Summary
Hier beschrijven we een protocol voor een algemene pulse-chase-methode, waarmee de kinetische analyse van vouwing, vervoer en afbraak van eiwitten te volgen in levende cellen.
Abstract
Puls-chase radioactieve labeling is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de conformationele rijping, het vervoer naar hun functionele cellulaire locatie, en de afbraak van doel proteïnen in levende cellen. Met behulp van korte (puls) radiolabeling keer (< 30 min) en streng gecontroleerd chase tijden, is het mogelijk om slechts een klein deel van de totale proteïne-pool label en volg de vouwen. Wanneer gecombineerd met nonreducing/vermindering van de Elektroforese van het gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) en immunoprecipitation met (conformatie-specifieke) antilichamen, kan vouwen processen worden onderzocht in groot detail. Dit systeem is gebruikt om te analyseren de vouwing van eiwitten met een enorme variatie in eigenschappen zoals oplosbare eiwitten, enkele en Multi-Pass transmembraan eiwitten, zwaar N - en O-geglycosyleerde eiwitten en proteïnen met en zonder uitgebreide bisulfide verlijmen. Puls-chase methoden vormen de basis van kinetische studies naar een aantal extra functies, waaronder co - en posttranslationele modificaties oligomerisatie en polymerisatie, waardoor in wezen de analyse van een eiwit vanaf de geboorte tot de dood. Puls-chase studies over de vouwing van eiwitten zijn complementair met andere biochemische en Biofysische methoden voor studeren eiwitten in vitro door verhoogde temporele resolutie en fysiologische informatie te bieden. De methoden zoals beschreven in dit document zijn gemakkelijk aangepast om te bestuderen de vouwen van bijna elk eiwit dat kan worden uitgedrukt in zoogdieren of insect-cel systemen.
Introduction
De vouwen van zelfs relatief eenvoudig eiwitten omvat vele verschillende opvouwbare enzymen, moleculaire chaperones en covalente wijzigingen1. Een volledige reconstructie van deze processen in vitro is praktisch onmogelijk, gezien het grote aantal verschillende componenten betrokken. Het is daarom zeer wenselijk, het bestuderen van in levende cellen waar de eiwitvouwing in vivo. Radioactieve pulse-jacht technieken blijken een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de synthese, vouwen, vervoer en afbraak van eiwitten in hun natuurlijke omgeving.
De metabole labeling van eiwitten tijdens een korte puls met 35S-geëtiketteerden methionine/cysteïne, gevolgd door een achtervolging in het ontbreken van een radioactieve label, kunt specifieke bijhouden van een bevolking van nieuw samengestelde eiwitten in de bredere cellulaire milieu. Vervolgens doel eiwitten kunnen worden geïsoleerd via immunoprecipitation en geanalyseerd via SDS-pagina of andere technieken. Voor veel eiwitten, wordt hun reis door de cel gekenmerkt door wijzigingen die zichtbaar op de SDS-pagina gel zijn. Bijvoorbeeld gaat het vervoer van geglycosyleerde eiwitten uit het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het Golgi-complex vaak gepaard met wijzigingen van N-gebonden glycanen of de toevoeging van O-gebonden glycanen2,3. Deze wijzigingen veroorzaken grote stijgingen in de schijnbare moleculaire massa, die kan worden gezien door mobiliteit veranderingen in SDS-pagina. Rijping kan ook worden gemarkeerd door Proteolytische breuklijnen, zoals de signaal-peptide decollete of de verwijdering van pro-peptides, wat resulteert in veranderingen in de schijnbare moleculaire massa die kan gemakkelijk worden gevolgd op SDS-pagina gel4. Radioactiviteit heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van vergelijkbare technieken zoals cycloheximide achtervolgingen, waar nieuwe eiwitsynthese wordt voorkomen, zoals langere behandelingen giftig voor de cellen zijn en sluit niet de meerderheid van de oudere, steady-state eiwitten uit de analyse, zoals sommige eiwitten hebben half-leven van dagen. De vergelijking van eiwitten onder beide nonreducing en vermindering van de voorwaarden kan de analyse van de vorming van de bond van bisulfide, een belangrijke stap in de vouwen van vele secretoire eiwitten4,5,6, 7.
Hier beschrijven we een algemene methode voor de analyse van de vouwing van eiwitten en vervoer in onbeschadigde cellen, met behulp van een radioactief pulse-chase-aanpak. Terwijl wij hebben gericht op de methode als gedetailleerd mogelijk, het protocol heeft een bijna onbegrensde mogelijkheden voor aanpassingsvermogen en optimalisatie te bestuderen van specifieke proteïnen van elke lezer zal toestaan.
Twee alternatieve pulse-chase protocollen, één voor Adherente cellen (stap 1.1 van het hier gepresenteerde protocol) en één voor schorsing cellen (stap 1.2 van het hier gepresenteerde protocol) worden verstrekt. De voorwaarden bedoeld hier volstaan om te visualiseren een eiwit uitgedrukt met middellange - tot hoog-expressie niveaus. Als de lezer met slecht uitgedrukte proteïnen of verschillende posttreatment omstandigheden, zoals meerdere immunoprecipitations werkt, is het noodzakelijk om te verhogen van de grootte van de schotel of cel nummer op de juiste manier.
Voor schorsing pulse chase, worden de chase-monsters op elk punt van de tijd genomen uit een enkele buis van cellen. De stappen wassen nadat de pols worden weggelaten; in plaats daarvan wordt verdere integratie van 35S verhinderd door verdunning met een hoge overmaat van labelloze methionine en cysteïne.
De gepresenteerde protocollen gebruiken radioactieve 35S-geëtiketteerden cysteïne en methionine te volgen van cellulaire eiwitvouwing processen. Alle bewerkingen met radioactieve reagentia moeten worden uitgevoerd met behulp van passende beschermende maatregelen om te minimaliseren van eventuele blootstelling van de exploitant en het milieu aan radioactieve straling en worden uitgevoerd in een aangewezen laboratorium. Als de puls-chase labeling techniek is relatief inefficiënt korte puls tijde (< 15 min), minder dan 1% van het beginbedrag van radioactiviteit is verwerkt in de onlangs samengestelde eiwitten. Na de verrijking van de target eiwit via immunoprecipitation bevat het monster voor SDS-pagina minder dan 0,05 procent van het beginbedrag van radioactiviteit.
Hoewel de 35S methionine en cysteïne labeling mix is gestabiliseerd, zal sommige ontleding, opbrengst van de vluchtige radioactieve stoffen, plaatsvinden. Ter bescherming van de onderzoeker en de apparatuur, moeten sommige voorzorgsmaatregelen worden genomen. De onderzoeker moet altijd de veiligheidsvoorschriften van de lokale straling gehoorzamen en een houtskool masker, naast een laboratoriumjas en (dubbele) handschoenen van de verpleegkunde mag dragen. Voorraad flesjes met 35S methionine en cysteïne moeten altijd worden geopend in een zuurkast of onder een lokale aspiratie-punt. Bekende laboratorium besmetting plekken zijn centrifuges, pipetten, waterbaden, incubatoren en shakers. De besmetting van deze gebieden wordt verminderd door het gebruik van de pipet tips met een houtskool filter, positief-seal microcentrifuge buizen (Zie Tabel of Materials), aquarium houtskool sponzen in water baden, houtskool filtreerpapier gelijmd in de puls-chase gerechten, houtskool bewaker in de aspiratie systeem, en de plaatsing van gerechten met houtskool korrels in voorbroeders en opslagtanks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle radioactieve reagentia en procedures werden behandeld in overeenstemming met lokale Universiteit Utrecht straling regels en voorschriften.
1. pulse Chase
-
Pulse Chase voor Adherente cellen
Opmerking: De hier gegeven volumes zijn gebaseerd op 60 mm cel cultuur gerechten. Voor 35 mm of 100 mm gerechten, vermenigvuldigt u de volumes met 1/2 of 2, respectievelijk. Dit protocol maakt gebruik van een puls-tijd van 10 min en chase tijden van 0, 15, 30, 60, 120 en 240 min. Dit kunnen variëren afhankelijk van de specifieke proteïnen bestudeerd (zie hieronder).- Zaad van Adherente cellen (bijvoorbeeldHEK 293, HeLa, CHO) in zes 60 mm cel cultuur gerechten, zodat zij zullen subconfluent (80% - 90%) op de dag van de puls-jacht. Het gebruik van ten minste één schotel per tijdstip en/of voorwaarde.
- Indien nodig, transfect de cellen met verkrijgbare transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant; of, viraal transduce8 de cellen 1 dag vóór de puls-chase met de juiste constructie voor expressie experiment.
- De afwas met 2 mL was buffer (Henks uitgebalanceerd zoutoplossing [HBSS]), voeg 2 mL van honger medium (normale kweekmedium ontbreekt van methionine en cysteïne en foetale runderserum [FBS], zoals minimale essentiële medium [MEM] zonder methionine en cysteïne maar met 10 mM HEPES, pH 7.4), en plaats de schotels in een bevochtigde incubator van de 37 ° C met 5% CO2 gedurende 15 minuten.
- Overbrengen in de gerechten de rekken in een waterbad 37 ° C voorverwarmde dus dat ze in contact met water maar niet doen drijven. Een timer te starten.
- Bij 40 s, gecombineerd het medium van de honger, 600 µL van pulse oplossing (honger media + 55 µCi/35 mm schotel label, zie de opmerking voorafgaand aan stap 1.1.1) opstellen in de pipet, en toe te voegen zachtjes naar het midden van de schotel op precies 1 min. Herhaal deze stap voor t tussenpozen 1 min Hij resterende gerechten. Begin met het langste achtervolging monster om tijd tijdens uw experiment te besparen.
Opmerking: Bij het verwerken van radioactief materiaal, is het essentieel te volgen passende voorzorgsmaatregelen en lokale regels en voorschriften ter voorkoming van accidentele blootstelling en/of besmetting. - Op precies 11 min voor alle volgende gerechten, met uitzondering van het 0 min chase monster, voeg toe 2 mL van chase medium rechtstreeks naar de schotel, gecombineerd het en opnieuw, voeg 2 mL van chase medium. Herhaal deze stap voor de overige gerechten tussenpozen 1 min. Alle gerechten overbrengen in een 37 ° C incubator.
- Op precies 16 minuten, voeg 2 mL van chase medium (normale kweekmedium + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM cysteïne en methionine 5 mM) rechtstreeks naar de 0 min monster schotel op de top van het medium van de pols om te stoppen met etikettering; vervolgens onmiddellijk gecombineerd, de schotel overbrengen in een gekoelde aluminiumplaat, en voeg 2 mL ijskoud stop buffer (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]).
Opmerking: Dit is de 0 min chase steekproef. Voor dit voorbeeld, ga direct naar stap 1.1.9. - Elk gerecht chase ook terug overzetten naar het waterbad 2 min voordat chase telkens (bijvoorbeeld24 min. voor een achtervolging van 15 min) en, op het moment van de exacte chase (bijvoorbeeld26 min. voor een achtervolging van 15 min), gecombineerd de chase-media (of het overbrengen van een microcentrifuge buis als volgende pr de secretie van de otein) en de schotel overbrengen in een gekoelde aluminiumplaat. Voeg toe 2 mL ijskoud stop buffer.
- Incubeer alle gerechten op ijs in de stop-buffer voor ≥5 min; vervolgens de eindeoplossing gecombineerd en wassen met 2 mL ijskoud eindeoplossing. De wash gecombineerd en gerechten met 600 µL van lysis buffer lyse (met fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] + nondenaturing wasmiddel [Zie Tabel of Materials] proteaseinhibitors + 20 mM NEM). Gebruik een cel schraper om ervoor te zorgen dat de gerechten kwantitatief zijn lysed.
- Overdracht van de lysate een tube van 1,5 mL microcentrifuge en centrifuge voor 10 min bij 15,000-20,000 x g en 4 ° C tot pellet de kernen.
-
Pulse Chase voor schorsing cellen
Opmerking: Om ervoor te zorgen efficiënte etikettering, cellen moeten worden gepulseerde bij een concentratie van 3 x 10,6 tot en met 5 x 106 cellen/mL, en chase volumes moet 4 x het volume van de pols. In het volgende voorbeeld, gepulseerde wij 5 x 106 cellen in een volume van 1 mL voor 10 min, aan opbrengst vijf achter de tijd aanhollen wijst (0, 15, 30, 60 en 120 min) van 1 mL, met 1 x 106 cellen per tijdstip. Alle oplossingen zijn hetzelfde als in punt 1.1.- Cultuur de schorsing cellen (bijvoorbeeld3T3, Jurkat) volgens een eerder gepubliceerde protocol9 , zodat er een voldoende aantal cellen ten tijde van het experiment, minstens 1 x 106 cellen per keer wijs en/of voorwaarde.
- Indien nodig, transfect cellen met verkrijgbare transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant, of viraal transduce8 de cellen 1 dag vóór de puls-chase met de juiste constructie voor expressie experiment.
- 5 x 106 cellen per voorwaarde in een tube van 50 mL voor 5 min op 250 x g bij kamertemperatuur pellet, was ze 1 x met 5 mL honger media, pellet hen opnieuw en resuspendeer hen in 1 mL honger media.
- De cellen overbrengen in een waterbad 37 ° C en incubeer hen voor 10-25 min. Agitate de buizen elke 10-15 minuten om te voorkomen dat de cellen regelen onderaan.
- De timer te starten. Op precies 1 min, 275 µCi (55 µCi/1 x 106 cellen) van onverdunde label rechtstreeks toevoegen aan de buis met cellen en wervelen om te mengen.
Opmerking: Bij het verwerken van radioactief materiaal, is het essentieel te volgen passende voorzorgsmaatregelen en lokale regels en voorschriften ter voorkoming van accidentele blootstelling en/of besmetting. - Precies 11 min, stoppen door toevoeging van 4 mL chase media labelen. Meng het monster en onmiddellijk overbrengen in 1 mL een tube van 15 mL op ijs, met 9 mL ijskoud eindeoplossing.
Opmerking: Dit is de 0 min chase steekproef. - Herhaal deze stappen voor elke opeenvolgende tijdstip. Zodra alle tijdstippen worden verzameld, pellet de cellen gedurende 5 minuten bij 250 x g bij 4 ° C. Het medium gecombineerd (of overbrengen naar een nieuwe tube van 15 mL als volgende eiwit secretie). Wassen van de cellen met 5 mL van de oplossing van de stop- and -pellet de cellen gedurende 5 minuten bij 250 x g bij 4 ° C.
- De stop-oplossing gecombineerd, volledig lyse de cellen met 300 µL van ijskoude lysis buffer en incubeer hen gedurende 20 min op het ijs om een volledige lysis. Overdracht van de lysate een tube van 1,5 mL microcentrifuge en centrifuge voor 10 min bij 15,000-20,000 x g bij 4 ° C tot pellet de kernen.
2. Immunoprecipitation
- Combineren van antilichaam (Zie de bespreking) en 50 µL van immunoprecipitation parels (bijvoorbeeld eiwit A-Sepharose) (10% schorsing [v/v] in lysis-buffermengsel + 0,25% bovien serumalbumine [BSA]) in een microcentrifuge buis en incubeer hen bij 4 ° C gedurende ongeveer 30 min. in een shaker.
- De kralen voor 1 min bij 12.000 x g bij kamertemperatuur pellet en het supernatant gecombineerd. Voeg 200 µL van lysate aan de antilichaam-kraal-mengsel en Incubeer bij 4 ° C in een shaker voor 1 h of kop-over-kop als de immunoprecipitation vereist > 1 h.
- Pellet de kralen voor 1 min bij 12.000 x g bij kamertemperatuur. De bovendrijvende substantie gecombineerd en voeg 1 mL immunoprecipitation was buffer. Leg het monster in een shaker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- De kralen pellet zoals beschreven in stap 2.3 en herhaal het wassen 1 x. Vervolgens gecombineerd het supernatant en resuspendeer de kralen in 20 µL van TE buffer, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortex het monster.
- Voeg 20 µL van 2 x monster buffer zonder de reductiemiddel, vortex, verwarm het opnieuw gedurende 5 minuten bij 95 ° C, en vortex.
Opmerking: als slechts voorbereiding reducerend monsters, 2 µL van 500 mM DTT moet worden toegevoegd op dit punt. Ga vervolgens verder met stap 2.7. - Pellet de parels zoals beschreven in stap 2.3. 19 µL van het supernatans dat nonreduced overbrengen in een buis van de verse microcentrifuge met 1 µL van 500 mM DTT, centrifugeren van het monster, en de vortex eerder de verwarming het gedurende 5 minuten bij 95 ° C weer.
- Spin down de steekproef voor 1 min op 12.000 x g; Dit is het deelmonster. Afkoelen tot kamertemperatuur en 1.1 µL van 1 M NEM toevoegen aan zowel het lagere en het nonreduced monster. Vortex en spin down de monsters.
3. SDS-PAGE
- Bepaal eerst het juiste SDS-pagina oplossen gel percentage voor de proteïne van belang. Bijvoorbeeld, HIV-1 gp120, toen deglycosylated, ~ 60 kDa prestatiestatus en wordt geanalyseerd in een gel van 7,5%.
- Het oplossen gel mengsel zonder TEMED bereiden volgens de aanwijzingen van de fabrikant (x % acrylamide, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1% SDS [w/v], en 0,05% ammoniumnitraat persulfate [APS] [w/v]) en ontgas onder drukvermindering voor > 15 min. Terwijl het mengsel gel is ontgassing, grondig reinigen van de gel glasplaten met 70% ethanol en pluisvrije weefsels en plaats ze op een apparaat gieten.
- Voeg TEMED toe aan het mengsel van het oplossen gel (met een eindconcentratie van 0.005% [v/v]), meng en Pipetteer tussen de glazen platen, waardoor ~1.5 cm ruimte voor het stapelen van gel. Zorgvuldig overlay van de gel met gedeïoniseerd H2O of isopropanol en laat het polymeriseren.
- Zodra het oplossen gel heeft polymeervorm, bereiden de stapelvolgorde gel-mengsel (4% acrylamide, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], 0,1% SDS [w/v], en 0,025% APS [w/v]).
- Leegmaken van de bovenkant van het oplossen gel met gedeïoniseerd H2O en verwijder vervolgens alle water.
Opmerking: Gebruik filtreerpapier te verwijderen van de laatste druppels. - Voeg TEMED aan de stapelvolgorde gel mengsel (0.005% [v/v]), meng, en bedekken het oplossen gel met stapelen gel en invoegen van een 15-well kam. Zodra de stapelvolgorde gel heeft polymeervorm, het overbrengen van een lopende kamer en vul de bovenste en onderste kamers met het runnen van de buffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycine [pH 8.3] en 0,1% SDS [w/v]).
- 10 µL van monster per rijstrook in een 15-baans minigel laden. Vermijd het laden van de monsters in de eerste en de laatste lane op de gel en laden de nonreducing monster buffer in alle lege rijstroken om te voorkomen dat de glimlachen van bands. Pas uitvoeren nadat de gels bij constant een 25 mA/gel de kleurstof voorzijde is aan de onderkant van de gel.
- Haal de gels uit de glasplaten, vlek de gels met eiwit-kleuring oplossing (azijnzuur 10% en 30% methanol in H2O + 0,25% briljant blauw R250 [w/v]) voor 5 min met agitatie, en vervolgens destain voor 30 min met destaining oplossing (kleuring oplossing zonder briljant blauw R250).
- Schik de gels gezicht naar beneden op een plastic wikkel en, vervolgens, plaats 0.4 mm chromatografie papier op de top van hen. Plaats de gel sandwich chromatografie papier-zijde naar beneden op een gel droger. Na instructies van de fabrikant, drogen de gels gedurende 2 uur bij 80 ° C.
- De gedroogde gels overbrengen in een cassette en bedekken ze met autoradiografie film of fosfor scherm. Als met behulp van autoradiografie film, moet deze stap worden uitgevoerd in een donkere kamer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De vouwen en afscheiding van HIV-1 gp120 vanaf een aanhangend pulse chase is afgebeeld in Figuur 2. De nonreducing gel (NR van de cellen in de figuur) toont de oxidatieve vouwen van gp120. Onmiddellijk na de pols labeling van 5 min (0 min chase) gp120 weergegeven als een diffuse band hoger in de gel, en naarmate de chase de band migreert naar beneden de gel door nog meer verspreid vouwen tussenproducten (IT) totdat het hoopt zich op in de strakke band (NT) die vertegenwoordigt native gevouwen gp120. Dit gebeurt als de vorming van disulfide bindingen de compactheid van het eiwit verhoogt, waardoor het sneller dan de volledig verlaagd eiwit migreren. Op de reducerende gel (R van de cellen in de figuur), zijn de disulfide bindingen op alle vormen verlaagd, zodat allen tijde chase, hebben ze geen invloed op mobiliteit. Hierdoor is de analyse van andere wijzigingen. De verschuiving in de tijd van Ru naar Rc vertegenwoordigt de posttranslationele signaal-peptide splitsing van gp120: de mobiliteit verhoogt als gevolg van het verlies van het signaal-peptide, die tijdens de achtervolging toeneemt als meer eiwitten de inheemse vouwen bereiken en hun signaal peptide verliezen. Op zowel de nonreducing en reducerende gel begint het signaal te dalen vanaf ~ 1 h verder als gevolg van de afscheiding van gp120. Dit kan worden gecontroleerd door het analyseren van de media (Medium in de figuur). Een vergelijking van de nonreducing en reducerende gels onthult disulfide binding wijzigingen en signaal-peptide verwijdering. Dit was alleen mogelijk omdat een andere wijziging, N-gebonden glycosylatie en glycan wijzigingen, werden verwijderd uit gp120 (en de analyse) door de spijsvertering met endoglycosidase H net voor SDS-pagina.
De handel in de µ zware ketting van immunoglobuline M (IgM) vanaf een schorsing pulse chase is afgebeeld in Figuur 3. Een verschuiving in de tijd van HCER naar HCGolgi vertegenwoordigt de handel in de µ-keten van de ER tot het Golgi, die voorafgaat aan afscheiding uit de cel. Deze verandering in de moleculaire massa wordt veroorzaakt door de wijziging van N-gebonden glycanen in het Golgi.
Figuur 1 : Schematisch diagram van het protocol voor puls chase, immunoprecipitation, en SDS-PAGE. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Folding en afscheiding van HIV-1 gp120, bepaald door aanhangend pulse chase. Subconfluent 60 mm gerechten van HeLa cellen uiten van HIV-1 gp120 waren pulse gelabeld voor 10 min en joeg voor de aangegeven tijden. Na de immunoprecipitation van gp120, de monsters werden deglycosylated en geanalyseerd met behulp van een 7,5% SDS-pagina gel. HET = vouwen tussenproducten; NT = native gp120; Ru = verminderde signaal-peptide-uncleaved gp120; RC = verminderde signaal-peptide-gekloofd gp120; NR: = nonreducing; R = verminderen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Handel in de zware keten van IgM, bepaald door schorsing pulse chase. 5 x 106 I.29 µ+ B cellen werden pulse gelabeld voor 5 min en joeg voor de aangegeven tijden. Na immunoprecipitation, waren de monsters geanalyseerd met behulp van een 10% SDS-pagina gel. HC = immunoglobulin µ zware ketting; LC = immunoglobulin lichtketting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Puls-chase methoden zijn essentieel voor de ontwikkeling van wetenschappers inzicht in waar de eiwitvouwing in onbeschadigde cellen. Terwijl wij hebben geprobeerd om te verstrekken een methode die is zo algemeen mogelijk, heeft deze aanpak het potentieel voor bijna onbegrensd variaties om verschillende processen die zich voordoen tijdens het vouwen, het vervoer, en het leven van proteïnen in de cel te bestuderen.
Bij het uitvoeren van een puls-achtervolging aanhangend cuvetten in gerechten, is het essentieel voor de behandeling van elk gerecht hetzelfde zoveel mogelijk, als een aparte schotel wordt gebruikt voor elk tijdstip en/of voorwaarde in een experiment. Vooral voor korte puls en chase tijden (< 5 min), is het essentieel om een strakke controle over de puls en chase tijden (met een digitale timer). Pulse chases met schorsing cellen kunnen helpen om deze variabiliteit als alle monsters worden genomen van een enkele buis. Zoals sommige celtypen minder goed aan cultuur gerechten dan anderen houden, moet worden gezorgd dat de cellen niet tijdens de diverse middellange wijzigingen weggewassen zijn. Dit kan worden overwonnen door hetzij met behulp van deze cellen in suspensie of door de coating van de gerechten met poly-L-lysine of gelatine, bijvoorbeeld om te houden van de cellen aan de cultuur-gerechten. Voor het meten van de reproduceerbaarheid van labeling tussen gerechten, moet een steekproef van lysate worden onderzocht door SDS-PAGE te controleren van alle monsters voor identieke totale labeling en eiwit patroon. Ook zal vloeistofscintillatietelling van lysates instellen voor de totale punten-per-minuut (cpm) opgenomen maar zal geen gegevens verstrekt over de bevolking van de eiwitten met het label.
Als een doel eiwit slecht etiketten, wordt het signaal verhoogd door de verhoging van het aantal cellen (of gerechten) in plaats van verhoging van het bedrag van label. Verlenging van de puls-tijd is een optie wanneer de kinetiek van de bestudeerde proces zullen dit toestaan. De ideale pulse tijd zal variëren met elk doel als gevolg van factoren zoals het niveau van expressie, de transcriptie tarief, het aantal methionines/cysteines en de opklapbare tarief van het eiwit. Als zodanig moet experimenten plaatsvinden om te bepalen van de beste balans tussen de bovengenoemde factoren in elk experiment met behoud van de experimentele doel in gedachten. Als tussenproducten tijdens het vouwen worden bestudeerd, bijvoorbeeld, is het wenselijk om de label voor zo kort mogelijk dat de grondstof zo dicht mogelijk bij een ongevouwen staat mogelijk, terwijl de balancing expressie niveaus pulse. Als alternatief, als het transport of de afbraak van een eiwit het doel van de studie is, pulse keer kunnen worden verlengd om de hoogste niveaus van signaal mogelijk zonder afbreuk te doen aan kinetische informatie. In het algemeen, kunnen pulse tijden variëren van 2-15 min bij het gebruik van dit protocol zonder wijziging. Vorige experimenten5 heeft aangetoond een vertragingstijd van ~ 10 s na de pols voor de opneming van radioactiviteit in het zwembad van de totale proteïne; Dit is belangrijk in gedachten te houden wanneer het afleiden van de kinetische gegevens uit pulse-chase experimenten. Voor korte pulse tijden (< 2 min), alle gerechten op het waterbad houden gedurende de gehele pulse-tijd. Als puls keer verlengd (> 1 h) zijn wordt gebruikt, is het raadzaam om de pols volume verhogen door 1,5 keer en gerechten op een rocker in een incubator 37 ° C te plaatsen tijdens de pols om te voorkomen dat de gerechten uitdrogen. Terwijl labeling oplossingen met individuele 35S-methionine/cysteïne of een mix beschikbaar zijn, is de mix voorkeur, zelfs wanneer zijn eiwitten die alleen methionine of cysteïne bevatten wordt geëtiketteerdt als beide zijn nodig om de algemene eiwitsynthese in de cel. Als experimentele omstandigheden specifieke methionine/cysteïne labeling vereisen, moeten de niveaus van nonradioactive methionine/cysteïne tijdens de pols dienovereenkomstig worden aangepast.
Chase tijden (en het aantal tijdstippen) worden bepaald op een soortgelijke manier. Een goed startpunt is om stelt u de eerste tijd van de chase (na de 0 min chase) als gelijk aan de tijd van de pols en, vervolgens, het dubbele van de tijdsduur voor elk punt van de opeenvolgende keer (bijvoorbeeld5, 10, 20 en 40 min). Dit moet echter worden geoptimaliseerd voor elke specifieke proteïne en vraag.
Om te voorkomen dat de activering van stress reacties door verhongering (die kan invloed hebben op de eiwitsynthese en vouwen), idealiter, moeten sommige labelloze methionine en cysteïne worden toegevoegd aan de honger en radiolabeling oplossingen. De hoeveelheid zal afhangen van de cellijn, de labeling tijd, de hoeveelheid van de radiolabel gebruikt en media volumes en zal moeten testen. Een goed startpunt is 1% van het bedrag van cysteïne en methionine aanwezig in het kweekmedium cel, die met toenemende pulse keer kan worden verhoogd. Periodes van verhongering, met of zonder labelloze aminozuren, moeten worden bewaard in de range van 15-30 minuten om te zorgen voor voldoende label opneming en de activering van stress reacties te voorkomen. Bij het gebruik van een uitgebreide puls (≥1 h), is honger niet vereist.
De hier beschreven lysisbuffermengsel zal worden geschikt voor de meeste doeleinden, maar in principe elke buffersysteem, zoals HEPES, Tris of MES, zal werken. De detergenten concentratie moest lyse cellen zal afhangen van het aantal cellen en wasmiddel volume. De concentratie moet altijd boven de kritische micel concentratie (CMC)- en de hoeveelheid wasmiddel voldoende lyse cellen. Een empirische vuistregel is dat 200 µL van 0,5% nondenaturing wasmiddel (Zie Tabel van materialen) volstaat lyse het equivalent van de cel van ~ 1 mg van eiwit (~ 1 x 106 cellen). De zoutconcentratie en detergenten kunnen ook variëren afhankelijk van de toepassing, maar in het algemeen, voorwaarden die breken kernen openen (hoge zout, > 0,1% SDS) dient te worden vermeden als de aanwezigheid van gratis DNA met immunoprecipitation interfereren zal. Als dit niet kan worden vermeden, bijvoorbeeld wanneer volledige cel lysates met inbegrip van kernen of Ingehuld eiwitten worden geanalyseerd moet, kan door de cellen door een kleine gauge naald vóór immunoprecipitation DNA worden schuingetrokken. Dit heeft de voorkeur boven ultrasoonapparaat teneinde te voorkomen dat buitensporige schuimvorming en de productie van radioactieve aërosolen.
Voor immunoprecipitation, moeten zowel de optimale hoeveelheid antilichamen en de beste was buffer voor elke combinatie van antilichaam-antigeen grondig worden getest om een evenwicht te vinden tussen het gewenste antigeen signaal en achtergrond. Antilichamen moet altijd aanwezig zijn in de overschrijding van de antigenen om kwantitatieve immunoprecipitation; een goed startpunt is 1 µg antilichamen per immunoprecipitation van een 35 mm schotel/1 x 106 cellen. De achtergrond kan worden verlaagd door het verhogen van het schoonmaakmiddel of zout concentraties. Met name de toevoeging van ≤0.1% SDS kan helpen aanzienlijk doen afnemen van de achtergrond, maar kan ook het verstoren van antilichaam-antigeen interactie. Om te bepalen voor de specificiteit van antistoffen tijdens immunoprecipitation, moeten identieke cellen ontbreekt het doel eiwit worden gebruikt wanneer beschikbaar. Als dit niet eenvoudig is, zoals wanneer endogene eiwitten worden geanalyseerd, zal de overexpressie of uitputting van het antigeen werken. Voor de bediening voor de achtergrond (en specificiteit), beide preimmune sera (indien mogelijk) of isotype besturingselementen moeten worden gebruikt. Om te controleren voor antigenen binden rechtstreeks aan immunoprecipitation kralen, moeten kralen zonder antilichaam ook worden gebruikt. De hier bedoelde voorwaarden moeten worden beschouwd als een uitgangspunt als elk paar van antilichaam-antigeen een optimalisering van zowel was buffer en wassen voorwaarden vergt. In het geval van teveel achtergrond, geen verhoging van het aantal wasbeurten maar eerder de tijd van wassen en/of de samenstelling van de was-buffer. Als bijzonder gevoelige interacties zoals in coimmunoprecipitations worden behandeld moeten, kan het wenselijk zijn voor het uitvoeren van alle stappen van het wassen bij 4 ° C, met behulp van ijskoude buffers.
Een voordeel van Adherente cellen over schorsing cellen is dat drug behandelingen kunnen worden uitgevoerd op vrijwel elk punt tijdens de achtervolging van de pols. Als gebruikt in combinatie met chaperone remmers, bijvoorbeeld, is het mogelijk om te onderscheiden van de gevolgen ervan voor de co - versus posttranslationele fasen van een opvouwbare proces. Dit kan worden uitgebreid door aanpassing van de lysis en immunoprecipitation wassen buffers (hierboven besproken) om de coimmunoprecipitation van eiwit-chaperone complexen tijdens opvouwbare10,11,12.
De postlysis behandeling van de monsters zal het verruimen van het toepassingsgebied van de vragen die kunnen worden aangepakt. De beperkte protease vertering van doel eiwitten voordat immunoprecipitation aanvullende conformationele informatie verstrekken en met succes gebruikt is om te controleren de vouwing van eiwitten, vooral die ontbreekt disulfide bindingen13, 14. Aggregatie van eiwitten en complexvorming kunnen worden gecontroleerd door middel van sacharose dichtheid-verloop centrifugeren vóór immunoprecipitation15,16.
U kunt optimaal profiteren van pulse achtervolgingen, is de beschikbaarheid van kwalitatief hoogwaardige reagentia vereist voor immunoprecipitations. Bij het onderzoek van opvouwbare tussenproducten, is het absoluut noodzakelijk dat er antilichamen die kunnen trekken van alle vormen van het eiwit onder analyse. Als specifieke antilichamen aan het doel-eiwit niet beschikbaar zijn, kan dit worden vervangen met behulp van affiniteit tags. Echter beperkt hierdoor ernstig het nut van postlysis methoden, zoals de beperkte proteolyse, direct sonde de conformatie van eiwitten, zoals alleen gecodeerde fragmenten kunnen worden hersteld.
De gevoeligheid van pulse achtervolgingen wordt beperkt door het aantal methionine en cysteïne residuen in het eiwit in kwestie. Eiwitten met lage aantallen van methionine/cysteïne residuen in combinatie met een lage expressie niveau zijn niet detecteerbaar in pulse-chase experimenten. Bij het uitvoeren van postlysis wijzigingen zoals beperkte proteolyse, zullen slechts methionine/cysteïne-houdende fragmenten aantoonbaar zijn.
Tot slot, gegeven de kinetische detail dat pulse achtervolgingen bieden, ze zijn een aanvulling op de vele andere technieken en hulpmiddelen gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire celbiologie op de steady-state-niveau. Zo blijven ze een onmisbare component in de moleculair bioloog werkset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken alle leden van de Braakman lab, verleden en presenteren, voor hun vruchtbare discussies en helpen bij de ontwikkeling van de methoden in dit artikel wordt gepresenteerd. Dit project heeft financiering ontvangen van zowel de Europese Onderzoeksraad onder de Europese Unie zevendekaderprogramma (KP7/2007-2013) N ° 235649 en de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) onder het ECHO-programma N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
