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Bioengineering

Assemblaggio e caratterizzazione biomolecolare Memristors costituito da membrane lipidiche drogato con scanalatura dello ione

Published: March 9, 2019 doi: 10.3791/58998
Automatic Translation
1,2, 2,3, 4, 5, 5, 5, 6, 7, 2, 2,3,7
1Joint Institute for Biological Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 2Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee, 3Bredesen Center for Interdisciplinary Research, University of Tennessee, 4Department of Biosystems and Agriculture Engineering, University of Kentucky, 5Department of Electrical Engineering and Computer Science, University of Tennessee, 6Computer Science and Mathematics Division, Oak Ridge National Laboratory, 7Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Morbido, bassa potenza, biomolecolari memristors sfruttare simile composizione, struttura e meccanismi di bio-sinapsi di commutazione. Presentato qui è un protocollo da assemblare e caratterizzazione biomolecolare memristors ottenuto da isolante lipidici formate tra le goccioline di acqua in olio. L'incorporazione di tensione-attivato alameticina risultati di peptidi in memristive conduttanza ionica attraverso la membrana.

Abstract

La capacità di ricreare la funzionalità sinaptica in elementi del circuito sintetico è essenziale per focalizzeranno informatica sistemi che cercano di emulare le competenze cognitive del cervello con densità ed efficienza paragonabile. Ad oggi, basata sul silicio transistori con tre terminali e due terminali memristors sono stati ampiamente utilizzati nei circuiti di neuromorphic, in gran parte dovuto la loro capacità di co-localizzare la memoria e l'elaborazione delle informazioni. Eppure questi dispositivi non possono raggiungere l'interconnettività e la complessità del cervello perché sono affamati di potere, non riescono a imitare chiave funzionalità sinaptica e soffrono di rumore elevati e alte tensioni di comando. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato e caratterizzato un memristor biomolecolari che simula la composizione, struttura e caratteristiche di commutazione delle sinapsi biologiche. Qui, descriviamo il processo di assemblaggio e caratterizzazione biomolecolare memristors costituito da un doppio strato di 5 nm di spessore lipidico formano tra le goccioline di acqua del lipido-funzionalizzati in olio e drogato con peptidi alameticina tensione-attivato. Mentre simili protocolli di assemblaggio sono stati utilizzati per indagare le proprietà biofisiche delle membrane lipidiche gocciolina-sostenuto e canali ionici di membrana-limita, in questo articolo si concentra sulle modifiche chiave del metodo gocciolina interfaccia doppio strato essenziale per ottenere prestazioni coerenti memristor. In particolare, descriviamo il processo di preparazione dei liposomi e l'incorporazione dei peptidi alameticina in membrane bilayer del lipido e le concentrazioni adeguate di ciascun costituente, nonché il loro impatto sulla risposta globale della memristors. Abbiamo inoltre dettagliatamente il processo di caratterizzazione di memristors biomolecolari, compresa la misurazione e analisi delle relazioni di tensione-corrente memristive ottenuta mediante voltammetria ciclica, come pure la plasticità a breve termine e l'apprendimento graduale in risposta a treni di impulsi di tensione.

Introduction

È ampiamente riconosciuto che le sinapsi biologiche sono responsabili per l'elevata efficienza ed enorme parallelismo del cervello dovuto la loro capacità di imparare ed elaborare le informazioni in modi altamente adattabili. Questa funzionalità coordinata emerge da multipli, altamente complessi meccanismi molecolari che guidano entrambi plasticità sinaptica a breve termine e a lungo termine1,2,3,4,5. Sistemi di calcolo focalizzeranno mirano a emulare le funzionalità sinaptiche a livelli prossimi alla densità, complessità e l'efficienza energetica del cervello, che sono necessari per la prossima generazione di computer cervello-come6,7 , 8. Tuttavia, riproduce la funzionalità sinaptica utilizzando elementi del tradizionale circuito elettronico è praticamente impossibile9, invece che richiedono la progettazione e la fabbricazione di nuovi elementi di hardware che può adattarsi ai segnali in ingresso e ricordare informazioni storie9. Questi tipi di sinapsi-ispirato hardware sono conosciuti come mem-elements9,10,11 (elementi di abbreviazione di memoria), che, secondo Di Ventra et al.9,11, sono passivo, due terminali dispositivi cui resistenza, capacitanza o induttanza possa essere riconfigurato in risposta agli stimoli esterni, e che può ricordare stati precedenti11. Per raggiungere livelli di consumo di energia si avvicina a quelli nel cervello, questi elementi dovrebbero impiegare materiali e meccanismi di plasticità sinaptica12simili.

Fin qui, due terminali memristors13,14,15 principalmente sono state costruite utilizzando tecnologia di (CMOS) metallo-ossido-semiconduttore complementare, caratterizzata da tensioni di commutazione ad alta e alta rumore. Questa tecnologia non si adatta bene a causa di alto consumo energetico e bassa densità. Per risolvere queste limitazioni, più organici e polimerici memristors sono state costruite recentemente. Tuttavia, questi dispositivi presentano significativamente più lento commutazione dinamica a causa della diffusione di ioni richiede molto tempo attraverso un polimero conduttivo matrice16,17. Di conseguenza, i meccanismi con cui entrambi i dispositivi basati su CMOS e organici memristive emulano sinapsi-ispirato funzionalità sono altamente fenomenologici, che comprende solo alcune funzionalità sinaptica come plasticità dipendente Timing (STDP) Spike per il 18, mentre con vista altro tasto funzioni che svolgono anche un ruolo essenziale nel rendere il cervello un computer potente ed efficiente, come plasticità a breve termine, pre-sinaptica19.

Recentemente, abbiamo introdotto una nuova classe di memristive dispositivi12 con peptidi attivati tensione incorporati nelle membrane lipidiche biomimetici che simula la composizione biomolecolare, struttura della membrana e ione canale attivato commutazione meccanismi biologici sinapsi20.  Qui, descriviamo come assemblare ed elettricamente interrogare questi dispositivi di due terminali, con focus specifico su come valutare la plasticità a breve termine per l'attuazione nella linea di apprendimento applicazioni12. Montaggio del dispositivo si basa sul metodo della gocciolina interfaccia doppio strato (DIB)21 , che è stato usato estesamente negli ultimi anni per studiare la biofisica delle membrane modello21 e membrana-limitano agli ioni canali22,23, 24e come blocchetti di costruzione per lo sviluppo di materiali stimoli-sensible a reagire25,26. Descriviamo il processo di assemblaggio e interrogatorio di membrana in dettaglio per coloro che sono interessati nelle applicazioni focalizzeranno ma hanno limitato l'esperienza in biomateriali o membrana biologia. Il protocollo comprende anche una descrizione completa della procedura di caratterizzazione, che è importante quanto il processo di assemblaggio, dato il dinamica e riconfigurabile proprietà elettriche del dispositivo27. La procedura e rappresentante risultati descritti qui sono fondamenti per una nuova classe di basso costo, basso consumo, mem-elementi morbidi basati su interfacce del lipido e altre biomolecole per le applicazioni in focalizzeranno computing, strutture autonome e sistemi, e anche interfacce cervello-computer adattivo.

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Protocol

1. precauzioni e istruzioni generali

  1. Selezionare adatto, intatto di misurazione/miscelazione cristalleria (beute, bicchieri, ecc.) e altri articoli da laboratorio (spatole, cucchiai, ecc.) per l'uso.
  2. Gestire la cristalleria con attenzione per evitare di danneggiare e indossare guanti in lattice o nitrile per evitare di contaminare la cristalleria/labware con residui dalla punta delle dita e per proteggere la pelle.
  3. Selezionate cristalleria/labware pulito accuratamente con acqua e soluzione detergente di lavaggio con un pennello morbido bottiglia fino a quando è pulito e tutti i residui vengono rimossi.
  4. Sciacquare abbondantemente con acqua di rubinetto e poi con acqua deionizzata (DI). Posto su stendino per aria a secco.
  5. Opzionale: Sciacquare la cristalleria/labware puliti con isopropilico (IPA, 99,5%) e posto sotto vuoto per evaporare tutti IPA residua per assicurarsi che siano esenti da eventuali contaminanti (~ 2 h). Rimuovere dalla camera a vuoto e posto in ambiente pulito.
    Nota: Utilizzare salviette panno per pulire la vetreria di laboratorio. Acquistare e utilizzare fiale di vetro sterili e sicuro-blocco tubi per conservazione di preparazione e dei campioni di materiali. Per maggiori dettagli su cristalleria di pulizia e altre procedure operative standard di laboratorio, rimanda al Giove Science Education Database28.

2. preparazione della soluzione tampone acquoso

  1. Indossando guanti di lattice o nitrile, selezionare un contenitore di vetro pulito e adeguato per preparare 50 mL di tampone acquoso (500 mM di cloruro di sodio (KCl), 10 mM 3-(N-morfolino) acido propansulfonico (MOPS), pH 7.0).
  2. Con un bilancio di massa digitale di alta precisione e una spatola, dispensare 1,86378 g di KCl sulla carta pesatura pulita e quindi aggiungere il contenitore di vetro.
    Nota: Le quantità di KCl e MOPS dovrebbero variare a seconda del volume desiderato e voluto concentrazioni finali.
  3. Pesare 0,10463 g di MOPS e aggiungere al contenitore di vetro. Quindi, aggiungere 50 mL di acqua deionizzata al contenitore di vetro e vortice accuratamente fino al KCl e MOPS non sia completamente disciolto.
  4. Conservare la soluzione tampone a temperatura ambiente e utilizzare quando necessario.
    Nota: Mentre soluzioni tampone possono essere conservati per periodi di tempo relativamente lunghi, si consiglia di utilizzare soluzioni tampone preparata per risultati migliori e più coerenti.

3. preparazione dei liposomi

Nota: Passaggio 3.1 si applica solo se i fosfolipidi vengono acquisiti come polveri liofilizzate e di conseguenza, possono essere ignorati se i fosfolipidi vengono acquistati in cloroformio.

  1. Sciogliere 5 mg di 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) o lipidi del cervello totale lipidi estratti (bottiglia) in 1 mL di cloroformio in un flaconcino di vetro sterili da 5 mL.
  2. Mentre delicatamente vorticoso, evaporare il cloroformio sotto una leggera corrente di azoto secco fino a quando un film lipidico rimane sul fondo del flaconcino.
  3. Collocare il flaconcino contenente il film lipidico sotto vuoto per 10-12 h consentire la rimozione completa di cloroformio residua.
  4. Estrarre la cuvetta dal camera del vuoto e reidratare il film lipidico aggiungendo 10 mL di soluzione tampone acquoso preparata nel passaggio 2 per ottenere una concentrazione finale del lipido di 2 mg/mL.
  5. (-20 °C) di congelare e scongelare completamente la sospensione del lipido sei volte per facilitare l'assemblaggio dei liposomi multilamellari.
    Nota: Lasciare che la miscela scongelare a temperatura ambiente, mai in un ambiente riscaldato.
  6. Utilizzando un estrusore commercialmente disponibile, estrudere la soluzione liposoma forzando la sospensione lipidica completa attraverso una membrana di pista-inciso diametro 0,1 μm poro. Estrudere la sospensione 11 volte in successione immediata per ottenere liposomi unilamellari con diametro di c.a. 100 nm necessarie per una formazione adeguata dei lipidi dello strato monomolecolare. Conservare la sospensione di liposomi a 4 °C e consumare entro 1 settimana di preparazione. Per semplicità, consultare la soluzione risultante di liposomi come "A".
    Nota: Per l'estrusione di liposomi a bottiglia, il ricercatore è incoraggiato a scaldare l'estrusore a 45-50 °C, superiore alla transizione di fase temperatura dei lipidi a bottiglia (~ 37 °C)23,29, per consentire più facile estrusione. Idratato liposoma a bottiglia sospensioni possono anche essere preparate direttamente (al posto di gelo-disgelo ed estrusione) ponendo il flacone di sospensione chiusa in un sonicatore bagno a 55 °C per circa 15 min.

4. la ricostituzione di alameticina peptidi

Nota: Questa procedura viene descritto il processo di alameticina ricostituzione in liposomi ad una concentrazione finale di 1 μM. Questa concentrazione è sufficiente per indurre le correnti nA-livello sono simili a quelli precedentemente pubblicati12. Aumentando la concentrazione di peptide riduce la soglia di commutazione e aumentare le ampiezze delle correnti indotte dalla tensione applicata29.

  1. Sciogliere alameticina peptidi in etanolo ad una concentrazione finale di 2,5 mg/mL, vortice brevemente per mescolare bene e conservare la soluzione stock in congelatore (-20 °C).
    Nota: Alameticina peptidi sono comprati solitamente in forma di polvere.
  2. In un tubo di sicurezza bloccaggio 1,5 mL, mescolare 99 μL di soluzione "A" con 1 μL di soluzione di riserva alameticina per ottenere una concentrazione finale alameticina 13 μm la sospensione del liposoma.  Vortice per mescolare bene. Fare riferimento alla soluzione del peptide-liposoma risultante come "B".
  3. 117 di mix μL di soluzione "A" con 10 μL di soluzione B per ottenere una concentrazione finale alameticina di 1 mM e poi vortice per mescolare bene. Fare riferimento alla soluzione risultante come "C".
  4. Memorizzare le soluzioni "B" e "" C a 4 °C e uso, se necessario.

5. preparazione del gel dell'agarosi

  1. Con un bilancio di massa digitale di alta precisione e una spatola, aggiungere 0,5 g di agarosio in polvere per una pesatura carta pulita.
  2. Trasferimento pesava agarosio in un recipiente di vetro pulito 100 mL e aggiungere 50 mL di acqua DI agarosio.
    Nota: Questo consente di ottenere una soluzione di gel di agarosio 1% (wt/vol).
  3. Mettere un magnete agitazione pulito dentro il bicchiere di vetro e porre il becher su un piatto caldo mescolando.
  4. Continuando a mescolare, portare la miscela a ebollizione fino alla completa dissoluzione dell'agarosi.
  5. Rimuovere il recipiente dalla piastra calda a lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Conservare a 4 °C e utilizzare quando necessario.
  6. Prima di utilizzare nuovamente, rifondere l'agarosio di riscaldamento con una piastra riscaldante o forno a microonde.

6. fabbricazione del serbatoio olio

Nota: La procedura descritta di seguito è solo uno dei molti modi che un serbatoio di olio possa essere fabbricato. Il lettore è incoraggiato a progettare e fabbricare un serbatoio basato su materiali disponibili, funzionalità e specifiche esigenze di lavorazione.

  1. Utilizzando una sega a nastro, tagliare un 12 x 12 x 12 cubo acrilico mm da un foglio di acrilico spessore 12 mm più grande.
  2. Laminatoio di un foro di diametro di 12 mm per una profondità di 8-12 mm di tubo acrilico (Figura 1a).

7. preparazione di elettrodi

  1. Utilizzando le forbici, tagliare due pezzi (75 mm) di fili d'argento (125 μm di diametro).
  2. Utilizzando una fiamma accendino, sciogliere un'estremità di ogni filo d'argento per formare piccole palline sferiche (circa 250 μm di diametro).
  3. Immergere il pallone termina in candeggina per 1-2 h creare un rivestimento d'argento cloruro di argento (Ag/AgCl). Un colore grigio scuro indica che il rivestimento di Ag/AgCl ha formato (Figura 2a).
  4. Rimuovere entrambi i fili da candeggina, risciacquare accuratamente con acqua deionizzata e mettere da parte su un panno pulito privo di lanugine.
  5. Immergere le estremità di palla in gel di agarosio fuso per creare uno strato sottile. Questo rivestimento in gel consente di ancorare le goccioline acquose su fili sotto olio.
  6. Utilizzando un tagliavetro, dividere una lunga 10 cm, 1/0,58 OD/ID mm in vetro borosilicato capillare in due capillari di 5 cm.
  7. Inserire uno dei capillari di vetro in un portaelettrodo (Figura 2b, c) e quindi alimentare uno del filo Ag/AgCl nel vaso capillare di vetro (figura 2d). Nutrire l'altro filo di Ag/AgCl nel secondo bicchiere capillare.
  8. Montare la seconda capillare di vetro a un supporto di una micropipetta di vetro (Figura 2e, f).

8. impostare l'esperimento

  1. Collocare una lastra di vetro 1 mm 25 x 75 mm di spessore, sul palco di un microscopio invertito (Figura 1a).
  2. Dispensare alcune gocce di olio di esadecano al centro del vetrino e quindi posizionare il serbatoio dell'olio direttamente sull'olio sul vetrino.
    Nota: L'aggiunta di olio tra il serbatoio di vetro scorrevole e olio viene utilizzato per abbinare l'indice di rifrazione del substrato per fornire immagini nitide e dettagliate.
  3. Riempire completamente il serbatoio dell'olio con olio esadecano. Assicurarsi che il serbatoio è posizionato sopra la lente dell'obiettivo.
    Nota: Altri oli idrofobici possono essere usati pure.
  4. Collegare il pinza porta elettrodo per l'headstage di un amplificatore di corrente. L'headstage deve essere montato su un micromanipolatore (Figura 1a) per ridurre al minimo la lunghezza dell'elettrodo e rumore elettrico.
  5. Montare il supporto di una micropipetta di vetro con il secondo cavo di Ag/AgCl su un altro micromanipolatore (Figura 1a).
  6. Utilizzando i manipolatori, posizione gli elettrodi tale che l'agarosio rivestito suggerimenti dei fili Ag/AgCl sono completamente sommerse nel serbatoio dell'olio a un simile piano verticale.
  7. Allineare i due elettrodi e separarli da pochi millimetri (Figura 1a, b).
    Nota: Dopo aver aggiunto le goccioline (descritte nel passo 13), i cavi devono essere portati fino in fondo fino a quando le punte dell'elettrodo sono toccare il fondo del serbatoio dell'olio. Questo passaggio farà in modo che i fili non oscillano e così, ridurrà al minimo inutili fluttuazioni della corrente da misurare.

9. corretta messa a terra per ridurre il rumore elettrico

  1. Creare un bus di terra con filettatura di una vite nella tabella anti-vibrazione sul quale il microscopio è collocato (Figura 3a).
    Nota: Utilizzando una tabella di anti-vibrazione è necessaria per minimizzare le vibrazioni dall'ambiente circostante, che potrebbero causare indesiderate fluttuazioni di corrente misurata.
  2. Utilizzando un filo conduttore, collegare la vite a una terra (Figura 3a) e quindi collegare il tavolino del microscopio al bus di terra.
  3. Posizionare una gabbia di Faraday sull'apparato sperimentale per ridurre rumore e poi collegarlo elettricamente al bus di terra (Figura 3b).
    Nota: Si consiglia sempre di evitare inutili loop di terra, come si possono portare ad un aumento nel livello di rumore di misura.

10. feedback controllato riscaldamento

  1. Un alluminio shell in cui il serbatoio di olio può adattarsi comodamente29di riscaldamento della macchina.
  2. Assicurarsi di lasciare un'apertura nella parte inferiore del guscio per essere in grado di vedere attraverso il guscio tramite il microscopio invertito.
  3. Inserire un elemento di riscaldamento flessibili di polyimide resistivo 30x30 mm sotto il guscio di alluminio.
  4. Posizionare un wafer di polidimetilsilossano (PDMS) isolante sotto la stufa per ridurre le dispersioni termiche verso il basso e proteggere il tavolino del microscopio.
  5. Inserire una termocoppia in fase oleosa. Dopo assicurandosi che la termocoppia non toccare o legare di Ag/AgCl, collegare i fili della termocoppia per una scheda di acquisizione dati di termocoppia e temperatura record utilizzando il software di programmazione personalizzato.
    Nota: Scrivere un On-Off, proporzionale integrale (PI) feedback controllo della temperatura per attivare il riscaldamento e raffreddamento passivo della temperatura dell'olio un valore desiderato. I codici possono essere forniti ai lettori su richiesta.

11. impostazione del Software e attrezzature

  1. Preparare il software di acquisizione dati di accensione del computer, microscopio, generatore di funzioni, amplificatore di corrente e sistemi di acquisizione dati a basso rumore.
    Nota: Mentre qualsiasi apparecchiatura di rilevamento corrente può essere utilizzato, le seguenti istruzioni sono specificamente per quello elencato nella Tabella materiali. I ricercatori che desiderano costruire il proprio amplificatore di corrente possono riferirsi a Shlyonsky et al.30.
  2. Sul pannello frontale del morsetto patch amplificatore di corrente, impostare il display del pannello anteriore e fonte-misurazione modalità quadranti VHOLD/IHOLD e V-CLAMP, rispettivamente.
  3. Sul pannello frontale, impostare il passa-basso Filtro di Bessel a 1 kHz e Guadagno di Output a 0,5.
    Nota: Scegliendo un guadagno di uscita bassa consente la registrazione più grandi ampiezze superiori attuali, mentre aumentando la gamma di misurazione guadagno sacrifici per ridurre il rumore di misura.
  4. Impostare la configurazione per intera cellula β = 1. Questo valore può essere più successivamente commutato a 0.1 per consentire la registrazione di correnti elevate di ampiezza.
  5. Impostare tutti gli altri quadranti di controllo a zero o in posizione neutra.
  6. Inizializzare il software facendo doppio clic sull'icona del desktop.
  7. Fare clic su configurazione di | Convertitore analogico/digitale per aprire la finestra di dialogo di digitalizzatore e quindi scegliere il pulsante Cambia .
  8. Nella finestra di dialogo Modifica digitalizzatore , selezionare il digitalizzatore appropriato dall'elenco Tipo di digitalizzatore .
  9. Fare clic sul pulsante Scan per rilevare il digitalizzatore.
  10. Fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo del Digitalizzatore di cambiamento e quindi fare clic su OK per chiudere la finestra di dialogo del digitalizzatore .
  11. Fare clic su ConFigura | Banco di laboratorio.
  12. Nella scheda Input segnali del Banco di laboratorio, impostare il fattore di scala per 0,0005 V/PA.
    Nota: Questo valore deve essere aggiornato se vengono modificati i valori di guadagno o β.

12. pipetta Offset

Nota: La procedura descritta di seguito si applica solo a amplificatore di corrente menzionati nella Tabella materiali.

  1. Usando una micropipetta, deposita 200 nL della soluzione acquosa del lipido "A" sulle estremità di ogni filo di Ag/AgCl sott'olio.
  2. Portare le goccioline in contatto e premere il tasto di ZAP sul pannello frontale dell'amplificatore a fondersi le goccioline in un unico volume che attraversa entrambi gli elettrodi. Ciò dovrebbe indurre una risposta di cortocircuito.
  3. Selettore di modalità di impostare origine-misurazione su pista.
  4. Modificare il pannello frontale display quadrante Vtraccia.
  5. Disabilita il PIPETTATRICI OFFSET comporre (in senso orario o antiorario) fino al contatore letture 0 mV ed è stabile.
  6. Restituire il selettore di modalità di origine-misurazione a V-CLAMP e pannello frontale Visualizza quadrante a V /Iteneretenere.

13. formazione di Bilayer del lipido

  1. Rilasciare le goccioline che precedentemente sono state depositate spostando gli elettrodi verticalmente fuori fase oleosa. In questo modo le goccioline cadere dagli elettrodi nell'olio. Ri-immergere e posizionare gli elettrodi in olio.
  2. Utilizzare la micropipetta per deposito 200 nL di soluzione lipidica "A" su ciascuno dei fili.
  3. Attendere 3-5 min consentire montaggio monostrato lipidico spontanea si verificano a ogni interfaccia acqua/olio.
    Nota: come le forme di monostrato lipidico, le diminuzioni di tensione superficiale interfaccia olio/acqua/lipidica, che possono causare le goccioline a incurvarsi se l'olio circostante è sufficientemente meno denso21.
  4. Abbassare gli elettrodi (e goccioline) fino a quando le estremità di entrambi gli elettrodi a malapena a toccare il fondo del serbatoio dell'olio (Figura 1b) e quindi spostarli orizzontalmente per portare le goccioline in contatto.
    Nota: Il doppio strato lipidico spontaneamente sarà sottile escludendo l'olio in eccesso tra il contatto con goccioline. In genere, questo processo si verifica entro 1 min.

14. elettrici caratterizzazione del Memristor biomolecolari

  1. Formazione di Bilayer del lipido
    1. Per registrare la formazione di bilayer del lipido, che corrisponde a un aumento della capacitanza elettrica tra gocce, applicare un 10 Hz, tensione di forma d'onda triangolare mV 10 utilizzando un generatore di funzione (Figura 4) collegato all'ingresso esterno del morsetto patch amplificatore.
      Nota: A causa della natura capacitiva della membrana del lipido, la risposta corrente risultante dovrebbe essere una forma d'onda quadra (Figura 4). Durante la formazione di bilayer del lipido, passo 11.6, il ricercatore dovrebbe vedere una crescita dell'ampiezza di corrente di picco-picco e anche osservare un cambiamento visivo tra gocce collegati (Figura 4).
  2. Misure di corrente-tensione
    Nota: Il memristor biomolecolari è modellato come un resistore e un condensatore in parallelo12,21. Di conseguenza, la risposta corrente del dispositivo può contenere componenti sia resistive e capacitive a seconda della frequenza della tensione applicata. Per studiare la natura memristive del dispositivo e per ottenere il rapporto di corrente-tensione con isteresi pizzicato12, può essere necessario sottrarre corrente capacitiva dalla corrente totale. Il protocollo qui sotto descrive questa procedura.
    1. Utilizzando un generatore di funzione, applicare una forma d'onda di tensione (triangolare o sinusoidale) ad una membrana lipidica privo di alameticina assemblata con le goccioline di soluzione "A".
    2. Registrare la risposta corrente indotta attraverso frequenze multiple.
      Nota: Correnti Capacitive sono ridotti al minimo a frequenze inferiori a 10 mHz.
    3. Registrare le dimensioni del bilayer del lipido interfacciale misurando il diametro della membrana lipidica sul computer, o registrando l'ampiezza di picco-picco corrente risultante da 10 Hz, onda triangolare di 10 mV. L'ampiezza corrente è proporzionale alla capacità di membrana, che a sua volta è proporzionale all'area della membrana.
    4. Rimuovere le goccioline che non contengono nessun alameticina.
    5. Aggiungere nuove goccioline acquose utilizzando la soluzione "C" e formare un doppio strato lipidico.
    6. Utilizzare i micromanipolatori per regolare contatto tra goccioline in modo che il bilayer ha un'area simile (diametro o onda quadra di ampiezza corrente) come quella formata all'inizio.
    7. Ripetere i passaggi 14.2.1 e 14.2.2.
    8. Sottrarre corrente registrato nel passaggio 14.2.2 da corrente registrato nel passaggio 14.2.7.
    9. Tracciare la corrente indotta contro tensione applicata per ogni frequenza e forma d'onda per ottenere la risposta di memristive "pizzicato isteresi".
  3. Esperimenti di impulso
    1. Utilizzando un software di programmazione personalizzato e fonte di tensione analogica, generare impulsi di tensione con specifiche ampiezze di alte e basse, il tempo e fuori tempo.
      Nota: Questo non è necessario se gli impulsi di tensione potrebbero essere generati utilizzando un generatore di funzione commerciale.
    2. Registrare la corrente in risposta agli impulsi applicati.
    3. A causa della natura capacitiva del memristor, saranno registrati picchi capacitivi. Rimuovere punte applicando un filtro passa-basso con adeguata banda passante.

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Representative Results

Figura 1 Visualizza la configurazione sperimentale utilizzata per assemblare e caratterizzare il memristor biomolecolari. Abbassare le estremità libere degli elettrodi alla parte inferiore del serbatoio dell'olio, come mostrato in Figura 1b, è stato trovato utile per minimizzare le vibrazioni degli elettrodi e le goccioline che possono provocare variazioni nella zona misurata corrente e doppio strato, specialmente nei casi in dove l'olio da riscaldamento può generare flusso convettivo nell'olio. La figura 2 Mostra la procedura e il risultato dell'assemblaggio cavi Ag/AgCl, capillari di classe e titolari di elettrodo e micropipetta. L'installazione è ospitato all'interno di una gabbia di Faraday correttamente messa a terra (Figura 3) per minimizzare le interferenze elettromagnetiche.

È imperativo per formare una stabile, isolante doppio strato lipidico per questo studio. In questo protocollo, un monostrato lipidico assembla nelle interfacce di olio/acqua delle goccioline acquose immerse nell'olio. Al contatto tra gocce, l'olio in eccesso viene escluso e l'avversaria monostrati lipidici sottile per un doppio strato lipidico spessore 5-nm. La tecnica più comunemente usata in elettrofisiologia doppio strato è tensione-clamp, dove la tensione attraverso il doppio strato è controllata e viene misurata la corrente indotta.  Figura 4a ritrae la corrente capacitiva di onda quadra indotta da un 10 mV, 10 Hz tensione durante la formazione del doppio strato. Mentre l'ampiezza aumenta dopo l'avvio doppio strato assottigliamento e la successiva espansione radiale della membrana assottigliata, la forma d'onda rimane quadrata. Utilizzando l'ampiezza allo steady-state di onda quadra corrente, l'area nominale del bilayer del lipido può essere calcolato utilizzando un valore predeterminato di capacità di membrana specifica per un doppio strato di DPhPC21.  Inoltre, l'area di doppio strato può essere valutata visivamente tramite la misura del diametro doppio strato da un'immagine scattata con il microscopio Figura 4b. Per calcoli di zona doppio strato lipidico accurata, il lettore dovrebbe vedere Taylor, et al.21. L'area del bilayer del lipido può essere regolata modificando le posizioni relative delle goccioline21,31.

Su richiesta di una polarizzazione di tensione, un doppio strato lipidico alameticina-libero, la risposta corrente varia in base alla frequenza della tensione in ingresso. Alle basse frequenze (< 10-50 mHz), dove la resistenza del bilayer domina l'impedenza complessa, la risposta corrente ohmica è trascurabile perché la resistenza nominale membrana è in genere maggiore di 10 GΩ. Man mano che aumenta la frequenza di ingresso, capacità di membrana contribuisca maggiormente all'impedenza del sistema, con conseguente risposta diverso da zero corrente visualizzata nella trama del corrente contro tensione in Figura 5a. Quando la stessa forma d'onda tensione di ingresso (150 mV) viene applicato a una risposta biomolecolari costituito da una membrana lipidica alameticina-drogati, e quando l'ampiezza di tensione supera una soglia critica di inserimento (~ 100 mV per una membrana di DPhPC a temperatura ambiente), alameticina peptidi che risiedono sulla superficie del bilayer del lipido inserire la membrana e radunare i pori conduttivi di forma. La formazione di soglia-dipendente dei canali ionici si traduce in una risposta attuale macroscopica non lineare, con l'aumento esponenziale correnti a tensioni superiori alla soglia di inserimento (Figura 5b). Mentre alameticina peptidi sono noti per modulo raddrizzatore canali ionici solo alle tensioni sufficientemente positivi, la natura simmetrica di queste risposte corrente presso entrambe le polarità è dovuto l'inserimento e l'aggregazione delle popolazioni separate di peptidi, ciascuno da di fronte i lati della membrana. A seconda della frequenza della tensione applicata, la risposta di corrente indotta può contenere anche contributi dalla corrente capacitiva. Di conseguenza, la corrente capacitiva in Figura 5a deve essere sottratto il visualizzate in totale attuale Figura 5b per ottenere solo la memristive pizzicato isteresi corrente-tensione risposta, visualizzata in Figura 5C, sviluppo.

Figura 6 Mostra la risposta dinamica di commutazione di un memristor biomolecolari indotta da un treno di impulsi di tensione (130 mV (alta), 20 mV (basso), 100 ms (ON), 20 ms (OFF)). La tensione OFF viene scelto per essere 20 mV a differenziare il ritorno del dispositivo a uno stato isolante come canali alameticina lasciano il bilayer piuttosto da corrente semplicemente evanescente a zero-tensione di ingresso. L'incremento cumulato in stato ON corrente durante gli impulsi successivi tensione rappresenta accoppiato-pulsata facilitazione, una plasticità che memristors biomolecolari volatili sono in grado di esporre12.

Figure 1
Figura 1: Messa a punto sperimentale e le parti principali. (un) la workstation standard per il montaggio e che caratterizzano il memristor biomolecolari include un microscopio invertito, 3 assi micromanipolatori, una fotocamera digitale, un tavolo di isolamento delle vibrazioni, titolare di un elettrodo, un supporto di una micropipetta di vetro, un amplificatore di corrente, un generatore di funzione e un serbatoio di olio. L'installazione è montato sul palco del microscopio come descritto nei passaggi 11-13. (b) una fotografia ingrandita del setup mostrando le punte dei fili Ag/AgCl toccare il fondo del serbatoio dell'olio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Procedura di preparazione di elettrodi. Fotografie che mostrano: (un) l'argento fili ammollo in candeggina; (b) il titolare di un elettrodo; (c) un capillare di vetro lungo 5 cm collegato alla pinza porta elettrodo; (d) un Ag/AgCl elettrodi alimentati attraverso il vetro capillare; (e), un supporto di una micropipetta di vetro; e (f) completamente assemblato elettrodi e titolari.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Procedura di messa a terra. Fotografie che mostrano: (un) una vite avvitata nella superficie del tavolo di isolamento delle vibrazioni per creare un bus di terra quando è collegato alla presa di terra; e (b) un Faraday fatti in laboratorio gabbia che copre l'installazione di elettrodo e serbatoio olio per schermare la misura da interferenze elettromagnetiche. La gabbia e il microscopio fase sono legati al suolo autobus via cavi I e II. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Misure di corrente in tempo reale mostrano una crescita di doppio strato iniziale assottigliamento e areal. (un) la corrente misurata (in alto) durante la formazione del doppio strato spontanea tra le goccioline del lipido-rivestito in risposta a una tensione di forma d'onda triangolare. La grandezza della corrente misurata è direttamente proporzionale alla capacità dell'interfaccia e, di conseguenza, l'area del bilayer. L'area dell'interfaccia può essere variata modificando la distanza tra i due elettrodi di goccia-cuscinetto. (b) un'immagine acquisita attraverso gli spettacoli di microscopio invertito una vista inferiore e le dimensioni di un memristor tipico biomolecolare basati sulle membrane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Relazione tensione-corrente e isteresi pizzicato. (un) la tensione di corrente le risposte di un doppio strato lipidico alameticina-libero DPhPC. Una membrana lipidica-solo è altamente isolante (~ 10 GΩ), che spiega la bassa risposta corrente ohmica a 0,017 Hz, una frequenza dove l'impedenza è dominato dalla resistenza di membrana. A frequenze superiori, capacità di membrana contribuisce più significativamente all'impedenza totale dell'interfaccia, risultante in una corrente capacitiva indotta diverso da zero. (b) le relazioni di corrente-tensione dinamiche vs frequenza di un doppio strato lipidico formano fra due goccioline contenenti peptidi alameticina (ottenute con un'onda triangolare di ingresso). (c) il memristive, pizzicato isteretico risposta corrente del dispositivo si ottiene sottraendo la corrente capacitiva visualizzata in un dalla corrente totale visualizzato in b. (d) zoom-in per evidenziare le differenze tra il totale e le correnti di memristive.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Risposta della memristors biomolecolari a impulsi di tensione rettangolare e plasticità. Il dispositivo risponde agli impulsi di tensione con un aumento della conduttanza durante il tempo di ON, nonostante in modo intermittente ripristinando uno stato isolante durante ogni tempo OFF. L'aumento della corrente da impulso a impulso dimostra che la conduttanza istantanea del dispositivo è una funzione di stimolo presente sia preventivo stimoli, analoghi alla plasticità a breve termine in bio-sinapsi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questa carta presenta un protocollo per l'assemblaggio e caratterizzazione biomolecolare memristors basato su ione drogato con canale sintetico biomembrane formata tra due gocce d'acqua in olio. Il dispositivo materia soffice, due terminali è stato progettato e studiato per: 1) superare i vincoli che sono associati con tecnologia a stato solido, come rumore elevato, elevato consumo di energia e alta commutazione tensioni, imitare 2) più molto attentamente la composizione, struttura commutazione meccanismi biologiche sinapsi, e 3) esplorare i meccanismi e le caratteristiche di plasticità bio-sinapsi che non sono esposte da dispositivi a stato solido.

La gocciolina interfaccia doppio strato tecnica21, che rappresenta il blocco di costruzione della tecnologia presente12, è un approccio semplice, modulare per montaggio di membrana che è stato ampiamente utilizzato per studiare la membrana biofisica21, proteine22, ione canali29e altre biomolecole32. Rappresenta un blocco di costruzione per materiali stimoli-sensible a reagire e autonoma26e offre vantaggi specifici per il proprio controllo e interrogando membrane modello. Diversi metodi sono stati sviluppati da montare bilayer interfaccia gocciolina, compreso l'impiccagione21 metodo che è stato adattato come metodo principale per sviluppare e caratterizzare il memristor biomolecolari di drop. Anche se questa tecnica di assemblaggio della membrana è stata usata in studi precedenti, qui vi presentiamo un protocollo completo che permette ai ricercatori di ricreare e studiare memristive doppii strati di interfaccia di goccia nei propri laboratori. Il protocollo è specificamente scritto in modo da permettere ai ricercatori nei campi della biologia non-membrana, come la comunità di neuromorphic, di comprendere e ricreare queste procedure.

Nella sua forma più semplice, il protocollo che abbiamo descritto nel presente documento per la valutazione della funzionalità di memristive di un biomembrane possa essere replicato con attrezzature di laboratorio di base come un generatore di funzione, un microscopio e un sistema di misurazione corrente. Il dispositivo assemblato è elettricamente equivalente ad un resistore (~ 10 GΩ) e un condensatore in parallelo. In presenza di peptidi, come alameticina, che sono in grado di formare pori voltaggio-dipendenti nella membrana, la resistenza di membrana scende significativamente e resistivo corrente può essere rilevato in risposta all'input segnali di tensione (DC o AC). Tuttavia, la membrana grande resistenza e l'impedenza elettrica dipendente dalla frequenza del dispositivo significa che: 1) le correnti sono piccole (pA-nA) e soggetto alle interferenze elettromagnetiche; e 2) cura deve essere presa per indurre accuratamente e per misurare le proprietà desiderata memristive separate dalle risposte di membrana capacitivo, rispettivamente. In risposta a una tensione di AC e a seconda della frequenza del segnale, la corrente registrata conterrà componenti sia capacitivi e resistivi. Per ottenere l'isteresi pizzicato, che è una firma di dispositivo memristive, uno deve seguire il protocollo descritto nel passaggio 14. I fili di sospensione sono sensibili alle vibrazioni, che possono provocare risposte artefactual come oscillazioni erroneamente attribuite alla dinamica reale del dispositivo. Posizionare i cavi nella parte inferiore del serbatoio dell'olio migliora questo comportamento.

Il memristor biomolecolare con la sua attuale struttura e design emula la plasticità sinaptica a breve termine che si verifica nel terminale presinaptico. Imita anche alcuni dei meccanismi che causano presinaptici accoppiati pulsata facilitazione nel cervello a causa dell'accumulo e lo svuotamento delle vescicole di neurotrasmettitore nel neurone presinaptico. Questa metodologia per montaggio sinaptica imita consente lo studio e la validazione dei processi biomimetici responsabili per molti tipi di plasticità a breve termine e l'ottimizzazione di modularità e scalabilità non è possibile con altre tecnologie33. Funzionalità impreviste può essere scoperto modificando la composizione della membrana, i tipi di canali ionici che sono incorporati nella membrana e anche il numero di goccioline collegate e interfacciale membrane che costituiscono ogni due terminali dispositivo. Ad esempio, recentemente abbiamo dimostrato le capacità di apprendimento on-line del memristor biomolecolari Interfacciandolo con un neurone a stato solido34.

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Disclosures

Questo manoscritto è stato autore di UT-Battelle, LLC, sotto contratto no. DE-AC0500OR22725 con l'US Department of Energy. Mantiene il governo degli Stati Uniti e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, mondiale per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di Questo manoscritto, o consentire ad altri di farlo, per le finalità di governo degli Stati Uniti.

Acknowledgments

Sostegno finanziario è stato fornito dalla National Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Ricerca per G.J.T., C.D.S, A.B., e c.p.c. parzialmente è stato sponsorizzato dal diretto di laboratorio ricerca e sviluppo programma di Oak Ridge National Laboratory, gestito da UT-Battelle, LLC, per l'US Department of Energy. Una parte di questa ricerca è stata condotta presso il centro per Nanophase Materials Sciences, che è un DOE Office of Science utente Facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P/850356C Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) 
Agarose  Sigma-Aldrich A9539
Agarose (0.5g Agarose Tablets) Benchmark A2501 You can either use the powder form or the tablets 
Alamethicin  AG Scientific A-1286
Analytical balance  Mettler Toledo ME204TE/00
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices -
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Brain Total Lipid Extracts (Porcine) Avanti Polar Lipids 131101
DigiData 1440A system Molecular Devices -
Extruder Set With Holder/Heating Block  Avanti Polar Lipids 610000 This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block
Freezer (-20 °C) VWR International SCUCBI0420AD
Glassware VWR International -
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
MOPS Sigma-Aldrich M1254
Nitrogen (N2) Gas Airgas UN1066
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film Parafilm PM999
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Precleaned Microscope Sildes  Fisher Scientific  22-267-013
Refrigirator (4 °C) VWR International SCUCFS-0504G
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Stirring Hot Plate Thermo Scientific  SP131325
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089

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References

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