Summary
在这里, 我们提出了一种新的缝隙结细胞间通信检测的协议, 旨在为药物发现和毒理学评估的间隙结调节化学品的高通量筛选。
Abstract
间隙连接点 (gj) 是允许小于 1 kda 的分子在相邻细胞之间扩散的细胞膜通道。由于它们具有生理和病理作用, 因此需要进行高通量筛选 (hts) 检测, 以识别药物发现和毒理学检测中的 gj 调节剂。一种新的碘化荧光蛋白间隙连接细胞间通信 (i-yfp-gjic) 检测满足了这一需求。它是一种基于细胞的检测方法, 包括受体和供体细胞, 旨在稳定地表达黄色荧光蛋白 (yfp) 变体, 其荧光分别由碘化物或碘化物转运体 slc26a4 敏感地淬火。当碘化物被添加到两种细胞类型的混合培养中时, 它们通过 slc26a4 转运体进入供体细胞, 并通过 gj 扩散到相邻的受体细胞中, 在那里它们会淬火 yfp 荧光。yfp 荧光在动力学模式下得到了很好的测量。yfp 淬火率反映了 gj 活性。该检测可靠、快速, 可用于高温超导。介绍了利用 ln215 细胞 (人胶质瘤细胞) 进行 i-yfp-gjic 检测的方法。
Introduction
缝隙连接点 (gj) 作为细胞间通道, 允许 lt;1 kda 的小分子在相邻细胞之间扩散, 如营养物质、代谢物和信号分子。结合元素包括每个细胞中的血道或连接, 每个连接体构成六个连接 (cxs)1。gj 和 cx 已被用于毒理学检测致癌物质, 如多环芳烃 (pah), 这是 gj 抑制剂2,3,4。被破坏的 gjic 与非遗传毒性致癌 5,6有关。作为一个潜在的治疗目标, gj 的参与已报告特别是亚型的癫痫发作7, 8,保护心脏和大脑缺血再灌注损伤9, 偏头痛与光环 10,药物引起的肝损伤6,11, 和伤口愈合12。需要进行高通量筛选 (hts) 检测, 以识别用于药物发现、毒理学检测的 gj 调节化学品或抗体, 并识别 gj 活性的新型细胞调节剂。高温超导检测也可用于研究 gj 调制器 2、13、14、15的构效与活动关系。
一些 gjic 检测包括染料转移或双膜片钳技术。在染料转移试验中, 采用了路西法黄色 ch (ly) 和钙酸乙酰氧甲酯 (钙素-am)。细胞不能渗透到 ly, 它是由微注射, 刮加载, 或电穿孔引入。一旦进入细胞, ly 通过gj 扩散到邻近的细胞, gj 活动被 ly 迁移16的程度所攻击.钙素 am 检测通常涉及光漂白17,18后的跃点荧光恢复。钙素-am 是一种细胞渗透染料, 通过固有的酯酶在体内转化为不透水的钙蛋白。该检测需要一个共聚焦显微镜来观察激光光漂白后周围的细胞中钙蛋白-am 的转移。如果存在功能 gj, 相邻细胞中的钙蛋白 am 进入光细胞, 荧光被恢复。gj 活性是通过光细胞荧光恢复的程度来检测的。染料转移检测既费力又耗时, 或灵敏度低。双贴片夹紧是一种测量结合部电导的电生理方法。它是相对地敏感的, 以电导的直接依赖性在开放 gj的数量 19;然而, 它是技术要求高, 耗时, 和昂贵的20。i-yfp-gjic 检测方法是为高温超导系统中的应用而开发的。
图 1说明了 i-yfp gjic 分析的组成和步骤, 该分析利用表达具有 h148q 和 iodide-sensitive (yfpql)的碘化物敏感 yfp 变体的受体以及表达碘化物转运体 (slc26a4) 21 的供体细胞.yfpql 携带的两种突变允许碘化物22对荧光进行淬火。在共培养的受体和供体细胞中添加碘化物;它们不进入受体细胞, 而是被存在于供体细胞上的 slc26a4 转运体吸收。供体细胞中的碘化物通过功能 gj 扩散到相邻的受体细胞中, 在那里它们会淬火yfp ql 荧光。如果 gj 被抑制剂关闭或阻断, 碘化物不能进入受体细胞来抑制荧光。yfpql淬火率反映了 gj 活性。i-yfp gjic 检测程序既不复杂, 也不耗时。它与高温超导系统兼容, 可用于在相对较短的时间内测试大量化合物对 gj 活性的影响。它只需要受体和供体细胞, 以及两个平衡的盐溶液。下面描述的协议基于 ln215 细胞, 其主要 cx 为 cx4321。ln215-yfpql受体和 ln215-i-供体细胞是通过表达 yfpql 或slc26a421、23的慢病毒传导而产生的。
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Protocol
1. 表达 yfpql 和slc26a4 的慢病毒的产生
- 将 hek293t 人类胚胎肾细胞在100毫米培养板上融合到80%。dulbecco 的改性鹰培养基 (dmem) 以10% 的胎牛血清、100 u/ml 青霉素和100μgml 链霉素为补充, 是整个协议中用于维持 hek293t 和下文所述其他细胞的培养基。
- 在每口井加入2毫升0.005% 的无菌聚 l-赖氨酸 (pll) 溶液, 将其涂布6毫升, 用2毫升的无菌水吸动 pll 溶液, 用2毫升的无菌水冲洗表面两次。
- 用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗 hek293t 细胞, 在37°c 下用2毫升0.25% 的色氨酸-edta 溶液处理每个100毫米盘中的细胞单层, 在3°c 下, 加入5毫升培养基, 重新悬浮细胞。
- 计数血细胞仪中的细胞, 并调整细胞悬浮液的密度为 250, 000 细胞在培养基中, 并在培养基中的2毫升添加 500, 000个细胞, 以每个6孔井的溶膜井。在37°c 下将 5% co/95% 空气气氛中的细胞中培养 24小时, 然后在没有青霉素或链霉素的情况下, 用 dmem 取代培养基。
- 在 1.5 ml 管中, 用500μl 的 dmem 稀释20μl 转染试剂, 不含血清或抗生素。通过移液轻轻混合, 让站在室温下5分钟。
- 同时, 将25μl 的 dmem 放入两个 1.5 ml 管中的每一个, 然后向每个管添加 1500 ng 的 plvx-ef-yfpql或 pletrip-slc26a4、1225 ng pspax2 和 375 ng pmd2. g。这两个慢病毒质粒已经被描述过21。在每个质粒管中加入250μl 稀释转染试剂, 轻轻搅拌, 在室温下孵育20分钟。
- 20分钟后, 在 1.5 ml 管中加入500μl 转染试剂和质粒配合物, 在步骤1.4 中滴入每个培养板, 并通过来回摇晃板进行混合。在37°c 时将细胞孵育在 co2孵化器中12小时。
- 将培养基更换为2.5 毫升的新鲜培养基, 并孵育48小时。然后将培养板放在冰上 5分钟, 使含有慢病毒的条件培养基冷却, 以保持传染性。
- 收集含有慢病毒的介质, 并转移到15毫升锥形管。在4°c 下以 3, 000 x x g的速度离心 3分钟, 然后通过0.4μm 的过滤从上清液中取出漂浮的 hek293t 细胞。
- 将含有慢病毒的培养基存放在4°c 内, 以便在2天内使用。供以后使用, 请将 200μl aliquots 存放在-80°c。
2. 慢病毒转导生成 ln215-yfpql和 ln215-i-细胞
- 如上所述, 在100毫米培养板中生长 ln215 细胞, 使 dmem 中的融合率达到 80%, 并辅以10% 的胎牛血清 (fbs) 100 uml 青霉素和100μgml 链霉素。
注: 如果 i-yfp-gjic 检测是使用不同的细胞系进行的, 请使用适当的培养基。ln215-yfpql和 ln215-i-细胞可由延世大学大学工业基金会提供。请联系相应的作者。 - 转导前一天, 用10毫升的 pbs 清洗细胞两次, 在37°c 下用0.25% 的胰蛋白酶-edta 治疗 3分钟, 用10毫升血清学移液器在培养基中的5毫升中取出细胞, 并将密度调整为 50, 000 细胞。在24μl 培养基的每口井中添加 20, 000个细胞, 以便在没有病毒控制的情况下进行治疗, yfpql 和slc26a4 细胞。
- 在37°c 孵育24小时后, 用 plvx-eip-yfp ql 或 pletrip-slc26a4 lentivirus 的1:1 混合物的 400μl 取代培养基, 并在最后浓度为4μg/ml 时补充新鲜培养基, 以培养培养基为基础。对于没有病毒控制, 请替换为培养基。
- 在37°c 孵育细胞 15小时, 吸入含有慢病毒的培养基, 加入新鲜培养基, 并孵育细胞72小时。
注意: 为防止井间的慢病毒污染, 当您吸入含有慢病毒的培养基或分配新鲜生长培养基时, 请为每口井使用新的提示或吸头。 - 用 0.5 ml 的 pbs 清洗每口井中的细胞两次, 用300μl 的胰蛋白酶 edta 治疗 3分钟. 用 2μgl puromycin 将细胞重新移植到 2 ml 培养基中的细胞和六井培养板中的板。
- 在含有 2μgml puromycin 的培养基中培养细胞, 直到对照井中的所有细胞死亡 (在显微镜下观察时的圆形或漂浮), 通常需要一周时间。在选择期间, 每隔一天刷新一次含有 puromycin 的培养基。如果 ln215-yfpql或 ln215-i-培养物在选择完成之前就会融合, 则将细胞转移到100毫米板, 并继续选择, 如步骤2.5 所示。
3. 检测所需的解决方案的制备
- 准备500毫升的 c 型溶液 (10 mm hepes, 140 mL 氯化碳, 10 mm 葡萄糖、5 mm kcl、1 mm mmcl2和 1 mm ccl2) 和 500 mL i-解答 (10 mm hepes、140 mL nai、10 mm 葡萄糖、5 mm kcl 和 1 mm cl2)。
- 用 1 n naoh 将两种溶液的 ph 值调整到 7.4, 通过0.4μm 的滤液对溶液进行灭菌以进行储存。在4°c 下存放, 最长1个月。使用前请检查 ph 值。
4. 电镀 ln215-yfpql和 ln215-i-细胞
- 在培养基中分别培养100毫米板的 ln215-yfp ql 和 ln215-i-细胞, 以达到检测所需的人群。ln215-yfpql和 ln215-i- -细胞分别在40% 和80% 的融合100毫米板中, 足以进行96孔板的测定。
- 在进行 i-yfp gjic 检测前的一天, 用10毫升的 pbs 清洗每个100毫米的培养板。用0.25% 的胰蛋白酶-edta 溶液对每个板进行治疗, 在37°c 孵育 5分钟, 将每个板的细胞在4毫升培养基中重新移植, 转移到15毫升锥形管。
- 以 1, 000 x克离心细胞, 3分钟离心, 丢弃上清液, 用5毫升培养基重新悬浮每个细胞颗粒。用10毫升血清学移液器上下移液约 20次, 将任何细胞团块分解成单个细胞。
- 计数血细胞仪中的细胞, 稀释培养基中的细胞, 使细胞悬浮液的 ln215-yfpql 在80, 000 细胞和 ln215-i-在 160, 000 细胞。
- 将 ln215-yfpql 的 7毫升和 ln215-i-细胞悬浮液的7毫升混合在储层中。使用多通道移液器将混合物的100μl 添加到96孔细胞培养板的每口井中。
注: 要在96孔板的每口井中加入100μl 的混合物, 需要约10毫升的混合电池悬浮液。建议使更多的细胞悬浮液超过需要。 - 在37°c 下将细胞加湿 5% co/95% 空气中培养 24小时.在进行检测时, ln215-yfpql和 ln215-i-细胞培养应100% 融合。
5. 进行 i-yfp gjic 检测
注: 使用具有20x 放大倍率的荧光显微镜和 gfp 滤光片检查96孔板, 以确保没有 ln215-yfpql 或ln215-slc26a4 细胞团块, 并且细胞培养物在之前完全融合和分布良好进行检测。
- 在进行检测前至少 30分钟, 打开微板并设置为37°c。
- 用3毫升的70% 乙醇、3毫升的蒸馏水, 然后用300μll 的流量清洗自动喷射器的油管。
- 将 c 和 i 溶液加热至37°c。
注: 由于96孔板的每口井都需要每个溶液 100μl, 因此每个检测需要大约10毫升的每个溶液。每个板材的引脚还需要10毫升的 i 型溶液 (共20毫升), 清洗每个板材 (共35毫升) 则需要额外的25毫升 c 溶液。 - 吸出生长介质或反转板材将其排空;分接剩余介质。
注: 生长介质中残留的胎儿牛血清会导致背景荧光和检测质量下降。 - 使用多通道移液器, 在水库的每口井中添加200μl 的 c 溶液。将 c 型溶液吸气或反转板, 使其清空并挖出剩余溶液。
- 以 50μμl c 溶液为载体, 在每口井加入 50μμ-l c-溶液, 为 2.5 mm 化学库存 (见表 1) 或二甲基亚硫酸盐 (dmso) 作为载体, 然后用多通道移液器将 50μlμl c 溶液添加到每口井。
注: 化学库中的大多数试剂都溶解在 dmso 中, 在大多数细胞检测24中最多允许使用 1% (v/v)。由于 dmso 的密度高于水, 在添加到培养板井中时, 溶解在 dmso 中的试剂往往会下降到底部, 从而干扰检测溶液的浓度。这可以通过添加50μl 的 c 溶液、dmso 中的试剂和 50μl c 的溶液来规避。最后50μl 的 c 溶液用于混合。 - 在空气中37°c 时培养细胞, 而不是 5% co2。孵化时间可以修改, 但 1 0分钟通常足以让离子通道调制器发挥作用。
- 在孵育过程中, 将微板读取器程序设置为在1秒处向每口井注入 100μl i-溶液, 并以0.4秒的间隔测量10秒的荧光。将读取器设置为从底部读取荧光。推荐的注射速度为 135μl. 将激发波长设置为 485 nm, 读取发射功率为 520 nm。
注: 微板读取器程序的详细设置如下所示。- 单击 "管理协议" 按钮。
- 单击"新建按钮"。在测量方法部分中选择"荧光强度" , 在阅读模式部分中选择 "井模"。接下来, 单击 "确定"按钮。将出现新选项卡。
- 在 "基本参数" 菜单中, 将激发波长设置为 485 nm, 将发射功率设置为 520 nm。选择底部光学从底部读取荧光。将测量开始时间设置为 "0 s", 将间隔数设置为 "25", 将每口井的闪烁次数和间隔数设置为 "20", 间隔时间设置为 "0.4个"。
- 在 "布局"菜单中, 绘制要读取的板的区域。
- 在集中/volumesesn 着色菜单中, 设置微板读取器, 以135μls 注入速度向每口井注入 100μl i-溶液。
注: 避免更快的注射速度, 因为它们会导致细胞脱离。 - 在"注入时间" 菜单中, 将注射开始时间设置为1秒。然后, 单击 "开始测量"按钮。
- 孵育后, 将96孔板放置在微板读取器中, 然后再次单击 "开始测量" 按钮开始测量。
6. gjic 活动的计算
- 计算 yfpql淬火和 gjic 活性的百分比为23
yfpql淬火 (%) =
gjic 活动 (%) =
注: 原则上, gjic 活性应根据受体细胞和供体细胞以及相应的受体细胞仅井中 yfp 荧光百分比的差异计算。然而, 由于 ln215-yfpql 细胞在10秒后被碘化物进行的 yfp 淬火可以忽略不计, 因此, 在使用 ln215-yfpql 和ln215-i细胞进行高温超导时, 我们没有考虑到背景 yfp 淬火。
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Representative Results
采用29层96孔培养板筛选 2, 320 种化学物质, 利用 ln215-yfp ql 和 ln215-i- --细胞, 通过 i-yfpgjic 测定来识别新型 gjic 调制器。用一个代表性的板获得的结果如图 2所示。每个油井中 yfp 荧光的百分比在图 2a 中显示为线形图, 每个井中 gjic 活动的百分比显示在图 2b 中的条形图中。消极和积极的控制措施以及筛选的80种化学品见表 1。每口井均采用25μm 的化合物处理 10分钟, 特比纳芬完全抑制 gjic, 并对大约50% 的 gjic 进行全圣抑制。特比纳芬被证实为 gj 抑制剂。它的剂量反应、可逆性和其他实验结果已在其他地方公布,23。
图 1: i-yfp gjic 检测的组成和步骤(a) 黄色和深黄色五边形表示淬火前后表达 yfpql 的受体细胞。黑色五边形是表示 slc26a4 的供体细胞。蓝条是 gj, 红色酒吧是 slc26a4 运输商。粉红色的圆圈是碘化物。当 gj 打开时 (上板), 碘化物通过 slc26a4 并进入供体细胞。碘化物通过gj 迁移到相邻的受体细胞. 碘化物会抑制受体细胞的 yfp 荧光。如果 gj 是闭合的 (下板), 进入供体细胞的碘化物不能移动到相邻的受体细胞, 并且只保留在供体细胞中。在进行 i-yfp-gjic 检测时, 添加碘化物 (b) 相对比度和荧光图像后, 受体的 yfp 荧光并没有显著降低。当受体和供体细胞以1:1 的比例镀膜时, 碘化物加入后1分钟观察到 yfpql淬火 (上板)。当只镀过受体细胞时, 碘化物治疗1分钟不会导致显著的 yfpql淬火21。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 使用 i-yfp-gjic 分析的代表性高温超导结果如议定书第4节所述, 将第1: 2 型 ln215-yfpql和 ln215-i-细胞混合物的悬浮液镀好, 孵育24小时。然后按照议定书第5节的规定, 用车辆或化学品清洗和处理细胞。所有化学品均为 dmso 2.5 mm 库存溶液中的25μm 样品, 时间为10分钟。每个井都含有 1μl dmso 和100μl 的 c 溶液。板的第一行和最后一排被分配给负 (车辆) 和正 (卡本索龙) 控制。其余80口水井用于筛选表 1所列化学品。经治疗后, 在协议第5节进行了良好的 i-yfp-gjic 检测。每次每口井的 yfp 荧光百分比被归一化为2秒的值, 并根据时间绘制。图中的线条代表了每口井 yfp 荧光的变化。在10秒时, 大多数井的 yfp 荧光从70% 到80% 不等。特比那芬和同酸酯是 gj 抑制剂的潜在命中 (b) 条形图显示了96口井中每口井的 gjic 活性百分比。gjic 活动的百分比如协议步骤6.1 所示, 并根据井数在条形图中绘制。请点击这里查看此图的较大版本.
| 好吧, 不。 | 位置 | 化学 | 好吧, 不。 | 位置 | 化学 |
| 1 | a01 | Dmso | 49 | e01 | Dmso |
| 2 | a02 | 盐酸地氟沙星 | 50 | e02 | 异 丙 酚 |
| 3个 | a03 | 丙戊二酸乙米松 | 51 | e03 | 磷酸奥兰霉素 |
| 4个 | a04 | 红霉素 | 52 | e04 | 盐酸米安塞林 |
| 5 | a05 | 盐酸环己定 | 53 | e05 | 缬 沙坦 |
| 6 | a06 | 廖托利宁 | 54 | e06 | 萨尔萨酸盐 |
| 7。 | a07 | 茶碱 | 55 | e07 | 氢化可的松 |
| 8 | a08 | 托尔纳夫特 | 56 | e08 | 里法希辛 |
| 9 | a09 | 盐酸三甲氨基甲酰胺 | 57 | e09 | 盐酸肾上腺素 |
| 10 | a10 | 头孢曼多莱·纳法特 | 58 | e10 | 伊米基莫德 |
| 11 | a11 | 富马酸二甲酯 | 59 | e11 | 非氧基醇-9 |
| 12 | a12 | cbx | 60 | e12 | cbx |
| 13 | b01 | Dmso | 61 | f01 | Dmso |
| 14 | b02 | 拉西坦 | 62 | f02 | 拉诺拉嗪 |
| 15 | b03 | 葡萄糖内酯 | 63 | f03 | 丹斯龙 |
| 16 | b04 | 阿唑西林钠 | 64 | f04 | 阿切达普松 |
| 17 | b05 | 氯化胆碱 | 65 | f05 | 盐酸奥莫西汀 |
| 18 | b06 | 阿托伐他汀钙 | 66 | f06 | 醋酸脱氧皮质激素 |
| 19 | b07 | 盐酸氧合凝氨酸 | 67 | f07 | 盐酸曲马多 |
| 20 | b08 | 盐酸丙帕酮 | 68 | f08 | 特比纳芬盐酸盐 |
| 21 | b09 | 氟 康 唑 | 69 | f09 | 托 吡 酯 |
| 22 | b10 | 洛 伐 他 汀 | 70 | f10 | 甲磺酸甲氧氟沙星 |
| 23 | b11 | 博莱霉素 (博莱霉素 b2 显示) | 71 | f11 | 普伐他汀钠 |
| 24 | b12 | cbx | 72 | f12 | cbx |
| 25 | c01 | Dmso | 73 | g01 | Dmso |
| 26 | c02 | 阿塞苏利森钾 | 74 | g02 | 盐酸勒克特罗 |
| 27 | c03 | 泰尼古德 | 75 | g03 | 盐酸二甲双胍 |
| 28 | c04 | 单宁酸 | 76 | g04 | 普雷加巴林 |
| 29 | c05 | 卡洛芬 | 77 | g05 | 盐酸托托替康 |
| 30 | c06 | 硫酸羟基氯奎因 | 78 | g06 | 盐酸苯氧苯胺 |
| 31 | c07 | 己 酮 可可 碱 | 79 | g07 | 氢溴酸亚雷辛 |
| 32 | c08 | 盐酸梅比卡因 | 80 | g08 | 梅帕特里金 |
| 33 | c09 | 硝胺 | 81 | g09 | 潘托拉唑 |
| 34 | c10 | 盐酸氨基氯乙酰丙酸 | 82 | g10 | 盐酸洛培胺 |
| 35 | c11 | 阿尼拉塞坦 | 83 | g11 | 波多菲洛克斯 |
| 36 | c12 | cbx | 84 | g12 | cbx |
| 37。 | d01 | Dmso | 85 | h01 | Dmso |
| 38 | d02 | 美塔西酮 | 86 | h02 | 莱沃多帕 |
| 39 | d03 | 盐酸氯奈德 | 87 | h03 | 埃斯特特龙 |
| 40 | d04 | 克拉 霉 素 | 88 | h04 | 恩诺沙星 |
| 41 | d05 | 硫酸莫达林 | 89 | h05 | 硫酸司泰因 |
| 42 | d06 | 普罗蒂雷林 | 90 | h06 | 丙酸睾酮 |
| 43 | d07 | 可可碱 | 91 | h07 | 吡啶斯蒂格明溴 |
| 44 | d08 | 马来酸罗格列酮 | 92 | h08 | 硫酸依尼康唑 |
| 45 | d09 | 氯 沙坦 | 93 | h09 | 倍他米松磷酸钠 |
| 46 | d10 | 霍阿拉拉特 | 94 | h10 | 阿扎塞林 |
| 47 | d11 | 水杨酸 | 95 | h11 | 阿克里索钦 |
| 48 | d12 | cbx | 96 | h12 | cbx |
表1。本研究中筛选的化学品清单。
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Discussion
i-yfp-gjic 检测方法可用于高温超导系统, 因为它坚固、快速且价格低廉。如果 z '-因子高于 0.525,则 hts 检测被认为是鲁棒性。有关用于评估高温超导检测25适宜性的统计分析的说明,请参见 zhang 等人。当 ln215 细胞被使用时, z '-因子是 & gt;0.5 没有任何分析优化。如果在检测中使用其他细胞类型, 其 z '-因子为 & & lt;0.5, 则可以通过延长检测时间21来提高鲁棒性。ln215 和 hos, 人类骨肉瘤细胞, 细胞只需要10秒就能获得 z '-因子 & gt;0.521。该检测只需要受体和供体细胞、i 型溶液和 c 型溶液。不需要额外的试剂, 如 ly 和钙素 am。这种 gjic 检测的另一个优点是, 它测量单个井中细胞的总 gjic 活性, 从而导致井间的低变异性。在微注射、光漂白后的缝隙荧光恢复 (frap) 和双膜片钳检测中, 检测区域内的细胞可能会对测量产生显著影响。虽然刮装检测在相对较宽的区域内对 gjic 进行评估, 但刮装过程会带来显著的变异性26。
成功进行 i-yfp-gjic 检测的关键步骤如下。在每次使用之前, c 和 i 溶液的 ph 值必须调整为7.4。yfpql 荧光受 ph 值和卤化物22的强烈影响。两种溶液之间的 ph 值差可能导致 i 溶液加入后 yfp 荧光的异常变化。在电镀前, 供体和受体细胞必须完全分离。供体或受体细胞的团块扰乱了检测。混合培养的融合应 100%, 以最大限度地形成细胞之间的 gj。受体与供体细胞的比例也会影响李等人所描述的检测结果.21. 由于只有受体细胞具有 yfp 荧光, 在进行检测之前, 可通过荧光显微镜轻松地检查受体和供体细胞的比例和排列。在用车辆或化学品处理之前, 用 c 溶液清洗共培养, 以去除残留介质, 这一点很重要。培养基中残留的血清或苯酚红色可能分别是背景荧光的来源或不需要的荧光淬火剂。因此, 它们可能会中断 i-yfp-gjic 检测。fbs 中存在的生长因子也会抑制 gjic27。另一方面, 血清饥饿最终会导致细胞凋亡28, 这也可以通过化学治疗加速。根据我们的经验, 受体和供体细胞在经过大多数筛选化学物质的治疗后是健康的, c 溶液中 25μm, 没有血清10分钟。有些化学物质即使经过4小时的处理也是无毒的。由于化学毒性不同, 在需要长时间治疗时, 应仔细检查细胞的状况。如果细胞不健康, i-溶液引入后1秒内发生的 yfp 荧光明显减少可能是细胞脱离造成的。这可以通过对相关井的微观观察来证实。
i-yfp-gjic 检测中使用的细胞应满足多种要求。他们应该内生表达 gj, 或诱导形成 gj。由于由 cx43 组成的通道几乎同样渗透于原子阳离子和阴离子 29, 碘化物可以通过 ln215 细胞中 i-yfp gjic 中存在的通道迁移。如果感兴趣的细胞中的 cx 通道具有较低的碘渗透率, 但自由允许 ca2 +扩散, 则 i-yfp-gjic 检测可能无法进行。缺乏碘化物的吸收活动是一项要求。迅速表达功能性阴离子通道和碘化物的细胞不适合这种检测。细胞生长是另一个要求。受体和供体细胞是由表达 yfpql 或slc26a4 的慢病毒的转导和至少 1周19用与 puromycin 的选择而产生的。生长缓慢或生长有限的细胞, 如原发性肝细胞, 不适合这种检测。细胞粘附到塑料培养器表面也很重要。不牢固粘附的细胞, 如 hek293 细胞, 通过引入 i 型溶液很容易分离。这可以通过在电镀前将96孔板涂覆锁相环来克服。然而, 涂层板是一个繁琐的步骤, 建议避免这些类型的细胞。原则上, 原代细胞如星形胶质细胞、肝细胞和角质形成细胞在毒理学、生理和药理上比胶质瘤、肝癌和基底细胞等癌细胞更相关。然而, 它们有限的增长率使它们不适合进行检测。未来细胞培养的进展, 允许生长的原代细胞, 满足上述要求更长的时间, 将扩大毒理, 生理和药理评估可能与此方法的分析。
i-yfp gjic 检测不仅可用于高温超导, 还可用于确定细胞类型是否内生表达功能 gj。如果细胞没有 gj, 在共组成受体和供体细胞中观察到的 yfpql淬火率与只镀过受体细胞时观察到的 yfp ql 淬火率没有区别。如果淬火率有显著差异, 那么原始细胞就能表达功能 gj。由于差异往往随着时间的推移而增加, 如图 2a 所示, 与刮片或溢片-frap 检测相比, 这种检测对检测 gjic 活性较弱的敏感性更大。利用 i-yfp-gjic 法 23、30 可以获得时间过程数据、剂量-反应关系和 gj 调制器的可逆性评估。通过诱导有兴趣的 cx 表达到没有功能 gj 的细胞中, 然后产生受体和供体, 可以建立 i-yfp 特异性 cx-gjic 检测 23.因此, 这种分析可以确定一种化学品在特定类型的 cx 上的 ic50 值。
与大多数高温超导检测一样, i-yfp-gjic 检测可产生由 slc26a4、yfpql 或细胞碘化物渗透性变化引起的假阳性结果。由于假 gj 抑制可能是由于抑制 slc26a4 或 yfpql对碘化物脱敏, 因此每个潜在的 gj 抑制剂都应该使用能共同表达 yfpql 和slc26a4 的细胞进行测试。如果潜在的 gj 抑制剂是 slc26a4 阻滞剂或 yfp 脱敏剂, yfp 淬火是衰减的。相反, 真正的 gj 抑制剂并不影响 yfp 淬火。电生理方法或纯化的 yfpql可以区分 slc26a4 阻滞剂和 yfp 脱敏剂。通过阴离子通道、cx 半长或非特异性毒性作用提高 yfp 对碘化物的敏感或增加碘化物渗透性的 gj 激活剂也会产生假阳性结果。应确定当只镀过受体细胞时, 潜在的 gj 激活剂是否能增强 yfp 淬火。如果一种化学物质对 yfpql 的敏化或增加碘化物的渗透性, 那么在没有供体的受体细胞培养物中, 它将增加 yfpql 淬火.这两种类型的假 gj 激活剂可以区分在其他 gj 检测, 如刮负荷或 frap 或使用纯化的 yfpql 蛋白。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可供披露。
Acknowledgments
这项研究得到了由教育部资助的韩国国家研究基金会 (2011-0023701、2016r1d1a02929397 和 2016R1D1A1A02937397) 资助的基础科学研究方案。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
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