Summary
Vi præsenterer her, en protokol for en roman gap junction intercellulær kommunikation assay designet til high throughput screening af gap junction-modulerende kemikalier for drug discovery og toksikologisk vurdering.
Abstract
Kløften vejkryds (GJs) er cellemembranen kanaler, der tillader diffusion af molekyler, mindre end 1 kDa mellem naboceller. Som de har fysiologiske og patologiske roller, er der behov for høj overførselshastighed screening (HTS) assays til at identificere GJ modulatorer i drug discovery og toksikologi assays. En roman Iodid-gul fluorescerende proteiner-gap junction-intercellulær kommunikation (I-YFP-GJIC) assay opfylder dette behov. Det er en celle-baserede analyse herunder acceptor og donor celler, der er manipuleret til at stabilt udtrykke en gul fluorescerende proteiner (YFP) variant, hvis Fluorescens er nænsomt bratkølet af Iodid, eller SLC26A4, en Iodid transporter, henholdsvis. Iodid er føjet til en blandingskultur af to celletyper, de angive donor celler via SLC26A4 transporter og diffuse til tilstødende acceptor celler via GJs hvor de slukke YFP fluorescens. YFP fluorescens måles godt af godt i en kinetisk tilstand. YFP dæmper sats afspejler GJ aktivitet. Analysen er pålidelig og hurtig nok til at blive brugt til HTS. Protokol for jeg-YFP-GJIC analyse ved hjælp af LN215 cellerne, humane gliom celler, er beskrevet.
Introduction
Kløften vejkryds (GJs) fungere som intercellulære kanaler at tillade diffusion af små molekyler af < 1 kDa som næringsstoffer, metabolitter og signalering molekyler mellem naboceller. De junctional elementer omfatter en hemichannel eller connexon i hver celle, og hvert connexon udgør seks connexins (Cxs)1. GJs og Cxs har været brugt i toksikologi assays af kræftfremkaldende stoffer såsom polycykliske aromatiske kulbrinter (PAH), som er GJ hæmmere2,3,4. Forstyrret GJIC har været forbundet med nongenotoxic carcinogenese5,6. Som potentielle terapeutiske mål, er GJ involvering blevet rapporteret i særlige undertyper af anfald7,8, beskyttelse mod hjerte og hjerne iskæmi/reperfusion skade9, migræne med aura10, Drug-induceret leverskade6,11, og sårheling12. Høj overførselshastighed screening (HTS) assays er forpligtet til at identificere GJ-modulerende kemikalier eller antistoffer for drug discovery, for toksikologi assays, og identificere roman cellulære regulatorer af GJ aktivitet. HTS assays kan også bruges til at undersøge struktur-aktivitet relationer af GJ modulatorer2,13,14,15.
Nogle GJIC assays omfatter dye transfer eller dobbelt patch klemme teknikker. Lucifer gule CH (LY) og calcein acetoxymethyl ester (calcein-AM) har været anvendt i dye-overførsel assays. Celler er ikke gennemtrængelige til LY, som er indført ved mikroinjektion, Skrab lastning eller elektroporation. Én gang inde i cellen, LY breder sig til omkringliggende celler via GJs og GJ aktivitet er analyseret af omfanget af LY migration16. Calcein-AM assays indebære normalt gap-fluorescens opsving efter photobleaching17,18. Calcein-AM er en celle-permeant farvestof, der omdannes intracellulært til uigennemtrængelige calcein af en iboende esterase. Analysen kræver en Konfokal mikroskop til at observere overførsel af calcein-AM i en celle fra dem omkring det efter laser photobleaching. Hvis funktionelle GJs er til stede, calcein-AM i tilstødende celler træder photobleached cellerne og Fluorescens er genoprettet. GJ aktivitet er analyseret af omfanget af fluorescens inddrivelse af photobleached celler. Dye-overførsel assays er besværlig og tidskrævende eller har lav følsomhed. Dobbelt patch fastspænding er en elektrofysiologiske metode, der måler junctional ledningsevne. Det er relativt følsomme, med en direkte afhængighed af ledningsevne på antallet af åbne GJs19; Men, det teknisk krævende, tidskrævende og dyrt20. Jeg-YFP-GJIC-analysen blev udviklet til brug i HTS.
Figur 1 illustrerer de komponenter og trin af-YFP GJIC assay, der udnytter acceptor celler, der udtrykker en Iodid-følsomme YFP variant forsynet med H148Q og I152L (YFPQL) og donor celler, der udtrykker en Iodid transporter (SLC26A4)21 . De to mutationer af YFPQL tillade quenching af fluorescens af Iodid22. Jodider føjes til co kulturperler acceptor og donor celler; de indtaste ikke acceptor celler, men er taget af SLC26A4 transportører stede på donor celler. Jodider i cellerne, donor diffuse gennem velfungerende GJs i tilstødende acceptor celler hvor de slukke YFPQL fluorescens. Hvis GJs er lukket eller blokeret af hæmmere, angive Iodid ikke acceptor celler for at slukke fluorescens. YFPQL quenching sats afspejler GJ aktivitet. YFP GJIC analyseprocedure er hverken kompliceret eller tidskrævende. Det er foreneligt med HTS og kan bruges til at teste virkningerne af et stort antal forbindelser på GJ aktivitet i en relativt kort periode. Det kræver kun acceptor og donor celler og to afbalanceret saltopløsninger. Protokollen beskrevet nedenfor er baseret på LN215 celler hvis store Cx er Cx4321. LN215-YFPQL receptor og LN215-jeg− donor celler blev genereret af transduktion med lentiviruses udtrykker YFPQL eller SLC26A421,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generation af lentiviruses udtrykker YFPQL og SLC26A4
- Vokse HEK293T menneskelige embryonale nyreceller til 80% confluency på 100 mm kultur plader. Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum, 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin er dyrkningsmediet anvendes i hele protokollen til at opretholde HEK293T og andre celler, der er nævnt nedenfor.
- Pels 6-og kultur plader ved tilsætning 2 mL 0,005% af sterile poly-L-lysin (PLL) løsning til hver brønd for 10 min. Aspirér PLL løsning og skyl overfladen to gange med 2 mL sterilt vand.
- Vask HEK293T celler med 10 mL af fosfat bufferet saltvand (PBS) og behandle de celle encellelag i hver 100 mm fad med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA-oploesning ved 37 ° C i 3 min. tilføje 5 mL af næringssubstratet og resuspend cellerne.
- Tælle celler i en hemocytometer og justere tæthed af cellesuspension til 250.000 celler/mL i dyrkningsmediet og tilføje 500.000 celler i 2 mL af næringssubstratet til hver lysin-belagt godt af 6-godt plader. Inkuber celler i en fugtig 5% CO2/95 luft atmosfære ved 37 ° C i 24 timer og derefter erstatte næringssubstratet med DMEM uden penicillin og streptomycin.
- I en 1,5 mL tube, fortyndes 20 µL Transfektion reagens med 500 µL af DMEM uden serum eller antibiotika. Bland forsigtigt af pipettering og lad det stå ved stuetemperatur i 5 min.
- I mellemtiden, afpipetteres 250 µL af DMEM i hver af to 1,5 mL rør og derefter tilføje 1500 ng pLVX-EIP-YFPQL eller pLenti6P-SLC26A4, 1225 ng af psPAX2 og 375 ng af pMD2.G til hver. De to lentiviral plasmider har været tidligere beskrevet21. Tilføje 250 µL fortyndede Transfektion reagens til hver plasmid tube, blandes forsigtigt og Ruger i 20 min. ved stuetemperatur.
- Efter 20 min, tilføjes 500 µL af Transfektion reagens og plasmid komplekser i 1,5 mL rør dråbevis hver kultur plade godt i trin 1.4 og mix af vuggende plade frem og tilbage. Inkuber celler ved 37 ° C i en CO2 inkubator for 12 timer.
- Udskift mediet med 2,5 mL frisk medium og inkuberes i en yderligere 48 h. Derefter kultur pladen anbringes i isbad i 5 min at holde konditioneret medium indeholdende lentivirus nedkøles for at opretholde smitteevne.
- Høste de medier, der indeholder lentiviruses og overføre til 15 mL konisk rør. Der centrifugeres ved 3.000 x g ved 4 ° C i 3 min og derefter fjerne flydende HEK293T celler fra supernatanten ved filtrering på 0,4 µm.
- Gemme medier indeholdende lentiviruses ved 4 ° C til brug inden for 2 dage. Til senere brug, gemme 200 µL alikvoter ved −80 ° C.
2. generation af LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler ved lentiviral transduktion
- Vokse LN215 celler i 100 mm kultur plader til 80% confluency i DMEM, suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin som beskrevet ovenfor.
Bemærk: Hvis jeg-YFP-GJIC-analysen er udført ved hjælp af en anden cellelinie, bruge passende næringssubstratet. LN215-YFPQLog LN215-jeg- celler kan leveres af universiteter og erhvervslivet fundament, Yonsei Universitet. Kontakt venligst de tilsvarende forfatteren. - En dag før transduktion, vaske cellerne to gange med 10 mL PBS, behandle med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA ved 37 ° C i 3 min. Resuspend celler i 5 mL af næringssubstratet med 10 mL serologiske pipette og justere tæthed til 50.000 celler/mL. Tilføje 20.000 celler i 400 µL af medier til hver brønd med en 24-godt kultur plade for behandling som ingen virus kontrol, YFPQLog SLC26A4 celler.
- Efter 24 h inkubation ved 37 ° C, transduce to brønde ved at erstatte næringssubstratet med 400 µL af en 1:1 blanding af pLVX-EIP-YFPQL eller pLenti6P-SLC26A4 lentivirus og frisk næringssubstratet suppleret med polybrene i en endelig koncentration på 4 µg/mL. For ingen virus kontrol, erstatte med næringssubstratet.
- Inkuber celler ved 37 ° C i 15 h, Aspirér det medium, der indeholder lentiviruses, tilføje frisk næringssubstratet og inkuberes celler for en yderligere 72 h.
Forsigtig: For at forhindre forurening af lentivirus mellem brønde, bruge nye tips eller pipets til hver brønd når du Aspirér næringssubstratet indeholdende lentivirus eller give afkald på frisk vækstmedium. - Vask celler i hver godt to gange med 0,5 mL PBS, behandle med 300 µL af trypsin-EDTA for 3 min. Resuspend celler i 2 mL af næringssubstratet og plade i seks-og kultur plader med 2 µg/mL puromycin.
- Kultur, cellerne i medier indeholdende 2 µg/mL puromycin, indtil alle celler i kontrolelementet godt er døde (runde-formede eller flydende når observeret i mikroskop), som tager normalt en uge. Opdater kultur medier indeholdende puromycin hver anden dag i perioden, valg. Hvis LN215-YFPQL eller LN215-I- kulturer blive sammenflydende før valget har afsluttet, overførsel celler til 100 mm plade og fortsætte udvalg som i trin 2,5.
3. forberedelse af løsninger kræves for analysen
- Forberede 500 mL af C-løsning (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 10 mM glukose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2og 1 mM CaCl2) og 500 mL af opløsning (10 mM HEPES, 140 mM NaI, 10 mM glukose, 5 mM KCl, og 1 mM CaCl2).
- PH-værdien af begge løsninger til 7.4 med 1 N NaOH, sterilisere løsningerne af filtrations på 0,4 µm til opbevaring. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned. Tjek pH vha.
4. plating LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler
- Kultur LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler i 100 mm plader separat i dyrkningsmediet til at nå de befolkninger, der er nødvendige for analysen. LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler i 40% og 80% confluency i 100 mm plader, henholdsvis, er tilstrækkeligt til en 96-brønd plade assay.
- En dag før udførelse-YFP GJIC assay, vaske hver 100 mm kultur plade med 10 mL PBS. Behandle hver plade med 2 mL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Resuspend celler i hver plade i 4 mL af næringssubstratet og overførsel til 15 mL konisk rør.
- Sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 1.000 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspend hver celle pellet med 5 mL af næringssubstratet. Bryde op enhver celle klumper i enkelt celler af pipettering op og ned omkring 20 gange med 10 mL serologisk pipette.
- Tælle celler i en hemocytometer, og fortynd celler i dyrkningsmediet at gøre celle suspensioner af LN215-YFPQL på 80.000 celler/mL og LN215-jeg− på 160.000 celler/mL.
- Mix 7 mL af LN215-YFPQL og 7 mL af LN215-jeg− celle suspensioner i et reservoir. Tilsæt 100 µL af blandingen til hver brønd med en 96-brønd celle kultur plade ved hjælp af en multikanalpipette.
Bemærk: For at tilføje 100 µL af blandingen i hver brønd i 96-brønd celle plade, ca. 10 mL af blandet cellesuspension er nødvendig. Det anbefales at gøre flere cellesuspension end nødvendigt. - Inkuber cellerne i fugtet 5% CO2/95% luft ved 37 ° C i 24 timer. LN215-YFPQL og LN215-jeg−cellekultur bør være 100% sammenflydende, når analysen er gennemført.
5. udførelse-YFP GJIC analysen
Bemærk: Brug et fluorescens mikroskop med 20 x forstørrelse, og en normal god landbrugspraksis filter til at kontrollere de 96-brønd plader være sikker på der er ingen klumper af LN215-YFPQL eller LN215-SLC26A4 celler, og at cellekulturer er fuldt sammenflydende og godt fordelt før at gennemføre analysen.
- Mindst 30 min før du gør analysen, drej på en mikrotiterplade og sat til 37 ° C.
- Vask slange af en automatiseret injektor med 3 mL af 70% ethanol, 3 mL destilleret vand og derefter 3 mL løsning med en væskehastighed på 300 µL/s.
- Varm C - og jeg-løsninger til 37 ° C i vandbad.
Bemærk: Som 100 µL af hver løsning er nødvendig for hvert hul i 96-brønd plade, ca. 10 mL af hver opløsning er nødvendig for hvert assay. En yderligere 10 mL løsning er nødvendig for priming hver plade (i alt 20 mL) og en yderligere 25 mL af C-løsningen er nødvendige for vask hver plade (i alt 35 mL). - Opsug vækstmediet eller vendes pladen for at tømme den; trykke ud resterende medium.
Bemærk: Resterende føtal bovint serum i vækst medier forårsager baggrund fluorescens og en nedgang i assay kvalitet. - Tilføje 200 µL af C-løsning til hver brønd fra et reservoir, ved hjælp af en multikanalpipette. Opsug C-løsningen eller vendes pladen for at tømme og trykke ud resterende løsning.
- Tilsæt 50 µL µL C-løsning, 1 µL af 2,5 mM kemisk lager (Se tabel 1) eller dimethylsulfoxide (DMSO) som et køretøj, og derefter 50 µL µL C-løsning til hver brønd med en multikanalpipette.
Bemærk: De fleste reagenser i en kemisk bibliotek er opløst i DMSO og op til 1% (v/v) er tilladt i de fleste celle-baserede assays24. Som DMSO har en højere densitet end vand, reagenser opløst i DMSO har tendens til at gå ned til bunden når føjet til kultur plade wells, som forstyrrer koncentrationen af assay løsninger. Dette kan omgås ved at tilføje 50 µL af C-løsning, reagenser i DMSO og 50 µL C af - løsning i rækkefølge. De sidste 50 µL af C-løsning er til at blande. - Inkuber celler ved 37 ° C i luften, ikke i 5% CO2. I inkubationstiden kan ændres, men 10 min er normalt tilstrækkeligt for ion-kanal modulatorer til at handle.
- Under inkubation, indstille mikrotiterplade reader program til at injicere 100 µL af jeg-løsning til hver brønd på 1 s og til at måle fluorescens for 10 s 0,4 s mellemrum. Indstille læseren at læse fluorescens fra bunden. Den anbefalede injektion hastighed er 135 µL/s. sæt excitation bølgelængde til 485 nm og Læs emission ved 520 nm.
Bemærk: Detaljerede indstillinger for mikrotiterplade reader programmer er som følger.- Klik på knappen Administrer protokoller .
- Klik på knappen ny . Vælg Fluorescens intensitet i måling metode afsnit og Godt tilstanden i læsning tilstand sektion. Næste, klik på knappen OK . Ny fane vises.
- I menuen Grundparametre bølgelængden excitation 485 nm og emission ved 520 nm. Vælg den Nederste fiberoptiske at læse fluorescens fra bunden. Sæt måling start tid til at være "0 s", antallet af intervaller for at være "25", antallet af blinker pr. brønd, og interval til at være "20" og interval tid til at være "0,4 s".
- Tegne region af pladen læses i menuen Layout .
- I menuen Koncentrationer/bind/Shacking indstille mikrotiterplade læseren at injicere 100 µL af jeg-løsning til hver brønd med 135 µL/s injektion hastighed.
Bemærk: Undgå hurtigere injektion hastigheder, fordi de kan resultere i udstationering af celler. - I menuen injektion tid indstille starttiden injektion 1 s. Klik på knappen Start måling .
- Efter inkubationen Anbring 96-brønd plader i mikrotiterplade læseren og starte målingen ved at klikke på Start måling knappen igen.
6. beregning af GJIC aktivitet
- Beregne procenter af YFPQL dæmper og GJIC aktivitet som23
YFPQL dæmper (%) =
GJIC aktivitet (%) =
Bemærk: I princippet GJIC aktivitet skal beregnes af forskellen mellem procentdelen af YFP fluorescens i brønde med acceptor celler og donor celler og den tilsvarende acceptor-celle kun brønde. Men som LN215-YFPQL celler viser ubetydelige YFP dæmper af Iodid efter 10 s, vi tager ikke imod den baggrund YFP dæmper højde ved udførelse HTS ved hjælp af LN215-YFPQL og LN215-jeg- celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tyve-ni 96-og kultur plader blev anvendt til at screene 2320 kemikalier for at identificere nye GJIC modulatorer af-YFP GJIC analyse ved hjælp af LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler. De opnåede resultater med en repræsentativ plade er vist i figur 2. Procentdelen af YFP fluorescens i hver brønd er vist som en linjegraf i fig. 2A og procentdelen af GJIC aktivitet i hver brønd er vist i baren grafen i figur 2B. Den negative og positive kontroller og 80 kemikalier, der blev screenet er vist i tabel 1. Hver blev godt behandlet med 25 µM af et sammensat for 10 min. terbinafin helt hæmmede GJIC og homosalate hæmmes ca 50% af GJIC. Terbinafin blev bekræftet som et GJ hæmmer. Dens dosis-respons, reversibilitet og andre eksperimentelle resultater har været offentliggjort andetsteds23.
Figur 1 : Komponenter og trin af-YFP GJIC analyse (A) gule og mørke gule Femkanter repræsenterer acceptor celler udtrykker YFPQL før og efter dæmper. De sorte Femkanter er donor celler udtrykker SLC26A4. De blå bjælker er GJs og de røde stænger er SLC26A4 transportvirksomheder. De pink cirkler er jodider. Når GJs er åbne (øverste panel), jodider passere gennem SLC26A4 og angive cellen donor. Jodider migrere til tilstødende acceptor celler via GJs. jodider dæmpningen YFP fluorescens af acceptoren celler. Hvis GJs er lukket (nederste panel), jodider indtastning donor celler kan ikke flytte til naboceller kontrakttager, og bevares kun i cellerne, donor. YFP fluorescens af acceptoren celler er ikke væsentligt reduceret efter tilsætning af jodider (B) fasekontrast og fluorescerende billeder fremkommer når du laver en jeg-YFP-GJIC analyse. Når acceptor og donor celler blev forgyldt i forholdet 1:1, blev YFPQL quenching observeret 1 min efter jodider blev tilføjet (øverste panel). Når kun acceptor celler blev forgyldt, førte Iodid behandling i 1 min. ikke til betydelige YFPQL quenching21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant HTS resultater ved hjælp af jeg-YFP-GJIC analyse (A) suspensioner af 1:2 blandinger af LN215-YFPQL og LN215-jeg− celler blev forgyldt og inkuberes i 24 timer, som beskrevet i protokollen afsnit 4. Celler blev derefter vaskes og behandles med køretøjet eller kemikalier som i protokollen afsnit 5. Alle kemikalier blev analyseret som 25 µM prøver fra 2,5 mM stamopløsninger i DMSO i 10 min. Hver indeholdt godt 1 µL DMSO og 100 µL af C-løsning. De første og sidste rækker af pladen blev tildelt negative (køretøj) og positivt (carbenoxolone) kontrol. De resterende 80 brønde blev anvendt til at screene kemikalier opført i tabel 1. Efter behandling, blev jeg-YFP-GJIC-analysen foretaget godt af godt som i protokollen afsnit 5. Procentdelen af YFP fluorescens i hver brønd på hver gang var normaliseret til værdien på 2 s og plottes i tid. Linjer i figuren repræsenterer ændringerne i YFP fluorescens i hver brønd. YFP fluorescens i de fleste godt på 10 s varierede fra 70% til 80%. Terbinafin og homosalate var potentielle hits for GJ hæmmere (B) søjlediagrammet viser den procentvise GJIC aktivitet af hver af de 96 brønde. Procent GJIC aktiviteten blev beregnet som vist i protokollen trin 6.1 og afbildet i søjlediagrammet mod den godt tal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Godt nr. | Position | Kemiske | Godt nr. | Position | Kemiske |
| 1 | A01 | DMSO | 49 | E01 | DMSO |
| 2 | A02 | difloxacin hydrochlorid | 50 | E02 | propofol |
| 3 | A03 | betamethason valerate | 51 | E03 | oleandomycin fosfat |
| 4 | A04 | erythromycin | 52 | E04 | mianserin hydrochlorid |
| 5 | A05 | cyproheptadine hydrochlorid | 53 | E05 | Valsartan |
| 6 | A06 | Liothyronine | 54 | E06 | salsalate |
| 7 | A07 | theophyllin | 55 | E07 | hydrocortison |
| 8 | A08 | Tolnaftate | 56 | E08 | rifaximin |
| 9 | A09 | trimethobenzamide hydrochlorid | 57 | E09 | adrenolone hydrochlorid |
| 10 | A10 | cefamandole nafate | 58 | E10 | imiquimod |
| 11 | A11 | dimethyl fumarat | 59 | E11 | Nonoxynol-9 |
| 12 | A12 | CBX | 60 | E12 | CBX |
| 13 | B01 | DMSO | 61 | F01 | DMSO |
| 14 | B02 | Piracetam | 62 | F02 | ranolazin |
| 15 | B03 | gluconolactone | 63 | F03 | danthron |
| 16 | B04 | azlocillin natrium | 64 | F04 | acedapsone |
| 17 | B05 | cholinchlorid | 65 | F05 | atomoxetin hydrochlorid |
| 18 | B06 | atorvastatin calcium | 66 | F06 | desoxycorticosterone acetat |
| 19 | B07 | oxyphencyclimine hydrochlorid | 67 | F07 | tramadol hydrochlorid |
| 20 | B08 | propafenon hydrochlorid | 68 | F08 | terbinafin hydrochlorid |
| 21 | B09 | fluconazol | 69 | F09 | topiramat |
| 22 | B10 | lovastatin | 70 | F10 | gemifloxacin mesylat |
| 23 | B11 | Bleomycin (bleomycin b2 vist) | 71 | F11 | pravastatin natrium |
| 24 | B12 | CBX | 72 | F12 | CBX |
| 25 | C01 | DMSO | 73 | G01 | DMSO |
| 26 | C02 | acesulfam kalium | 74 | G02 | levalbuterol hydrochlorid |
| 27 | C03 | teniposide | 75 | G03 | Metformin hydrochlorid |
| 28 | C04 | garvesyre | 76 | G04 | pregabalin |
| 29 | C05 | carprofen | 77 | G05 | topotecan hydrochlorid |
| 30 | C06 | hydroxychloroquin sulfat | 78 | G06 | phenoxybenzamine hydrochlorid |
| 31 | C07 | pentoxifyllin | 79 | G07 | arecoline hydrobromid |
| 32 | C08 | mepivacain hydrochlorid | 80 | G08 | mepartricin |
| 33 | C09 | nilutamide | 81 | G09 | pantoprazol |
| 34 | C10 | aminolaevulinsyre syre hydrochlorid | 82 | G10 | loperamid hydrochlorid |
| 35 | C11 | Aniracetam | 83 | G11 | podofilox |
| 36 | C12 | CBX | 84 | G12 | CBX |
| 37 | D01 | DMSO | 85 | H01 | DMSO |
| 38 | D02 | metaxalone | 86 | H02 | levodopa |
| 39 | D03 | chloroguanide hydrochlorid | 87 | H03 | ethisterone |
| 40 | D04 | clarithromycin | 88 | H04 | enrofloxacin |
| 41 | D05 | modaline sulfat | 89 | H05 | sparteine sulfat |
| 42 | D06 | protirelin | 90 | H06 | testosteron propionat |
| 43 | D07 | theobromin | 91 | H07 | pyridostigmine bromid |
| 44 | D08 | Rosiglitazon maleat | 92 | H08 | enilconazol sulfat |
| 45 | D09 | Losartan | 93 | H09 | betamethason natriumfosfat |
| 46 | D10 | homosalate | 94 | H10 | azaserine |
| 47 | D11 | salicylanilide | 95 | H11 | acrisorcin |
| 48 | D12 | CBX | 96 | H12 | CBX |
Tabel 1. Liste over kemikalier, der er screenet i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jeg-YFP-GJIC-analysen kan anvendes til HTS, fordi det er robust, hurtig og billig. En HTS analysen anses for robust hvis Z'-faktor er over 0,525. Se Zhang et al. for en beskrivelse af den statistiske analyse anvendes til vurderingen af egnetheden af HTS assays25. Når LN215 celler blev brugt, Z'-faktor var > 0,5 uden nogen assay optimering. Hvis andre celletyper er brugt i analysen og dens Z'-faktor er < 0.5, robusthed kan forbedres ved at udvide assay gang21. LN215 og HOS, menneskelige osteosarkom celler, celler behov kun 10 s til at indhente en Z'-faktor > 0,521. Analysen kræver kun acceptor og donor celler, -løsning og C-løsning. Ingen yderligere reagenser, såsom LY og calcein-AM er nødvendige. En anden fordel ved denne GJIC analyse er at det måler den samlede GJIC aktivitet af celler i et enkelt godt, hvilket resulterer i lave mellem-og variabilitet. I mikroinjektion, gap-fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) og dobbelt patch klemme assays, kan en celle i det analyserede område påvirke målingen. Selv om skrabe lastning assays evaluere GJIC over et relativt stort område, kan skrabe-loading procedure indføre betydelig variabilitet26.
De kritiske trin for vellykket gennemførelse af jeg-YFP-GJIC-analysen er som følger. PH af C - og jeg-løsningerne skal tilpasses 7.4 før hver brug. YFPQL Fluorescens er stærkt påvirket af pH og af halogenider22. En pH forskel mellem de to løsninger kan føre til afvigende ændring i YFP fluorescens efter tilsætning af løsning. Donor og acceptor cellerne skal adskilles fuldstændigt før plating. Klumper af donor eller acceptor celler forstyrrer analysen. Sammenløbet af de blandede kultur bør være 100% at maksimere dannelsen af GJs mellem celler. Forholdet mellem acceptoren til donor celler påvirker også assay resultater som beskrevet af Lee et al. 21. som kun acceptor celler har YFP fluorescens, forholdet og arrangement af acceptor og donor celler kan let kontrolleres med et fluorescens mikroskop før foretage analysen. Det er vigtigt at vaske fælles kultur med C-løsning til at fjerne resterende medium før behandling med køretøjet eller kemikalier. Resterende serum eller phenol rød fra dyrkningsmediet kan være en kilde til baggrunden fluorescens eller en uønsket fluorescens quencher, henholdsvis. De kan derfor afbryder jeg-YFP-GJIC-analysen. Vækstfaktorer findes i FBS kan også hæmme GJIC27. På den anden side kan serum sult i sidste ende føre apoptose28, som også kan fremskyndes ved kemisk behandling. Vores erfaring var acceptor og donor cellerne sund efter behandling af mest screenet kemikalier på 25 µM i C-løsning uden serum i 10 min. Nogle kemikalier var ikke giftig selv efter behandling for 4 h. Som kemiske toksicitet varierer, bør betingelsen om cellerne kontrolleres omhyggeligt, når behandling i længere perioder er påkrævet. Hvis celler ikke er sundt, en indlysende reduktion af YFP fluorescens, der opstår inden for 1 s efter indførelsen af løsning kan medføre fra celle detachement. Der kan bekræftes af mikroskopiske observation af de involverede godt.
De celler, der bruges i jeg-YFP-GJIC-analysen bør opfylde flere krav. De bør udtrykke GJs endogent eller tilskyndes til at danne GJs. Som kanaler sammensat af Cx43 er næsten lige så gennemtrængelig for atomic kationer og anioner29, kan jodider vandrer gennem de kanaler, der er til stede i-YFP GJIC i LN215 celler. Hvis Cx kanaler i cellerne i interesse har lav Iodid permeabilitet men frit give diffusion af Ca2 +, kan jeg-YFP-GJIC-analysen ikke være muligt. Fraværet af Iodid optagelse aktivitet er et krav. De celler, der udtrykker funktionelle anion kanaler og optagelse Iodid hurtigt er ikke passende for denne analyse. Cellevækst er et andet krav. Acceptor og donor cellerne er genereret af transduktion af lentiviruses udtrykker YFPQL eller SLC26A4 og udvalg med puromycin for mindst 1 uge19. Celler, der vokser langsomt eller har begrænset vækst som primære hepatocytter ikke er egnede til dette assay. Vedhæftning af celler på overfladen af plast kultur ware er også vigtig. Celler, der ikke overholder fast, såsom HEK293 celler, er uden sammenligning løsrevet af indførelsen af løsning. Dette kan løses ved belægning plader af 96-brønd med PLL før plating. Dog belægning plader er en kedelig skridt, og at undgå disse typer af celler anbefales. I princippet, primærelementer som astrocytter, hepatocytter og keratinocytter er toksikologisk, fysiologisk, og farmakologisk mere relevant end kræftceller som gliom, hepatocellulært carcinom og basal celle karcinom celler. Men deres begrænsede vækstrater gøre dem upassende for analysen. Fremtidige fremskridt i cellekultur, som tillader vækst af primærelementer, der opfylder ovenstående krav i længere perioder, vil udvide de toksikologiske, fysiologiske og farmakologiske vurderinger, der er muligt med denne analyse.
YFP GJIC assay kan bruges ikke blot til HTS, men også for at afgøre, om en celletype endogent udtrykker funktionelle GJs. Hvis cellerne ikke har GJs, den YFPQL quenching sats observeret i cocultured acceptor og donor celler ville ikke være forskellige fra der iagttages, når kun acceptor cellerne blev forgyldt. Hvis der var en signifikant forskel i dæmper satser, så express de oprindelige celler funktionelle GJs. Da forskellen tendens til at stige med tiden som vist i figur 2A, har dette assay en større følsomhed til at afsløre svage GJIC aktivitet end Skrab-loading eller kløft-FRAP assays. Tid kursus data, forholdet mellem dosis og respons og vurdere, reversibilitet af GJ modulatorer kan fås med jeg-YFP-GJIC assay23,30. Af inducerende udtryk for en Cx af interesse til celler funktionelle GJs og derefter generere acceptorer og donorer, kan-YFP specifikke Cx-GJIC assays være etableret23. Denne analyse gør det således muligt at bestemme IC50 værdier af et kemisk stof på en bestemt type af Cx.
Ligesom de fleste HTS assays, kan jeg-YFP-GJIC-analysen producere falske positive resultater som følge af ændringer i SLC26A4, YFPQLeller cellulære Iodid permeabilitet. Som falsk GJ hæmning kan skyldes hæmning af SLC26A4 eller desensibilisering af YFPQL at Iodid, bør alle potentielle GJ hæmmer testes ved hjælp af celler, der coexpress YFPQL og SLC26A4. Hvis en potentiel GJ inhibitor er en SLC26A4 blocker eller en YFP desensitizer, er YFP dæmper svækket. Tværtimod, påvirker en sand GJ hæmmer ikke YFP dæmper. Elektrofysiologiske metoder eller renset YFPQL kan diskriminere mellem SLC26A4 blokkere og YFP desensitizers. GJ aktivatorer, at bevidstgøre YFP til Iodid eller øge Iodid permeabilitet via anion kanaler, Cx hemichannels, eller af uspecifikke toksiske virkninger vil også give falske positive resultater. Det skal afgøres, om potentielle GJ aktivatorer forbedre YFP dæmper når kun acceptor celler er forgyldt. Hvis et kemikalie sensitizes YFPQL eller øger Iodid permeabilitet, vil det øge YFPQL quenching i acceptoren cellekulturer uden donorer. De to typer af falske GJ aktivatorer kan skelnes i andre GJ assays, såsom Skrab lastning eller FRAP eller ved hjælp af renset YFPQL protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, og 2018R1A6A1A03023718).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well plate | SPL | 30096 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C5670 | I-solution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C-solution, I-solution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | sigma | 276855 | |
| HEPES | Sigma | RES6003H-B7 | C-solution, I-solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | transfection reagent |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG LabTech | POLARstar Omega 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| Polybrene | sigma | H9268 | |
| Poly-L-lysine solution | sigma | P4707 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | C-solution, I-solution |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| Puromycin Dihydrochloride | sigma | P8833 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | C-solution, I-solution |
| Sodium hyroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| Sodium Iodide (NaI) | Sigma | 383112 | I-solution |
References
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated Gap Junctional Intercellular Communication as a Biomarker of PAH Epigenetic Toxicity: Structure-Function Relationship. Environmental Health Perspectives. 106, 975 (1998).
- U, J. E. T., Chang, C., Upham, B., Wilson, M. Epigenetic toxicology as toxicant-induced changes in intracellular signalling leading to altered gap junctional intercellular communication. Toxicology Letters. , 71-78 (1998).
- Yamasaki, H. Role of disrupted gap junctional intercellular communications in detection and characterization of carcinogens. Mutation Research - Reviews in Genetic Toxicology. , (1996).
- Yamasaki, H., et al. Gap junctional intercellular communication and cell proliferation during rat liver carcinogenesis. Environmental Health Perspectives. 101, suppl 5 191-197 (1993).
- Vinken, M., et al. Gap junctional intercellular communication as a target for liver toxicity and carcinogenicity. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 201-222 (2009).
- Fonseca, C. G., Green, C. R., Nicholson, L. F. B. Upregulation in astrocytic connexin 43 gap junction levels may exacerbate generalized seizures in mesial temporal lobe epilepsy. Brain Research. 929 (1), 105-116 (2002).
- Garbelli, R., et al. Expression of connexin 43 in the human epileptic and drug-resistant cerebral cortex. Neurology. 76 (10), 895-902 (2011).
- Schulz, R., et al. Connexin 43 is an emerging therapeutic target in ischemia/reperfusion injury, cardioprotection and neuroprotection. Pharmacology and Therapeutics. 153, 90-106 (2015).
- Sarrouilhe, D., Dejean, C., Mesnil, M. Involvement of gap junction channels in the pathophysiology of migraine with aura. Frontiers in Physiology. , (2014).
- Patel, S. J., et al. Gap junction inhibition prevents drug-induced liver toxicity and fulminant hepatic failure. Nature Biotechnology. 30 (2), 179-183 (2012).
- Kandyba, E. E., Hodgins, M. B., Martin, P. E. A murine living skin equivalent amenable to live-cell imaging: analysis of the roles of connexins in the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 128 (4), 1039-1049 (2008).
- Upham, B. L., et al. Differential roles of 2 , 6 , and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. Cancer Letters. 191, 27-34 (2003).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environmental Health Perspectives. 117 (4), 545-551 (2009).
- Weis, L. M., et al. Bay or Baylike Regions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons Were Potent Inhibitors of Gap Intercellular Communication. Environmental Health Perspectives. 106 (1), 17-22 (1998).
- el-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-Loading and Dye Transfer: A Rapid and Simple Technique to Study Gap Junctional Intercellular Communication. Experimental Cell Research. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. Photobleaching Assay of Gap Junction- Mediated Communication Between Human Cells. Advancement of Science. 232 (4749), 525-528 (2010).
- Abbaci, M., et al. In vitro characterization of gap junctional intercellular communication by gap-FRAP technique. Proceedings of SPIE. , 585909 (2005).
- Neyton, J., Trautmann, A. Single-channel currents of an intercellular junction. Nature. 317 (6035), 331-335 (1985).
- Wilders, R., Jongsma, H. J. Limitations of the dual voltage clamp method in assaying conductance and kinetics of gap junction channels. Biophysical Journal. 63 (4), 942-953 (1992).
- Lee, J. Y., Choi, E. J., Lee, J. A new high-throughput screening-compatible gap junctional intercellular communication assay. BMC Biotechnology. 15 (1), 1-9 (2015).
- Galietta, L. J. V., Haggie, P. M., Verkman, A. S. Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities. FEBS Letters. 499 (3), 220-224 (2001).
- Lee, J. Y., Yoon, S. M., Choi, E. J., Lee, J. Terbinafine inhibits gap junctional intercellular communication. Toxicology and Applied Pharmacology. 307, 102-107 (2016).
- Hughes, J., Rees, S., Kalindjian, S., Philpott, K. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Upham, B. L. Role of Integrative Signaling Through Gap Junctions in Toxicology. Current Protocols in Toxicology. , (2011).
- Schalper, K. A., et al. Modulation of gap junction channels and hemichannels by growth factors. Molecular BioSystems. 8 (3), 685-698 (2012).
- Kulkarni, G. V., Mcculloch, C. A. G. Serum deprivation induces apoptotic cell death in a subset of Balb / c 3T3 fibroblasts. Journal of Cell Science. 1179, 1169-1179 (1994).
- Harris, A. L., Locke, D. Permeability of Connexin Channels. Connexins. , 165-206 (2009).
- Choi, E. J., Yeo, J. H., Yoon, S. M., Lee, J. Gambogic Acid and Its Analogs Inhibit Gap. Junctional Intercellular Communication. 9, 1-10 (2018).
