen jagen fünf Mal Punkte (0, 15, 30, 60 und 120 min.) von 1 mL, 1 x 106 Zellen pro Zeitpunkt. Alle Lösungen sind die gleichen wie in Abschnitt 1.1.- Kultur der Aussetzung Zellen (z. B.3 t 3, Jurkat) gemäß einer zuvor veröffentlichten Protokoll9 so dass es eine ausreichende Anzahl von Zellen zum Zeitpunkt des Experiments, mindestens 1 x 106 Zellen pro Zeiteinheit zeigen und/oder Zustand.
- Bei Bedarf transfizieren Sie Zellen mit handelsüblichen Transfektion Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers, oder Viral transduzieren Sie8 Zellen 1 Tag vor der Puls-Jagd mit dem entsprechenden Konstrukt für Ausdruck experimentieren.
- Pellet-5 x 106 Zellen pro Zustand in ein 50 mL-Tube für 5 min bei 250 X g bei Raumtemperatur, waschen Sie sie 1 X mit 5 mL der Hunger Medien, pellet-sie wieder und Aufschwemmen ihnen in 1 mL der Hunger Medien.
- Übertragen Sie die Zellen auf 37 ° C Wasserbad und inkubieren sie für 10-25 min. rühren den Röhren alle 10-15 min zu verhindern, dass die Zellen unten absetzen.
- Der Timer gestartet wird. Bei genau 1 min 275 µCi (55 µCi/1 x 106 Zellen) unverdünnt Beschriftung der Röhrchen mit Zellen direkt hinzufügen und wirbeln um zu mischen.
Hinweis: Beim Umgang mit radioaktiven Stoffen ist es wichtig, entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und lokale Regeln und Vorschriften, versehentliche Belichtung und/oder Kontamination zu verhindern. - Vor genau 11 min Halt Kennzeichnung durch Zugabe von 4 mL Chase Medien. Mischen Sie die Probe und sofort übertragen Sie 1 mL auf eine 15 mL-Tube auf Eis, mit 9 mL eiskalte Hand.
Hinweis: Dies ist die 0 min Chase Probe. - Wiederholen Sie diese Schritte für jeden aufeinanderfolgenden Zeitpunkt. Sobald alle Zeitpunkte gesammelt sind, pellet-Zellen für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C. Aspirieren Sie das Medium (oder an eine neue 15 mL Tube übertragen Sie, wenn Protein Sekretion nach). Waschen Sie die Zellen mit 5 mL Stopp-Lösung und pellet-Zellen für 5 min bei 250 X g bei 4 ° C.
- Aspirieren Sie die Stop-Lösung, komplett lösen Sie die Zellen mit 300 µL Puffer eiskalte lyse und inkubieren sie für 20 min auf Eis, um eine komplette Lyse zu gewährleisten. Übertragen Sie auf einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 10 min bei 15.000-20.000 X g bei 4 ° C zu die Kernen Pellets die lysate.
(2) Immunopräzipitation
- Antikörper zu kombinieren (siehe die Diskussion) und 50 µL Immunopräzipitation Perlen (z. B. Protein A-Sepharose) (10 % Suspension [V/V] Lyse Puffer + 0,25 % Rinderserumalbumin [BSA]) in einem Microcentrifuge Rohr und inkubieren sie bei 4 ° C für ca. 30 min in einen Shaker geben.
- Pellet-die Perlen für 1 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur und den Überstand abgesaugt. Die Antikörper-Korn-Mischung 200 µL lysate hinzu und brüten bei 4 ° C in einem Shaker für 1 h oder Kopf-über-Kopf verlangt die Immunopräzipitation > 1 h.
- Pellet-die Perlen für 1 min bei 12.000 X g bei Raumtemperatur. Den Überstand abgesaugt und 1 mL Immunopräzipitation Waschpuffer. Legen Sie die Probe in einem Shaker für 5 min bei Raumtemperatur.
- Pellet-Perlen wie unter Punkt 2.3 beschrieben, und wiederholen Sie die Wäsche 1 X. Dann Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Perlen in 20 µL TE-Puffer, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Wirbel der Probe.
- Fügen Sie 20 µL 2 x Probenpuffer ohne das Reduktionsmittel, Wirbel, erhitzen Sie es wieder für 5 min bei 95 ° C und Wirbel.
Hinweis: Wenn nur die Proben vorbereiten, 2 µL von 500 mM DTT sollte an dieser Stelle hinzugefügt werden. Dann fahren Sie mit Schritt 2.7. - Pellet-Perlen wie unter Punkt 2.3 beschrieben. 19 µL des Überstands nonreduced zu einem frischen Microcentrifuge Schlauch mit 1 µL von 500 mM DVB-t übertragen, Zentrifugieren der Probe und Wirbel es schon wieder für 5 min bei 95 ° C erhitzt.
- Spin-down der Probe für 1 min bei 12.000 X g; Dies ist die reduzierte Stichprobe. Die reduzierte und die nonreduced Probe 1,1 µL 1 m NEM hinzufügen und auf Zimmertemperatur abkühlen. Wirbel und Spin-down der Proben.
(3) SDS-PAGE
- Bestimmen Sie zuerst die entsprechende SDS-PAGE Lösung von Gel Prozentsatz für das Protein von Interesse. Zum Beispiel HIV-1 gp120, wenn Deglycosylated, läuft bei ~ 60 kDa und wird in einem 7,5 % Gel analysiert.
- Bereiten Sie die Lösung von Gel-Mischung ohne TEMED gemäß den Anweisungen des Herstellers (x % Acrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1 % SDS [w/V], und 0,05 % Ammonium bleichen [APS] [w/V]) und unter Vakuum für entgasen > 15 min. Während die Gel-Mischung Entgasung ist, gründlich reinigen Sie die Gel-Glasplatten mit 70 % Ethanol und fusselfreien Gewebe und legen Sie sie in einer Gießvorrichtung.
- Die Lösung von Gel-Mischung (auf eine Endkonzentration von 0,005 % [V/V]) TEMED hinzu, mischen, und pipette zwischen Glasplatten, ~1.5 cm Freiraum für das Stapeln Gel. Sorgfältig überlagern Sie das Gel mit entionisiertem H2O oder Isopropanol und lassen Sie es zu polymerisieren.
- Sobald die Lösung von Gel polymerisiert hat, bereiten die Stapeln Gel-Mischung (4 % Acrylamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1 % SDS [w/V], und 0,025 % APS [w/V]).
- Spülen Sie oben auf die Lösung von Gel mit entionisiertem H2O, und entfernen Sie dann alle Wasser.
Hinweis: Verwenden Sie Filterpapier, um die letzten Tropfen zu entfernen. - Die Stapelung Gel-Mischung (0,005 % [V/V]) TEMED hinzu, mischen Sie, und überlagern Sie das Auflösen von Gel mit Stapeln Gel und legen Sie einen 15-Well-Kamm. Sobald das stapelnde Gel polymerisiert hat, überträgt es auf eine laufende Kammer und füllen Sie die oberen und unteren Kammern mit Puffer ausgeführt (25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin [pH 8,3] und 0,1 % SDS [w/V]).
- 10 µL der Probe pro Bahn in einem 15-spurige Minigel zu laden. Vermeiden Sie das Laden der Proben in der ersten und der letzten Spur auf das Gel und laden Sie die nonreducing Probenpuffer in allen leeren Spuren zu verhindern, dass das Lächeln der Bands. Führen Sie die Gele bei konstanten 25 mA/Gel, bis Farbstoff vorne an der Unterseite des Gels ist.
- Entfernen Sie die Gele aus Glasplatten, färben die Gele mit Protein-Färbelösung (10 % Essigsäure und 30 % Methanol in H2O + 0,25 % brilliant blue R250 [w/V]) für 5 min. unter Rühren, und dann für 30 min mit entfärben (Färbung Lösung destain Lösung ohne brilliant blue R250).
- Ordnen Sie die Gele verdeckt auf einem Kunststoff wickeln und dann legen Sie 0,4 mm Chromatographiepapier auf ihnen. Legen Sie die Gel Sandwich Chromatographie Papier-Seite nach unten auf ein Gel Trockner. Trocknen Sie nach den Anweisungen des Herstellers die Gele für 2 h bei 80 ° C.
- Die getrockneten Gele auf einer Kassette übertragen und mit Autoradiographie Film oder Phosphor-Bildschirm überlagern. Wenn Autoradiographie Film verwenden, muss dieser Schritt in einem dunklen Raum durchgeführt werden.
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Representative Results
Die Faltung und Sekretion von HIV-1 gp120 aus einem anhaftenden Puls Chase ist in Abbildung 2dargestellt. Das nonreducing Gel (Zellen NR in der Abbildung) zeigt die oxidative Faltung des gp120. Sofort nach dem Puls Kennzeichnung von 5 min (0 min. Chase) gp120 erscheint als eine diffuse Band höher in das Gel, und Fortschreiten der Jagd, die Band wandert nach unten das Gel durch noch mehr verbreitet Faltung Zwischenprodukte (IT), bis es reichert sich in den engen Band (NT) nativ gefalteten gp120 darstellt. In diesem Fall die Bildung von Disulfid-Bindungen mit zunehmender Kompaktheit des Proteins, wodurch es schneller als das vollständig reduzierte Protein migrieren. Auf dem reduzierende Gel (Zellen R in der Abbildung) wurden die Disulfid-Bindungen auf alle Formen reduziert sodass jederzeit Chase, diese Mobilität nicht beeinträchtigen. Dies ermöglicht die Analyse von anderen Modifikationen. Die Verschiebung im Laufe der Zeit von Ru RC repräsentiert die posttranslationale Signalpeptid Spaltung von gp120: die Mobilität erhöht sich durch den Verlust von Signalpeptid, die während der Jagd erhöht, da mehr Proteine die native Klappe erreichen und ihre Signalpeptid verlieren. Auf dem nonreducing und reduzierenden Gel beginnt das Signal von ~ 1 h weiter durch die Sekretion von gp120 sinken. Dies kann durch die Analyse der Medien (mittlere Abbildung) überwacht werden. Ein Vergleich der nonreducing und reduzierenden Gele deckt Disulfid Bindung Änderungen und Signal-Peptid entfernen. Dies war nur möglich, weil eine weitere Modifikation, N-linked Glykosylierung und Glycan Änderungen durch Vergärung mit Endoglycosidase H kurz vor SDS-PAGE von gp120 (und der Analyse) entfernt wurden.
Der Handel mit der µ schwere Kette von Immunglobulin M (IgM) aus einer Suspension Puls Verfolgungsjagd ist in Abbildung 3dargestellt. Eine Verschiebung im Laufe der Zeit von HCER zu HCGolgi stellt der Handel mit der µ-Kette von der Notaufnahme bis Golgi, die Sekretion aus der Zelle vorausgeht. Diese Änderung in der molekularen Masse wird durch die Änderung der N-linked Glykoproteinen in den Golgi verursacht.
Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Protokolls für Puls Chase, Immunopräzipitation und SDS-PAGE. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Faltung und Sekretion von HIV-1 gp120, bestimmt durch anhaftende Puls Chase. Subconfluent 60 mm Schalen von HeLa-Zellen mit dem Ausdruck HIV-1 gp120 wurden Puls für 10 min beschriftet und jagte den angegebenen Zeiten. Nach der Immunopräzipitation gp120 die Proben wurden Deglycosylated und mit einer 7,5 % SDS-PAGE Gel analysiert. ES = Faltung Zwischenprodukte; NT = nativen gp120; RU = reduzierte Signal-Peptid-uncleaved gp120; RC = reduzierte Signal-Peptid gespalten gp120; NR: = nonreducing; R = reduzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Handel mit der schweren Kette des IgM, bestimmt durch Aussetzung Puls Chase. 5 x 106 i. 29 µ+ B-Zellen waren Impuls für 5 min beschriftet und jagte den angegebenen Zeiten. Nach Immunopräzipitation wurden die Proben mit 10 % SDS-PAGE Gel analysiert. HC = Immunglobulin µ schwere Kette; LC = Immunglobulin Leichtketten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Puls-Jagd-Methoden wurden wesentlich für die Entwicklung von wissenschaftlichen Verständnis der Proteinfaltung in intakten Zellen. Während wir versucht haben, ein Verfahren zu schaffen, die so allgemein wie möglich ist, hat dieser Ansatz das Potenzial für nahezu grenzenlose Variationen, verschiedene Prozesse zu studieren, die während der Faltung, den Transport und das Leben der Proteine in der Zelle auftreten.
Bei der Durchführung einer Puls-Verfolgungsjagd mit adhärenten Zellen in Gerichte unbedingt jedes Gericht behandeln das gleiche so weit wie möglich, als eine separate Schüssel für jeden Zeitpunkt und/oder Bedingung in einem Experiment verwendet wird. Vor allem für kurze Pulse und Chase Zeiten (< 5 min), es ist wesentlich, eine strenge Kontrolle über den Puls und Chase Zeiten (mit einem digitalen Timer) beizubehalten. Puls-Verfolgungsjagden mit Aussetzung Zellen können helfen, um diese Variabilität zu reduzieren, da alle Proben aus einem einzigen Rohr entnommen werden. Da einige Zelltypen weniger gut als andere Kultur Gerichte halten, sollte darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass die Zellen während der verschiedenen mittlere Veränderungen nicht weggespült werden. Dies kann entweder über diese Zellen in Suspension oder durch die Beschichtung die Gerichte mit Poly-L-Lysin oder Gelatine, zum Beispiel, um die Zellen, die die Kultur Gerichte halten überwunden werden. Um die Reproduzierbarkeit der Kennzeichnung zwischen Gerichten zu messen, sollte eine Probe des lysate durch SDS-PAGE zu überprüfen, alle Proben für identische total Etikettier- und Protein-Muster untersucht werden. Alternativ wird liquid funkeln Zählung der Lysates etablieren, die insgesamt zählt pro Minute (cpm) aufgenommen, aber wird nicht Aufschluß über die Protein-Bevölkerung gekennzeichnet.
Wenn ein Zielprotein schlecht kennzeichnet, wird das Signal durch die Erhöhung der Anzahl der Zellen (oder Gerichte) und nicht durch die Erhöhung der Menge des Labels erhöht. Verlängerung der Impulszeit ist eine Option, wenn die Kinetik des untersuchten Prozesses dies zulässt. Die ideale Impulszeit variiert jedes Ziel aufgrund Faktoren wie die Expression, die Transkription-Rate, die Anzahl der Methionines/Cysteine und die klappbaren Rate des Proteins. Als solche muss Experimente durchgeführt werden, zu bestimmen, die beste Balance zwischen den oben genannten Faktoren in jedem Experiment beim halten der experimentellen Ziel im Verstand. Wenn Zwischenprodukte während der Faltung studiert werden, zum Beispiel, ist es wünschenswert, das Label für möglichst kurze Zeit wie möglich, das Ausgangsmaterial so nah an einem aufgeklappten Zustand wie möglich, wobei Ausgewogenheit zwischen Ausdruck Niveaus Puls. Wenn der Transport oder zum Abbau von Protein das Ziel der Studie ist, können alternativ Impulszeiten verlängert werden, um das höchste Niveau des Signals möglich ohne kinetische Informationen bieten. Im Allgemeinen reichen Impulszeiten von 2-15 min. bei Verwendung dieses Protokolls ohne Modifikation. Vorherige Versuche5 zeigte eine Zeitverzögerung von ca. 10 s nach dem Puls vor der Aufnahme der Radioaktivität in den Gesamt-Protein-Pool; Dies ist wichtig im Auge zu behalten, beim kinetische Informationen von Puls-Jagd Experimente ableiten. Für kurze Zeiten (< 2 min) Puls, halten die Gerichte auf dem Wasserbad während der gesamten Taktzeit. Wenn der Puls Mal verlängert (> 1 h) sind verwendet wird, ist es ratsam, erhöhen Sie die Lautstärke der Puls durch das 1,5-fache und Gerichte auf einer Wippe in einem Inkubator 37 ° C während des Puls zu verhindern, dass die Speisen austrocknen. Während Kennzeichnung Lösungen mit individuellen 35S-Methionin/Cystein oder eine Mischung zur Verfügung stehen, ist die Mischung bevorzugt auch wenn Proteine, die nur Methionin oder Cystein enthalten beschriftet sind, Bedarf sowohl allgemeine Proteinsynthese pflegen in der Zelle. Experimentelle Bedingungen erfordern spezielle Methionin/Cystein Kennzeichnung, müssen die Höhe der nicht radioaktiven Methionin/Cystein während der Puls angepasst werden.
Chase Zeiten (und die Anzahl der Zeitpunkte) werden in ähnlicher Weise bestimmt. Ein guter Ausgangspunkt ist, zum ersten Mal der Jagd (nach 0 min Chase) als gleich die Taktzeit und, dann, verdoppeln Sie die Länge der Zeit für jeden aufeinanderfolgenden Zeitpunkt (z. B.5, 10, 20 und 40 min). Dies muss jedoch für jeden spezifischen Proteins und Frage optimiert werden.
Um zu verhindern, dass die Aktivierung von Stressreaktionen durch Hunger (die Proteinsynthese und Falten beeinträchtigen kann), im Idealfall, sollten einige unbeschriftete Methionin und Cystein, die Hunger und enzymatische Lösungen hinzugefügt werden. Die Menge richtet sich nach der Zell-Linie, die Kennzeichnung Zeit die Menge von den Himmelskörpern verwendet und Medien Bände und Tests benötigen. Ein guter Ausgangspunkt ist 1 % des Betrages von Cystein und Methionin im Zellkulturmedium, das mit zunehmender Impulszeiten erhöht werden kann. Hunger-Perioden, ob mit oder ohne unbeschriftete Aminosäuren, im Bereich von 15-30 min, angemessene Bezeichnung Einbau zu gewährleisten und verhindern, dass die Aktivierung von Stressreaktionen aufbewahrt werden. Wenn Sie einen erweiterte Puls (≥1 h) verwenden, ist Hunger nicht erforderlich.
Der hier beschriebenen Lyse-Puffer wird für die meisten Zwecke geeignet sein, aber im Prinzip Puffer-System, z. B. HEPES, Tris oder MES, funktioniert. Die Waschmittel Konzentration erforderlich, um Zellen zu lösen hängt von der Anzahl der Zellen und Waschmittel Volumen. Die Konzentration sollte immer oberhalb der kritischen Micelle Konzentration (CMC) und die Menge des Waschmittels ausreichen, um die Zellen lysiert werden. Eine empirische Faustregel ist, dass 200 µL 0,5 % nondenaturing Waschmittel (siehe Tabelle der Materialien) ist ausreichend, um die Zelle entspricht ~ 1 mg Protein (~ 1 x 106 Zellen) zu lösen. Die Salzkonzentration und Waschmittel können auch je nach Anwendung variiert werden, aber im Allgemeinen Bedingungen, die zu brechen öffnen Kerne (hohe Salz > 0,1 % SDS) sollte vermieden werden, da das Vorhandensein von freie DNA mit Immunopräzipitation stören wird. Wenn dies beispielsweise vermieden werden, kann nicht als vollständige Zelle Lysates einschließlich Kerne oder gebeizte Proteine werden analysiert müssen, kann DNA geschoren werden, indem man die Zellen durch eine kleine Nadel vor Immunopräzipitation. Dies wird bevorzugt über Beschallung um übermäßige Schaumbildung zu vermeiden und die Produktion von radioaktiven Aerosolen.
Für Immunopräzipitation müssen die optimale Menge von Antikörpern und die besten Waschpuffer für jede Kombination der Antikörperantigen gründlich getestet werden, um ein Gleichgewicht zwischen den gewünschten Antigen-Signal und den Hintergrund. Antikörpern sollte immer vorhanden sein, im Übermaß über Antigene dazu quantitative Immunopräzipitation; ein guter Ausgangspunkt ist 1 µg pro Immunopräzipitation aus einem 35 mm Teller/1 x 106 -Zellen-Antikörper. Hintergrund kann verringert werden, indem man das Waschmittel oder Salzkonzentrationen. Insbesondere die Zugabe von ≤0.1 % SDS kann helfen, den Hintergrund erheblich reduzieren aber Antikörperantigen Interaktionen auch stören kann. Um für die Spezifität der Antikörper während Immunopräzipitation zu steuern, sollten identische Zellen fehlt das Zielprotein verfügbar genutzt werden. Ist dies nicht einfach ist, wie wenn körpereigene Proteine analysiert werden, funktioniert die Überexpression oder Erschöpfung des Antigens. Für Hintergrund (und Spezifität), entweder preimmune Sera Steuern (soweit möglich) oder Isotype Steuerelemente verwendet werden soll. Um Antigene binden direkt an Immunopräzipitation Perlen zu steuern, sollten auch Perlen ohne Antikörper verwendet werden. Die hier zur Verfügung gestellten Bedingungen sollte als Ausgangspunkt betrachtet werden, da jedes Antikörper-Antigen-paar eine Optimierung der Waschpuffer und waschen Bedingungen erfordert. Erhöhen Sie bei zu viel Hintergrund nicht die Anzahl der Wäschen aber eher die Zeit des Waschens und/oder die Zusammensetzung der Waschpuffer. Bei besonders sensible Interaktionen wie z. B. in Coimmunoprecipitations behandelt werden, kann es alle waschen Arbeitsschritte bei 4 ° C, mit eiskaltem Puffer vorzuziehen.
Ein Vorteil von adhärenten Zellen über Aussetzung Zellen ist das Medikament, die Behandlungen während der Puls-Jagd zu nahezu jedem Zeitpunkt ausgeführt werden können. Wenn mit Chaperon-Inhibitoren verwendet, zum Beispiel ist es möglich, seine Auswirkungen auf die co - versus posttranslationale Phasen eines klappbaren Prozesses zu unterscheiden. Dies kann erweitert werden durch die Anpassung der Lyse und Immunopräzipitation waschen-Puffer (siehe oben) um die Coimmunoprecipitation zu ermöglichen der Chaperon-Protein-komplexe während der Faltung10,11,12.
Die postlysis Behandlung der Proben wird das Ausmaß der Fragen erweitern, die behandelt werden können. Die begrenzte Protease Verdauung von Zielproteinen bevor Immunopräzipitation zusätzliche Konformationsänderungen Informationen und erfolgreich verwendet wurde, um die Faltung von Proteinen, insbesondere fehlen Disulfid Anleihen13zu überwachen, 14. Proteinaggregation und Komplexbildung können durch Saccharose Dichtegradienten Zentrifugation vor Immunopräzipitation15,16überwacht werden.
Um Puls jagt nutzen zu können, ist die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Reagenzien für Immunperoxidase erforderlich. Bei klappbaren Zwischenprodukte der Prüfung unbedingt Antikörper haben, die in der Lage, alle Formen des Proteins unter Analyse herunterziehen. Wenn spezifische Antikörper an das Zielprotein nicht verfügbar sind, kann dies mithilfe von Affinität-Tags ersetzt werden. Dies schränkt jedoch stark die Nützlichkeit der postlysis Methoden wie die begrenzte Proteolyse die Konformation Protein direkt zu untersuchen, da nur tagged Fragmente wiederhergestellt werden können.
Die Empfindlichkeit der Puls jagt wird durch die Anzahl von Methionin und Cystein-Rückständen in das fragliche Protein begrenzt. Proteine mit einer geringen Anzahl von Methionin/Cystein Rückstände gepaart mit einem niedrigen Ausdruck sind nicht nachweisbar im Puls-Chase-Experimente. Bei der Durchführung postlysis Modifikationen wie begrenzte Proteolyse werden nur Methionin/Cystein-haltigen Fragmente nachweisbar sein.
Abschließend, bestimmten die kinetische Details, die Verfolgungsjagden Puls bieten, zu vielen anderen Techniken und Hilfsmittel zum studieren molekulare Zellbiologie Ebene der stationären komplementär sind. Sie weiterhin als solche eine wertvolle Komponente in der Molekular-Biologe-Toolbox.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen Mitgliedern des Labors Braakman, vorbei an und präsentieren, für ihre fruchtbaren Diskussionen und helfen bei der Entwicklung der Methoden in diesem Artikel vorgestellt. Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Forschungsrat unter der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) N ° 235649 und der Niederlande Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unter der ECHO-Programm N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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