Summary
软、低功耗、生物分子记忆电阻利用生物突触的相似成分、结构和切换机制。本文提出了一种从油中水滴之间形成的绝缘脂质双层层中获得的生物分子记忆器的组装和表征方案。电压活化的阿米西林肽的加入导致膜上的记忆离子电导。
Abstract
能够在合成电路元素中重现突触功能对于寻求模仿具有同等效率和密度的大脑认知能力的神经形态计算系统至关重要。迄今为止, 硅基三端晶体管和双端记忆电阻器在神经形态电路中得到了广泛的应用, 这在很大程度上是由于它们能够进行同地定位的信息处理和存储器。然而, 这些设备无法实现大脑的互连性和复杂性, 因为它们耗电, 无法模拟关键的突触功能, 并受到高噪声和高开关电压的影响。为了克服这些限制, 我们开发并表征了一种生物分子记忆电阻器, 该记忆器模拟了生物突触的组成、结构和开关特性。在这里, 我们描述了生物分子记忆器的组装和表征过程, 其中包括 5 nw 厚的脂质双层在油中的脂质功能化水滴之间形成的, 并掺杂了电压活化的醛氧西林肽。虽然类似的组装协议已被用来研究生物物理特性的液支持脂膜和膜结合离子通道, 本文的重点是关键的修改液滴接口双层法必不可少的实现稳定的电阻器性能。具体而言, 我们描述了脂质体的制备过程和在脂质双层膜中加入类似霉素肽的过程, 以及每个成分的适当浓度及其对记忆电阻器整体响应的影响。我们还详细介绍了生物分子记忆器的表征过程, 包括测量和分析通过循环伏安法获得的记忆电流-电压关系, 以及短期可塑性和学习响应阶跃化电压脉冲列车。
Introduction
人们普遍认识到, 生物突触是大脑高效和巨大平行的原因, 因为它们能够以高度适应性的方式学习和处理信息。这种协调的功能产生于多个高度复杂的分子机制, 这些机制驱动短期和长期突触可塑性1、2、3、4、5。神经形态计算系统的目标是在接近大脑密度、复杂性和能量效率的水平上模拟突触功能, 这是下一代类似大脑的计算机所需要的 6,7,8. 然而, 使用传统的电子电路元件复制突触特征几乎是不可能的, 而是需要设计和制造能够适应传入信号和记忆的新硬件元件信息历史9。这些类型的突触启发硬件被称为 mem-tem-mecemtem-memtemtemt"9 、10、11 (内存元素的缩写), 根据 di ventra 等人的说法, 这些硬件是被动的,双终端设备, 其电阻、电容或电感可以根据外部刺激重新配置, 并且可以记住先前的状态11。为了达到接近大脑能量消耗的水平, 这些元素应该使用类似的材料和机制来实现突触可塑性12。
迄今为止, 双端记忆电阻器13,14,15主要是使用互补金属氧化物半导体 (cmos) 技术制造的, 其特点是开关电压高、噪声高。由于高功耗和低密度, 该技术不能很好地扩展。为了解决这些限制, 最近建造了多个有机和聚合物记忆电阻器。然而, 由于通过导电聚合物基体 16,17 进行耗时的离子扩散, 这些器件的开关动力学明显变慢。因此, 基于 cmos 的记忆装置和有机记忆装置模仿突触激发的功能的机制是高度现象学的, 只包含一些突触功能, 如尖峰定时依赖可塑性 (stdp)1 8日, 同时忽视了其他关键特征, 这些特征也在使大脑成为一台强大而高效的电脑方面发挥着至关重要的作用, 比如突触前、短期可塑性19日。
最近, 我们推出了一类新型的记忆装置12 , 其特点是在仿生脂质膜中加入了电压激活肽, 模拟了生物分子组成、膜结构和离子通道触发开关生物突触的机制20。 在这里, 我们描述了如何组装和电气询问这些双终端设备, 特别侧重于如何评估短期可塑性, 以便在在线学习应用程序12中实现。器件组装是基于液滴界面双层 (dib)21方法, 近年来被广泛用于研究模型膜21和膜结合离子通道22,23的生物物理学. 24, 并作为发展刺激反应材料的基石 25,26。我们详细描述了那些对神经形态应用感兴趣, 但在生物材料或膜生物学方面经验有限的人的膜组装和审讯过程。该协议还包括对特性描述过程的完整描述, 考虑到装置27的动态和可重新配置的电气特性, 该过程与组装过程同样重要。这里描述的程序和代表性的结果是基础, 为一类新的低成本、低功耗、基于脂质界面的软记忆元件和其他生物分子, 用于神经形态计算、自主结构和系统的应用,甚至是自适应脑机接口。
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Protocol
1. 一般说明和注意事项
- 选择合适的、未损坏的测量器/混合玻璃器皿 (烧瓶、烧杯等) 和其他实验室器具 (飞溅、铲子等) 使用。
- 小心处理玻璃器皿, 避免损坏, 并戴上乳胶或丁腈手套, 以避免污染玻璃制品与残留物从指尖, 并保护您的皮肤。
- 使用洗涤剂溶液和水彻底清洁所选择的玻璃制品, 用软瓶刷擦洗, 直到清洁, 所有残留物被去除。
- 用自来水彻底冲洗, 然后用去离子水冲洗。放置在晾衣架上, 以空气干燥。
-
可选:用异丙基清洗清洗的玻璃制品 (ipa, 99.5%)并将其置于真空下, 蒸发所有残留的 ipa, 以确保它们不含任何污染物 (~ 2小时)。从真空室中取出, 放置在干净的环境中。
注: 使用无绒毛擦拭玻璃器皿和实验室器具。购买和使用无菌小玻璃瓶和安全锁管进行材料制备和样品储存。有关玻璃器皿清洗和其他实验室标准作业程序的更多详细信息, 请参阅 jave 科学教育数据库28。
2. 水缓冲液的制备
- 配戴乳胶或丁腈手套, 选择合适的清洁玻璃容器, 制备50毫升的水缓冲液 (500 mm 氯化钠 (kcl), 10 mm 3-(N-morpholino) 丙磺酸 (mL), ph 7.0)。
- 使用数字、高精度的质量平衡和干净的铲子, 将1.86378 克 kcl 分配到干净的称重纸上, 然后添加到玻璃容器中。
注: kcl 和 mops 的数量应根据所需的体积和所需的最终浓度而有所不同。 - 称重 0.10463 g 的 mops, 并添加到玻璃容器中。然后, 将50毫升的 di 水直接加入玻璃容器和涡旋, 直到 kcl 和 mL 完全溶解。
- 在室温下储存缓冲液, 并在需要时使用。
注: 虽然缓冲区解决方案可以存储相对较长的时间, 但建议使用新准备的缓冲解决方案, 以获得更好和更一致的结果。
3. 脂质体的制备
注: 步骤3.1 仅适用于以冻干粉末的形式获得磷脂的情况, 因此, 如果磷脂是以氯仿购买的, 则可跳过。
- 在1毫升氯仿中溶解5毫克的 1, 2-二苯基-环甘油-甘油-3-磷胆碱 (dphpc) 或大脑总脂质提取物 (btle) 脂类在5毫升无菌玻璃小瓶中。
- 在轻轻旋转时, 在温和的干氮流下蒸发氯仿, 直到小瓶底部仍有脂膜。
- 将含有脂膜的小瓶置于真空下 10-12, 以便完全去除残留的氯仿。
- 从真空室取出小瓶, 加入步骤2中制备的水缓冲液10毫升, 使小瓶脂质膜再水分, 最终脂质浓度为 2 mg/ml。
- 冻结 (- 20°c), 并将脂质悬浮液完全解冻 6次, 以方便多层脂质体组装。
注: 让混合物在室温下解冻, 不要在加热的环境中解冻。 - 使用市售的挤出机, 通过强制通过0.1μm 的孔径轨道蚀刻膜强制完全的脂质悬浮液挤出脂质体溶液。立即连续下一次挤出悬浮液 11次, 得到适当的脂质单层形成所需的直径为 c..100 nm 的单形脂质体。将脂质体悬浮液存放在4°c, 并在准备后1周内使用。为简单起见, 请将生成的脂质体解决方案称为 "a"。
注: 对于 btle 脂质体的挤出, 研究人员鼓励研究人员将挤出机加热至40-50°c, 高于 btle 脂质 (~ 37°c)23、29的相变温度, 以使挤出变得更容易。在55°c的情况下, 将封闭悬浮液瓶放入浴超声器中, 直接制备 btle 脂质体悬浮液 (代替冻融和挤压) 约15分钟。
4. 阿拉米西霉素肽的重组
注: 本程序描述了在脂质体中 alamethicin 重组为1微米的最终浓度的过程。这种浓度足以诱发与先前公布的 12相似的 a 级电流。增加肽浓度会降低开关阈值, 增加施加电压29引起的电流振幅.
- 将丙胺肽溶解在乙醇中, 最终浓度为 2.5 mgml, 旋涡短暂混合良好, 并将库存溶液存放在冰柜 (- 20°c) 中。
注: 阿拉米太新肽通常以粉末形式购买。 - 在 1.5 ml 安全锁管中, 将99μl 溶液 "a" 与1μl 的 alamethicin 库存溶液混合, 以在脂质体悬浮液中达到13微米的最终丙二醇浓度。 漩涡混合得很好。将生成的肽脂质体溶液称为 "b"。
- 将117μl 溶液 "a" 与10μl 溶液 b 混合, 最终达到 1 mm 的醛氧西林浓度, 然后旋涡混合均匀。将生成的解决方案称为 "c"。
- 将溶液"b"和"c"存储在4°c, 并根据需要使用。
5. 琼脂糖凝胶的制备
- 使用数字、高精度质量平衡和干净的铲子, 在干净的称重纸上加入0.5 克琼脂糖粉。
- 转移称重琼脂糖到一个100毫升清洁玻璃烧杯, 并添加50毫升的 di 水琼脂糖。
注: 这将产生1% 琼脂糖凝胶溶液。 - 将一个干净的搅拌磁铁放在玻璃烧杯内, 并将烧杯放在搅拌的热板上。
- 搅拌时, 将混合物煮沸, 直到琼脂糖完全溶解。
- 从热板上取下烧杯, 让混合物冷却到室温。存放在4°c, 并在需要时使用。
- 在再次使用之前, 用热板或微波炉加热, 重新融化琼脂糖。
6. 油藏的制造
注: 下面描述的过程只是可以制造油藏的多种方法之一。我们鼓励读者根据可用的材料、加工能力和特定需求来设计和制造储罐。
- 使用带锯, 从一个更大的12毫米厚的丙烯酸片切割一个 12 x 12 x 12 毫米丙烯酸立方体。
- 在丙烯酸管中将直径为12毫米的孔磨成8-12 毫米的深度 (图 1a)。
7. 电极的制备
- 使用剪刀, 切割两片 (75 毫米) 的银线 (125 微米直径)。
- 使用开火打火机, 熔化每根银线的一端, 形成小的球形球 (直径约250微米)。
- 将球浸入漂白剂中 1-2小时, 形成银氯化银 (ag/agcl) 涂层。深灰色表示 ag/agcl 涂层已形成 (图 2a)。
- 从漂白剂中取出两根电线, 用 di 水彻底冲洗, 放在干净的无绒毛擦拭上。
- 将球的末端浸入熔融的琼脂糖凝胶中, 形成一层薄薄的凝胶。这种凝胶涂层有助于将水滴固定在油下的电线上。
- 使用玻璃切割机, 将10厘米长的、1/0.58 的 odsid mm 硼硅酸盐玻璃毛细管分成两个5厘米的毛细血管。
- 将其中一个玻璃毛细血管插入电极支架 (图 2b, c), 然后将其中一根 ag/agcl 电线送入玻璃毛细管 (图 2b)。将另一根 agscl 电线送入第二玻璃毛细管。
- 将第二个玻璃毛细管安装到玻璃微移液器支架上 (图 2e, f)。
8. 设置实验
- 将厚度为1毫米、25 x 75 毫米的玻璃滑块放置在倒置显微镜的舞台上 (图 1a)。
- 在玻璃滑梯中心分配几滴六烷油, 然后将储油层直接放在玻璃滑梯上的油上。
注: 在玻璃滑块和油层之间添加油用于匹配基板的折射率, 以提供更清晰、更清晰的图像。 - 在储油层中完全填充十六烷油。确保储集层位于物镜上方。
注: 也可使用其他疏水油。 - 将电极支架连接到电流放大器的顶部。机头必须安装在微机械手上 (图 1a), 以最大限度地减少电极长度和电气噪声。
- 将玻璃微移液器支架与第二根 ag/agcl 电线安装到另一个微机械手上 (图 1a)。
- 使用机械手, 放置电极, 使 ag/agcl 电线的琼脂糖涂层尖端完全淹没在类似的垂直平面上的油藏中。
- 将两个电极对齐, 并将它们分开几毫米 (图 1a, b)。
注: 添加液滴 (如步骤 13所述) 后, 必须将电线一直向下, 直到电极尖端接触到油库底部。这一步将确保电线不会振荡, 从而最大限度地减少测量电流的不必要波动。
9. 适当接地以减少电气噪音
- 通过将螺钉螺纹插入放置显微镜的防振工作台来创建地面总线(图 3a)。
注: 需要使用防震工作台, 以最大限度地减少来自周围的振动, 这可能会导致测量电流的意外波动。 - 使用导电线, 将螺钉连接到接地 (图 3a), 然后将显微镜阶段连接到地面总线。
- 将法拉第保持架放置在实验装置上, 以减少噪音, 然后将其与地面总线电连接 (图 3b)。
注: 始终建议避免不必要的接地环路, 因为它们可能会导致测量噪声水平的增加。
10. 反馈控制加热
- 机器的铝加热壳, 其中油库可以紧贴 29.
- 一定要在外壳底部留一个开口, 以便能够通过倒置显微镜通过外壳查看。
- 将 30 x 30 mm 电阻聚酰亚胺柔性加热元件置于铝壳下方。
- 将绝缘聚二甲基硅氧烷 (pdms) 晶片放置在加热器下方, 以减少向下的热量损失, 并保护显微镜阶段。
- 将热电偶插入油相中。确保热电偶不接触 ag/agcl 电线后, 将热电偶电线连接到热电偶数据采集板上, 并使用自定义编程软件记录温度。
注: 编写一个开关, 比例积分 (pi) 反馈温度控制, 以实现油温加热和被动冷却到所需的值。可根据要求向读者提供代码。
11. 软件和设备的设置
- 通过在计算机、显微镜、功能发生器、电流放大器和低噪声数据采集系统上供电, 准备数据采集软件。
注: 虽然可以使用任何电流传感设备, 但以下说明是专门针对《材料表》中列出的设备的。希望建立自己的电流放大器的研究人员可以参考 shlyonsky 等人。 - 在膜片钳电流放大器的前面板上, 将前面板显示和源测量模式拨号分别设置为 vhold/ihold 和 v-clamp。
- 在前面板上,将低通贝塞尔滤波器设置为 1 khz,将输出增益设置为0.5。
注: 选择较低的输出增益可记录较大的电流振幅, 同时增加增益牺牲测量范围, 以降低测量噪声。 - 将配置设置为全细胞β= 1。此值以后可能会切换到 0.1, 以便记录较大的振幅电流。
- 将所有其他控制拨号设置为零或处于中性位置。
- 双击桌面的图标, 初始化软件。
- 单击 "配置""数字化器"打开"数字化器" 对话框, 然后单击 "更改" 按钮。
- 在 "更改数字化器" 对话框中, 从"数字化器类型" 列表中选择相应的数字化器。
- 单击 "扫描" 按钮以检测数字化器。
- 单击"确定" 退出 "更改数字化器" 对话框, 然后单击"确定" 退出 "数字化器" 对话框。
- 点击图表 实验室板凳。
- 在实验室台的"输入信号" 选项卡中, 将比例因子设置为 0.0005 vp a。
注: 如果增益或β值发生更改, 则必须更新此值。
12. 移液器偏移
注: 下面描述的过程仅适用于材料表中提到的电流放大器。
- 使用微移液器, 将水脂溶液 "a" 的 200 nl 沉积在油下的每根 ag/agcl 电线的两端。
- 接触液滴, 并按放大器前面板上的zap按钮, 将液滴合并成一个跨越两个电极的卷。这应该会引起短路响应。
- 将源测量模式拨号设置为轨迹。
- 将前面板显示拨号更改为v轨迹。
- 转动管状偏移盘(顺时针或逆时针), 直到仪表读数为 0 mv 并稳定。
- 将源测量模式拨号返回到v-clamp , 将前面板显示刻度盘返回到vhold/hold.
13. 脂质 bilayer 的形成
- 通过将电极垂直移出油相来释放先前沉积的液滴。这将导致液滴从电极上掉落到油中。重新淹没电极并将其放置在油中。
- 使用微型移液器在每条电线上沉积 200 nl 的脂质溶液 "a"。
- 等待 3-5分钟, 以便在每个水/油界面上发生自发脂质单层组装。
注: 当脂质单层形成时, 水/油界面表面张力降低, 如果周围的油密度不够低 21, 可能会导致液滴下垂21。 - 降低电极 (和液滴), 直到两个电极的两端几乎没有接触到储油层的底部 (图 1b), 然后水平移动它们, 使液滴接触。
注: 脂质双层会自发变薄, 排除多余的油从接触液滴之间。通常, 此过程发生在1分钟内。
14. 生物分子记忆器的电特性
- 脂质双层形成
- 要记录与液滴之间电容增加相对应的脂质双层形成, 请使用连接到膜片钳外部输入的功能发生器 (图 4) 施加 10 hz、10 mv 的三角形波形电压放大 器。
注: 由于脂质膜的电容性, 所产生的电流响应应为正方形波形 (图 4)。在脂质双层形成过程中, 步骤 11.6, 研究人员应看到峰值到峰值电流振幅的增长, 并观察连接的液滴之间的视觉变化 (图 4)。
- 要记录与液滴之间电容增加相对应的脂质双层形成, 请使用连接到膜片钳外部输入的功能发生器 (图 4) 施加 10 hz、10 mv 的三角形波形电压放大 器。
- 电流电压测量
注: 生物分子记忆器被建模为并联的电阻器和电容器 12,21。因此, 器件的电流响应可以同时包含电阻和电容元件, 具体取决于施加电压的频率。为了研究器件的记忆特性, 并获得夹紧的流电压关系12, 可能需要从总电流中减去电容电流。下面的协议描述了此过程。- 使用功能发生器, 将电压波形 (三角形或正弦) 应用于用溶液 "a" 液滴组装的无丙胺脂膜。
- 记录多个频率的感应电流响应。
注: 在低于 10 mhz 的频率下, 电容电流被最小化。 - 通过在计算机上测量脂膜的直径, 或记录 10 hz, 10 mv 三角波产生的峰值至峰值电流振幅, 记录界面脂质双层的大小。电流振幅与膜电容成正比, 而膜电容又与膜的面积成正比。
- 取出不含 alamethicin 的液滴。
- 使用溶液 "c" 加入新的水滴, 形成脂质双层。
- 使用微机械手来调整液滴之间的接触, 使双层具有与先前形成的区域相似的面积 (直径或方波电流振幅)。
- 重复步骤14.2.1 和14.2.2。
- 从步进14.2.7 中记录的电流中减去步进14.2.2 中记录的电流。
- 绘制每个频率和波形的感应电流与施加电压, 以获得 "夹紧滞后" 的记忆响应。
- 脉冲实验
- 使用自定义编程软件和模拟电压源, 产生具有特定高振幅和低振幅、on 时间和 off 时间的电压脉冲。
注: 如果可以使用商业函数发生器生成电压脉冲, 则不需要这样做。 - 记录电流以响应应用的脉冲。
- 由于记忆器的电容性, 电容式尖峰将被记录。通过使用适当的通带应用低通滤波器来去除尖峰。
- 使用自定义编程软件和模拟电压源, 产生具有特定高振幅和低振幅、on 时间和 off 时间的电压脉冲。
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Representative Results
图 1显示了用于组装和表征生物分子记忆器的实验装置。图1b所示, 将电极的自由端降低到油层底部, 有助于最大限度地减少电极和液滴的振动, 从而导致测量电流和双层面积的变化, 特别是在情况下在那里加热油可以产生油的对流流动。图 2显示了组装 ag/agcl 电线、类毛细血管、电极和微型移液器支架的过程和结果。该装置位于正确接地的法拉第保持架 (图 3) 中, 以最大限度地减少电磁干扰。
本研究必须形成稳定、绝缘的脂质双层。在该协议中, 脂质单层聚集在浸入油中的水滴的油水界面上。液滴之间接触后, 多余的油被排除在外, 相对的脂质单层薄到5纳米厚的脂质双层。在双层电生理学中最常用的技术是电压夹, 控制双层的电压, 测量感应电流。 图 4a描绘了双层地层过程中由 10 mv、10hz 电压引起的电容方波电流。当振幅在启动双层变薄和随后变薄膜的径向膨胀时增加时, 波形保持正方形。利用方波电流的稳态振幅, 可以使用 dphpc 双层21的特定膜电容预定值计算脂质双层的标称面积. 此外, 通过测量用显微镜拍摄的图像中的双层直径, 可以直观地评估双层区域。对于准确的脂质双层面积计算, 读者应参考泰勒等.脂质双层的面积可以通过改变液滴的相对位置 21,31来调整。
当对无丙胺脂质双层施加电压偏置时, 电流响应将根据输入电压的频率而变化。在低频 (和 lt;10-50 mhz), 其中双层的电阻主导复杂的阻抗, 欧姆电流响应是可以忽略不计的, 因为标称膜电阻通常大于 10 gω。随着输入频率的增加, 膜电容对系统阻抗的贡献更大, 导致图5a 中的电流与电压图中显示的非零电流响应。当相同的输入电压波形 (150mv) 应用于由掺杂铝氨酸脂质膜组成的生物分子响应时, 当电压振幅超过临界插入阈值 (室温下 dphpc 膜的约 100 mv) 时,生活在脂质双层表面的醛氧西林肽插入膜并聚集形成导电毛孔。离子通道的阈值相关的形成会导致非线性宏观电流响应, 在电压高于插入阈值的情况下, 电流呈指数级增长 (图 5b)。虽然众所周知, 轴对称肽只有在足够正的电压下才能形成整流离子通道, 但这些电流响应在这两个极性上的对称性质是由于不同的多肽种群的插入和聚集, 每个。膜的对立面。根据施加电压的频率, 感应电流响应也可能包含电容电流的贡献。因此, 必须从图 5a中显示的总电流中减去图5a 中的电容电流, 才能获得图 5ad 中显示的固定夹紧滞后电流电压响应.
图 6显示了由电压脉冲序列 (130 mv (high)、20 mv (low)、100毫秒 (on)、20 ms (off)) 引起的生物分子记忆电阻器的动态开关响应。选择 off 电压为 20 mv, 以区分器件返回到绝缘状态, 因为 alamethicin 通道使双层离开, 而不是在零电压输入下简单消失的电流。连续电压脉冲期间的正态电流累积增加代表了配对脉冲的便利性, 这种可塑性是挥发性生物分子记忆器能够显示出 12的可塑性。
图 1:实验设置和主要部件.(a) 生物分子记忆器的组装和表征标准工作站包括倒置显微镜、3轴微机械手、数码相机、隔振台、电极支架、玻璃微移液器、电流放大器、功能发生器和油库。如步骤11-13 中所述, 设置在显微镜的舞台上进行组装。(b) 一张放大的装置照片, 显示接触油层底部的 ag/agcl 电线的尖端。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:电极制备程序.照片显示: (a) 浸泡在漂白剂中的银丝;(b) 电极座;(c) 连接到电极支架的5厘米长的玻璃毛细管;(d) 通过玻璃毛细管输送的 ag/agcl 电极;(e) 玻璃微移液器支架;和 (f) 完全组装的电极和支架。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:接地程序.照片显示: (a) 螺杆螺纹插入隔振台表面, 在连接到地面时产生地面总线;(b) 覆盖油库和电极装置的实验室制作的法拉第笼, 以保护测量不受电磁干扰。保持架和显微镜阶段都通过 i 和 ii 电缆与地面总线捆绑在一起。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:实时电流测量显示初始双层变薄和区域增长.(a) 在脂涂层液滴之间自发层形成时对三角形波形电压的电流 (顶部)。测量电流的大小与接口的电容成正比, 因此也与双层的面积成正比。通过改变两个带滴的电极之间的距离, 可以改变接口的面积。(b) 通过倒置显微镜获得的图像显示了典型的膜基生物分子记忆器的底部视图和尺寸。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5:电流电压关系和挤压滞后.(a) 不含丙胺的 dphpc 脂质双层的电流电压响应。纯脂膜具有很高的绝缘性 (~ 10 gω), 这解释了 0.017 hz 的低欧姆电流响应, 在这种频率下, 阻抗以膜电阻为主。在较高的频率下, 膜电容对接口总阻抗的贡献更大, 从而产生非零诱导电容电流。(b) 含有 alamethicin 肽的两个液滴之间形成的脂质双层的动态电流-电压关系 (用三角输入波获得)。(c) 装置的记忆性、夹紧的迟滞电流响应是通过从b中显示的总电流中减去显示在a中的电容电流来获得的。(d) 缩小, 以突出总电流和记忆电流之间的差异。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6:生物分子记忆器对矩形电压脉冲和塑性的响应.尽管在每次 off 时间内间歇性地恢复绝缘状态, 但该器件在 on 时间内对随后的电压脉冲做出响应, 电导率增加。从脉冲到脉冲的电流增加表明, 器件的瞬时电导率是当前刺激和先前刺激的函数, 类似于生物突触中的短期可塑性。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
本文提出了一种基于离子通道掺杂合成生物膜在油中两滴水之间形成的生物分子记忆器的组装和表征方案。设计和研究了软物质双端子器件: 1) 克服了与固态技术相关的限制, 如高噪声、高能耗、高开关电压, 2) 更密切地模仿了组合、结构, 生物突触的切换机制, 3) 探索固体装置不表现出的生物突触可塑性的机制和特征。
液滴界面双层技术21, 代表了目前技术的基石 12, 是一种简单的模块化方法的膜组装, 已被广泛用于研究膜生物物理学21,蛋白质22, 离子通道29, 和其他生物分子32。它为精确控制和查询模型膜提供了具体的优势, 并代表了刺激响应和自主材料26的构建块。提出了多种组装液滴界面双层的方法, 包括作为生物分子记忆器开发和表征的主要方法的吊滴21法。尽管这种膜组装技术在以前的研究中得到了应用, 但在这里我们提出了一个完整的协议, 允许研究人员在自己的实验室中再现和研究记忆液滴界面双层。该协议是专门以一种方式编写的, 目的是让非膜生物学领域的研究人员 (如神经形态社区) 了解和重新创建这些过程。
在最简单的形式中, 我们在本文中描述的评估生物膜记忆功能的协议可以通过基本的实验室设备 (如功能发生器、显微镜和电流测量系统) 进行复制。所组装的器件与电阻器 (~ 10gω) 和并联的电容器电等效。在存在能够在膜中形成电压依赖性孔的肽 (如 alamethicin) 的情况下, 膜电阻显著下降, 并且可以检测到电阻电流以响应输入电压信号 (dc 或 ac)。然而, 该器件的大膜电阻和频率相关的电阻率意味着: 1) 感应电流小 (pa-na), 并受到电磁干扰;2) 必须注意准确地诱导和测量与电容膜响应分离的所需的记忆特性。为了响应交流电压, 并根据信号的频率, 记录的电流将包含电容和电阻元件。要实现夹紧的滞后, 这是记忆装置的签名, 必须遵循步骤14中描述的协议。悬挂的电线很容易受到振动的影响, 这可能会导致人工制品的事实反应, 如振动错误地归因于设备的实际动力学。将电线定位在油藏底部可以改善这种行为。
生物分子记忆器以其目前的结构和设计模拟了发生在突触端子的短期突触可塑性。它还模仿了一些机制, 导致突触前配对脉冲促进在大脑中由于在突触前神经元的神经递质囊泡的积累和耗尽。这种组合突触模拟的方法使负责多种短期可塑性的仿生过程的研究和验证, 以及其他技术无法优化的模块化和可扩展性, 33。通过修改膜组合物、纳入膜中的离子通道类型, 甚至是构成每个双端的连接液滴和界面膜的数量, 都可以发现不可预见的功能装置。例如, 我们最近通过将生物分子记忆器与固态神经元34连接, 展示了它的在线学习能力。
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Disclosures
这份手稿是由 ut-batellle, llc 根据合同号撰写的。de-ac0500or22725 与美国能源部合作。美国政府保留并由出版商通过接受该文章供出版, 承认美国政府保留了非排他性的、实收的、不可撤销的、世界性的许可, 以出版或复制已公布的这份手稿, 或允许其他人这样做, 为美国政府的目的。
Acknowledgments
国家科学基金会赠款 nsf eccs-1631472 提供了财政支助。对 g. j. t.、c. d. s.、a. b. 和 c. p. c. 的研究部分是由美国能源部的 UT-Battelle, llc 管理的橡树岭国家实验室实验室指导研究和发展方案赞助的。这项研究的一部分是在纳米酶材料科学中心进行的, 该中心是 doe 科学用户设施办公室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P/850356C | Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Agarose (0.5g Agarose Tablets) | Benchmark | A2501 | You can either use the powder form or the tablets |
| Alamethicin | AG Scientific | A-1286 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME204TE/00 | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Brain Total Lipid Extracts (Porcine) | Avanti Polar Lipids | 131101 | |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000 | This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block |
| Freezer (-20 °C) | VWR International | SCUCBI0420AD | |
| Glassware | VWR International | - | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Nitrogen (N2) Gas | Airgas | UN1066 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Parafilm | PM999 | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Precleaned Microscope Sildes | Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Refrigirator (4 °C) | VWR International | SCUCFS-0504G | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Stirring Hot Plate | Thermo Scientific | SP131325 | |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 |
References
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