Summary

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Published: February 12, 2019
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Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine allgemeine Puls-Jagd-Methode, die die kinetische Analyse der Faltung, Transport und Abbau von Proteinen in lebenden Zellen einzuhaltenden erlaubt.

Abstract

Kennzeichnung von radioaktiven Puls-Jagd ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Konformationsänderungen Reifung, den Transport zu ihrer zellulären Platzes und der Verschlechterung der Zielproteine in lebenden Zellen. Mit kurzen (Puls) enzymatische Zeiten (< 30 min) und streng kontrolliert Chase Zeiten, es ist möglich, beschriften Sie nur einen Bruchteil des gesamten Protein Pools und folgen seinen Falten. In Kombination mit nonreducing/Reduzierung der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Immunopräzipitation mit (Konformation) Antikörper kann Falten Prozesse im Detail untersucht werden. Dieses System wurde verwendet, um die Faltung von Proteinen mit eine große Variation in Eigenschaften wie lösliche Proteine, Einzel- und Multi-Pass transmembranen Proteine, stark N und O-glycosylierten Proteine und Proteine mit und ohne umfangreiche Disulfid analysieren die Verklebung. Puls-Jagd-Methoden sind die Basis für kinetische Untersuchungen in eine Reihe von zusätzlichen Funktionen, einschließlich Co- und posttranslationale Modifikationen, Oligomerisierung und Polymerisation, im wesentlichen erlaubt die Analyse eines Proteins von der Geburt bis zum Tod. Puls-Chase-Studien zur Proteinfaltung ergänzen sich mit anderen biochemischen und biophysikalischen Methoden für ein Studium Proteine in Vitro durch höhere zeitliche Auflösung und physiologische Informationen. Die Methoden, wie in diesem Dokument beschrieben sind leicht angepasst, zur Untersuchung der Faltung von fast jedem Protein, das in Säugetieren oder Insekt-Zelle Systeme ausgedrückt werden kann.

Introduction

Die Faltung auch relativ einfache Proteine umfasst viele verschiedene klappbaren Enzyme, molekulare Chaperone und kovalente Modifikationen1. Eine vollständige Wiederherstellung der diese Prozesse in Vitro ist praktisch unmöglich, angesichts die Vielzahl von verschiedenen Komponenten beteiligt. Es ist daher höchst wünschenswert, Proteinfaltung in Vivo, in lebenden Zellen zu studieren. Radioaktiven Puls-Jagd Techniken beweisen ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Synthese, Falten, Transport und Abbau von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung.

Die metabolische Kennzeichnung von Proteinen während eines kurzen Impuls mit 35S-Label Methionin/Cystein, gefolgt von einer Verfolgungsjagd in Ermangelung eines radioaktiven Labels, können spezielle Tracking einer Bevölkerung der neu synthetisierten Proteine im weiteren zellulären Milieu. Dann können Zielproteine isoliert über Immunopräzipitation und analysiert per SDS-PAGE oder andere Techniken. Für viele Proteine zeichnet sich ihre Reise durch die Zelle durch Änderungen, die auf SDS-PAGE Gel sichtbar sind. Beispielsweise wird der Transport des glykosylierten Proteinen aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) an der Golgi-Komplex oft durch Modifikationen von Glykoproteinen N verbunden oder die Zugabe von O-linked Glykane2,3begleitet. Diese Änderungen verursachen hohe Zuwächse in die scheinbare molekulare Masse, die durch Mobilität Veränderungen im SDS-PAGE zu sehen ist. Reifung kann auch gekennzeichnet werden, durch proteolytische Spaltungen, wie Signal-Peptid Spaltung oder die Entfernung von Pro-Peptide, was zu Veränderungen in der scheinbaren molekulare Masse, die SDS-PAGE Gel4leicht verfolgt werden können. Radioaktivität hat erhebliche Vorteile gegenüber vergleichbaren Techniken wie Cycloheximide jagt, wo wird Roman Proteinsynthese vorgebeugt, da längere Behandlungen giftig für Zellen sind und schließen nicht die Mehrheit der älteren, stationäre Proteine aus, die Analyse, wie einige Proteine haben Halbwertszeiten von Tagen. Der Vergleich der Proteine unter beide nonreducing und reduzierenden Bedingungen erlaubt die Analyse von Disulfid Bindung Bildung, ein wichtiger Schritt bei der Faltung von vielen Sekretorische Proteine4,5,6, 7.

Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode für die Analyse der Proteinfaltung und Transport in intakten Zellen mit einem radioaktiven Puls-Chase-Ansatz. Während wir haben die Methode als bereitstellen soll detailliert wie möglich, das Protokoll hat ein fast grenzenloses Potential für Anpassungsfähigkeit und ermöglicht die Optimierung des Lesers bestimmte Proteine zu studieren.

Zwei alternative Puls-Jagd-Protokolle, eine für adhärente Zellen (Schritt 1.1 des Protokolls, die hier vorgestellten) und eine für Aussetzung Zellen (Schritt 1.2 des hier vorgestellten Protokolls) stehen zur Verfügung. Die Bedingungen zur Verfügung gestellt, hier sind ausreichend, um ein Protein mit Medium-High Ausdruck Niveaus ausgedrückt zu visualisieren. Wenn der Leser mit schlecht ausgedrückten Proteine oder verschiedenen Behandlungsgruppen Bedingungen, z. B. mehrere Immunperoxidase funktioniert ist es notwendig zu Gericht vergrößern oder Handy-Nummer entsprechend.

Für Aufhängung Puls Chase sind Chase Proben, die zu jedem Zeitpunkt alle aus einem einzigen Rohr Zellen getroffen. Die Wäsche Schritte nach dem Puls der Zeit entfallen; Stattdessen wird weiter Aufnahme von 35S durch Verdünnung mit einem hohen Überschuss der unbeschrifteten Methionin und Cystein verhindert.

Die vorgestellten Protokolle verwenden radioaktiven 35S-Label Cystein und Methionin-Proteinfaltung Zellprozesse folgen. Alle Operationen mit radioaktiven Reagenzien sollten durchgeführt werden, über geeignete Schutzmaßnahmen zur Minimierung des Bedieners und der Umwelt gegenüber radioaktiver Strahlung ausgesetzt und in einem bestimmten Labor durchgeführt werden. Als der Puls-Chase Kennzeichnung Technik ist relativ ineffizient bei kurzen Impulszeiten (< 15 min), weniger als 1 % des Grundbetrags von Radioaktivität in die neu synthetisierte Proteine aufgenommen wird. Nach der Anreicherung von Ziel-Protein über Immunopräzipitation enthält die Probe für SDS-PAGE weniger als 0,05 % des Grundbetrags der Radioaktivität.

Obwohl die 35S Methionin und Cystein Kennzeichnung Mischung wird stabilisiert, wird einige Zersetzung, nachgiebig flüchtige radioaktive Verbindungen auftreten. Um der Forscher und das Gerät zu schützen, sollten einige Vorkehrungen getroffen werden. Der Forscher sollte immer die lokalen Strahlung Sicherheitsregeln einhalten und kann eine Kohle Pflege Maske, neben einem Laborkittel und (Doppel-) Handschuhe tragen. Lager Fläschchen mit 35S Methionin und Cystein sollte immer unter einem Abzug oder unter einem lokalen Aspiration Punkt geöffnet werden. Bekannte Labor Kontamination Spots sind Zentrifugen, Pipetten, Wasserbäder, Inkubatoren und Schüttele-Apparat. Die Kontamination von diesen Bereichen wird reduziert, indem Pipettenspitzen mit einem Aktivkohlefilter, Positive Dichtung Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle der Materialien), Aquarium Holzkohle Schwämme in Wasser Bäder, Holzkohle Filterpapiere geklebt in der Puls-Chase-Gerichte, Holzkohle Wache in die Aspiration und die Platzierung der Speisen mit Holzkohle Körner in Inkubatoren und Lagerbehälter.

Protocol

Alle radioaktiven Reagenzien und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit örtlichen Universität Utrecht Strahlung Regeln und Vorschriften gehandhabt. 1. Puls Chase Puls-Chase für adhärente ZellenHinweis: Die hier angegebenen Volumen basiert auf 60 mm Zelle Kultur Gerichte. Für 35 mm oder 100 mm Schalen die Bände mit 1/2 oder 2, jeweils multipliziert. Dieses Protokoll verwendet eine Taktzeit von 0, 15, 30, 60, 120 und 240 min. 10 min und Chase Zeiten. Diese…

Representative Results

Die Faltung und Sekretion von HIV-1 gp120 aus einem anhaftenden Puls Chase ist in Abbildung 2dargestellt. Das nonreducing Gel (Zellen NR in der Abbildung) zeigt die oxidative Faltung des gp120. Sofort nach dem Puls Kennzeichnung von 5 min (0 min. Chase) gp120 erscheint als eine diffuse Band höher in das Gel, und Fortschreiten der Jagd, die Band wandert nach unten das Gel durch noch mehr verbreitet Faltung Zwischenprodukte (IT), bis es reichert sich in den en…

Discussion

Puls-Jagd-Methoden wurden wesentlich für die Entwicklung von wissenschaftlichen Verständnis der Proteinfaltung in intakten Zellen. Während wir versucht haben, ein Verfahren zu schaffen, die so allgemein wie möglich ist, hat dieser Ansatz das Potenzial für nahezu grenzenlose Variationen, verschiedene Prozesse zu studieren, die während der Faltung, den Transport und das Leben der Proteine in der Zelle auftreten.

Bei der Durchführung einer Puls-Verfolgungsjagd mit adhärenten Zellen in Ger…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken allen Mitgliedern des Labors Braakman, vorbei an und präsentieren, für ihre fruchtbaren Diskussionen und helfen bei der Entwicklung der Methoden in diesem Artikel vorgestellt. Dieses Projekt wird finanziell von der Europäischen Forschungsrat unter der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) N ° 235649 und der Niederlande Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unter der ECHO-Programm N ° 711.012.008.

Materials

1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes Sarstedt 72.706.400
Acetic Acid Sigma A6283 glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20×25 cm GE Life Sciences 28956475
Bromophenol Blue Sigma B8026 Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films Kodak Z350370-50EA
Cell-culture media Various N/A Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine Various N/A Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper Whatman 1872047
Charcoal filtered pipette tips Molecular bioproducts 5069B
Charcoal vacu-guard Whatman 67221001
Coomassie Brilliant Blue R250 Sigma 112,553 for electrophoresis
Cysteine Sigma C7352 Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 
Dithiothreitol (DTT) Sigma 10197777001 Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix Perkin Elmer NEG772014MC Other size batches of label are available depending on useage
EDTA Sigma E1644 Molecular biology grade
Gel-drying equipment Various N/A
Glycerol Sigma G5516 Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper GE Life Sciences 3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 24020117
HEPES Sigma H4034 Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C
Kimwipes delicate task wipes VWR 21905-026
MES Sigma  M3671 Molecular biology grade
Methanol Sigma MX0490 
Methionine Sigma M5308 Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment Various N/A
NaCl Sigma S7653 Molecular biology grade
N-ethylmaleimide Sigma E3876 Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS Sigma P5368 Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads GE health-care 17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 Molecular biology grade
Triton X-100 Sigma T8787 Molecular biology grade
Trizma base (Tris) Sigma T6066 Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager Amersham 29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath Nalgene 5970-0320PK

References

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McCaul, N., Yeoh, H. Y., van Zadelhoff, G., Lodder, N., Kleizen, B., Braakman, I. Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase. J. Vis. Exp. (144), e58952, doi:10.3791/58952 (2019).

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