Summary
Mjuk, låg strömförbrukning, biomolekylär memristors utnyttja liknande sammansättning, struktur och byta mekanismer av bio-synapser. Presenteras här erhålls ett protokoll att montera och karakterisera biomolekylär memristors från isolerande lipid lipidmonolager bildas mellan vattendroppar i olja. Införlivandet av spänning-aktiverad alamethicin peptider resulterar i memristive Joniska konduktans över membranet.
Abstract
Möjlighet att återskapa synaptic funktioner i syntetiska kretselement är viktigt för neuromorphic computing system som syftar till att efterlikna hjärnans kognitiva befogenheter med jämförbar effektivitet och densitet. Hittills har kiselbaserade tre-terminal transistorer och två-terminal memristors har använts i neuromorphic kretsar, till stor del på grund av deras förmåga att samlokalisera informationsbehandling och minne. Men dessa enheter inte kan nå den sammankoppling och komplexiteten av hjärnan eftersom de är makthungriga, misslyckas med att imitera nyckel synaptic funktioner och lider av högt buller och hög Växla spänningar. För att övervinna dessa begränsningar, har vi utvecklat och kännetecknas en biomolekylär memristorn som efterliknar sammansättningen, strukturen och växling egenskaper biologiska synapser. Här beskriver vi processen för montering och karaktärisera biomolekylär memristors bestående av en 5 nm tjock lipid lipidens bildas mellan lipid-functionalized vattendroppar i olja och dopade med spänning-aktiverad alamethicin peptider. Medan liknande montering protokoll har använts för att undersöka biofysiska egenskaper av droplet-stödda lipid membran och membran-bundna jonkanaler, fokuserar denna artikel på viktiga ändringar av droplet lipidens gränssnittsmetoden avgörande för att uppnå konsekvent memristorn prestanda. Specifikt, beskriver vi processen Liposom förberedelse och införlivandet av alamethicin peptider i lipid lipidens membran, och lämpliga koncentrationer av varje beståndsdel samt deras inverkan på memristors samlade respons. Vi också detalj karakterisering processen av biomolekylära memristors, inklusive mätning och analys av memristive ström-spänning relationer erhålls via cyklisk voltametri, samt kortsiktiga plasticitet och lärande som svar på överläggsgrafer spänning puls tåg.
Introduction
Det är allmänt erkänt att biologiska synapser ansvarar för hög effektivitet och enorma parallellitet i hjärnan på grund av deras förmåga att lära sig och bearbeta information i mycket adaptivt sätt. Denna samordnade funktion framträder från flera, mycket komplexa molekylära mekanismer som driver både kortsiktiga och långsiktiga synaptisk plasticitet1,2,3,4,5. Neuromorphic computing system syftar till att efterlikna synaptic funktioner på nivåer som närmar sig den täthet, komplexitet och energieffektivitet av hjärnan, som behövs för nästa generation av hjärnan-liknande datorer6,7 , 8. reproducera synaptic funktioner använder traditionell elektronisk kretselement är dock nästan omöjligt9, i stället kräva design och tillverkning av ny hårdvara element som kan anpassas till inkommande signaler och minns information historia9. Dessa typer av synaps-inspirerade maskinvara är kända som mem-elements9,10,11 (kort för minne element), som enligt Di Ventra et al.9,11, passiv, två-terminal enheter vars resistans, kapacitans och induktans kan konfigureras som svar på yttre stimuli, och som kan komma ihåg tidigare stater11. För att uppnå energi konsumtionsnivåer närmar sig dem i hjärnan, bör dessa element anställa liknande material och mekanismer för synaptisk plasticitet12.
Hittills har två-terminal memristors13,14,15 huvudsakligen byggts med kompletterande metall-oxid-halvledare (CMOS) tekniken, kännetecknas av hög-Växla spänningar och hög ljudnivå. Denna teknik skalar inte väl på grund av hög energiförbrukning och låg densitet. För att hantera dessa begränsningar, har flera organiska och polymera memristors nyligen byggts. Dessa enheter uppvisar dock betydligt långsammare växlingen dynamics på grund av tidskrävande ion diffusion genom en ledande polymer matris16,17. Som ett resultat, är de mekanismer som både CMOS-baserade och ekologiska memristive enheter emulera synaps-inspirerade funktioner mycket fenomenologiska, som omfattar endast ett fåtal synaptic funktioner såsom Spike Timing beroende plasticitet (STDP) 18, medan med utsikt över andra viktiga funktioner som också spela viktiga roller i att göra hjärnan en kraftfull och effektiv dator, till exempel pre synaptic, kortfristiga plasticitet19.
Nyligen har introducerat vi en ny klass av memristive enheter12 med spänning-aktiverat peptider införlivas i biomimetiska lipid membran som härmar biomolekylär sammansättning, membranstruktur, och ion kanalväxling utlöses mekanismer för biologiska synapser20. Här beskriver vi hur du monterar och elektriskt förhöra dessa två-terminal enheter, med särskild fokus på hur man utvärderar kortsiktiga plasticitet för genomförandet i online lärande program12. Enheten församling är baserad på droplet lipidens (DIB)21 gränssnittsmetoden, som har använts i stor utsträckning under de senaste åren för att studera biofysik modell membran21 -membran-bundna ion kanaler22,23, 24, och som byggstenar för utveckling av stimuli-lyhörd material25,26. Vi beskriver membran montering och förhör processen i detalj för dem intresserade av neuromorphic program men har begränsad erfarenhet av biomaterial eller membran biologi. Protokollet innehåller även en fullständig beskrivning av förfarandet för karakterisering, som är lika viktig som församlingen processen, då de dynamiska och omkonfigurerbara elektriska egenskaperna enhet27. Förfarande och representant resultaten beskrivs här är grunden för en ny klass av låg kostnad, låg strömförbrukning, mjuk mem-element utifrån lipid gränssnitt och andra biomolekyler för applikationer i neuromorphic computing, autonoma strukturer och system, och även adaptiv hjärna-dator gränssnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. allmänna anvisningar och försiktighetsåtgärder
- Välj lämplig, oskadade mätning/blandning glas (flaskor, bägare, etc.) och andra labware (spatlar, skopor, etc.) för användning.
- Hantera glas noggrant för att undvika skador och bär latex eller nitril handskar att undvika kontaminering av glas/labware med rester från fingertopparna och skydda din hud.
- Ren valt glas/labware grundligt med rengöringsmedel och vatten genom att skrubba med en mjuk flaskborste tills ren och alla rester tas bort.
- Skölj noggrant med kranvatten och därefter med avjoniserat vatten (DI) vatten. Plats på Torkställ luft torka.
-
Tillval: Skölj den rengjorda glas/labware med isopropylalkohol (IPA, 99,5%) och placera under vakuum avdunsta alla kvarvarande IPA för att säkerställa att de är fria från eventuella föroreningar (~ 2 h). Ta bort från vakuumkammare och placera i ren miljö.
Obs: Använd luddfria servetter för att torka glas och labware. Köpa och använda sterila små glasampuller och säker-lås rör för förberedelse och prov materiallager. För ytterligare information om glas rengöring och andra laboratorium standardrutiner, hänvisa till JoVE Science Education Database28.
2. Preparering av vattenhaltiga buffertlösning
- Bär latex eller nitril handskar, Välj en lämplig och ren glasbehållare att förbereda 50 mL vattenlösning buffert (500 mM natriumklorid (KCl), 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic syra (moppar), pH 7,0).
- Använder en digital, hög precision massbalans och en ren spatel, fördela 1.86378 g av KCl på ren väger papper och sedan lägga till i glasbehållaren för.
Obs: Mängderna KCl och moppar bör variera beroende på önskad volym och önskade slutliga koncentrationer. - Väg 0.10463 g av moppar och lägga till i glasbehållaren för. Sedan lägger du till 50 mL DI vatten glasbehållaren och vortex grundligt tills KCl och moppar är helt upplöst.
- Lagra buffertlösningen i rumstemperatur och Använd när den behövs.
Obs: Medan buffertlösningar kan lagras under relativt lång tid, är det rekommenderat att använda nylagade buffertlösningar för bättre och jämnare resultat.
3. beredning av liposomer
Obs: Steg 3.1 gäller endast om fosfolipider förvärvas som frystorkat pulver, och därför kan hoppas över om fosfolipider köps i kloroform.
- Lös 5 mg 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) eller hjärnan totala Lipid extrakt (BTLE) lipider i 1 mL kloroform i en injektionsflaska med 5 mL i sterilt glas.
- Samtidigt försiktigt virvlande, avdunsta i kloroform under en svag luftström torrt kväve tills en lipid film kvar på botten av injektionsflaskan.
- Placera injektionsflaskan med lipid filma under vakuum för 10-12 h för fullständig borttagning av återstående kloroform.
- Ta bort injektionsflaskan från vakuumkammare och rehydrera lipid filmen genom att tillsätta 10 mL vattenlösning buffertlösningen beredd i steg 2 för att uppnå en slutlig lipid koncentration på 2 mg/mL.
- Frysa (-20 °C) och Tina helt lipid suspensionen sex gånger för att underlätta multilamellar Liposom församling.
Obs: Låt blandningen Tina i rumstemperatur, aldrig i en uppvärmd miljö. - Använder en kommersiellt tillgänglig extruder, extrudera Liposom lösningen genom att tvinga komplett lipid suspensionen genom en 0,1 μm porstorlek diameter spår-etsade membran. Extrudera suspensionen 11 gånger i omedelbar följd att erhålla unilamellar liposomer med diametrar av c.a. 100 nm behövs för korrekt lipid enskiktslager bildandet. Lagra Liposom suspensionen vid 4 °C och Använd inom 1 vecka efter beredning. För enkelhetens skull kalla den resulterande Liposom-lösningen ”A”.
Obs: För extrudering av BTLE liposomer, forskaren är uppmuntras att värma upp extrudern att 45-50 °C, högre än fasövergång temperatur BTLE lipider (~ 37 °C)23,29, aktivera lättare extrudering. Hydrerade BTLE Liposom suspensioner kan också vara direkt beredd (i stället för frysning-tining och extrudering) genom att placera stängda suspension injektionsflaskan i ett bad någon sonikator vid 55 °C för ~ 15 min.
4. beredning av Alamethicin peptider
Obs: Denna procedur beskrivs processen för alamethicin beredning i liposomer till en slutlig koncentration på 1 μM. Denna koncentration är tillräcklig för att framkalla nA-nivå strömmar liknar de tidigare publicerade12. Öka peptid koncentrationen minskar tröskeln för växling och öka amplituderna av strömmar induceras av tillämpad spänning29.
- Lös alamethicin peptider i etanol till en slutlig koncentration på 2,5 mg/mL, vortex kort att blanda väl, och lagra stamlösning i frys (-20 °C).
Obs: Alamethicin peptider köps oftast i pulverform. - I en 1,5 mL säker-lås tube, blanda 99 μL lösning ”A” med 1 μL av alamethicin stamlösning att uppnå en slutlig alamethicin koncentration av 13 μM i Liposom avstängning. Vortex att blanda väl. Hänvisa till den resulterande peptid-Liposom-lösningen som ”B”.
- Blanda 117 μL av lösning ”A” med 10 μL av lösning B att uppnå en slutlig alamethicin koncentration av 1 mM, och sedan vortex att blanda väl. Hänvisa till den resulterande lösningen som ”C”.
- Lagra lösningarna ''B” och ”C'' vid 4 °C och Använd efter behov.
5. beredning av agarosgel
- En digital hög precision massbalans och en ren spatel, Lägg till 0,5 g agaros pulver till en ren väger papper.
- Överföring vägde agaros till en 100 mL rent glasbägare och tillsätt 50 mL avjoniseratvatten till Agarens.
Obs: Detta kommer att ge en 1% (wt/vol) agaros gel lösning. - Placera en ren omrörning magnet inuti glasbägaren och placera bägaren på en omrörningsanordning värmeplatta.
- Under omrörning, Låt blandningen koka upp tills agaros är helt upplöst.
- Ta bort bägaren från värmeplattan till Låt blandningen svalna till rumstemperatur. Förvaras vid 4 °C och använd vid behov.
- Innan du använder igen, åter smält Agarens genom uppvärmning med en värmeplatta eller mikrovågsugn.
6. tillverkning av oljebehållaren
Obs: Det förfarande som beskrivs nedan är bara ett av många sätt att en oljebehållare kan fabriceras. Läsaren uppmuntras att designa och tillverka en reservoar baserat på tillgängligt material, bearbetning kapacitet och vilka specifika behov.
- Använda en bandsåg, skära en 12 x 12 x 12 mm akryl kub från ett större 12 mm tjock akryl blad.
- Mal en 12 mm diameter hål till ett djup av 8-12 mm akryl röret (figur 1a).
7. förberedelse av elektroder
- Med sax, klipp ut två bitar (75 mm) av silvertrådar (125 μm-diameter).
- Använder en öppen-flame tändare, smälta ena änden av varje silvertråd att bilda små sfäriska bollar (ca 250 μm i diameter).
- Doppa bollen ändarna i blekmedel för 1-2 h till skapa en silver silver-klorid (Ag/Granulatfyllda) beläggning. En mörk grå färg indikerar att Ag/Granulatfyllda beläggning har bildats (figur 2a).
- Ta bort båda kablarna från blekmedel, Skölj noga med DI vatten och placera på en ren luddfri torka.
- Doppa bollen ändarna i smält agarosgel att skapa ett tunt lager. Denna gel beläggning hjälper till att förankra aqueous droppar på trådarna under olja.
- Använda en glas fräs, dela en 10 cm lång, 1/0,58 OD ID mm borosilikatglas kapillär in två 5 cm kapillärer.
- Infoga en av glas kapillärerna i en Elektrodhållare (figur 2b, c), och sedan mata en av Ag/Granulatfyllda tråd i glaset kapillär (figur 2d). Mata den andra Ag/Granulatfyllda kabeln i andra glaset kapillär.
- Montera andra glas kapillären till en mikropipett glashållare (figur 2e, f).
8. ställa in experimentet
- Placera en 1 mm tjock, 25 x 75 mm glasskiva på scenen av en inverterade Mikroskop (figur 1a).
- Fördela några droppar hexadecane olja på mitten av en glasskiva och sedan placera oljetanken direkt på oljan på en glasskiva.
Obs: Lägga olja mellan reservoaren glas bild och olja används till att matcha brytningsindex för substratet ger skarpare bilder. - Helt Fyll oljetanken med hexadecane olja. Kontrollera att behållaren är placerad ovanför objektivet.
Obs: Andra hydrofobiska oljor kan användas också. - Anslut elektrodhållare till headstage av en nuvarande förstärkare. Headstage måste monteras på en micromanipulator (figur 1a) för att minimera elektrod längd och elektriska störningar.
- Montera glas mikropipett hållaren med andra Ag/Granulatfyllda tråd på ett annat micromanipulator (figur 1a).
- Använda manipulatorer, placera elektroderna är sådan att Agarens belagda tips av Ag/Granulatfyllda trådarna är helt nedsänkt i oljetanken på ett liknande vertikalplan.
- Rikta in de två elektroderna och separera dem med ett par millimeter (figur 1a, b).
Obs: Efter tillägger droppar (beskrivs i steg 13), ledningarna måste föras ända ner tills den elektrod tipsen vidrör botten av oljetanken. Detta steg kommer att se till att trådarna inte svänga, och således kommer att minimera onödiga svängningar i den uppmätta strömmen.
9. korrekt jordning för att minska elektriska störningar
- Skapa en marken buss genom gängning en skruv i tabellen vibrationsdämpande där mikroskopet placeras (figur 3a).
Obs: Med en vibrationsdämpande tabell krävs för att minimera vibrationer från omgivningen, som kan orsaka oönskade svängningar i uppmätta strömmen. - Använder en ledande tråd, ansluta skruven till en jordning (figur 3a) och sedan ansluta Mikroskop scenen till marken buss.
- Placera en Faradays bur över som experimentella inställning till att minska buller och sedan elektriskt ansluta det till marken buss (figur 3b).
Obs: Det rekommenderas alltid att undvika onödiga jordslingor, eftersom de kan leda till en ökning av mätning ljudnivå.
10. feedback-kontrollerad uppvärmning
- Maskin en aluminium värme shell där oljetanken ryms tätt29.
- Se till att lämna en öppning längst ned på skalet för att kunna visa genom skalet via inverterade mikroskopet.
- Placera ett 30 x 30 mm resistiv polyimid flexibla värmeelement under aluminium skalet.
- Placera en isolerande Polydimetylsiloxan (PDMS) wafer under värmaren att minska värmeförlusterna i nedåtgående riktning och skydda mikroskopet scenen.
- Infoga ett termoelement i fasen olja. Efter att se till att termoelementet inte vidrör antingen Ag/Granulatfyllda tråd, Anslut termoelement kablarna till en termoelement data förvärv styrelse och registrera temperatur via anpassad programmering programvara.
Obs: Skriv en On-Off, proportionell integrerad (PI) feedback temperaturkontroll för att aktivera uppvärmning och passiv kylning av olja temperaturen till önskat värde. Koder kan lämnas till läsare på begäran.
11. Konfigurera programvara och utrustning
- Förbereda data förvärv programvaran genom påslagning dator(er), Mikroskop, funktionsgenerator, nuvarande förstärkare och låg ljudnivå datainsamlingssystem.
Obs: Medan någon nuvarande avkänning utrustning kan användas, följande instruktioner är specifikt för som anges i Tabellen för material. Forskare som vill bygga sina egna nuvarande förstärkare kan hänvisa till Shlyonsky et al.30. - På frontpanelen på patch klämman nuvarande förstärkare, ställa in frontpanelens display och källa-mätning läge ringer till VHOLD/IHOLD och V-CLAMP, respektive.
- På frontpanelen, ange Lowpass Bessel-filtret till 1 kHz och Utgång till 0,5.
Obs: Att välja en låg utmatningsförstärkningen möjliggör inspelning större högre nuvarande amplituder, medan ökar vinst uppoffringar mätområdet för bullerminskning för mätning. - Ange konfiguration till hela cellen β = 1. Detta värde kan senare byta till 0,1 till tillåta inspelning av större amplitud strömmar.
- Ställa in alla andra kontroll-rattar till noll eller i en neutral position.
- Initiera programvaran genom att dubbelklicka på ikonen på skrivbordet.
- Klicka på konfiguration | Digitizer att öppna dialogrutan Digitizer , och klicka sedan på knappen ändra .
- I dialogrutan Ändra Digitizer , Välj lämplig digitizer från listan Digitizer .
- Klicka på knappen Skanna för att upptäcka digitizer.
- Klicka på OK för att stänga dialogrutan Ändra Digitizer och klicka sedan på OK för att stänga dialogrutan Digitizer .
- Klicka på Configur | Lab bänk.
- I fliken Input signaler Lab bänk, ställa in skalfaktorn till 0,0005 V/pA.
Obs: Det här värdet måste uppdateras om vinst eller β värden har ändrats.
12. Pipettera Offset
Obs: Det förfarande som beskrivs nedan gäller endast för nuvarande förstärkare som nämns i Tabell för material.
- Med hjälp av en mikropipett, sätter in 200 nL av vattenhaltigt lipid lösningen ”A” på ändarna av varje Ag/Granulatfyllda tråd under olja.
- Ta droppar in i kontakt och tryck på knappen ZAP på frontpanelen på förstärkaren till sammanfalla droppar till en volym som spänner över båda elektroderna. Detta bör föranleda en kortslutning svar.
- Ange källa-mätning lägesratten till spår.
- Ändra på frontpanelens display ratten till Vspår.
- Sväng av PIPETTER OFFSET ringa (medurs eller moturs) tills mätaren läser 0 mV och är stabil.
- Tillbaka källa-mätning funktionsratten till V-klämma och frontpanelen Visa dial till VHåll/IHåll.
13. bildandet av de Lipid Lipidens
- Släpp de droppar som förvarades tidigare genom att flytta elektroderna vertikalt ur fasen olja. Detta orsakar droppar falla från elektroderna i oljan. Re dränka och placera elektroderna i olja.
- Använd en mikropipett för att sätta in 200 nL lipid lösning ”A” på var och en av trådarna.
- Vänta 3-5 min till möjliggöra spontana lipid enskiktslager montering ska ske vid varje vatten/olja-gränssnitt.
Obs: som de lipid enskiktslager formerna, de vatten-lipid/oil gränssnitt ytspänning minskar, vilket kan orsaka droppar SAG om omgivande oljan är tillräckligt mindre tät21. - Lägre de elektroder (droppar) tills ändarna av båda elektroderna röra knappt botten av oljetanken (figur 1b) och sedan flytta dem horisontellt för att sätta droppar i kontakt.
Obs: De lipid lipidens kommer spontant tunna genom att utesluta överflödig olja från mellan kontakta droppar. Denna process inträffar vanligtvis inom 1 min.
14. elektriska karakterisering av den biomolekylär memristorn
- Lipid Lipidens bildandet
- För att spela in lipid lipidens bildandet, vilket motsvarar en ökning av elektrisk kapacitans mellan droppar, tillämpa en 10 Hz, 10 mV triangulära vågform spänningen med en funktionsgenerator (figur 4) ansluten till den externa ingången av patch klämman förstärkare.
Obs: Kapacitiv Pågrund av lipid membranet, den resulterande nuvarande Svaren bör vara en fyrkantig vågform (figur 4). Under lipid lipidens bildandet, steg 11,6, bör forskaren se en tillväxt i peak-to-peak aktuella amplituden och också observera en visuell förändring mellan anslutna droppar (figur 4).
- För att spela in lipid lipidens bildandet, vilket motsvarar en ökning av elektrisk kapacitans mellan droppar, tillämpa en 10 Hz, 10 mV triangulära vågform spänningen med en funktionsgenerator (figur 4) ansluten till den externa ingången av patch klämman förstärkare.
- Ström-spänning mätningar
Obs: Den biomolekylär memristorn modelleras som ett motstånd och en kondensator i parallella12,21. Därför kan det nuvarande svaret av enheten innehålla både resistiva och kapacitiva komponenter beroende på frekvensen av spänningen. Att studera den memristive typ av enhet, och att få den nöp hysteretic ström-spänning relation12, kan det vara nödvändigt att subtrahera kapacitiv ström från den totala strömmen. Protokollet nedan beskriver proceduren.- Använd en funktionsgenerator att applicera en spänning vågform (triangulära eller sinusformad) en alamethicin-fri lipid membranet monteras med droppar av lösningen ”A”.
- Registrera det inducerade nuvarande svaret över flera frekvenser.
Obs: Kapacitiva strömmar minimeras på frekvenser under 10 mHz. - Spela in storleken på den gränsskiktspänning lipid lipidens genom antingen mäta diametern av lipid membranet på dator eller spela in peak-to-peak aktuella amplituden som härrör från de 10 Hz, 10 mV triangulär våg. Aktuella amplituden är proportionell mot den membran kapacitansen, som i sin tur är proportionell mot området i membranet.
- Ta bort droppar som innehåller ingen alamethicin.
- Lägg till nya aqueous droppar lösning ”C” och bilda en lipid lipidens.
- Använd micromanipulators för att justera kontakt mellan droppar så att lipidens har ett liknande område (diameter eller kvadratiska våg nuvarande amplitud) som den bildade tidigare.
- Upprepa steg 14.2.1 och 14.2.2.
- Subtrahera aktuella inspelade i steget 14.2.2 från nuvarande registrerades i steg 14.2.7.
- Rita den inducerade strömmen kontra tillämpad spänning för varje frekvens och vågform att få ”nöp hysteres” memristive svaret.
- Pulse experiment
- Använda en anpassad programmering programvara och analoga spänningskälla, generera spänning pulser med specifika höga och låga amplituder, i tid och OFF tid.
Obs: Detta behövs inte om spänningen pulserna kan skapas med hjälp av en kommersiell funktionsgenerator. - Anteckna aktuellt svar på tillämpad pulser.
- Kapacitiv Pågrund av memristorn, kommer kapacitiv spikes att registreras. Ta bort spikar genom att tillämpa ett lågpassfilter med lämpliga passband.
- Använda en anpassad programmering programvara och analoga spänningskälla, generera spänning pulser med specifika höga och låga amplituder, i tid och OFF tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar de experiment som används för att montera och karaktärisera den biomolekylär memristorn. Sänka de fria ändarna av elektroderna till botten av oljetanken, hittades som visas i figur 1b, bra att minimera vibrationer av elektroder och droppar som kan leda till variationer i uppmätta strömmen och lipidens område, särskilt i de fall där värme oljan kan generera Konvektiv flöde i oljan. Figur 2 visar förfarandet och resultatet av montering av Ag/Granulatfyllda ledningar klass kapillärer och elektroden och mikropipett innehavare. Installationen är inrymt i ett jordat Faradays bur (figur 3) för att minimera elektromagnetiska störningar.
Det är absolut nödvändigt att bilda en stabil, isolerande lipid lipidens för denna studie. I detta protokoll monterar en lipid enskiktslager på olja/vatten gränssnitten i vattenlösning droppar nedsänkt i olja. Vid kontakt mellan droppar, överflödig olja är uteslutet, och de motsatta lipid enskiktslager tunna till en 5-nm tjock lipid lipidens. Den vanligaste tekniken som används i lipidens elektrofysiologi är spänning-klämma, där spänningen över lipidens styrs och den inducerade strömmen mäts. Figur 4a skildrar den kapacitiva kvadratiska våg nuvarande inducerad av en 10 mV, 10 Hz spänning under lipidens bildandet. Amplituden ökar på start lipidens gallring och efterföljande radiell expansion av tunnas membranet, vågformen fortfarande är fyrkantig. Använda steady state amplituden av fyrkantsvåg nuvarande, kan de lipid lipidens nominella området beräknas med ett förutbestämt värde för specifika membran kapacitans för en DPhPC lipidens21. Även kan området lipidens bedömas visuellt genom mätning av lipidens diameter från en bild tagen med mikroskopet figur 4b. För korrekt lipid lipidens området beräkningar hänvisas läsaren till Taylor, et al.21. Området i den lipid lipidens kan justeras genom att ändra de relativa positionerna för de droppar21,31.
Efter ansökan av en spänning bias till en alamethicin-fri lipid lipidens varierar nuvarande svaret beroende på frekvensen av inspänningen. Vid låga frekvenser (< 10-50 mHz), där motståndet av lipidens dominerar den komplexa impedansen, ohmsk nuvarande svaret är försumbar eftersom det nominella membran motståndet är vanligtvis större än 10 GΩ. Som ingående frekvensen ökar, bidrar membran kapacitans mer till impedansen i systemet, vilket resulterar i noll nuvarande svaret visas i handlingen i nuvarande kontra spänning i diagram 5a. När samma ingång spänning vågform (150 mV) tillämpas på ett biomolekylär svar bestående av en alamethicin-dopade lipid membranet, och när spänning amplituden överträffar en kritisk införande tröskel (~ 100 mV för ett DPhPC membran vid rumstemperatur), alamethicin peptider som bor på ytan av den lipid lipidens infoga i membranet och aggregerar till formuläret Konduktiv porer. Tröskel-beroende bildandet av jonkanaler resulterar i en ickelinjär makroskopiska nuvarande svaret, med exponentiellt ökande strömmar på spänningar högre än tröskelvärdet införande (Figur 5b). Medan alamethicin peptider är kända för formuläret rättelse jonkanaler endast vid tillräckligt positiva spänningar, beror symmetrisk arten av dessa aktuella svar på båda polerna på införande och aggregering av åtskilda populationer av peptider, var och en från motsatta sidor av membranet. Beroende på frekvensen av spänningen innehålla det inducerade nuvarande svaret också bidrag från den kapacitiva strömmen. Därför måste den kapacitiva strömmen i figur 5a subtraheras från den totala nuvarande visas i Figur 5b för att erhålla endast memristive nöp hysteres ström-spänning svar, visas i figur 5 c, d.
Figur 6 visar dynamiskt byta svaret av en biomolekylär memristorn induceras en spänning puls tåg (130 mV (hög), 20 mV (låg), 100 ms (på), 20 ms (OFF)). Den OFF spänningen väljs vara 20 mV att skilja återlämnande av enheten till en isolerande stat som alamethicin kanaler lämnar lipidens snarare från nuvarande helt enkelt försvinnande vid noll spänning-ingången. Den kumulativa ökningen av ON-statliga ström under successiva spänning pulser representerar ihopkopplade pulsade underlättande, en plasticitet att flyktiga biomolekylär memristors klarar av att ställa ut12.
Figur 1: Experiment och huvuddelar. (en) standard arbetsstationen för montering och karaktärisera den biomolekylär memristorn inkluderar ett inverterat Mikroskop, 3-axlig micromanipulators, en digitalkamera, en vibration isolering tabell, en elektrodhållare, en mikropipett glashållare, en Nuvarande förstärkare, en funktionsgenerator och en oljebehållare. Installationen monteras på scenen av mikroskopet som beskrivs i steg 11-13. (b) en inzoomad bild av installationen visar tips av Ag/Granulatfyllda trådarna röra botten av oljetanken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Elektrod arbetsgången. Fotografier visar: (en) silver trådar blötläggning i blekmedel; (b) en elektrodhållare; (c) en 5 cm lång glas kapillär ansluten till elektrodhållare; (d) en Ag/Granulatfyllda elektrod matas genom glaset kapillär; (e), en mikropipett glashållare; och (f) den färdigmonterad elektroder och innehavare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jordning förfarande. Fotografier visar: (en) en skruv gängade i vibrationer isolering bordsytan att skapa en marken buss när ansluten till jorden marken; och (b) en lab-made Faraday bur täcker olja reservoar och elektroden installationen att skydda mätningen från elektromagnetiska störningar. Både buren och Mikroskop scenen är knutna till marken buss via kablar I och II. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Realtid nuvarande mätningar visar ursprungliga lipidens gallring och areala tillväxt. (en) den nuvarande uppmätta (överst) under spontana lipidens bildandet mellan lipid-belagd droppar som svar på en triangulär vågform spänning. Omfattningen av den uppmätta strömmen är direkt proportionell mot kapacitansen av gränssnittet och därmed området i lipidens. Området i gränssnittet kan varieras genom att ändra avståndet mellan de två elektroderna droplet-bärande. (b) en bild förvärvats genom den inverterade Mikroskop visar en underifrån och dimensioner av en typisk membranbaserad biomolekylär memristorn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Ström-spänning relation och nöp hysteres. (en) den ström-spänningen Svaren från en alamethicin-gratis DPhPC lipid lipidens. En lipid-bara membran mycket isolerande (~ 10 GΩ), vilket förklarar låg ohmsk nuvarande svaret på 0.017 Hz, en frekvens där impedansen domineras av membran motstånd. Vid högre frekvenser, membran kapacitans som mer väsentligt bidrar till den totala impedansen av gränssnittet, vilket resulterar i en icke-noll inducerad kapacitiv ström. (b) de dynamiska ström-spänning relationerna jämfört med frekvensen av en lipid lipidens bildas mellan två droppar som innehåller alamethicin peptider (erhålls med en trekantig ingång våg). (c) memristive, nöp hysteretic nuvarande svaret av enheten erhålls genom att subtrahera den kapacitiva strömmen visas i en från den totala strömmen visas i b. (d) zoomning-i att lyfta fram skillnaderna mellan totalen och memristive strömmarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Svar den biomolekylär memristors rektangulär spänning pulser och plasticitet. Enheten svarar på efterföljande spänning pulser med en ökning av konduktans under ON, trots periodvis en isolerande återställningstillstånd under varje OFF tid. Ökningen av ström från pulse till puls visar att den momentana konduktans av enheten är en funktion av både nuvarande stimulans och tidigare stimuli, analogt med kort sikt plasticitet i bio-synapser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument presenterar ett protokoll för montering och karaktärisera biomolekylär memristors baserat på ion kanal-dopade syntetiska biomembranes bildas mellan två vattendroppar i olja. Den mjuka alster, två-terminal enheten är utformad och studerade till: 1) övervinna begränsningar som är associerade med SSD-teknik, såsom högt buller, hög energiförbrukning och hög Växla spänningar, 2) närmare efterlikna sammansättning, struktur byta mekanismer av biologiska synapser, och 3) utforska mekanismer och funktioner av bio-synaps plasticitet som inte ställs av SSD-enheter.
Droplet gränssnitt lipidens teknik21, som representerar byggstenen i de nuvarande teknik12, är en enkel, modulär metod för membran montering som har använts i stor utsträckning att studera membran biofysik21, proteiner22, ion kanaler29och andra biomolekyler32. Hotellet erbjuder särskilda fördelar för exakt styrning och förhör modell membran, och representerar en byggsten för stimuli-lyhörd och autonoma material26. Flera metoder har utvecklats för att montera droplet gränssnitt lipidmonolager, inklusive hängande släpp21 metoden som anpassades som den huvudsakliga metoden att utveckla och karakterisera den biomolekylär memristorn. Även om denna membran montering teknik användes i tidigare studier, presenterar här vi en grundlig protokoll som tillåter forskare att återskapa och studera memristive droplet gränssnitt lipidmonolager i egna laboratorier. Protokollet är särskilt skriven på ett sätt att låta forskare inom icke-membran biologi, bland annat neuromorphic gemenskapen, att förstå och återskapa dessa förfaranden.
I sin enklaste form kan protokollet har vi beskrivit häri för bedömning av memristive funktioner i en biomembrane replikeras med grundläggande laboratorieutrustning såsom en funktionsgenerator, Mikroskop och ett nuvarande mätsystem. Den monterade enheten är elektriskt motsvarar en resistor (~ 10 GΩ) och en kondensator som parallell. I närvaro av peptider, såsom alamethicin, som kan bilda spänningsberoende porerna i membranet, membran motståndet betydligt droppar, och resistiv ström kan upptäckas i svar på ingång spänningssignaler (DC eller AC). Stort membran motstånd och frekvens-beroende elektrisk impedans på enheten innebär dock att: 1) inducerade strömmar är små (pA-nA) och föremål för elektromagnetiska störningar; och 2) var noga med att framkalla och mäta egenskaperna önskad memristive separat från kapacitiv membran svaren, respektive. Svar till en växelspänning, och beroende på frekvensen av signalen innehåller den inspelade nuvarande både kapacitiv och resistiv komponenter. För att uppnå den nöp hysteres, som är en signatur av memristive enheten, måste man följa protokollet beskrivs i steg 14. Hängande kablar är känsliga för vibrationer, vilket kan resultera i tingsliga Svaren såsom svängningar som felaktigt tillskrivs själva dynamiken i enheten. Positionering trådarna på botten av oljetanken mildrar problemet.
Den biomolekylär memristorn med dess nuvarande struktur och design emulerar det kortsiktiga synaptisk plasticitet som uppstår i presynaptiska terminalen. Det härmar också några av de mekanismer som orsakar presynaptiska Parade pulsad underlättande i hjärnan på grund av ansamling och utarmning av signalsubstansen blåsor i presynaptiska neuron. Denna metod för montering av synaptic härmar möjliggör studie och validering av biomimetiska processer ansvarar för många typer av kortsiktiga plasticitet och optimering av modularitet och skalbarhet inte möjligt med andra tekniker33. Oförutsedda funktionalitet kan upptäckas genom att antingen ändra membran sammansättning, typerna av jonkanaler som är införlivade med membranet, och även antalet anslutna droppar och gränsskiktspänning membran som utgör varje två-terminal enheten. Som ett exempel, har vi nyligen visat online lärande funktionerna i den biomolekylär memristorn av samverkar det med en solid-state neuron34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta manuskript har skrivits UT-Battelle, LLC, under Kontraktsnr DE-AC0500OR22725 med US Department of Energy. Förenta staternas regering behåller och förlaget, genom att godkänna artikeln för publicering, erkänner att Förenta staternas regering behåller en icke-exklusiv, inbetalda, oåterkallelig, världsomfattande licens att publicera eller reproducera det publicerade formuläret för Detta manuskript, eller tillåta andra att göra det, för att Förenta staternas regering.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd tillhandahölls av det nationella Science Foundation Grant NSF ECCS-1631472. Forskning för G.J.T., C.D.S., A.B., och C.P.C. var delvis sponsrad av laboratorium riktad forskning och utveckling Program av Oak Ridge National Laboratory, förvaltas av UT-Battelle, LLC, för US Department of Energy. En del av denna forskning utfördes vid centrum för Nanophase materialvetenskaper, som är en DOE Office av vetenskap användaren anläggning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P/850356C | Purchased as lyophilized powder (P) or in chloroform (C) |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Agarose (0.5g Agarose Tablets) | Benchmark | A2501 | You can either use the powder form or the tablets |
| Alamethicin | AG Scientific | A-1286 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME204TE/00 | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Brain Total Lipid Extracts (Porcine) | Avanti Polar Lipids | 131101 | |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000 | This includes a mini-extruder, 2 syringes, 100 PC membranes, 100 filter supports, and 1 holder/heating block |
| Freezer (-20 °C) | VWR International | SCUCBI0420AD | |
| Glassware | VWR International | - | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Nitrogen (N2) Gas | Airgas | UN1066 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Parafilm | PM999 | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Precleaned Microscope Sildes | Fisher Scientific | 22-267-013 | |
| Refrigirator (4 °C) | VWR International | SCUCFS-0504G | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Stirring Hot Plate | Thermo Scientific | SP131325 | |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 |
References
- Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
- Squire, L. R. Memory systems of the brain: a brief history and current perspective. Neurobiology of learning and memory. 82 (3), 171-177 (2004).
- Benfenati, F. Synaptic plasticity and the neurobiology of learning and memory. Acta Bio Medica Atenei Parmensis. 78 (1Suppl), 58-66 (2007).
- Marx, G., Gilon, C.
- Izquierdo, I., Medina, J. H. Memory formation: the sequence of biochemical events in the hippocampus and its connection to activity in other brain structures. Neurobiology of learning and memory. 68 (3), 285-316 (1997).
- Merolla, P. A. A million spiking-neuron integrated circuit with a scalable communication network and interface. Science. 345 (6197), 668-673 (2014).
- Benjamin, B. V. Neurogrid: A mixed-analog-digital multichip system for large-scale neural simulations. Proceedings of the IEEE. 102 (5), 699-716 (2014).
- Furber, S.
- Di Ventra, M., Pershin, Y. V.
- Chua, L.
- Di Ventra, M., Pershin, Y. V., Chua, L. O. Circuit elements with memory: memristors, memcapacitors, and meminductors. Proceedings of the IEEE. 97 (10), 1717-1724 (2009).
- Najem, J. S. Memristive Ion Channel-Doped Biomembranes as Synaptic Mimics. ACS Nano. , (2018).
- Strukov, D. B., Snider, G. S., Stewart, D. R., Williams, R. S.
- Prezioso, M. Training and operation of an integrated neuromorphic network based on metal-oxide memristors. Nature. 521 (75550), 61-64 (2015).
- Prodromakis, T., Toumazou, C., Chua, L.
- Berzina, T. Optimization of an organic memristor as an adaptive memory element. Journal of Applied Physics. 105 (12), 124515 (2009).
- van de Burgt, Y., Melianas, A., Keene, S. T., Malliaras, G., Salleo, A. Organic electronics for neuromorphic computing. Nature Electronics. 1, (2018).
- Dan, Y., Poo, M. M. Spike timing-dependent plasticity: from synapse to perception. Physiological reviews. 86 (3), 1033-1048 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Shepherd, J. D., Huganir, R. L. The cell biology of synaptic plasticity: AMPA receptor trafficking. Annual Review of Cell Developmental Biology. 23, 613-643 (2007).
- Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
- Najem, J. S. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
- Taylor, G. J. Capacitive Detection of Low-Enthalpy, Higher-Order Phase Transitions in Synthetic and Natural Composition Lipid Membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
- Taylor, G. Electrophysiological interrogation of asymmetric droplet interface bilayers reveals surface-bound alamethicin induces lipid flip-flop. Biochimica et biophysica acta (BBA)-Biomembranes. , (2018).
- Sarles, S. A., Garrison, K. L., Young, T. T., Leo, D. J. Formation and Encapsulation of Biomolecular Arrays for Developing Arrays of Membrane-Based Artificial Hair Cell Sensors. Proceedings of the Asme Conference on Smart Materials, Adaptive Structures and Intelligent Systems (Smasis 2011), Vol 2. , 663-671 (2011).
- Sarles, S. A., Leo, D. J.
- Sarles, S. A. Physical encapsulation of interface bilayers. , Virginia Tech. (2010).
- JoVE Science Education Datatbase. Organic Chemistry II. Cleaning Glassware. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
- Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using Escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2014).
- Shlyonsky, V., Dupuis, F., Gall, D. The OpenPicoAmp: an open-source planar lipid bilayer amplifier for hands-on learning of neuroscience. Plos One. 9 (9), e108097 (2014).
- Najem, J. S. Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Bayley, H.
- Nguyen, M., Srijanto, B., Retterer, S., Collier, C. P., Sarles, S. A. Hydrodynamic trapping for rapid assembly and in situ electrical characterization of droplet interface bilayer arrays. Lab on a Chip. 16, 3576-3588 (2016).
- A Soft-Matter Biomolecular Memristor Synapse for Neuromorphic Systems. Weiss, R., Najem, J. S., Hasan, M. S., Schuman, C. D., Belianinov, A., Collier, C. P., Sarles, S. A., Rose, G. S. IEEE Biomedical Circuits and Systems Conference (BioCAS), 1984 Mar 30-31, Cleveland, Ohio, , (2018).
